ES2925694T3 - Colorantes poliméricos de BODIPY y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan tintes BODIPY poliméricos que incluyen multicromóforos que comprenden unidades BODIPY de captación de luz. En algunas realizaciones, los colorantes son colorantes poliméricos en tándem que incluyen un multicromóforo que comprende una unidad BODIPY captadora de luz y un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en la proximidad del mismo que recibe energía. Los tintes poliméricos en tándem pueden unirse covalentemente a un miembro de unión específico. También se proporcionan métodos para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra y métodos para marcar una molécula diana usando composiciones que incluyen los colorantes poliméricos en tándem. También se proporcionan kits y sistemas para practicar los métodos de la materia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Colorantes poliméricos de BODIPY y métodos de uso de los mismos
Introducción
Los colorantes fluorescentes son compuestos que, cuando se irradian con luz de una longitud de onda que absorben, emiten luz de una longitud de onda (generalmente) diferente. Los colorantes fluorescentes encuentran uso en una variedad de aplicaciones en bioquímica, biología y medicina, por ejemplo, en kits de diagnóstico, en microscopía o en detección de drogas. Los colorantes fluorescentes se caracterizan por una serie de parámetros que permiten al usuario seleccionar un colorante adecuado en dependencia del propósito deseado. Los parámetros de interés incluyen el máximo de longitud de onda de excitación, el máximo de longitud de onda de emisión, el desplazamiento de Stokes, el coeficiente de extinción, el rendimiento cuántico de la fluorescencia y el tiempo de vida de la fluorescencia. Los colorantes pueden seleccionarse de acuerdo con la aplicación de interés para, por ejemplo, permitir la penetración de radiación excitante en muestras biológicas, minimizar la fluorescencia de fondo y/o lograr una alta relación señal/ruido.
El reconocimiento molecular implica la unión específica de dos moléculas. Las moléculas que tienen especificidad de unión para una biomolécula diana encuentran uso en una variedad de aplicaciones en la investigación y el diagnóstico, tales como el marcaje y la separación de analitos, la citometría de flujo, la hibridación in situ, los enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), los análisis de inmunoelectrotransferencia, las separaciones celulares magnéticas y la cromatografía. Las biomoléculas diana pueden detectarse mediante el marcaje con un colorante fluorescente.
El resumen de YU RONG y otros, "Multicolor Fluorescent Semiconducting Polymer Dots with Narrow Emissions and High Brightness", ACS, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, EE. UU., (20130101), vol. 7, núm. 1, doi:10.1021/NN304376Z, ISSN 1936-0851, plantea: “Los puntos de polímeros semiconductores fluorescentes (puntos P) han atraído un gran interés debido a sus características superiores como sondas fluorescentes, tales como alto brillo de fluorescencia, índices radiativos rápidos y excelente fotoestabilidad. Sin embargo, los puntos P actualmente disponibles generalmente exhiben amplios espectros de emisión, lo que limita significativamente su utilidad en muchas aplicaciones biológicas que involucran detecciones múltiples. Aquí, describimos el diseño y desarrollo de puntos P multicolores de emisión estrecha basados en diferentes unidades de dipirrometeno de boro (BODIPY). Se sintetizaron polímeros semiconductores que contienen BODIPY que emiten en múltiples longitudes de onda y se utilizaron como precursores para preparar los puntos P, donde la transferencia de energía entre partículas condujo a emisiones estrechas y muy brillantes. El ancho completo de emisión a la mitad del máximo de los puntos P resultantes varía de 40 a 55 nm, que es de 1,5 a 2 veces más estrecho que los puntos de polímeros semiconductores convencionales. Los puntos P de BODIPY 520 eran aproximadamente un orden de magnitud más brillantes que los puntos Q 525 comerciales en condiciones de excitación láser idénticas. Los experimentos de imágenes de fluorescencia y citometría de flujo indican que las emisiones estrechas de estos puntos P brillantes son prometedoras para detecciones biológicas múltiples.
LU-BO MENG y otros, "FRET-capable supramolecular polymers based on a BODIPY-bridged pillar[5]arene dimer with BODIPY guests for mimicking the light-harvesting system of natural photosynthesis", CHEMICAL COMMUNICATIONS, (20150205), vol. 51, núm. 22, doi:10.1039/C5CC00398A, ISSN 1359-7345 plantea: “se han construido con éxito los polímeros supramoleculares con capacidad de FRET de tipo AA/BB y tipo A2/B3 basados en un dímero de pilar con puente de BODIPY[5]areno y dos invitados derivados de BODIPY y se estudió su aplicación para imitar el sistema de captación de luz de la fotosíntesis natural” Zhu, y otros (Analytica Chimica Acta, 2012, vol. 758, páginas 138-144) describe colorantes poliméricos BODIPY altamente solubles en agua (por la presencia de restos de PEG), emisores en el infrarrojo cercano.
Resumen
Se proporcionan colorantes de BODIPY poliméricos que incluyen multicromóforos que comprenden unidades de BODIPY captadoras de luz como se define en las reivindicaciones. Los colorantes son colorantes poliméricos en tándem que incluyen un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY captadora de luz y un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en la proximidad receptora de energía con este. Los colorantes poliméricos en tándem pueden unirse covalentemente a un miembro de unión específica. También se proporcionan métodos para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra y se describen métodos para marcar una molécula diana mediante el uso de composiciones que incluyen los colorantes poliméricos en tándem. Adicionalmente se describen kits y sistemas para llevar a la práctica los métodos en cuestión.
Breve descripción de las figuras
Se entiende que los dibujos, descritos más abajo, son solo para fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.
La Figura 1 ilustra la absorción y emisión de colorantes poliméricos en tándem ilustrativos con una variedad de colorantes aceptores unidos en el sitio enlazador interno. No se adjunta ningún miembro de unión específica para estas estructuras.
La figura 2 ilustra la absorción y emisión de colorantes poliméricos en tándem ilustrativos con una variedad de moléculas de colorante unidas en el sitio enlazador interno. La absorción para todas las soluciones es de 0,04 OD. Tenga en cuenta que la intensidad de emisión es significativamente mayor para los polímeros con un cromóforo aceptor unido con relación al polímero solo. No se adjunta ningún miembro de unión específica a estos polímeros.
Definiciones
Antes de describir las modalidades ilustrativas con mayor detalle, se establecen las siguientes definiciones para ilustrar y definir el significado y el alcance de los términos usados en la descripción.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado como comúnmente se entiende por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton y otros, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED, John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale y Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan al experto el significado general de muchos de los términos usados en la presente descripción. Aun así, determinados términos se definen más abajo en aras de la claridad y la facilidad de la referencia.
Se observa que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera. Por ejemplo, el término "un cebador" se refiere a uno o más cebadores, es decir, un solo cebador y múltiples cebadores. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de tal terminología exclusiva como "únicamente", "solo", y similares en relación con la exposición de elementos de las reivindicaciones, o el uso de una limitación "negativa".
Como se usa en la presente descripción, el término "muestra" se refiere a un material o mezcla de materiales, en algunos casos en forma líquida, que contiene uno o más analitos de interés. En algunas modalidades, el término, tal como se usa en su sentido más amplio, se refiere a cualquier material vegetal, animal o bacteriano que contiene células o que produce metabolitos celulares, tales como, por ejemplo, tejido o fluido aislado de un individuo (que incluye, pero no se limita a, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, linfa, lágrimas, saliva y secciones de tejido) o de constituyentes de cultivos celulares in vitro, así como también muestras del medio ambiente. El término "muestra" también puede referirse a una "muestra biológica". Como se usa en la presente descripción, el término "una muestra biológica" se refiere a un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, fluidos corporales, que incluyen, pero no se limitan a, sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen). Una "muestra biológica" también puede referirse a un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de este, que incluyen, pero no se limitan a, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secciones externas de la piel, vías respiratorias, intestinales y genitourinarias, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores y órganos. En determinadas modalidades, la muestra se ha extraído de un animal o una planta. Las muestras biológicas pueden incluir células. El término "células" se usa en su sentido convencional para referirse a la unidad estructural básica de los organismos vivos, tanto eucariotas como procariotas, que tienen al menos un núcleo y una membrana celular. En determinadas modalidades, las células incluyen células procariotas, tales como las bacterias. En otras modalidades, las células incluyen células eucariotas, tales como células obtenidas de muestras biológicas de animales, plantas u hongos.
Como se usa en la presente descripción, los términos "afinidad" y "avidez" tienen el mismo significado y pueden usarse en la presente descripción de manera intercambiable. "Afinidad" se refiere a la fuerza de la unión, que se correlaciona con una mayor afinidad de unión con una Kd más baja.
Como se usa en la presente descripción, los términos "determinar", "medir" y "evaluar" y "ensayar" se usan indistintamente e incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas.
Como se usa en la presente descripción, los términos "unido al soporte" y "enlazado a un soporte" se usan indistintamente y se refieren a un resto (por ejemplo, un miembro de unión específica) que está enlazado de forma covalente o no covalente a un soporte de interés. El enlace covalente puede implicar la reacción química de dos grupos funcionales compatibles (por ejemplo, dos grupos funcionales quimioselectivos, un electrófilo y un nucleófilo, etc.) para formar un enlace covalente entre los dos restos de interés (por ejemplo, un soporte y un miembro de unión específica). En algunos casos, el enlace no covalente puede implicar la unión específica entre dos restos de interés (por ejemplo, dos restos de afinidad tales como un hapteno y un anticuerpo o un resto de biotina y una estreptavidina, etc.). En determinados casos, el enlace no covalente puede implicar la absorción a un sustrato.
Como se usa en la presente descripción, el término "biomolécula" se refiere a una molécula orgánica o macromolécula de una clase de moléculas de origen natural, o un derivado de estas. Biomolécula pretende abarcar polipéptidos (por ejemplo, un péptido, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo), polinucleótidos, carbohidratos (por ejemplo, azúcares) y lípidos. En algunos casos, la molécula es un miembro de unión específica (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).
Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" se refiere a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que incluyen péptidos que varían de 2-50 aminoácidos de longitud y polipéptidos que tienen más de 50 aminoácidos de longitud. Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción. El término "polipéptido" incluye polímeros de aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados o derivatizados química o bioquímicamente, y polipéptidos que tienen cadenas principales peptídicas modificadas en las que la cadena principal convencional se ha reemplazado por cadenas principales sintéticas o no naturales. Un polipéptido puede ser de cualquier longitud conveniente, por ejemplo, 2 o más aminoácidos, tales como 4 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 20 o más aminoácidos, 50 o más aminoácidos, 100 o más aminoácidos, 300 o más aminoácidos, tales como hasta 500 o 1000 o más aminoácidos. Los "péptidos" pueden ser 2 o más aminoácidos, tales como 4 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 20 o más aminoácidos, tales como hasta 50 aminoácidos. En algunas modalidades, los péptidos tienen una longitud de entre 5 y 30 aminoácidos.
Como se usa en la presente descripción, el término "aislado" se refiere a un resto de interés que está al menos un 60 % libre, al menos un 75 % libre, al menos un 90 % libre, al menos un 95 % libre, al menos un 98 % libre, e incluso al menos un 99 % libre de otros componentes con los que el resto se asocia antes de la purificación.
Una "pluralidad" contiene al menos 2 miembros. En determinados casos, una pluralidad puede tener 10 o más, tales como 100 o más, 1000 o más, 10000 o más, 100000 o más, 106 o más, 107 o más, 108 o más o 109 o más miembros.
Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
El término "separar", como se usa en la presente descripción, se refiere a la separación física de dos elementos (por ejemplo, por tamaño o afinidad, etc.) así como también a la degradación de un elemento y dejar el otro intacto.
Como se usa en la presente descripción, el término "unión específica" se refiere a la capacidad de un agente de captura (o un primer miembro de un par de unión específica) para unirse preferentemente a un analito particular (o un segundo miembro de un par de unión específica) que está presente, por ejemplo, en una mezcla homogénea de diferentes analitos. En algunos casos, una interacción de unión específica discriminará entre analitos deseables e indeseables en una muestra con una especificidad de 10 veces o más para un analito deseable sobre un analito indeseable, tales como 100 veces o más, o 1000 veces o más. En algunos casos, la afinidad entre un agente de captura y el analito cuando se unen específicamente en un complejo de agente de captura/analito es de al menos 10­ 8 M, al menos 10-9 M, tal como hasta 10-10 M.
Los métodos descritos en la presente descripción incluyen varias etapas. Cada etapa puede realizarse después de que haya transcurrido una cantidad de tiempo predeterminada entre las etapas, según se desee. Como tal, el tiempo entre la realización de cada etapa puede ser de 1 segundo o más, 10 segundos o más, 30 segundos o más, 60 segundos o más, 5 minutos o más, 10 minutos o más, 60 minutos o más y que incluyen 5 horas o más. En determinadas modalidades, cada etapa subsiguiente se realiza inmediatamente después de completar la etapa anterior. En otras modalidades, una etapa puede realizarse después de un tiempo de incubación o de espera después de completar la etapa anterior, por ejemplo, de unos minutos a un tiempo de espera de toda la noche.
Como se usa en la presente descripción, el término "enlazador" o "enlace" se refiere a un resto de enlace que conecta dos grupos y tiene una cadena principal de 100 átomos o menos de longitud. Un enlazador o enlace puede ser un enlace covalente que conecta dos grupos o una cadena de entre 1 y 100 átomos de longitud, por ejemplo una cadena de 1,2, 3, 4, 5, 6 , 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más átomos de carbono de longitud, donde el enlazador puede ser lineal, ramificado, cíclico o de un solo átomo. En algunos casos, el enlazador es un enlazador de ramificación que se refiere a un resto de enlace que conecta tres o más grupos. En determinados casos, uno, dos, tres, cuatro o cinco o más átomos de carbono de una cadena principal del enlazador pueden estar opcionalmente sustituidos con un heteroátomo de azufre, nitrógeno u oxígeno. Los enlaces entre los átomos de la cadena principal pueden ser saturados o insaturados y, en algunos casos, no hay más de uno, dos o tres enlaces insaturados en la cadena principal del enlazador. El enlazador puede incluir uno o más grupos sustituyentes, por ejemplo, con un grupo alquilo, arilo o alquenilo. Un enlazador puede incluir, sin limitaciones, polietilenglicol; éteres, tioéteres, aminas terciarias, alquilos, que pueden ser lineales o ramificados, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, 1 -metiletilo (iso-propilo), n-butilo, n-pentilo, 1,1-dimetiletilo (t-butilo) y similares. La cadena principal del enlazador puede incluir un grupo cíclico, por ejemplo, un grupo arilo, heterociclo o cicloalquilo, donde 2 o más átomos, por ejemplo, 2, 3 o 4 átomos, del grupo cíclico se incluyen en la cadena principal. Un enlazador puede ser escindible o no escindible.
Como se usa en la presente descripción, los términos "óxido de polietileno", "PEO", "polietilenglicol", "PEG" y "resto de PEG" se usan indistintamente y se refieren a un grupo polimérico que incluye una cadena descrita por la fórmula --(CH2—CH2—O—)n- o un derivado de esta. En algunas modalidades, "n" es 5000 o menos, tales como 1000 o menos, 500 o menos, 200 o menos, 100 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos, 15 o menos, tales como de 3 a 15, o de 10 a 15. Se entiende que el grupo polimérico de PEG puede tener cualquier longitud conveniente y puede incluir una variedad de grupos terminales y/o grupos sustituyentes adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, alquilo, arilo, hidroxilo, amino, acilo, aciloxi y amido terminal y/o grupos sustituyentes. Los grupos de PEG que pueden adaptarse para su uso en los multicromóforos en cuestión incluyen los PEG descritos por S. Zalipsky en "Functionalized poly(ethylene glycol) for preparation of biologically relevant conjugates", Bioconjugate Chemistry 1995, 6 (2), 150-165; y por Zhu y otros en "Water-Soluble Conjugated Polymers for Imaging, Diagnosis, and Therapy", Chem. Rev., 2012, 112 (8), pp 4687-4735.
Como se usa en la presente descripción, los términos "grupo funcional quimioselectivo", "marcador quimioselectivo" y "marcador de conjugación" se usan indistintamente y se refieren a un grupo funcional que puede reaccionar selectivamente con otro grupo funcional compatible para formar un enlace covalente, en algunos casos, después de la activación opcional de uno de los grupos funcionales. Los grupos funcionales quimioselectivos de interés incluyen, entre otros, tioles y maleimida o yodoacetamida, aminas y ácidos carboxílicos o ésteres activos de estos, así como también grupos que pueden reaccionar entre sí a través de la química de Click, por ejemplo, grupos azida y alquino (por ejemplo, grupos ciclooctino), así como también hidroxilo, hidrazido, hidrazino, aldehído, cetona, azido, alquino, fosfina, epóxido y similares. En algunos casos, el grupo funcional quimioselectivo es un grupo funcional protegido que debe desprotegerse antes del enlace covalente. En determinados casos, el grupo funcional quimioselectivo puede activarse antes o durante el enlace covalente con un grupo funcional compatible.
Como se usa en la presente descripción, el término "alquilo" por sí mismo o como parte de otro sustituyente se refiere a un radical de hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada saturado derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alcano original. Los grupos alquilo de interés incluyen, pero no se limitan a, metilo; etilo, propilos tales como propan-1-ilo o propan-2-ilo; y butilos, tales como butan-1-ilo, butan-2-ilo, 2-metil-propan-1-ilo o 2-metil-propan-2-ilo. En algunas modalidades, un grupo alquilo incluye de 1 a 20 átomos de carbono. En algunas modalidades, un grupo alquilo incluye de 1 a 10 átomos de carbono. En determinadas modalidades, un grupo alquilo incluye de 1 a 6 átomos de carbono, tales como de 1 a 4 átomos de carbono. Este término incluye, a modo de ejemplo, grupos hidrocarbilo lineales y ramificados tales como metilo (CH3-), etilo (CH3CH2-), n-propilo (CH3CH2CH2-), isopropilo ((CH3)2CH-), n-butilo (CH3CH2CH2CH2-), isobutilo ((CH3)2CHCH2-), sec-butilo ((CH3)(CH3CH2)CH-), t-butilo ((CH3)3C-), n-pentilo (CH3CH2CH2CH2CH2-) y neopentilo ((CH3)3CCH2-).
El término "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo como se define en la presente descripción en donde uno o más átomos de carbono en la cadena de alquilo se han reemplazado opcionalmente con un heteroátomo tales como -O-, -N-, -S-, -S(O)n-(donde n es de 0 a 2), -NR-(donde R es hidrógeno o alquilo) y que tiene de 1 a 5 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-arilo, -SO2-heteroarilo, y -NRaRb, en donde R y R pueden ser iguales o diferentes y se eligen entre hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo y heterocíclico.
“Alquinilo” se refiere a grupos hidrocarbilo monovalentes lineales o ramificados que tienen de 2 a 6 átomos de carbono y preferentemente de 2 a 3 átomos de carbono y que tienen al menos 1 y preferentemente de 1 a 2 sitios de insaturación de triple enlace. Los ejemplos de dichos grupos alquinilo incluyen acetilenilo (-CECH) y propargilo (-CH2CECH).
El término "alquinilo sustituido" se refiere a un grupo alquinilo como se define en la presente descripción que tiene de 1 a 5 sustituyentes, o de 1 a 3 sustituyentes, seleccionados de alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO2-alquilo, -SO2-alquilo sustituido, -SO2-arilo y -SO2-heteroarilo.
"Arilo" por sí mismo o como parte de otro sustituyente se refiere a un radical de hidrocarburo aromático monovalente derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillos aromáticos. Los grupos arilo de interés incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleyadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, trifenileno, trinaftaleno y similares. En determinadas modalidades, un grupo arilo incluye de 6 a 20 átomos de carbono. En determinadas modalidades, un grupo arilo incluye de 6 a 12 átomos de carbono. Los ejemplos de un grupo arilo son fenilo y naftilo.
"Heteroarilo" por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un radical heteroaromático monovalente derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de un sistema de anillo heteroaromático. Los grupos heteroarilo de interés incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de acridina, arsindol, carbazol, pcarbolina, cromano, cromeno, cinolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolizina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalazina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolizina, quinazolina, quinolina, quinolizina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, triazol, benzotriazol, tiofeno, triazol, xanteno, benzodioxol y similares. En determinadas modalidades, el grupo heteroarilo es un heteroarilo de 5-20 miembros. En determinadas modalidades, el grupo heteroarilo es un heteroarilo de 5-10 miembros. En determinadas modalidades, los grupos heteroarilo son los derivados de tiofeno, pirrol, benzotiofeno, benzofurano, indol, piridina, quinolina, imidazol, oxazol y pirazina.
El término "alcarilo" o "aralquilo" se refiere a los grupos -alquileno-arilo y alquileno-arilo sustituido donde alquileno, alquileno sustituido y arilo se definen en la presente descripción.
"Alcoxi" se refiere al grupo -O-alquilo, en donde alquilo es como se define en la presente descripción. Alcoxi incluye, a modo de ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, t-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi y similares. El término "alcoxi" también se refiere a los grupos alquenil-O-, cicloalquil-O-, cicloalquenil-O- y alquinil-O-, donde alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo y alquinilo son como se definen en la presente descripción.
El término "alcoxi sustituido" se refiere a los grupos alquil-O- sustituido, alquenil-O- sustituido, cicloalquil-O- sustituido, cicloalquenil-O- sustituido y alquinil-O- sustituido donde alquilo sustituido, alquenilo sustituido, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo sustituido y alquinilo sustituido son como se definen en la presente descripción.
"Alquileno" se refiere a grupos hidrocarbilo alifáticos divalentes que tienen preferentemente de 1 a 6 y con mayor preferencia de 1 a 3 átomos de carbono que son de cadena lineal o ramificada, y que se interrumpen opcionalmente con uno o más grupos que se seleccionan de -O-, -NR10-, -NR10C(O)-, -C(O)NR10- y similares. Este término incluye, a modo de ejemplo, metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), n-propileno (-CH2CH2CH2-), isopropileno (-CH2CH(CH3)-), (-C(CHa)2CH2CH2-), (-C(CH3)2CH2C(O)-), (-C(CH3)2CH2C(O)NH-), (-CH(CH3)CH2-) y similares. "Alquileno sustituido" se refiere a un grupo alquileno que tiene de 1 a 3 hidrógenos reemplazados con sustituyentes como se describe para los carbonos en la definición de "sustituido" más abajo.
"Sustituido" se refiere a un grupo en el que uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan independientemente con los mismos o diferentes sustituyentes. Los sustituyentes de interés incluyen, pero no se limitan a, alquilendioxi (tal como metilendioxi), -M, -R60, -O', =O, -OR60, -SR60, -S-, =S, -NR60R61, =NR60, -CF3, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)2O-, -S(O)2OH, -S(O)2R60, -OS(O)2O-, -OS(O)2R60, -P(O)(O-)2, -P(O)(OR60)(O‘), -OP(O)(OR60)(OR61), -C(O)R60, -C(S)R60, -C(O)OR60, -C(O)NR60R61, -C(O)O‘, -C(S)OR60, -NR62C(O)NR60R61, -NR62C(S)NR60R61, -NR62C(NR63)NR60R61 y -C(NR62)NR60R61 donde M es halógeno; R60, R61, R62 y R63 son independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloheteroalquilo, cicloheteroalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido, u opcionalmente R60 y R61 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo cicloheteroalquilo o cicloheteroalquilo sustituido; y R64 y R65 son independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloheteroalquilo, cicloheteroalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido, u opcionalmente R64 y R65 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo cicloheteroalquilo o cicloheteroalquilo sustituido. En determinadas modalidades, los sustituyentes incluyen -M, -R60, =O, -OR60, -SR60, -S-, =S, -NR60R61, =NR60, -CF3, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)2R60, -OS(O)2O- -OS(O)2R60, -P(O)(O‘)2 -P(O)(OR60)(O-), -OP(O) (OR60)(OR61), -C(O)R60, -C(S)R60, -C(O)OR60, -C(O)NR60R61,-C(O)O-, -NR62C(O)NR60R61. En determinadas modalidades, los sustituyentes incluyen -M, -R60, =O, -OR60, -SR60, -NR60R61, -CF3, -CN, -n O2,-S(O)2R60, -P(O)(OR60)(O-), -OP(O) (OR60)(OR61), -C(O)R60, -C(O)OR60, -C(O)NR60R61,-C(O)O‘. En determinadas modalidades, los sustituyentes incluyen -M, -R60, =O, -OR60, -SR60, -NR60R61, -CF3, -CN, -NO2,-S(O)2R60, -OP(O)(OR60)(OR61), -C (O)R60, -C(O)OR60,-C(O)O‘, donde R60, R61 y R62 son como se definen anteriormente. Por ejemplo, un grupo sustituido puede tener un sustituyente metilendioxi o uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan de un átomo de halógeno, un grupo alquilo (1-4C) y un grupo alcoxi (1-4C). Cuando el grupo que se sustituye es un grupo arilo o heteroarilo, el(los) sustituyente(s) (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) puede(n) denominarse "sustituyente(s) arilo".
Otras definiciones de términos pueden aparecer a lo largo de la especificación.
Descripción detallada
Como se resumió anteriormente, se proporcionan colorantes poliméricos en tándem. Los colorantes poliméricos en tándem incluyen un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY captadora de luz y un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con este, como se define en las reivindicaciones. Los colorantes poliméricos en tándem pueden unirse covalentemente a un miembro de unión específica. Se proporcionan, además, métodos para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra, y se describen adicionalmente métodos para marcar una molécula diana mediante el uso de composiciones que incluyen los colorantes poliméricos en tándem.
También se describen kits y sistemas para practicar los métodos en cuestión.
Antes de que se describan con mayor detalle las diversas modalidades, debe entenderse que las enseñanzas de esta descripción no se limitan a las modalidades particulares descritas y, como tales, pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción tiene el propósito de describir las modalidades particulares únicamente, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de las presentes enseñanzas se limitará únicamente mediante las reivindicaciones adjuntas.
Los encabezados de las secciones que se usan en la presente descripción son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como una limitación del tema descrito de ninguna manera.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Aunque cualquier método y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción también pueden usarse en la práctica o la prueba de las presentes enseñanzas, ahora se describen los métodos y los materiales ilustrativos.
Como será evidente para los expertos en la técnica al leer esta descripción, cada una de las modalidades individuales descritas e ilustradas en la presente descripción tiene componentes y características discretos que pueden separarse fácilmente de o combinarse con las características de cualquiera de las otras diversas modalidades.
Cualquier método expuesto puede llevarse a cabo en el orden de los eventos expuestos o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
Al describir adicionalmente la invención en cuestión, los colorantes poliméricos y los colorantes en tándem que incluyen un cromóforo aceptor se describen primero con mayor detalle. A continuación, se describen los conjugados que incluyen los colorantes poliméricos. Después, se revisan los métodos de interés en los que las composiciones que incluyen los colorantes poliméricos en tándem en cuestión encuentran uso. También se describen sistemas y kits que pueden usarse en la práctica de los métodos de la invención.
Multicromóforos que comprenden unidades de bodipy captadoras de luz
Como se resumió anteriormente, la presente descripción proporciona un colorante BODIPY polimérico. En algunas modalidades, el colorante polimérico incluye un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY captadora de luz. En algunas modalidades, el multicromóforo es en sí mismo fluorescente. En determinados casos, el multicromóforo es un colorante polimérico en tándem. Como tal, en algunas modalidades, el multicromóforo incluye además un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con este.
Como se usa en la presente descripción, los términos "multicromóforo captador de luz", "colorante polimérico" y "polímero conjugado" se usan indistintamente y se refieren a un polímero conjugado que tiene una estructura que puede captar luz con una longitud de onda de máxima absorción particular y convertirla en luz emitida a una longitud de onda más larga de máxima emisión. En algunos casos, el multicromóforo captador de luz es en sí mismo fluorescente. Los polímeros conjugados (CP) se caracterizan por una estructura electrónica deslocalizada y pueden tener una longitud de conjugación efectiva que es sustancialmente más corta que la longitud de la cadena del polímero, porque la cadena principal puede contener una gran cantidad de segmentos conjugados muy próximos. En algunos casos, los polímeros conjugados son eficientes para la captación de luz y proporcionan amplificación óptica a través de la transferencia de energía de Forster a un aceptor. En algunas modalidades, el polímero conjugado incluye una pluralidad de primeras unidades ópticamente activas que forman un sistema conjugado, que tiene una longitud de onda de absorción (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) en la que las primeras unidades ópticamente activas absorben luz para formar un estado excitado. En determinados casos, el colorante polimérico incluye un segmento polimérico conjugado o una estructura oligomérica que incluye n unidades repetitivas conjugadas que reducen la banda prohibida.
Como se usa en la presente descripción, el término "unidad" se refiere a una subunidad estructural de un polímero. El término unidad pretende incluir monómeros, comonómeros, cobloques, segmentos conjugados, unidades repetitivas y similares. Una "unidad repetitiva" es una subunidad de un polímero que se define por el número mínimo de características estructurales distintas que se requieren para que la unidad se considere monomérica, de modo que cuando la unidad se repite n veces, la estructura resultante describe el polímero o un bloque de este. En algunos casos, el polímero puede incluir dos o más unidades repetitivas diferentes, por ejemplo, cuando el polímero es un polímero multibloque, cada bloque puede definir una unidad repetitiva distinta. En algunos casos, una unidad repetitiva del polímero incluye un único grupo monomérico. En determinados casos, una unidad repetitiva del polímero incluye dos o más grupos monoméricos, es decir, grupos comonómeros, tales como dos, tres, cuatro o más grupos comonómeros. Como se usa en la presente descripción, el término "comonómero" o "grupo comonómero" se refiere a una unidad estructural de un polímero que puede formar parte de una unidad repetitiva del polímero. En algunas modalidades, el polímero conjugado incluye un copolímero de bloques que se compone de bloques de monómeros polimerizados. En tales casos, el copolímero de bloque puede describirse como que tiene distintas unidades repetitivas, cada una de las cuales corresponde a un cobloque distinto del polímero. En algunos casos, el polímero es un copolímero dibloque que contiene dos cobloques diferentes. En tales casos, el polímero puede describirse como que incluye cobloques, donde cada cobloque puede estar compuesto de comonómeros, tales como uno, dos, tres o más comonómeros.
Como se usa en la presente descripción, el término "unidad de BODIPY" se refiere a una subunidad estructural del multicromóforo que incluye un cromóforo que tiene la siguiente estructura central de dipirrometeno de boro (BODIPY):
Figure imgf000008_0001
donde cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, OH, H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquinilo y alquinilo sustituido. La estructura central de BODIPY se puede unir a unidades adyacentes del multicromóforo a través de cualquier posición conveniente de la estructura central y adicionalmente se puede sustituir de manera opcional. En algunos casos, la unidad de BODIPY puede n-conjugarse con unidades adyacentes del polímero. En algunas modalidades, la unidad de BODIPY define una unidad repetitiva. En determinadas modalidades, la unidad de BODIPY define un comonómero que forma parte de una unidad repetitiva. Cualquier estructura conveniente que contenga BODIPY puede adaptarse para su uso en los multicromóforos en cuestión como una unidad de BODIPY. Las estructuras de interés que contienen BODIPY incluyen, pero no se limitan a, los colorantes y derivados de BODIPY descritos por Loudet y Burgess en "BODIPY Dyes and Their Derivatives: Syntheses and Spectroscopic Properties", Chem. Rev. 2007, 107 (11): 4891-4932. En determinadas modalidades, la unidad de BODIPY se describe mediante la estructura:
Figure imgf000008_0002
donde:
cada uno de R1, R2, R3 y R4 se selecciona independientemente de H, un alquilo o un alquilo sustituido;
R5 es un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido, un heteroarilo, un heteroarilo sustituido, en donde R5 está opcionalmente sustituido con un grupo que se solubiliza en agua; y
cada R se selecciona del grupo que consiste en F, OH, H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquinilo y alquinilo sustituido.
Cualquier multicromóforo captador de luz conveniente puede adaptarse para incluir una unidad de BODIPY. Los multicromóforos captadores de luz de interés que pueden modificarse para incluir una unidad de BODIPY incluyen, pero no se limitan a, los colorantes descritos por Gaylord y otros en las publicaciones de Estados Unidos núms.
20040142344, 20080293164, 20080064042, 20100136702, 20110256549, 20120028828, 20120252986 y 20130190193 y las patentes de Estados Unidos núms. 8,575,303 y 8,802450; y Gaylord y otros, J. Am. Chem. Soc., 2001, 123 (26), pp 6417-6418; Feng y otros, Chem. Soc. Rev., 2010,39, 2411-2419; y Traina y otros, J. Am. Chem. Soc., 2011, 133 (32), pp 12600-12607.
El multicromóforo en cuestión puede ser soluble en agua. Cualquier grupo conveniente que se solubiliza en agua puede incluirse en el multicromóforo para proporcionar una mayor solubilidad en agua del colorante. Si bien el aumento de la solubilidad puede variar, en algunos casos el aumento (en comparación con el compuesto sin WSG(s)) es de 2 veces o más, por ejemplo, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces o más. El término "grupo que se solubiliza en agua" (w Sg ) se refiere a un grupo que se solvata bien en ambientes acuosos, por ejemplo, en condiciones fisiológicas, y que imparte una mejor solubilidad en agua a las moléculas a las que se une. En algunas modalidades, un WSG aumenta la solubilidad del multicromóforo en una solución predominantemente acuosa, en comparación con un multicromóforo que carece del WSG. Los grupos solubles en agua pueden ser cualquier grupo hidrofílico conveniente que se solvate bien en ambientes acuosos. En algunos casos, el grupo hidrofílico soluble en agua está cargado, por ejemplo, con carga positiva o negativa. En determinados casos, el grupo hidrofílico soluble en agua es un grupo hidrofílico neutro. En algunas modalidades, el WSG es un polímero hidrofílico, por ejemplo, un polietilenglicol, una celulosa, un quitosano o un derivado de este. Los grupos solubles en agua de interés incluyen, pero no se limitan a, carboxilato, fosfonato, fosfato, sulfonato, sulfato, sulfinato, sulfonio, éster, polietilenglicoles (PEG) y PEG modificados, hidroxilo, amina, amonio, guanidinio, piridinio, poliamina y sulfonio, polialcoholes, sacáridos de cadena lineal o cíclicos, aminas y poliaminas primarias, secundarias, terciarias o cuaternarias, grupos fosfonato, grupos fosfinato, grupos ascorbato, glicoles, que incluyen poliéteres, -COOM', -SO3M', -PO3M', -NR3+, Y', (CH2CH2O)pR y las mezclas de estos, donde Y' puede ser cualquier halógeno, sulfato, sulfonato u anión que contenga oxígeno, p puede ser de 1 a 500, cada R puede ser independientemente H o un alquilo (tal como metilo) y M' puede ser un contraión catiónico o hidrógeno, --(CH2CH2O)yyCH2CH2XRyy, --(CH2CH2O)yyCH2CH2X--, -X(CH2CH2O)yyCH2CH2--, glicol y polietilenglicol, en donde yy se selecciona de 1 a 1000, X se selecciona de O, S y NRZZ y RZZ y RYY se seleccionan independientemente de H y alquilo C1-3.
Pueden incluirse múltiples WSG en una sola ubicación en los multicromóforos en cuestión a través de un enlazador de ramificación. Puede utilizarse cualquier enlazador de ramificación conveniente para proporcionar enlace a múltiples WSG. Los enlazadores de ramificación de interés incluyen, pero no se limitan a, grupos amino terciarios (por ejemplo, donde N es un átomo de ramificación), residuos de aminoácidos, grupos arilo sustituidos, grupos heteroarilo sustituidos, grupos heterocíclicos sustituidos, dendrímeros y similares. En determinadas modalidades, el enlazador de ramificación es un sustituyente aralquilo, que además está disustituido con grupo(s) soluble(s) en agua. Como tal, en algunos casos, el grupo enlazador de ramificación es un sustituyente del multicromóforo que conecta el multicromóforo a dos o más grupos solubles en agua. En algunos casos, la incorporación de múltiples WSG a través de enlazadores de ramificación imparte una solubilidad conveniente en el multicromóforo. En algunas modalidades, el multicromóforo incluye sustituyente(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en un alquilo, un aralquilo y un grupo heterocíclico, cada grupo sustituido adicionalmente con un grupo que se solubiliza en agua. En determinados casos, el WSG es un grupo polimérico hidrofílico, tal como un polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, un PEG de 2 a 20 unidades).
El multicromóforo puede ser de cualquier longitud conveniente. En algunos casos, el número particular de unidades repetitivas monoméricas o segmentos del multicromóforo puede estar dentro del intervalo de 2 a 500000, tales como de 2 a 100000, de 2 a 30000, de 2 a 10000, de 2 a 3000 o de 2 a 1000 unidades o segmentos, o tal como de 5 a 100000, de 10 a 100000, de 100 a 100000, de 200 a 100000 o de 500 a 50000 unidades o segmentos. En algunos casos, el número particular de unidades repetitivas monoméricas o segmentos del multicromóforo puede estar dentro del intervalo de 2 a 1000, tales como de 2 a 500, de 2 a 100, de 3 a 100, de 4 a 100, de 5 a 100, de 6 a 100, de 7 a 100, de 8 a 100, de 9 a 100 o de 10 a 100 unidades o segmentos.
El multicromóforo puede tener cualquier peso molecular (MW) conveniente. En algunos casos, el MW del multicromóforo puede expresarse como un peso molecular promedio. En algunos casos, el colorante polimérico tiene un peso molecular promedio de 500 a 500000, tal como de 1000 a 100000, de 2000 a 100000, de 10000 a 100000 o incluso un peso molecular promedio de 50000 a 100000.
En algunas modalidades, la unidad de BODIPY constituye el 25 % o más por molaridad del multicromóforo, tal como el 30 % o más, el 40 % o más, el 45 % o más, el 50 % o más, el 60 % o más, el 70 % o más, o incluso más por molaridad del multicromóforo. En tales casos, el multicromóforo puede incluir 5 o más unidades repetitivas, tales como 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, 10000 o más, o incluso más unidades repetitivas. En tales casos, el multicromóforo puede incluir 5 o más unidades de comonómero, tales como 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, 10000 o más, o incluso más unidades de comonómero.
El multicromóforo en cuestión puede tener una o más propiedades espectroscópicas convenientes, tales como una longitud de onda de máxima absorción particular, una longitud de onda de máxima emisión particular, coeficiente de extinción, rendimiento cuántico, características espectrales de banda estrecha, bandas de absorción de baja energía y similares.
En determinadas modalidades, el multicromóforo tiene características espectrales de banda estrecha. Una característica espectral de banda estrecha se refiere a un espectro de absorbancia o emisión con un ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de 50 nm o menos con picos centrados en 500 nm o más. En algunas modalidades, el colorante tiene bandas de absorción de baja energía que tienen un ancho de banda de 200 nm o menos, tal como 150 nm o menos, 100 nm o menos, 90 nm o menos, 80 nm o menos, 70 nm o menos, 60 nm o menos, 50 nm o menos, 40 nm o menos, 30 nm o menos, 20 nm o menos, o incluso menos. En algunos casos, el ancho de banda se determina a través de una medición del ancho completo a la mitad del máximo (FWHM). En determinadas modalidades, el colorante tiene bandas de absorción de baja energía que tienen un ancho de banda de 50 nm o menos.
En algunas modalidades, el multicromóforo tiene una longitud de onda de máxima absorción en el intervalo de 300 a 900 nm, tal como de 350 a 850 nm, de 350 a 600 nm, de 360 a 500 nm, de 370 a 500 nm, de 380 a 500 nm, de 390 a 500 nm o de 400 a 500 nm, donde los ejemplos específicos de máxima absorción de interés incluyen, pero no se limitan a: 590 nm, 630 nm, 650 nm, 680 nm y 750 nm. En determinadas modalidades, el multicromóforo tiene una longitud de onda de máxima absorción de 590 nm ± 5 nm, 630 nm ± 5 nm, 650 nm ± 5 nm, 680 nm ± 5 nm o 750 nm ± 5 nm. En algunas modalidades, el multicromóforo tiene una longitud de onda de máxima emisión en el intervalo de 300 a 900 nm, tal como de 350 a 850 nm, de 350 a 600 nm, de 360 a 500 nm, de 370 a 500 nm, de 380 a 500 nm, de 390 a 500 nm o de 400 a 500 nm, donde los ejemplos específicos de máxima emisión de interés incluyen, pero no se limitan a: 605 nm, 650 nm, 680 nm, 700 nm y 805 nm. En determinadas modalidades, el multicromóforo tiene una longitud de onda de máxima emisión de 605 nm ± 5 nm, 650 nm ± 5 nm, 680 nm ± 5 nm, 700 nm ± 5 nm u 805 nm ± 5 nm.
En algunos casos, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción de 5 * 105 cm-1M-1 o más, tal como 6 x 105 cm-1M-1 o más, 7 * 105 cm-1M-1 o más, 8 * 105 cm-1M-1 o más, 9 * 105 cm-1M-1 o más, tal como 1 * 106 cm-1M-1 o más, 1,5 * 106 cm-1M-1 o más, 2 * 106 cm-1M-1 o más, 2,5 * 106 cm-1M-1 o más, 3 * 106 cm-1M-1 o más, 4 * 106 cm-1M-1 o más, 5 * 106 cm-1M-1 o más, 6 * 106 cm-1M-1 o más, 7 * 106 cm-1M-1 o más, u 8 * 106 cm-1M-1 o más. En tales casos, el multicromóforo puede tener 5 o más unidades repetitivas, tales como 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 0 incluso más unidades repetitivas. En algunas modalidades, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción molar de 5 * 105 M-1cm-1 o más. En determinadas modalidades, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción molar de 1 * 106 M-1cm-1 o más.
En algunos casos, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción de 40000 cm-1M-1 por comonómero o más, tales como 45 000 cm-1M-1 por comonómero o más, 50 000 cm-1M-1 por comonómero o más, 55 000 cm-1M-1 por comonómero o más, 60000 cm-1M-1 por comonómero o más, 70000 cm-1M-1 por comonómero o más, 80000 cm-1M-1 por comonómero o más, 90000 cm-1M-1 por comonómero o más, 100000 cm-1M-1 por comonómero o más, o incluso más. En algunos casos, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción de 40000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, tal como 45000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 50000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 55000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 60000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 70000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 80 000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 90000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 100000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 100,000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 120,000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, o incluso más. En algunos casos, el coeficiente de extinción descrito en la presente descripción es un coeficiente de extinción promedio. En determinados casos, la unidad repetida del multicromóforo puede incluir un solo monómero, dos comonómeros o tres o más comonómeros.
En determinadas modalidades, el multicromóforo tiene un rendimiento cuántico de 0,05 o más, tal como 0,1 o más, 0,15 o más, 0,2 o más, 0,25 o más, 0,3 o más, 0,35 o más, 0,4 o más, 0,45 o más, 0,5 o más, 0,6 o más, 0,7 o más, o incluso más. En determinados casos, el multicromóforo tiene un rendimiento cuántico de 0,1 o más. En determinados casos, el multicromóforo tiene un rendimiento cuántico de 0,3 o más.
Se entiende que en algunos casos los multicromóforos pueden incluir cobloques (por ejemplo, cobloques n y m). Los multicromóforos en cuestión pueden incluir cualquier disposición lineal conveniente de cobloques n y m de varias longitudes dentro de la estructura del polímero global. Además, los multicromóforos pueden incluir cualquier disposición conveniente de comonómeros dentro de dichos cobloques n y/o m. Puede usarse una variedad de métodos de síntesis de polímeros para preparar comonómeros y cobloques de interés en la preparación de los multicromóforos en cuestión. Se entiende que, en algunos casos, los métodos de polimerización pueden producir una composición que incluye una población de polímeros conjugados que incluye alguna variación con respecto a la longitud particular y/o grupos terminales (por ejemplo, grupos finales) presentes en cada CP de la población. Las fórmulas representadas en la presente descripción pueden referirse a un solo compuesto o a una población o subpoblación de compuestos poliméricos.
En algunas descripciones, el multicromóforo incluye un segmento conjugado que comprende BODIPY descrito por la fórmula (I):
Figure imgf000010_0001
en donde:
B es una unidad de BODIPY (por ejemplo, como se describe en la presente descripción);
M es un comonómero conjugado en n;
cada L es un grupo terminal; y
n es un número entero de 1 a 100 000. En determinados casos de la fórmula (I), cada L se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo terminal, un segmento conjugado en n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado.
Puede utilizarse cualquier comonómero conjugado en n conveniente en los multicromóforos en cuestión. Como se usa en la presente descripción, el término "comonómero conjugado en n" se refiere a cualquier subunidad de monómero conveniente de un polímero que sea capaz de conjugación en n (es decir, deslocalización de electrones pi a través de unidades adyacentes) a grupos adyacentes a lo largo de una cadena principal del polímero. En determinadas modalidades de la fórmula (I), M se selecciona de un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado, un comonómero de fluoreno, un comonómero de fenileno-vinileno, un comonómero de fenileno-etinileno, un comonómero de carbazol, un comonómero de alquino C2-C12, un comonómero de arileno-etinileno, un comonómero de heteroarileno-etinileno, un comonómero de arileno y un comonómero de heteroarileno. En determinadas modalidades de la fórmula (I), M es un comonómero de fenileno-vinileno. En algunos casos de la fórmula (I), M es un comonómero de fenileno-etinileno. En algunos casos de la fórmula (I), M es un comonómero de carbazol. En determinados casos de la fórmula (I), M es un comonómero de alquino C2-C12. En determinados casos de la fórmula (I), M es un comonómero de arileno-etinileno. En algunas modalidades de la fórmula (I), M es un comonómero de heteroarilenoetinileno. En algunos casos de la fórmula (I), M es un comonómero de arileno. En algunos casos de la fórmula (I), M es un comonómero de heteroarileno.
En algunas descripciones de la fórmula (I), M es un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado. Un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado es un comonómero que incluye un grupo aromático tricíclico que tiene tres anillos fusionados en la configuración 6-5-6, es decir, dos anillos benzo fusionados con un anillo central de 5 miembros. El anillo de 5 miembros puede ser un carbociclo o un heterociclo y además puede incluir un sustituyente de cadena lateral en el átomo del anillo que no está fusionado con un anillo benzo. En determinados casos, el comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000011_0001
donde:
Z es -C(R1)2-o -N(R1)-;
cada R es independientemente H o uno o más sustituyentes arilo; y
cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en un alquilo, un alquilo sustituido, un aralquilo, un aralquilo sustituido, un resto PEG y -L1-Z2, donde L1 es un enlazador y Z1 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, un marcador que incluye un grupo funcional quimioselectivo) o un WSG. Tal como se usa en cualquiera de las fórmulas descritas en la presente descripción, * indica un sitio para la unión covalente a la cadena principal insaturada de un polímero conjugado o un grupo terminal. En algunas modalidades, cuando Z es -N(R1)-, el comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado es un comonómero de carbazol. Puede usarse cualquier comonómero de carbazol conveniente en los multicromóforos en cuestión. En algunas modalidades, cuando Z es -C(R1)2-, el comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado es un comonómero de fluoreno. Cualquier comonómero de fluoreno conveniente puede usarse en los multicromóforos en cuestión. En algunas modalidades de la fórmula (I), M es un comonómero de carbazol. En determinados casos del comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado, cada R1 se selecciona de un grupo bencilo sustituido con uno, dos o más restos de PEG o un grupo alquilo sustituido con dos o más restos de PEG.
En algunas descripciones de la fórmula (I), M es un comonómero de fluoreno. Un comonómero de fluoreno es un grupo aromático que tiene una estructura del núcleo de 9H-fluoreno sustituida en la posición 9 con cualquier sustituyente de cadena lateral conveniente. En algunos casos, el comonómero de fluoreno es un fluoreno disustituido en 9,9. El comonómero de fluoreno puede conjugarse con grupos poliméricos adyacentes de la cadena principal a través de cualquier posición conveniente de la estructura del núcleo de fluoreno, tal como dos posiciones convenientes cualesquiera seleccionadas de las posiciones 1-8 (consulte el esquema de numeración más abajo). En algunas modalidades, la estructura del núcleo de fluoreno está enlazada a grupos adyacentes de la cadena principal polimérica a través de las posiciones 2 y 7 (consulte el esquema de numeración más abajo). En determinadas modalidades, el comonómero de fluoreno se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000011_0002
donde cada R1 se selecciona independientemente de un alquilo, un alquilo sustituido, un aralquilo, un aralquilo sustituido, un resto PEG y -L1-Z1, donde L1 es un enlazador y Z1 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, un marcador que incluye un grupo funcional quimioselectivo) o un WSG. En determinados casos del comonómero de fluoreno, cada R1 se selecciona de un grupo bencilo sustituido con uno, dos o más restos de PEG o un grupo alquilo sustituido con dos o más restos de PEG. En algunos casos, Z1 incluye un grupo funcional que encuentra uso en la unión covalente del multicromóforo a un cromóforo aceptor (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En determinados casos, Z1 incluye un grupo amino para unirse covalentemente al cromóforo aceptor. En determinados casos, Z1 incluye un grupo ácido carboxílico, o un derivado de este, para unirse covalentemente al cromóforo aceptor. En determinadas modalidades, L1 es un enlazador ramificado que enlaza con dos o más grupos Z1 (por ejemplo, WSG). En determinados casos, el comonómero de fluoreno se sustituye además con un sustituyente R5y/o R6 ubicado en una, dos o más posiciones seleccionadas entre las posiciones 1, 3, 4, 5, 6 y 8 , donde R5 y R6 se seleccionan independientemente de un grupo que se solubiliza en agua (WSG) y un sustituyente arilo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).
En algunos casos, el comonómero de fluoreno se describe mediante la estructura:
Figure imgf000012_0001
donde cada R2 es un alquilo sustituido con un grupo soluble en agua o un enlazador ramificado conectado a dos o más grupos solubles en agua (por ejemplo, un bencilo disustituido con PEG o un alquilo sustituido con PEG). En determinados casos del comonómero de fluoreno, cada R2 es un grupo bencilo sustituido con uno, dos o tres restos de PEG (por ejemplo, -O(CH2CH2O)nR' donde R' es H o un alquilo y n es 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16). En determinados casos del comonómero de fluoreno, cada R2 es un grupo bencilo sustituido con un grupo -O(CH2CH2O)nR' (por ejemplo, en la posición 2, 3 o 4), donde R' es H o un alquilo y n es 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16. En determinados casos del comonómero de fluoreno, cada R2 es un grupo bencilo sustituido con dos grupos -O(CH2CH2O)nR' (por ejemplo, en las posiciones 2,4, 3,4 o 3,5), donde cada R' es independientemente H o un alquilo y cada n es independientemente 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16. En determinados casos del comonómero de fluoreno, cada R2 es un grupo bencilo sustituido con tres grupos -O(CH2CH2O)nR' (por ejemplo, en las posiciones 2,4,6, 2,4,5 o 3,4,5), donde cada R' es independientemente H o un alquilo y cada n es independientemente 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16. En determinados casos del comonómero de fluoreno, cada R2 es un grupo alquilo inferior sustituido con un grupo de ramificación trivalente, cada uno sustituido con dos restos de PEG (por ejemplo, un grupo de ramificación trivalente -CO-NR"2 u -O(CH2R")2 donde cada R" es independientemente un resto PEG (por ejemplo, -O(CH2CH2O)nR' donde R' es H o un alquilo y n es 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16). En determinadas modalidades, el comonómero de fluoreno se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000012_0002
donde R3 es un alquilo sustituido con un grupo soluble en agua (por ejemplo, un alquilo sustituido con PEG), y R4 es L1-Z2 donde L1 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, para la conjugación a un cromóforo aceptor) o un cromóforo aceptor. Cualquier grupo funcional quimioselectivo conveniente puede incluirse en los multicromóforos en cuestión, que incluyen, pero no se limitan a, ácido carboxílico, éster activo (por ejemplo, NHS o éster de sulfo-NHS), amino, hidroxilo, tiol, maleimido, yodoacetilo, hidrazido, hidrazino, aldehído, cetona, azido, alquino, fosfino, epóxido y similares. En algunos casos, el marcador quimioselectivo se utiliza para unir covalentemente cualquier resto conveniente (por ejemplo, un cromóforo aceptor) al multicromóforo. En determinados casos, Z2 incluye un grupo amino para unirse covalentemente a un cromóforo aceptor. En determinados casos, Z2 incluye un grupo ácido carboxílico, o un derivado de este, para unirse covalentemente a un cromóforo aceptor. En determinados casos del comonómero de fluoreno, R3 es un grupo alquilo inferior sustituido con un grupo de ramificación trivalente, cada uno sustituido con dos restos de PEG (por ejemplo, un grupo de ramificación trivalente -CO-NR"2 u -O(CH2R")2 donde cada R" es un resto PEG (por ejemplo, -O(CH2CH2O)nR' donde R' es H o un alquilo y n es 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16).
En algunos casos, el comonómero de fluoreno se describe mediante la siguiente estructura:
R3 r4
Figure imgf000012_0003
*__ / \___/ >■__ *
R5 R6
en donde:
R3 es un sustituyente que comprende un grupo que se solubiliza en agua (por ejemplo, como se describe en la presente descripción);
R4 es L1-Z2 en donde L1 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, para la conjugación con un cromóforo aceptor) o un cromóforo aceptor; y
R5 y R6 se seleccionan independientemente de H, un grupo que se solubiliza en agua y un sustituyente arilo (por ejemplo, un alquilo, un alquilo sustituido, un alcoxi, un alcoxi sustituido, un halógeno o un nitro). En determinados casos del comonómero de fluoreno, R3 es un grupo alquilo inferior sustituido con un grupo de ramificación trivalente, cada uno sustituido con dos restos de PEG (por ejemplo, un grupo de ramificación trivalente -CO-NR"2 u -O(CH2R")2 donde cada R" es un resto PEG (por ejemplo, -O(CH2CH2O)nR' donde R' es H o un alquilo y n es 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16).
Puede utilizarse cualquier grupo terminal conveniente en los extremos de los multicromóforos en cuestión. Los grupos terminales de interés incluyen, pero no se limitan a, un grupo de protección terminal, un segmento conjugado en n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado. En algunas modalidades, un grupo de protección terminal es un grupo monovalente que se conjuga con la cadena principal del multicromóforo después de la polimerización. En determinados casos, el grupo de protección terminal es un arilo, un arilo sustituido, un heteroarilo, un heteroarilo sustituido, un alquilo o un alquilo sustituido. En algunas modalidades, el grupo de protección terminal se sustituye con un enlazador y/o un marcador de conjugación a la que se puede unir cualquier resto conveniente, tal como un miembro de unión específica. En determinados casos, el grupo terminal es un grupo derivado de un monómero usado en el método de polimerización, por ejemplo, un grupo tal como un halógeno (por ejemplo, Br), un ácido borónico o un éster borónico, que puede experimentar una conjugación adicional. En algunos casos, el grupo terminal es un segmento conjugado en n. Como se usa en la presente descripción, un segmento conjugado en n se refiere a cualquier segmento adicional conveniente de un polímero conjugado al que puede conjugarse el multicromóforo (es decir, que permite la deslocalización del electrón pi a través de unidades adyacentes). En determinadas modalidades, la unidad terminal es un enlazador, tal como un enlazador que incluye un grupo funcional adecuado para la conjugación con un resto de unión específica. Se entiende que los enlazadores y los marcadores de conjugación ubicados en los extremos del multicromóforo pueden seleccionarse de manera que sean ortogonales a cualquier otro enlazador y marcador quimioselectivo que pueden estar presentes en una cadena lateral del multicromóforo. Como se usa en la presente descripción, los términos marcador quimioselectivo y marcador de conjugación se pueden usar indistintamente y se refieren a cualquier grupo conveniente que incluya un grupo funcional de interés (por ejemplo, un grupo funcional quimioselectivo como se describe en la presente descripción). En determinadas modalidades, un grupo funcional amino o derivado de este se incluye en un grupo terminal (por ejemplo, G1 y/o G2) y un grupo funcional de ácido carboxílico o derivado de este se incluye en Z1. En determinadas modalidades, un grupo funcional de ácido carboxílico o derivado de este se incluye en un grupo terminal (por ejemplo, G1 y/o G2) y un grupo funcional amino o derivado de este se incluye en Z1.
Colorantes poliméricos en tándem
Como se resumió anteriormente, la presente descripción proporciona colorantes poliméricos en tándem que incluyen un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY captadora de luz. Cualquiera de los multicromóforos que comprenden una unidad de BODIPY captadora de luz descritos en la presente descripción puede utilizarse en los colorantes poliméricos en tándem en cuestión. En algunas modalidades, los colorantes poliméricos en tándem incluyen un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY captadora de luz y un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en la proximidad de recepción de energía con este. En algunas modalidades, el multicromóforo captador de luz es soluble en agua.
Los colorantes poliméricos en tándem incluyen dos restos unidos covalentemente: un multicromóforo donante captador de luz (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) y un cromóforo aceptor. Como se usa en la presente descripción, el término "cromóforo aceptor" se refiere a una molécula que absorbe luz que puede recibir o absorber energía transferida desde el multicromóforo. En algunos casos, el cromóforo aceptor puede emitir como luz la energía recibida del multicromóforo o disipar la energía como calor. Se entiende que, a menos que se estipule lo contrario, en las estructuras y fórmulas representadas en la presente descripción, el marcador "colorante" se refiere a un "cromóforo aceptor". En algunos casos, el cromóforo aceptor es un inactivador. Tal como se usa en la presente descripción, el término “inactivador” se refiere a un cromóforo aceptor que absorbe energía del multicromóforo y no emite luz sino que puede disipar la energía en forma de calor. En determinados casos, el cromóforo aceptor es un colorante fluorescente. En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem puede excitarse a la longitud de onda de máxima absorción del multicromóforo donante y puede emitir luz a la longitud de onda de emisión del cromóforo aceptor. En algunos casos, el multicromóforo captador de luz puede transferir energía a una especie de cromóforo aceptor en la proximidad receptora de energía. Los mecanismos para la transferencia de energía incluyen, por ejemplo, la transferencia de energía resonante (por ejemplo, transferencia de energía de resonancia de Forster (o fluorescencia), FRET), el intercambio de carga cuántica (transferencia de energía de Dexter) y similares. En algunos casos, estos mecanismos para la transferencia de energía tienen un alcance relativamente corto; es decir, la estrecha proximidad del sistema multicromóforo captador de luz al cromóforo aceptor proporciona una transferencia de energía eficiente. En algunos casos, en condiciones de transferencia de energía eficiente, la amplificación de la emisión del cromóforo aceptor se produce cuando el número de cromóforos individuales en el sistema multicromóforo captador de luz es grande; es decir, la emisión del cromóforo de señalización es más intensa cuando la luz incidente (la "luz de la bomba") tiene una longitud de onda que se absorbe por el multicromóforo captador de luz que cuando el cromóforo de señalización se excita directamente por la luz de la bomba.
En algunos casos, por transferencia de energía "eficiente" se entiende que el 5 % o más de la energía captada se transfiere al aceptor, tal como el 10 % o más, el 20 % o más, el 30 % o más, el 40 % o más, el 50 % o más, o incluso más. En algunos casos, cuando el cromóforo aceptor es un colorante fluorescente, el término transferencia de energía eficiente puede referirse a un rendimiento cuántico fluorescente de 0,05 o más, tal como 0,1 o más, 0,2 o más, 0,3 o más, 0,4 o más, 0,5 o más, o incluso mayor. Por "amplificación" se entiende que la señal del cromóforo aceptor es
1,5x o mayor cuando es excitado por el cromóforo captador de luz en comparación con la excitación directa con luz incidente de una intensidad equivalente, tal como 2,0x o más, 2,5x o más, 3x o más, 4x o más, 5x o más, 6x o más, o más, 8x o más, 10x o más, o incluso más. La señal puede medirse mediante el uso de cualquier método conveniente.
En algunos casos, la señal de 1,5x o mayor se refiere a una intensidad de la luz emitida. En determinados casos, la señal de 1,5x o mayor se refiere a una mayor relación señal/ruido. En determinadas modalidades del colorante polimérico en tándem, la emisión del cromóforo aceptor es 1,5 veces mayor o más cuando se excita por el multicromóforo en comparación con la excitación directa del cromóforo aceptor con la luz incidente.
En algunos casos, el colorante polimérico en tándem tiene un coeficiente de extinción de 5 * 105 cm-1M-1 o más, tales como 6 * 105 cm-1M-1 o más, 7 * 105 cm-1M-1 o más, 8 * 105 cm-1M-1 o más, 9 * 105 cm-1M-1 o más, tales como 1 * 106 cm-1M-1 o más, 1,5 * 106 cm-1M-1 o más, 2 * 106 cm-1M-1 o más, 2,5 * 106 cm-1M-1 o más, 3 * 106 cm-1M-1 o más, 4 *
106 cm-1M-1 o más, 5 * 106 cm-1M-1 o más, 6 * 106 cm-1M-1 o más, 7 * 106 cm-1M-1 o más, o 8 * 106 algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem tiene un coeficiente de extinción molar de 5 * 105 M-1cm-1 o más. En determinadas modalidades, el colorante polimérico en tándem tiene un coeficiente de extinción molar de 1 *
106 M-1cm-1 o más.
En determinadas modalidades, el colorante polimérico en tándem tiene un rendimiento cuántico de 0,05 o más, tal como 0,10 o más, 0,15 o más, 0,20 o más, 0,25 o más, 0,30 o más, 0,35 o más, tal como 0,40 o más, 0,45 o más, 0,5 o más o incluso más. En determinados casos, el colorante polimérico en tándem tiene un rendimiento cuántico de 0,1 o más. En determinados casos, el colorante polimérico en tándem tiene un rendimiento cuántico de 0,3 o más.
Cualquier colorante fluorescente conveniente puede utilizarse en los colorantes poliméricos en tándem en cuestión como un cromóforo aceptor. Los términos "colorante fluorescente" y "fluoróforo" se usan indistintamente en la presente descripción. En algunas modalidades, el cromóforo aceptor es un colorante de cianina, un colorante de xanteno, un colorante de cumarina, un colorante de tiazina o un colorante de acridina. Los colorantes fluorescentes de interés incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, 6-FAM, rodamina, rojo Texas, tetrametilrodamina, carboxirodamina, carboxirodamina 6G, carboxirodol, carboxirodamina 110, azul cascada, amarillo cascada, cumarina, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-Chrome, ficoeritrina, PerCP (proteína peridinina clorofila-a), PerCP-Cy5.5, JOE (6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína), NED, ROX (5-(y-6)-carboxi-X-rodamina), HEX, amarillo Lucifer, azul marino, verde Oregón
488, verde Oregón 500, verde Oregón 514, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa
Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa
Fluor 700, ácido 7-amino-4-metilcumarina-3-acético, BODIPY FL, BODIPY FL-Br.sub.2, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR, conjugados de estos y combinaciones de estos. Los quelatos de lantánidos de interés incluyen, pero no se limitan a, quelatos de europio, quelatos de terbio y quelatos de samario. En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem incluye un colorante polimérico unido a un fluoróforo aceptor seleccionado entre
Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Alexa488, Alexa 647 y Alexa700. En determinadas modalidades, el colorante polimérico en tándem incluye un colorante polimérico unido a un fluoróforo aceptor seleccionado de colorantes Dyomics (tales como DY 431, DY 485XL, DY 500XL, DY 530, DY 610, DY 633, DY 640, DY 651, DY 654, DY 682, DY 700, DY 701,
DY 704, DY 730, DY 731, DY 732, DY 734, DY 752, DY 754, DY 778, DY 782, DY 800 o DY 831), biotio CF 555, Cy
3,5 y dietilamino cumarina.
En determinadas modalidades del colorante polimérico en tándem, la relación de comonómeros que carecen de un cromóforo aceptor a comonómeros que incluyen un cromóforo aceptor unido está en el intervalo de 40:1 a 3:1, tal como en el intervalo de 20:1 a 3:1, 10:1 a 3:1, 9:1 a 3:1, 5:1 a 3:1 o 4:1 a 3:1, o en el intervalo de 20:1 a 4:1,20:1 a
5:1, 20:1 a 9:1 o 20:1 a 10:1.
Se describe y reivindica un colorante polimérico en tándem soluble en agua que comprende:
un multicromóforo que es un polímero conjugado que comprende unidades de BODIPY conjugadas en n; y
un cromóforo aceptor que está unido covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con este,
en donde el multicromóforo se describe mediante la fórmula (II):
Figure imgf000015_0001
en donde:
B1 y B2 son cada uno independientemente una unidad de BODIPY;
cada M1 y cada M2 son independientemente un comonómero en n que está conjugado en n con B1 o B2; a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 , 1 o 2 , en donde b+e > 1;
n es 0 o n y m son un número entero de 1 a 100000, en donde n+m > 1;
p es un número entero de 1 a 100000; y
cada L2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo terminal, un segmento conjugado en n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado.
en donde el colorante se describe mediante la fórmula (III):
Figure imgf000015_0002
o fórmula (VI)
Figure imgf000015_0003
en donde cada L1 es un enlazador opcional y cada C1 es un cromóforo aceptor,
o en donde el colorante se describe mediante la fórmula (IV):
Figure imgf000015_0004
o fórmula (V)
Figure imgf000016_0001
en donde cada L1 es un enlazador opcional y cada C1 es un cromóforo aceptor,
y en donde para las fórmulas (III), (IV), (V), (VI), B1, B2, M1, M2, n, m, p y cada L2 son como se definen para la fórmula (II).
Un multicromóforo no reivindicado puede comprender un segmento conjugado que comprende BODIPY descrito por la fórmula (I):
Figure imgf000016_0002
en donde:
B es una unidad de BODIPY;
M es un comonómero conjugado en n que está conjugado en n con B;
cada L se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un grupo terminal, un segmento conjugado en n conjugado a una unidad [B -M], un enlazador y un miembro de unión específica enlazado; y n es un número entero de 1 a 100000, en donde cada M es preferentemente un comonómero tricíclico fusionado 6-5-6, un comonómero de fluoreno, un comonómero de fenileno-vinileno, un comonómero de fenileno-etinileno, un comonómero de carbazol, un comonómero de alquino C2-C12, un comonómero de arileno-etinileno, un comonómero de heteroarileno-etinileno, un comonómero de arileno y un comonómero de heteroarileno.
La unidad de BODIPY se describe preferentemente por la estructura:
Figure imgf000016_0003
en donde:
cada uno de R1, R2, R3 y R4 se selecciona independientemente de H, un alquilo y un alquilo sustituido; R5 se selecciona del grupo que consiste en un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido, un heteroarilo, un heteroarilo sustituido, en donde R5 está opcionalmente sustituido con un grupo que se solubiliza en agua; y
cada R se selecciona del grupo que consiste en F, OH, H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquinilo y alquinilo sustituido.
Preferentemente, cuando b es 0, a y c son cada uno 1;
cuando e es 0 , d y f son cada uno 1;
cuando b es 1, a c > 1; y
cuando e es 1, d f >1.
El colorante tiene preferentemente una relación de cromóforos aceptores a unidades repetidas del multicromóforo en el intervalo de 1:40 a 1:4.
Preferentemente, B1 y B2 se describen de forma independiente mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000017_0001
Preferentemente, R6 es un arilo o un heteroarilo, opcionalmente sustituido con uno o más grupos que se solubilizan en agua.
Preferentemente, al menos un L2 se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000017_0002
en donde:
q es un número entero de 1-12; y
Z es un miembro de unión específica.
Preferentemente, L1 es un alquilo, un alquilo sustituido, un alquil-amido, un alquil-amido-alquilo o un resto PEG; y C1 se selecciona del grupo que consiste en un colorante de cianina, un colorante de xanteno, un colorante de cumarina, un colorante de tiazina y un colorante de acridina.
Cada M1 y M2 se seleccionan preferentemente independientemente de un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado, un comonómero de fluoreno, un comonómero de carbazol, un comonómero de vinileno, un comonómero de arilenoetinileno y un comonómero de arileno-vinileno, opcionalmente sustituido con un grupo que se solubiliza en agua. También se reivindica y describe un miembro de unión específica marcado, que comprende:
el colorante polimérico en tándem reivindicado como se ha mencionado anteriormente y un miembro de unión específica unido covalentemente al multicromóforo.
Además, se describe y reivindica un método para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra, el método comprende:
(a) poner en contacto la muestra con un conjugado de colorante polimérico en tándem que se une específicamente al analito diana para producir una muestra en contacto con una composición de marcaje, en donde el conjugado de colorante polimérico en tándem comprende:
(i) un colorante polimérico en tándem como se describió y reivindicó anteriormente y
(ii) un miembro de unión específica; y
(b) evaluar la muestra en contacto con una composición de mareaje para detectar la presencia de un complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico en tándem para evaluar si el analito diana está presente en la muestra.
En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la fórmula (VI):
Figure imgf000018_0001
donde B1, M1, M2, n, m, p y cada L2 es como se define para la fórmula (II) cada L1 es un enlazador opcional y cada C1 es un cromóforo aceptor. En determinadas modalidades de la fórmula (VI), cada M1 es un comonómero de carbazol y cada M2 es un comonómero de fluoreno, opcionalmente sustituido con un grupo que se solubiliza en agua. En algunos casos de la fórmula (VI), cada M1 y cada M2 son independientemente un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado, tal como un comonómero de fluoreno o un comonómero de carbazol, opcionalmente sustituido con un grupo que se solubiliza en agua. En determinados casos de la fórmula (VI), la relación de n a m está en el intervalo de 20:1 a 3:1, tal como en el intervalo de 10:1 a 3:1, 9:1 a 3:1, 5:1 a 3:1 o 4:1 a 3:1, o en el intervalo de 20:1 a 4:1, 20:1 a 5:1,20:1 a 9:1 o 20:1 a 10:1.
En algunas modalidades de las fórmulas (II) a (VI), B1 y B2 se describen cada uno de forma independiente mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000018_0002
donde R6 es un arilo, un heteroarilo o un enlazador, opcionalmente sustituido con uno o más grupos que se solubilizan en agua (WSG). En determinados casos, R6 es un enlazador ramificado que une la estructura de núcleo de BODIPY a dos o más WSG. En algunos casos, R6 es un resto arilo o heteroarilo que además está sustituido con uno, dos o más WSG, a través de enlazadores opcionales. En determinadas modalidades, R6 es un grupo fenilo sustituido con 1, 2, 3 o más sustituyentes poliméricos hidrofílicos (por ejemplo, un sustituyente PEG o PEG modificado). En determinados casos, R6 es un fenilo que está sustituido con uno, dos o tres restos de PEG (por ejemplo, -O(CH2CH2O)nR' donde R' es H o un alquilo y n es 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16). En determinados casos, R6 es un fenilo que está sustituido con un grupo -O(CH2CH2O)nR' (por ejemplo, en la posición 2, 3 o 4), donde R' es H o un alquilo y n es 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16. En determinados casos, R6 es un fenilo que está sustituido con dos grupos -O(CH2CH2O)nR' (por ejemplo, en las posiciones 2,4, 3,4 o 3,5), donde cada R' es independientemente H o un alquilo y cada n es independientemente 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16. En determinados casos, R6 es un fenilo que está sustituido con tres grupos -O(CH2CH2O)nR' (por ejemplo, en las posiciones 2,4,6, 2,4,5 o 3,4,5), donde cada R' es independientemente H o un alquilo y cada n es independientemente 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16.
En algunos casos de las fórmulas (II) a (VI), B1 y B2 se describen de forma independiente mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000019_0001
donde cada R' se selecciona independientemente de H y un alquilo; y p es 0 o un número entero de 1-20, tal como 1, 2 , 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11 o 12. En determinados casos, cada R' es metilo. En algunos casos, cada p es 3.
En algunas modalidades de las fórmulas (II) a (VI), al menos un grupo L2 es -L3-Z donde L3 es un enlazador y Z es un miembro de unión específica (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunas modalidades de las fórmulas (II) a (VI), al menos un L2 es -L3-Z donde L3 es un enlazador (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) y Z es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunos casos, Z se selecciona de ácido carboxílico, éster activo (por ejemplo, éster de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) o sulfo-NHS), amino, maleimida, yodoacetilo y tiol. En determinadas modalidades de la fórmula (II) a (VI), al menos un grupo L2 se describe mediante la siguiente estructura:
*-Ar-L-Z
donde Ar es un grupo arilo o heteroarilo conjugado en n, L es un enlazador y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica. En determinadas modalidades de la fórmula (II) a (VI), al menos un grupo L2 se describe mediante una de las siguientes estructuras:
Figure imgf000019_0002
donde q es 0 o un número entero de 1-12; L es un enlazador opcional; y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica. En determinadas modalidades de la fórmula (II) a (VI), al menos un grupo L2 se describe mediante la estructura:
Figure imgf000019_0003
donde q es 0 o un número entero de 1-12; L es un enlazador opcional; y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica. En determinados casos, -NH-L-Z incluye un enlace amida con el marcador quimioselectivo o el miembro de unión específica. En determinadas modalidades, Z es un miembro de unión específica que es una biomolécula. En determinados casos, Z es un anticuerpo. En algunos casos, Z es un fragmento de anticuerpo o un derivado de unión de este. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo o el derivado de unión de este se selecciona de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un diacuerpo y un triacuerpo.
En algunas modalidades de las fórmulas (II) a (VI), C1 se selecciona de un colorante de cianina, un colorante de xanteno, un colorante de cumarina, un colorante de tiazina y un colorante de acridina. En determinados casos, el enlazador se selecciona de un alquilo, un alquilo sustituido, un alquil-amido, un alquil-amido-alquilo y un resto PEG. En determinadas modalidades de las fórmulas (II) a (VI), el cromóforo aceptor C1 se selecciona de DY 431, DY 485XL, DY 500XL, DY 610, DY 640, DY 654, DY 682, DY 700, DY 701, DY 704, DY 730, DY 731, DY 732, DY 734, DY 752, DY 778, DY 782, DY 800, DY 831, Biotio CF 555, Cy3.5 y dietilamino cumarina. En determinados casos de las fórmulas (II) a (VI), el cromóforo aceptor se selecciona de Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Alexa488, Alexa 647 y Alexa700. En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la fórmula (VII):
Figure imgf000020_0001
donde:
cada q y r es independientemente un número entero de 1 a 20 ;
cada R1 es independientemente hidrógeno o un alquilo (por ejemplo, metilo);
cada R1 es independientemente un alquilo, un arilo, un heteroarilo o un enlazador, opcionalmente sustituido con uno, dos o más grupos que se solubilizan en agua (WSG) (por ejemplo, un bencilo disustituido con PEG o un alquilo sustituido con PEG);
el colorante es un cromóforo aceptor;
n, m, p y L2 son como se definen para la fórmula (II); y
L es un enlazador y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica. En determinados casos para la fórmula (VII), L es -O-(CH2)n-NH-, donde n es 2-12, tal como n es 4. En determinados casos, cada R1 se describe mediante la estructura:
Figure imgf000020_0002
donde cada q es independientemente un número entero de 2-20, y cada R’ es independientemente hidrógeno, un alquilo o un alquilo sustituido. En determinados casos, cada R1 es metilo. En algunos casos, cada q es 2. En determinados casos, cada q es 3. En determinados casos, cada q es 4. En determinados casos, cada q es 5. En determinados casos, cada q es 6. En determinados casos, cada q es 7. En determinados casos, cada q es 8. En determinados casos, cada q es 9. En determinados casos, cada q es 10. En determinados casos, cada q es 11. En determinados casos, L2 es un grupo terminal.
En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la fórmula (VIII):
Figure imgf000021_0001
donde:
cada q
Figure imgf000021_0002
cada R' es independientemente hidrógeno, un alquilo o un alquilo sustituido;
n, m, p y L2 son como se definen para la fórmula (II);
cada R1 es independientemente un alquilo, un arilo, un heteroarilo o un enlazador, opcionalmente sustituido con uno, dos o más grupos que se solubilizan en agua (WSG) (por ejemplo, un bencilo disustituido con PEG o un alquilo sustituido con PEG);
el colorante es un cromóforo aceptor;
L es un enlazador y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica. En determinados casos, cada R' es metilo. En determinados casos de la fórmula (VIII), L-Z es -O-(CH2)n-NH2, donde n es 2-12 (por ejemplo, n es 2, 3 o 4). En determinados casos de la fórmula (VIII), L es -O-(CH2)n-NH-, donde n es 2-12, tal como n es 4, y Z es un miembro de unión específica (por ejemplo, una biomolécula). En determinados casos de la fórmula (VIII), L-Z es -(CH2)n-NH2, donde n es 2-12 (por ejemplo, n es 2, 3 o 4). En determinados casos de la fórmula (VIII), L es -(CH2)n-NH- y Z es un miembro de unión específica (por ejemplo, una biomolécula), donde n es 2-12 (por ejemplo, n es 2, 3 o 4). Se entiende que el grupo Colorante de fórmula (VIII) que está unido al comonómero de fluoreno a través de un enlace -CONH-Colorante puede unirse alternativamente a través de una conexión -NHCO-Colorante. En dicha representación alternativa de la fórmula (VIII), L puede ser -(CH2)n-CO-, donde n es 2-12 (por ejemplo, n es 2, 3 o 4). En determinados casos, cada R1 se describe mediante la estructura:
Figure imgf000021_0003
donde cada q es independientemente un número entero de 2-20, y cada R' es independientemente hidrógeno, un alquilo o un alquilo sustituido. En determinados casos, cada R' es metilo. En algunos casos, cada q es 2. En determinados casos, cada q es 3. En determinados casos, cada q es 4. En determinados casos, cada q es 5. En determinados casos, cada q es 6. En determinados casos, cada q es 7. En determinados casos, cada q es 8. En determinados casos, cada q es 9. En determinados casos, cada q es 10. En determinados casos, cada q es 11. En determinados casos, L2 es un grupo terminal.
En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la fórmula (IX):
Figure imgf000022_0001
donde:
cada q es independientemente un número entero de 1-20 ;
cada R' es independientemente hidrógeno, un alquilo o un alquilo sustituido;
cada R1 es independientemente un alquilo, un arilo, un heteroarilo o un enlazador, opcionalmente sustituido con uno, dos o más grupos que se solubilizan en agua (WSG) (por ejemplo, un bencilo disustituido con PEG o un alquilo sustituido con PEG);
el colorante es un cromóforo aceptor;
n, m, p y L2 son como se definen en la fórmula (II);
L es un enlazador y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica. En determinados casos, cada R' es metilo. En determinados casos para la fórmula (IX), L es -O-(CH2)n-NH-, donde n es 2-12, tal como n es 4. En determinados casos, cada R1 se describe mediante la estructura:
Figure imgf000022_0002
donde cada q es independientemente un número entero de 2-20, y cada R' es independientemente hidrógeno, un alquilo o un alquilo sustituido. En determinados casos, cada R' es metilo. En algunos casos, cada q es 2. En determinados casos, cada q es 3. En determinados casos, cada q es 4. En determinados casos, cada q es 5. En determinados casos, cada q es 6. En determinados casos, cada q es 7. En determinados casos, cada q es 8. En determinados casos, cada q es 9. En determinados casos, cada q es 10. En determinados casos, cada q es 11. En determinados casos, L2 es un grupo terminal.
En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la fórmula (X):
Figure imgf000023_0001
donde:
cada PEGn es independientemente un PEG o un PEG modificado de 1 a 20 unidades;
cada R1 es independientemente un alquilo, un arilo, un heteroarilo o un enlazador, opcionalmente sustituido con uno, dos o más grupos que se solubilizan en agua (WSG) (por ejemplo, un bencilo disustituido con PEG o un alquilo sustituido con PEG);
el colorante es un cromóforo aceptor;
n, m, p y L2 son como se definen en la fórmula (II);
cada L es un enlazador y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica. En determinados casos de la fórmula (X), L es -O-(CH2)n-NH-, donde n es 2-12, tal como n es 4. En determinados casos de la fórmula (X), R1 es un alquilo. En determinadas modalidades de la fórmula (X), la relación de n a m está en el intervalo de 20:1 a 3:1, tal como 15:1 a 4:1, 10:1 a 4:1 o 9:1 a 5:1.
En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la fórmula (XI):
Figure imgf000023_0002
donde:
cada q es independientemente un número entero de 1-20 ;
cada R1 es independientemente hidrógeno, un alquilo o un alquilo sustituido;
el colorante es un cromóforo aceptor;
n, m, p y L2 son como se definen en la fórmula (II);
cada L es un enlazador y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica. En determinados casos de la fórmula (XI), L es -O-(CH2)n-NH-, donde n es 2-12, tal como n es 4. En determinados casos de la fórmula (XI), L es -(CH2)n-CONH-, donde n es 1-12, tal como n es 1.
En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la fórmula (XII):
Figure imgf000024_0001
donde:
cada q es independientemente un número entero de 1-20;
cada R1 es independientemente hidrógeno, un alquilo o un alquilo sustituido;
el colorante es un cromóforo aceptor;
n, m, p y L2 son como se definen en la fórmula (II);
cada L es un enlazador y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica. En determinados casos de la fórmula (XII), L es -O-(CH2)n-NH-, donde n es 2-12, tal como n es 4. En determinados casos de la fórmula (XII), L es -(CH2)n-CONH-, donde n es 1-12, tal como n es 1.
En determinados casos del comonómero de fluoreno de cualquiera de las fórmulas (II)-(XN), cada grupo de cadena lateral R1 o R2 es un grupo bencilo sustituido con uno, dos o tres restos de PEG (por ejemplo, -O(CH2CH2O)nR’ donde R1 es H o un alquilo y n es 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16). En determinados casos del comonómero de fluoreno de cualquiera de las fórmulas (II)-(XN), cada grupo de cadena lateral R1 o R2 es un grupo bencilo sustituido con un grupo -O(CH2CH2O)nR’ (por ejemplo, en la posición 2, 3 o 4), donde R1 es H o un alquilo y n es 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16. En determinados casos del comonómero de fluoreno de cualquiera de las fórmulas (II)-(XN), cada grupo de cadena lateral R1 o R2 es un grupo bencilo sustituido con dos grupos -O(CH2CH2O)nR’ (por ejemplo, en las posiciones 2,4, 3,4 o 3,5), donde cada R1 es independientemente H o un alquilo y cada n es independientemente 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16. En determinados casos del comonómero de fluoreno de cualquiera de las fórmulas (II)-(XN), cada grupo de cadena lateral R1 o R2 es un grupo bencilo sustituido con tres grupos -O(CH2CH2O)nR’ (por ejemplo, en las posiciones 2,4,6, 2,4,5 o 3,4,5), donde cada R1 es independientemente H o un alquilo y cada n es independientemente 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16. En determinados casos del comonómero de fluoreno de cualquiera de las fórmulas (ÍI)-(XII), cada grupo de cadena lateral R1 o R2 es un grupo alquilo inferior sustituido con un grupo de ramificación trivalente, cada uno sustituido con dos restos de PEG (por ejemplo, un grupo de ramificación trivalente -CO-NRM2 u -O(CH2R")2 donde cada R" es independientemente un resto PEG (por ejemplo, -O(CH2CH2O)nR’ donde R1 es H o un alquilo y n es 1-20, por ejemplo, 3-16 tal como n es 8-16). Se entiende que el colorante polimérico en tándem de cualquiera de las fórmulas (I) a (XII) puede representarse alternativamente mediante una fórmula que indica cuáles son los valores de % en mol para cada comonómero en el polímero. Por ejemplo, en algunos casos, cualquiera de las fórmulas (II) a (XII) puede representarse mediante una de las siguientes fórmulas:
L2-(B1)x(M1)y(M2-L1-C1)z-L2
L2-(B1)x(M2)y(B2-L1-C1)z-L2
L2-(B1)x(M2)y(M2-L1-C1)z-L2
L2-(B1)x(M2)y(M1-L1-C1)z-L2
donde x, y y z son los valores de % en mol de los comonómeros en el polímero conjugado. En algunos casos de las fórmulas, x es 1 % en mol o más, tal como 2 % en mol o más, 3 % en mol o más, 4 % en mol o más, 5 % en mol o más, 10 % en mol o más, 15 % en mol o más, 20 % en mol o más, 25 % en mol o más, 30 % en mol o más, 35 % en mol o más, 40 % en mol o más, 45 % en mol o más, 50 % en mol o más, o incluso más. En determinados casos de las fórmulas, x varía de 1 % en mol a 50 % en mol, tal como de 5 % en mol a 25 % en mol o de 10 % en mol a 25 % en mol; o tal como de 5 % en mol a 25 % en mol o de 10 % en mol a 25 % en mol; o tal como de 1 % en mol a 25 % en mol, de 1 % en mol a 10 % en mol, o de 1 % en mol a 5 % en mol. En algunos casos de las fórmulas, z es 10 % en mol o más, tal como 15 % en mol o más, 20 % en mol o más, 25 % en mol o más, 30 % en mol o más, 35 % en mol o más, 40 % en mol o más, 45 % en mol o más, 50 % en mol o más, o incluso más. En algunos casos de las fórmulas, z es 25 % en mol o menos, tal como 20 % en mol o menos, 15 % en mol o menos, 10 % en mol o menos, 8 % en mol o menos, 6 % en mol o menos, 5 % en mol o menos, 2 % en mol o menos, 1 % en mol o menos, o incluso menos. En algunos casos de las fórmulas, y es 1 % en mol o más, tal como 5 % en mol o más, 10 % en mol o más, 15 % en mol o más, 20 % en mol o más, o 25 % en mol o más. En algunos casos de las fórmulas, y es 25 % en mol o menos, tal como 20 % en mol o menos, 15 % en mol o menos, 10 % en mol o menos, 8 % en mol o menos, 6 % en mol o menos, 5 % en mol o menos, 2 % en mol o menos, 1 % en mol o menos, o incluso menos.
Se entiende que para cualquiera de las estructuras y las fórmulas representadas en la presente descripción, en algunos casos de los colorantes poliméricos en tándem en cuestión, los grupos finales o terminales representados pueden estar ubicados en los extremos opuestos a los que se muestran, por ejemplo, los grupos finales pueden estar intercambiados. En algunas modalidades de los multicromóforos descritos en la presente descripción (por ejemplo, fórmulas (I)-(XII), al menos un grupo terminal (por ejemplo, L, L2 , G1, G2, L-Z) se selecciona de una de las siguientes estructuras 1-33:
Figure imgf000026_0001

Figure imgf000027_0001

Figure imgf000028_0001
*=sitio de unión covalente a la cadena principal insaturada;
en donde R' es independientemente H, halógeno, alquilo C1-C12, (alquilo Ci -C i2 )NH2, alqueno C2-C12, alquino C2-C12, cicloalquilo C3-C12, haloalquilo C1-C12, (hetero)arilo C2-C18, (hetero)arilamino C2-C18, -[CH2-CH2] r-Z1 o alcoxi(C1-C12)-X1; y en donde Z1 es -OH o -COOH; X1 es -NH2, -NHCOOH, -NHCOOC(CH3)3, -NHCO(cicloalquilo(C3-C12)alquilo(C1-C4)-N-maleimida; o -NHCO[CH2-CH2-O]s (CH2)s NH2; r' es un número entero de 1 a 20; y cada s' es independientemente un número entero de 1 a 20, (CH2)3(OCH2CH2)x"OCH3 donde x" es independientemente un número entero de 0 a 50, o un bencilo opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, hidroxilo, alcoxi C1-C12, o (OCH2CH2VCH3 donde cada y" es independientemente un número entero de 0 a 50 y R' es diferente de R; en donde k es 2 , 4, 8 , 12 o 24; en donde R15 se selecciona de los grupos I-u que tienen la estructura:
*— OH
m
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
*=sitio de unión covalente a la cadena principal.
En algunas modalidades de los multicromóforos descritos en la presente descripción (por ejemplo, fórmulas (I)-(XII), al menos un grupo terminal (por ejemplo, L, L2, G1, G2, L-Z) se selecciona de una de las siguientes estructuras:
Figure imgf000031_0001
donde r es 0 o un número entero de 1-50 (por ejemplo, 1-20); k es 0 o un número entero de 1 a 50 (por ejemplo, 1 a 20); R1 es como se define para cualquiera de los comonómeros de fluoreno descritos en la presente descripción; y R16 se selecciona de H, OH, NH2, -NH(CH2)r-N H y - NH(CH2)rCOOH.
Miembros de unión específica marcados
Los aspectos de la presente descripción incluyen miembros de unión específica marcados. Un miembro de unión específica marcado es un conjugado de un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY en cuestión (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) y un miembro de unión específica. El multicromóforo puede ser un colorante polimérico. El multicromóforo puede ser un colorante polimérico en tándem. El miembro de unión específica y el multicromóforo pueden conjugarse (por ejemplo, unirse covalentemente) entre sí a través de cualquier ubicación conveniente del multicromóforo, a través de un enlazador opcional.
Como se usa en la presente descripción, el término "miembro de unión específica" se refiere a un miembro de un par de moléculas que tienen especificidad de unión entre sí. Un miembro del par de moléculas puede tener un área en su superficie, o una cavidad, que se une específicamente a un área en la superficie de, o una cavidad en el otro miembro del par de moléculas. Así, los miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente entre sí para producir un complejo de unión. En algunas modalidades, la afinidad entre miembros de unión específica en un complejo de unión se caracteriza por una Kd (constante de disociación) de 10-6M o menos, tales como 10-7M o menos, que incluyen 10-8 M o menos, por ejemplo, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, que incluye 10-15 M o menos. En algunas modalidades, los miembros de unión específica se unen específicamente con gran avidez. Por alta avidez se entiende que el miembro de unión se une específicamente con una afinidad aparente caracterizada por una Kd aparente de 10 * 10-9 M o menos, tal como 1 * 10-9 M o menos, 3 * 10-10 M o menos, 1 * 10-10 M o menos, 3 * 10-11 M o menos, 1 * 10-11 M o menos, 3 * 10-12 M o menos o 1 * 10-12 M o menos.
Como se usa en la presente descripción, el término "proteico" se refiere a un resto (por ejemplo, un miembro de unión específica) que está compuesto por residuos de aminoácidos. Un resto proteico puede ser un polipéptido. En algunas modalidades, el miembro de unión específica es proteico. En determinados casos, el miembro de unión específica proteico es un anticuerpo. En determinadas modalidades, el miembro de unión específica proteico es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de unión de un anticuerpo que se une específicamente a un colorante polimérico. Como se usa en la presente descripción, los términos "anticuerpo" y "molécula de anticuerpo" se usan indistintamente y se refieren a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por todos o parte de los genes de inmunoglobulina reconocidos. Los genes de inmunoglobulina reconocidos, por ejemplo, en humanos, incluyen los loci genéticos kappa (k), lambda (I) y de cadena pesada, que juntos comprenden la miríada de genes de la región variable y los genes de la región constante mu (u), delta (d), gamma (g), sigma (e) y alfa (a) que codifican los isotipos IgM, IgD, IgG, IgE e IgA respectivamente. Una región variable de la cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina consiste en una región "marco" (FR) interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de complementariedad" o "c Dr ". La extensión de la región marco y las CDR se han definido con precisión (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat y otros, U.S. Department of Health and Human Services, (1991)). La numeración de todas las secuencias de aminoácidos de anticuerpos discutidas en la presente descripción se ajusta al sistema de Kabat. Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligera y pesada constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR. Las CDR son las principales responsables de la unión a un epítopo de un antígeno.
El término anticuerpo pretende incluir anticuerpos de longitud completa y puede hacer referencia a un anticuerpo natural de cualquier organismo, un anticuerpo modificado genéticamente o un anticuerpo generado de forma recombinante para fines experimentales, terapéuticos u otros, como se define más adelante. Los fragmentos de anticuerpos de interés incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a antígenos, ya sea producidos por la modificación de anticuerpos completos o aquellos sintetizados de novo mediante el uso de tecnologías de ADN recombinante. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden tener otras actividades específicas sobre las células (por ejemplo, anticuerpos antagonistas, agonistas, neutralizantes, inhibidores o estimuladores). Se entiende que los anticuerpos pueden tener sustituciones de aminoácidos conservadoras adicionales que sustancialmente no tienen efecto sobre la unión al antígeno u otras funciones del anticuerpo.
En determinadas modalidades, el miembro de unión específica es un anticuerpo. En determinadas modalidades, el miembro de unión específica es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un diacuerpo o un triacuerpo. En algunos casos, el miembro de unión específica es un anticuerpo murino o un fragmento de unión de este. En determinados casos, el miembro de unión específica es un anticuerpo recombinante o un fragmento de unión de este.
En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado incluye: un colorante polimérico en tándem que incluye: un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY captadora de luz; un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con este, como se reivindica; y un miembro de unión específica unido covalentemente al multicromóforo. En determinados casos del miembro de unión específica marcado, el multicromóforo captador de luz es soluble en agua. En algunos casos del miembro de unión específica marcado, el colorante tiene características espectrales de banda estrecha. En algunos casos del miembro de unión específica marcado, el colorante tiene bandas de absorción de baja energía que tienen un ancho de banda de 100 nm o menos, tal como 50 nm o menos. En determinados casos del miembro de unión específica marcado, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción molar de 5 x 105 M-1cm-1 o más (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En determinados casos del miembro de unión específica marcado, el multicromóforo tiene un rendimiento cuántico de 0,05 o más (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado incluye además un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con este, por ejemplo, el multicromóforo es un colorante polimérico en tándem. En algunas modalidades del miembro de unión específica marcado, el colorante tiene una relación de cromóforos aceptores a unidades repetidas del multicromóforo en el intervalo de 1:40 a 1:4, tal como una relación en el intervalo de 1:20 a 1:4, 1:10 a 1:4, 1:9 a 1:4, 1:8 a 1:4, 1:7 a 1:4, 1:6 a 1:4 o 1:5 a 1:4, o tal como una relación en el intervalo de 1:40 a 1:5, 1:40 a 1:6, 1:40 a 1:7, 1:40 a 1:8, 1:40 a 1:9, 1:40 a 1:10 o 1:40 a 1:20.
En determinados casos, el cromóforo aceptor es un fluoróforo. En algunas modalidades del miembro de unión específica marcado, la emisión del cromóforo aceptor es 1,5 veces mayor o más (tal como 2,0 veces mayor o más, 2,5 veces mayor o más, 3 veces mayor o más, 4 veces mayor o más, 5 veces mayor o más, 6 veces mayor o más, 7 veces mayor o más, 8 veces mayor o más, 9 veces mayor o más, 10 veces mayor o más, o incluso más) cuando está excitado por el multicromóforo en comparación con la excitación directa del cromóforo aceptor con luz incidente.
En algunas 2. descripciones del miembro de unión específica marcado, el multicromóforo incluye un segmento conjugado que comprende BODIPY descrito por la fórmula (I):
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donde B es una unidad de BODIPY; M es un comonómero conjugado en n; cada L se selecciona independientemente de un grupo terminal, un segmento conjugado en n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado; y n es un número entero de 1 a 100000. En determinadas modalidades de la fórmula (I), la unidad de BODIPY se describe mediante la estructura:
Figure imgf000033_0002
donde: R1, R2, R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente de H, un alquilo y un alquilo sustituido; R5 se selecciona de un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido, un heteroarilo y un heteroarilo sustituido, en donde R5 está opcionalmente sustituido con un grupo que se solubiliza en agua; y cada R se selecciona de F, OH, H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquinilo y alquinilo sustituido. En determinadas modalidades de la fórmula (I), M se selecciona de un comonómero de fluoreno, un comonómero de fenileno-vinileno, un comonómero de fenileno-etinileno, un comonómero de carbazol, un comonómero de alquino C2-C12, un comonómero de arileno-etinileno, un comonómero de heteroarileno-etinileno, un comonómero de arileno y un comonómero de heteroarileno.
En algunas modalidades del miembro de unión específica marcado, el multicromóforo se describe mediante la fórmula (II):
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donde: B1 y B2 son cada uno independientemente una unidad de BODIPY; cada M1 y cada M2 son independientemente un comonómero conjugado en n; a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 , 1 o 2 , en donde b+e > 1; n y m son independientemente de 0 a 100000, en donde n+m > 1; y un grupo L2 es un grupo terminal (G1) y el otro grupo L2 es un miembro de unión específica enlazado (por ejemplo, L-Z). En determinadas modalidades de la fórmula (II), al menos uno de B1, B2, M1 y M2 incluye -L1-C1, en donde L1 es un enlazador opcional y C1 es el cromóforo aceptor.
En determinadas modalidades de la fórmula (II), el miembro de unión específica enlazado es un anticuerpo. En algunos casos de Fórmula (II), el miembro de unión específica enlazado es un fragmento de anticuerpo o un derivado de unión de este. En algunos casos de la fórmula (II), el miembro de unión específica enlazado es un fragmento de anticuerpo o un derivado de unión de este que se selecciona de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un diacuerpo y un triacuerpo. En algunos casos de la fórmula (II), el cromóforo aceptor se selecciona de un colorante de cianina, un colorante de xanteno, un colorante de cumarina, un colorante de tiazina y un colorante de acridina. En determinados casos de la fórmula (II), el cromóforo aceptor se selecciona de DY 431, DY 485XL, DY 500XL, DY 610, DY 640, DY 654, DY 682, DY 700, DY 701, DY 704, DY 730, DY 731, DY 732, DY 734, DY 752, DY 778, DY 782, DY 800, DY 831, Biotio CF 555, Cy 3.5 y dietilamino cumarina. En algunos casos de la fórmula (II), el cromóforo aceptor se selecciona de Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Alexa488, Alexa 647 y Alexa700.
En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado es un colorante polimérico en tándem de fórmula (III), donde un grupo L2 es un miembro de unión específica enlazado. En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado es un colorante polimérico en tándem de fórmula (IV), donde un grupo L2 es un miembro de unión específica enlazado. En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado es un colorante polimérico en tándem de fórmula (V), donde un grupo L2 es un miembro de unión específica enlazado. En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado es un colorante polimérico en tándem de fórmula (VI), donde un grupo L2 es un miembro de unión específica enlazado.
En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado es un colorante polimérico en tándem de fórmula (VII), donde Z es un miembro de unión específica. En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado es un colorante polimérico en tándem de fórmula (VIII), donde Z es un miembro de unión específica. En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado es un colorante polimérico en tándem de fórmula (IX), donde Z es un miembro de unión específica. En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado es un colorante polimérico en tándem de fórmula (X), donde Z es un miembro de unión específica. En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado es un colorante polimérico en tándem de fórmula (XI), donde Z es un miembro de unión específica. En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado es un colorante polimérico en tándem de fórmula (XII), donde Z es un miembro de unión específica.
En determinadas modalidades, el miembro de unión específica marcado se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000034_0001
En determinadas modalidades, el miembro de unión específica marcado se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000034_0002
En determinadas modalidades, el miembro de unión específica marcado se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000034_0003
En determinadas modalidades, el miembro de unión específica marcado se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000035_0001
En determinadas modalidades, el miembro de unión especifica marcado se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000035_0002
En determinadas modalidades, el miembro de unión específica marcado se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000035_0003
Se proporcionan, ademas, precursores de colorantes polimericos en tándem de cualquiera de las estructuras mostradas anteriormente que incluyen un grupo funcional amino terminal adecuado para la conjugación con la "biomolécula". Las estructuras de dichos precursores de colorantes poliméricos en tándem pueden representarse al reemplazar el grupo "biomolécula" representado en las estructuras anteriores con una "H". En algunos casos de las estructuras representadas anteriormente, el "colorante" enlazado es un colorante fluorescente enlazado.
Métodos
Como se resumió anteriormente, los aspectos de la invención incluyen métodos para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra. El método incluye: (a) poner en contacto la muestra con un conjugado de colorante polimérico en tándem que se une específicamente al analito diana como se reivindica para producir una muestra en contacto con la composición de marcaje; y (b) evaluar la muestra en contacto con la composición de marcaje para detectar la presencia de un complejo de unión de analito diana-conjugado de colorante polimérico en tándem para evaluar si el analito diana está presente en la muestra. El conjugado de colorante polimérico incluye: (i) un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY captadora de luz según se reivindica (ii) un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con este; y (iii) un miembro de unión específica (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).
Puede usarse cualquier método conveniente para poner en contacto la muestra con un conjugado de colorante polimérico que se une específicamente al analito diana para producir la muestra en contacto con una composición de marcaje. Como se usa en la presente descripción, los términos "conjugado de colorante polimérico" y "miembro de unión específica marcado" se usan indistintamente. En algunos casos, la muestra se pone en contacto con el conjugado de colorante polimérico en condiciones en las que el miembro de unión específica se une específicamente al analito diana, si está presente. Para la unión específica del miembro de unión específica del conjugado con el analito diana, puede usarse una solución apropiada que mantenga la actividad biológica de los componentes de la muestra y el miembro de unión específica. La solución puede ser una solución salina balanceada, por ejemplo, solución salina normal, PBS, solución salina balanceada de Hank, etc., convenientemente complementada con suero de ternero fetal, lisado de plaquetas humanas u otros factores, junto con un amortiguador aceptable a baja concentración, tal como de 5-25 mM. Los amortiguadores convenientes incluyen HEPES, amortiguadores de fosfato, amortiguadores de lactato, etc. Hay varios medios disponibles comercialmente y pueden usarse de acuerdo con la naturaleza del analito diana, que incluyen dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, medio de Iscove, etc., en algunos casos complementados con suero de ternero fetal o lisado de plaquetas humanas. Los componentes finales de la solución pueden seleccionarse en función de los componentes de la muestra que se incluyan.
La temperatura a la que tiene lugar la unión específica del miembro de unión específica del conjugado al analito diana puede variar, y en algunos casos puede variar de 5 °C a 50 °C, tal como de 10 °C a 40 °C, de 15 °C a 40 °C, de 20 °C a 40 °C, por ejemplo, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C o 37 °C (por ejemplo, como se describió anteriormente). En algunos casos, la temperatura a la que tiene lugar la unión específica se selecciona para que sea compatible con la actividad biológica del miembro de unión específica y/o el analito diana. En determinados casos, la temperatura es de 25 °C, 30 °C, 35 °C o 37 °C. En determinados casos, el miembro de unión específica es un anticuerpo o fragmento de este y la temperatura a la que tiene lugar la unión específica es la temperatura ambiente (por ejemplo, 25 °C), 30 °C, 35 °C o 37 °C. Puede seleccionarse cualquier tiempo de incubación conveniente para la unión específica para permitir la formación de una cantidad conveniente de complejo de unión y, en algunos casos, puede ser 1 minuto (min) o más, tal como 2 min o más, 10 min o más, 30 min o más, 1 hora o más, 2 horas o más, o incluso 6 horas o más.
Cualquier miembro de unión específica conveniente puede utilizarse en el conjugado de colorante polimérico. Los miembros de unión específica de interés incluyen, pero no se limitan a, aquellos agentes que se unen específicamente a las proteínas de la superficie celular de una variedad de tipos de células, que incluyen, pero no se limitan a, células madre, por ejemplo, células madre pluripotentes, células madre hematopoyéticas, linfocitos T, linfocitos T reguladores, células dendríticas, linfocitos B, por ejemplo, linfocitos B de memoria, linfocitos B específicos al antígeno, granulocitos, células de leucemia, células de linfoma, células virales (por ejemplo, células de VIH), células NK, macrófagos, monocitos, fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales células y células eritroides. Las células diana de interés incluyen células que tienen un marcador de superficie celular conveniente o antígeno que puede capturarse por un conjugado de miembro de unión específica conveniente. En algunas modalidades, la célula diana se selecciona de células que contienen VIH, células Treg, poblaciones de linfocitos T específicos al antígeno, células tumorales o células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) de sangre total, médula ósea o sangre de cordón umbilical. Cualquier proteína de la superficie celular o marcador celular conveniente puede ser la diana para la unión específica a los conjugados de colorantes poliméricos en los métodos en cuestión. En algunas modalidades, la célula diana incluye un marcador de superficie celular que se selecciona de un receptor celular y un antígeno de superficie celular. En algunos casos, la célula diana puede incluir un antígeno de superficie celular tales como CD11b, CD123, CD14, CD15, CD16, CD19, CD193, CD2, CD25, CD27, CD3, CD335, CD36, CD4, CD43, CD45RO, CD56, CD61, CD7, CD8 , CD34, CD1c, CD23, CD304, CD235a, receptor de linfocitos T alfa/beta, receptor de linfocitos T gamma/delta, CD253, CD95, CD20, CD105, CD117, CD120b, Notch4, Lgr5 (extremo N), SSEA-3, antígeno TRA-1-60, disialogangliósido GD2 y CD71.
Puede seleccionarse cualquier diana conveniente para la evaluación mediante el uso de los métodos en cuestión. Las dianas de interés incluyen, pero no se limitan a, un ácido nucleico, tales como una molécula de ARN, ADN, PNA, CNA, HNA, LNA o ANA, una proteína, tales como una proteína de fusión, una proteína modificada, tales como una proteína fosforilada, proteína glucosilada, ubiquitinada, SUMOilada o acetilada, o un anticuerpo, un péptido, una biomolécula agregada, una célula, una molécula pequeña, una vitamina y una molécula de fármaco. Como se usa en la presente descripción, el término "una proteína diana" se refiere a todos los miembros de la familia diana y los fragmentos de esta. La proteína diana puede ser cualquier proteína de interés, tales como una diana terapéutica o diagnóstica, que incluye pero no se limita a: hormonas, factores de crecimiento, receptores, enzimas, citocinas, factores osteoinductores, factores estimulantes de colonias e inmunoglobulinas. El término "proteína diana" pretende incluir moléculas recombinantes y sintéticas, que pueden prepararse mediante el uso de cualquier método de expresión recombinante conveniente o mediante el uso de cualquier método sintético conveniente, o comprarse comercialmente. En algunas modalidades, los conjugados de colorantes poliméricos incluyen un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Cualquier analito diana conveniente que se una específicamente a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de interés puede ser diana en los métodos en cuestión.
En algunas modalidades, el analito diana está asociado con una célula. En determinados casos, el analito diana es un marcador de superficie celular de la célula. En determinados casos, el marcador de superficie celular se selecciona de un receptor celular y un antígeno de superficie celular. En algunos casos, el analito diana es una diana intracelular y el método incluye además la lisis de la célula. En determinados casos, el método incluye además la extracción de proteínas de la célula. Puede utilizarse cualquier método y agente conveniente para lisar la célula. Los métodos y agentes de interés incluyen los métodos y agentes de lisis celular y extracción de proteínas descritos en www.piercenet.com/method/traditional-methods-cell-lysis.
En algunas modalidades, la muestra puede incluir una población celular heterogénea a partir de la cual se aíslan las células diana. En algunos casos, la muestra incluye sangre total periférica, sangre total periférica en la que los eritrocitos se han lisado antes del aislamiento celular, sangre de cordón umbilical, médula ósea, células mononucleares de sangre periférica purificadas con gradiente de densidad o tejido homogeneizado. En algunos casos, la muestra incluye células progenitoras hematopoyéticas (por ejemplo, células CD34+) en sangre total, médula ósea o sangre de cordón umbilical. En determinadas modalidades, la muestra incluye células tumorales en sangre periférica. En determinados casos, la muestra es una muestra que incluye (o se sospecha que incluye) células virales (por ejemplo, VIH).
Los miembros de unión específica marcados en cuestión encuentran uso en los métodos en cuestión, por ejemplo, para marcar una célula diana, partícula, diana o analito con un colorante polimérico o un colorante polimérico en tándem. Por ejemplo, los miembros de unión específica marcados encuentran uso en el marcaje de células para ser procesadas (por ejemplo, detectadas, analizadas y/o clasificadas) en un citómetro de flujo. Los miembros de unión específica marcados pueden incluir anticuerpos que se unen específicamente, por ejemplo, a proteínas de la superficie celular de una variedad de tipos de células (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). Los miembros de unión específica marcados pueden usarse para investigar una variedad de propiedades o procesos biológicos (por ejemplo, celulares), tales como el ciclo celular, la proliferación celular, la diferenciación celular, la reparación del a Dn , la señalización de linfocitos T, la apoptosis, la expresión y/o la presentación de proteínas de la superficie celular, etcétera. Los miembros de unión específica marcados pueden usarse en cualquier aplicación que incluye (o puede incluir) el marcaje, mediado por anticuerpos, de una célula, partícula o analito.
En determinadas modalidades, el conjugado se describe mediante la fórmula (II):
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donde B1 y B2 son cada uno independientemente una unidad de BODIPY; cada M1 y cada M2 son independientemente un comonómero conjugado en n; a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 , 1 o 2 , en donde b+e > 1; n y m son independientemente de 0 a 100000, en donde n+m > 1; y un grupo L2 es un grupo terminal (G1) y el otro grupo L2 es un miembro de unión específica enlazado. En determinadas modalidades, al menos uno de B1, B2, M1 y M2 incluye -L1-C1, en donde L1 es un enlazador opcional y C1 es el cromóforo aceptor.
Una vez que la muestra se ha puesto en contacto con el conjugado de colorante polimérico, puede usarse cualquier método conveniente para analizar la muestra en contacto con una composición de marcaje que se produce para detectar la presencia de un complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico. El complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico es el complejo de unión que se produce tras la unión específica del miembro de unión específica del conjugado al analito diana, si está presente. El ensayo de la muestra en contacto con una composición de marcaje puede incluir la detección de una señal fluorescente del complejo de unión, si está presente. En algunos casos, el ensayo incluye una etapa de separación en el que el analito diana, si está presente, se separa de la muestra. Puede utilizarse una variedad de métodos para separar un analito diana de una muestra, por ejemplo, mediante inmovilización en un soporte. Los métodos de ensayo de interés incluyen, pero no se limitan a, cualquier método y formato de ensayo conveniente en los que sean de interés pares de miembros de unión específicas tales como avidina-biotina o anticuerpos anti-hapteno-hapteno. Los métodos y los formatos de ensayo de interés que pueden adaptarse para su uso con las composiciones en cuestión incluyen, pero no se limitan a, métodos de citometría de flujo, métodos de hibridación in situ, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunoelectrotransferencia, ensayos de separación celular magnética y cromatografía de purificación de fluorocromos.
En determinadas modalidades, el método incluye además poner en contacto la muestra con un segundo miembro de unión específica que se une específicamente al analito diana. En determinados casos, el segundo miembro de enlace específico está unido por soporte. Puede usarse cualquier soporte conveniente para inmovilizar un componente de los métodos en cuestión (por ejemplo, un segundo miembro de unión específica). En determinados casos, el soporte es una partícula, tal como una partícula magnética. En algunos casos, el segundo miembro de unión específica y el conjugado de colorante polimérico producen un complejo tipo sándwich que puede aislarse y detectarse, si está presente, mediante el uso de cualquier método conveniente. En algunas modalidades, el método incluye además el análisis por citometría de flujo del complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico, es decir, un analito diana marcado con fluorescencia. El ensayo de la presencia de un complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico puede proporcionar resultados de ensayo (por ejemplo, datos de ensayo cualitativos o cuantitativos) que pueden usarse para evaluar si el analito diana está presente en la muestra.
Cualquier soporte conveniente puede utilizarse en los métodos en cuestión. Los soportes de interés incluyen, pero no se limitan a: sustratos sólidos, donde el sustrato puede tener una variedad de configuraciones, por ejemplo, una lámina, una perla u otra estructura, tal como una placa con pocillos; perlas, polímeros, partículas, una malla fibrosa, hidrogeles, matriz porosa, un pin, una superficie de micromatriz, un soporte de cromatografía y similares. En algunos casos, el soporte se selecciona de una partícula, un sustrato sólido plano, una malla fibrosa, un hidrogel, una matriz porosa, un pin, una superficie de micromatriz y un soporte de cromatografía. El soporte puede incorporarse a un sistema que proporcione el aislamiento celular asistido por cualquier método conveniente, tal como una jeringa manual, una centrífuga o un sistema automatizado de manejo de líquidos. En algunos casos, el soporte encuentra uso en un sistema automatizado de manejo de líquidos para el aislamiento de células de alto rendimiento, tal como un citómetro de flujo.
En algunas modalidades del método, la etapa de separación incluye aplicar un campo magnético externo para inmovilizar una partícula magnética. Puede usarse cualquier imán conveniente como una fuente del campo magnético externo (por ejemplo, gradiente de campo magnético). En algunos casos, el campo magnético externo se genera por una fuente magnética, por ejemplo, por un imán permanente o un electroimán. En algunos casos, la inmovilización de las partículas magnéticas significa que las partículas magnéticas se acumulan cerca de la superficie más cercana a la fuente del gradiente del campo magnético, es decir, el imán.
La separación puede incluir además una o más etapas de lavado opcionales para eliminar el material sin unir de la muestra del soporte. Puede usarse cualquier método de lavado conveniente, por ejemplo, lavar el soporte inmovilizado con un amortiguador biocompatible que conserva la interacción de unión específica del colorante polimérico y el miembro de unión específica. La separación y el lavado opcional del material sin unir de la muestra del soporte proporcionan una población enriquecida de células diana de la que pueden eliminarse las células y el material no deseados.
En determinadas modalidades, el método incluye además la detección de la diana marcada. La detección de la diana marcada puede incluir excitar el multicromóforo con uno o más láseres y, posteriormente, detectar la emisión de fluorescencia del colorante polimérico mediante el uso de uno o más detectores ópticos.
También se proporcionan métodos para marcar una molécula diana. Los colorantes poliméricos en cuestión, que incluyen los colorantes en tándem, encuentran uso en una variedad de métodos de marcaje, separación, detección y/o análisis. En algunas modalidades, el método incluye: poner en contacto la molécula diana con un colorante polimérico en tándem para producir una molécula diana marcada, en donde el colorante polimérico en tándem incluye: un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY captadora de luz (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); y un marcador de conjugación. En determinados casos, el colorante polimérico es en sí mismo fluorescente. En algunas modalidades, el colorante polimérico es un colorante polimérico en tándem. Como tal, en algunos casos, el colorante polimérico incluye además un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con este. Como se usa en la presente descripción, el término "molécula diana marcada" se refiere a una molécula diana que está unida covalentemente a un multicromóforo en cuestión.
En algunas modalidades, el colorante polimérico se describe mediante la fórmula (II):
Figure imgf000039_0001
donde: B1 y B2 son cada uno independientemente una unidad de BODIPY; cada M1 y cada M2 son independientemente un comonómero conjugado en n; a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 , 1 o 2 , en donde b+e > 1; n y m son independientemente de 0 a 100000, en donde n+m > 1; y un grupo L2 es un grupo terminal (G1) y el otro grupo L2 es el marcador de conjugación. En determinados casos de la fórmula (II), al menos uno de B1, B2, M1 y M2 incluye -L1-C1, en donde L1 es un enlazador opcional y C1 es el cromóforo aceptor.
Como se usa en la presente descripción, el término "marcador de conjugación" se refiere a un grupo que incluye un grupo funcional quimioselectivo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) que puede enlazarse covalentemente con un grupo funcional compatible de una molécula diana, después de la activación y/o la desprotección opcional. Puede usarse cualquier marcador de conjugación conveniente en los colorantes poliméricos en cuestión para conjugar el colorante con una molécula diana de interés. En algunas modalidades, el marcador de conjugación incluye un grupo funcional terminal que se selecciona de un amino, un ácido carboxílico o un derivado de este, un tiol, un hidroxilo, una hidrazina, una hidrazida, una azida, un alquino y un grupo reactivo de proteína (por ejemplo, reactivo con amino, reactivo con tiol, reactivo con hidroxilo, reactivo con imidazolilo o reactivo con guanidinilo).
Cualquier método y reactivo convenientes pueden adaptarse para su uso en los métodos de marcaje en cuestión con el fin de enlazar covalentemente el marcador de conjugación a la molécula diana. Los métodos de interés para marcar una diana incluyen, pero no se limitan a, los métodos y reactivos descritos por Hermanson, Bioconjugate Techniques, tercera edición, Academic Press, 2013. La etapa de poner en contacto puede realizarse en una solución acuosa. En algunos casos, el marcador de conjugación incluye un grupo funcional amino y la molécula diana incluye un grupo funcional éster activado, tal como un éster NHS o un éster sulfo-NHS, o viceversa. En determinados casos, el marcador de conjugación incluye un grupo funcional maleimida y la molécula diana incluye un grupo funcional tiol, o viceversa.
Puede seleccionarse cualquier molécula diana conveniente para marcar mediante el uso de los métodos en cuestión. Las moléculas diana de interés incluyen, pero no se limitan a, un ácido nucleico, tales como una molécula de ARN, ADN, PNA, CNA, HNA, LNA o ANA, una proteína, tales como una proteína de fusión, una proteína modificada, tales como una proteína fosforilada, glucosilada, ubiquitinada, SUMOilada o acetilada, o un anticuerpo, un péptido, una biomolécula agregada, una célula, una molécula pequeña, una vitamina y una molécula de fármaco. Como se usa en la presente descripción, el término "una proteína diana" se refiere a todos los miembros de la familia diana y los fragmentos de esta. La proteína diana puede ser cualquier proteína de interés, tales como una diana terapéutica o diagnóstica, que incluye pero no se limita a: hormonas, factores de crecimiento, receptores, enzimas, citocinas, factores osteoinductores, factores estimulantes de colonias e inmunoglobulinas. El término "proteína diana" pretende incluir moléculas recombinantes y sintéticas, que pueden prepararse mediante el uso de cualquier método de expresión recombinante conveniente o mediante el uso de cualquier método sintético conveniente, o comprarse comercialmente. En algunas modalidades, la molécula diana es un miembro de unión específica (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En determinados casos, el miembro de unión específica es un anticuerpo. En algunos casos, el miembro de unión específica es un fragmento de anticuerpo o un derivado de unión de este. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo o el derivado de unión de este se selecciona de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un diacuerpo y un triacuerpo.
En algunos casos, el método incluye una etapa de separación en el que la molécula diana marcada se separa de la mezcla de reacción, por ejemplo, un exceso de reactivos o diana no marcada. Puede usarse una variedad de métodos para separar una diana de una muestra, por ejemplo, mediante inmovilización en un soporte, precipitación, cromatografía y similares.
En algunos casos, el método incluye además detectar y/o analizar la molécula diana marcada. En algunos casos, el método incluye además la detección fluorescente de la molécula diana marcada. Puede utilizarse cualquier método conveniente para detectar y/o analizar la molécula diana marcada junto con los métodos y las composiciones en cuestión. Los métodos para analizar una diana de interés que encuentran uso en los métodos en cuestión incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, hibridación in situ, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunoelectrotransferencia, ensayos de separación celular magnética y cromatografía de purificación de fluorocromos. Los métodos de detección de interés incluyen, pero no se limitan a, espectroscopia de fluorescencia, secuenciación de ácidos nucleicos, hibridación in situ con fluorescencia (FISH), espectroscopia de masas de proteínas, citometría de flujo y similares.
La detección puede lograrse directamente a través de una molécula indicadora, o indirectamente mediante un sistema de detección secundario. Este último puede basarse en uno cualquiera o en una combinación de varios principios diferentes, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos antiespecie marcados con anticuerpos y otras formas de puentes inmunológicos o no inmunológicos y sistemas de amplificación de señales (por ejemplo, tecnología de biotinaestreptavidina, tecnología mediada por proteína A y proteína G, o sondas de ácido nucleico/sondas anti-ácido nucleico, y similares). El marcador utilizado para la detección directa o indirecta puede ser cualquier molécula indicadora detectable. Las moléculas indicadoras adecuadas pueden ser las conocidas en el campo de la inmunocitoquímica, biología molecular, microscopía de luz, fluorescencia y electrónica, inmunofenotipado celular, clasificación celular, citometría de flujo, visualización celular, detección, enumeración y/o cuantificación de salida de señal. Los marcadores de interés incluyen, pero no se limitan a, fluoróforos, marcadores luminiscentes, complejos metálicos, radioisótopos, biotina, estreptavidina, enzimas u otros marcadores de detección y una combinación de marcadores tales como enzimas y un sustrato luminogénico. Las enzimas de interés y sus sustratos incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa y luciferasa, y similares. Puede marcarse y usarse más de un anticuerpo de naturaleza específica y/o no específica de manera simultánea o secuencial para mejorar la detección, identificación y/o análisis de dianas. Los marcadores de interés incluyen, pero no se limitan a, FITC (isotiocianato de fluoresceína) AMCA (ácido 7-amino-4-metilcumarina-3-acético), Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 350, DyLight350, ficoeritrina, aloficocianina y tintes para la detección de núcleos tales como Hoechst 33342, LDS751, TO-PRO y DAPI.
Sistemas
Los aspectos de la presente descripción incluyen además sistemas para su uso en la práctica de los métodos y las composiciones en cuestión. Un sistema de análisis de muestras puede incluir un canal de flujo cargado con una muestra y un miembro de unión específica marcado. En algunas modalidades, el sistema es un sistema de citometría de flujo que incluye: un citómetro de flujo que incluye una ruta de flujo; una composición en la ruta de flujo, en donde la composición incluye: una muestra; y un miembro de unión específica marcado (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunos casos del sistema, el miembro de unión específica marcado incluye un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY captadora de luz; y un miembro de unión específica que se une específicamente a un analito diana y se une covalentemente al multicromóforo. El multicromóforo puede ser un colorante polimérico que sea fluorescente en sí mismo. El multicromóforo puede ser un colorante polimérico en tándem. En determinados casos, el miembro de unión específica marcado incluye además un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con este. En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado se describe mediante la fórmula (II):
Figure imgf000040_0001
donde: B1 y B2 son cada uno independientemente una unidad de BODIPY; cada M1 y cada M2 son independientemente un comonómero conjugado en n; a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 , 1 o 2 , en donde b+e > 1; n y m son independientemente de 0 a 100000, en donde n+m > 1; y un grupo L2 es un grupo terminal (G1) y el otro grupo L2 es el marcador de conjugación. En determinados casos de la fórmula (II), al menos uno de B1, B2, M1 y M2 incluye -L1-C1, en donde L1 es un enlazador opcional y C1 es el cromóforo aceptor.
En determinadas modalidades del sistema, la composición incluye además un segundo miembro de unión específica que se une al soporte y se une específicamente al analito diana. En algunos casos, el soporte incluye una partícula magnética. Como tal, en determinados casos, el sistema también puede incluir un campo paramagnético externo controlable configurado para su aplicación a una región de ensayo del canal de flujo.
La muestra puede incluir una célula. En algunos casos, la muestra es una muestra biológica que contiene células. En algunos casos, la muestra incluye un miembro de unión específica marcado unido específicamente a una célula diana. En determinados casos, el analito diana que se une específicamente al miembro de unión específica es un marcador de la superficie celular de la célula. En determinados casos, el marcador de superficie celular se selecciona de un receptor celular y un antígeno de superficie celular.
En determinados aspectos, el sistema también puede incluir una fuente de luz configurada para dirigir la luz a una región de ensayo del canal de flujo. El sistema puede incluir un detector configurado para recibir una señal de una región de ensayo del canal de flujo, en donde la composición fluorescente proporciona la señal. Opcionalmente, además, el sistema de análisis de muestras puede incluir uno o más detectores y/o fuentes de luz adicionales para la detección de una o más señales adicionales.
En determinados aspectos, el sistema puede incluir además sistemas basados en ordenadores para detectar la presencia de la señal fluorescente. Un "sistema basado en ordenadores" se refiere a los componentes físicos de un ordenador, los programas informáticos y los medios de almacenamiento de datos usados para analizar la información de la presente invención. El componente físico mínimo de los sistemas basados en ordenadores de la presente invención incluye una unidad central de procesamiento (CPU), medios de entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que cualquiera de los sistemas basados en ordenadores actualmente disponibles es adecuado para su uso en los sistemas en cuestión. Los medios de almacenamiento de datos pueden incluir cualquier fabricación que incluya un registro de la presente información como se ha descrito anteriormente, o un medio de acceso a la memoria que pueda acceder a dicha fabricación.
"Registrar" datos, programación u otra información en un medio legible por ordenador se refiere a un proceso para almacenar información, mediante el uso de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Puede elegirse cualquier estructura de almacenamiento de datos conveniente, basándose en los medios usados para acceder a la información almacenada. Puede usarse una variedad de programas y formatos de procesamiento de datos para el almacenamiento, por ejemplo, archivo de texto de procesamiento de texto, formato de base de datos, etc.
Un "procesador" hace referencia a cualquier combinación de componentes físicos de un ordenador y/o programas informáticos que realizará las funciones que se le exigen. Por ejemplo, cualquier procesador en la presente descripción puede ser un microprocesador digital programable tal como el disponible en forma de controlador electrónico, unidad central, servidor u ordenador personal (de escritorio o portátil). Cuando el procesador es programable, la programación adecuada puede comunicarse desde una ubicación remota al procesador, o puede guardarse previamente en un producto de programa de ordenador (tal como un medio de almacenamiento legible por ordenador portátil o fijo, ya sea basado en un dispositivo magnético, óptico o de estado sólido). Por ejemplo, un medio magnético o disco óptico puede llevar la programación y puede ser leído por un lector adecuado que se comunique con cada procesador en su estación correspondiente.
Además del dispositivo sensor y el módulo de procesamiento de señales, por ejemplo, como se describe anteriormente, los sistemas de la invención pueden incluir una serie de componentes adicionales, tales como dispositivos de salida de datos, por ejemplo, monitores y/o altavoces, dispositivos de entrada de datos, por ejemplo, interfaz puertos, teclados, etc., componentes de manejo de fluidos, fuentes de alimentación, etc.
En determinados aspectos, el sistema incluye un citómetro de flujo. Los citómetros de flujo de interés incluyen, pero no se limitan a, los dispositivos descritos en las patentes de Estados Unidos núms.: 4,704,891; 4,727,029; 4,745,285; 4,867,908; 5,342,790; 5,620,842; 5,627,037; 5,701,012; 5,895,922; y 6,287,791.
Otros sistemas pueden encontrar uso en la práctica de los métodos en cuestión. En determinados aspectos, el sistema puede ser un fluorímetro o microscopio cargado con una muestra que tenga una composición fluorescente de cualquiera de las modalidades discutidas en la presente descripción. El fluorímetro o el microscopio pueden incluir una fuente de luz configurada para dirigir la luz a la región de ensayo del canal de flujo. El fluorímetro o el microscopio también pueden incluir un detector configurado para recibir una señal de una región de ensayo del canal de flujo, en donde la composición fluorescente proporciona la señal.
KITS
Los aspectos de la presente descripción incluyen además kits para su uso en la práctica de los métodos y las composiciones en cuestión. Las composiciones de la invención pueden incluirse como reactivos en kits, ya sea como materiales de partida o pueden proporcionarse para su uso, por ejemplo, en las metodologías descritas anteriormente.
Un kit puede incluir un multicromóforo que comprende una unidad de BODIPY captadora de luz (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); y uno o más componentes seleccionados de un colorante polimérico en tándem, un fluoróforo, un miembro de unión específica, un conjugado del miembro de unión específica, un miembro de unión específica unido a un soporte, una célula, un soporte, un tampón de elución acuoso biocompatible e instrucciones de uso. En algunas modalidades del kit, el multicromóforo está enlazado covalentemente a un miembro de unión específica. En algunos casos, el miembro de unión específica es un anticuerpo. En determinados casos, el miembro de unión específica es un fragmento de anticuerpo o derivado de unión de este. En determinados casos, el fragmento de anticuerpo o el derivado de unión de este se selecciona de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un diacuerpo y un triacuerpo. El multicromóforo puede ser un colorante polimérico que es fluorescente en sí mismo. El multicromóforo puede ser un colorante polimérico en tándem. En algunos casos, el multicromóforo incluye además un cromóforo aceptor unido covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con este.
En determinadas modalidades, el kit encuentra uso para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra, tal como una diana intracelular. Como tal, en algunos casos, el kit incluye uno o más componentes adecuados para lisar células. Uno o más componentes adicionales del kit pueden proporcionarse en recipientes separados (por ejemplo, tubos, botellas o pocillos separados en una tira o placa de múltiples pocillos).
En determinados aspectos, el kit incluye además reactivos para realizar un ensayo de citometría de flujo. Los reactivos de interés incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores para reconstitución y dilución, amortiguadores para poner en contacto una muestra celular con el multicromóforo, amortiguadores de lavado, células de control, perlas de control, perlas fluorescentes para la calibración del citómetro de flujo y las combinaciones de estos. El kit también puede incluir uno o más reactivos de fijación celular, tales como paraformaldehído, glutaraldehído, metanol, acetona, formalina o cualquier combinación o amortiguador de estos. Además, el kit puede incluir un reactivo de permeabilización celular, tales como metanol, acetona o un detergente (por ejemplo, tritón, NP-40, saponina, Tween 20, digitonina, leucoperma o cualquier combinación o amortiguador de estos). Otros inhibidores del transporte de proteínas, reactivos de fijación de células y reactivos de permeabilización de células familiares para el experto en la técnica están dentro del alcance de los kits en cuestión.
Las composiciones del kit pueden proporcionarse en una composición líquida, tal como cualquier amortiguador adecuado. Alternativamente, las composiciones del kit pueden proporcionarse en una composición seca (por ejemplo, pueden liofilizarse) y el kit puede incluir opcionalmente uno o más amortiguadores para reconstituir la composición seca. En determinados aspectos, el kit puede incluir alícuotas de las composiciones proporcionadas en recipientes separados (por ejemplo, tubos, botellas o pocillos separados en una tira o placa de pocillos múltiples).
Además, pueden combinarse uno o más componentes en un solo recipiente, por ejemplo, un vial, tubo o botella de vidrio o plástico. En determinados casos, el kit puede incluir además un recipiente (por ejemplo, tales como una caja, una bolsa, un recipiente aislado, una botella, un tubo, etc.) en el que están presentes todos los componentes (y sus recipientes separados). El kit puede incluir además un embalaje que esté separado o unido al recipiente del kit y sobre el que se imprima información sobre el kit, los componentes y/o las instrucciones para el uso del kit.
Además de los componentes anteriores, los kits en cuestión pueden incluir además instrucciones para practicar los métodos en cuestión. Estas instrucciones pueden presentarse en los kits en cuestión en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden presentarse en el kit. Una forma en la cual estas instrucciones pueden presentarse es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una hoja u hojas de papel en las cuales se imprime la información, en el embalaje del kit, en un prospecto, etc. Otro medio más sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, disquete, CD, DVD, memoria flash, etc., en el cual se ha grabado la información. Otro medio más que puede presentarse es una dirección de sitio web la cual puede usarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
Utilidad
Las composiciones, los métodos y los sistemas que se describen en la presente descripción pueden encontrar uso en una variedad de aplicaciones, que incluyen aplicaciones de diagnóstico e investigación, en las que es conveniente la detección y/o el análisis de marcaje de una diana de interés. Dichas aplicaciones incluyen metodologías tales como citometría, microscopía, inmunoensayos (por ejemplo, competitivos o no competitivos), evaluación de un analito libre, evaluación del ligando unido al receptor, etc. Las composiciones, el sistema y los métodos descritos en la presente descripción pueden ser útiles en el análisis de una serie de muestras, que incluyen, pero no se limitan a, fluidos biológicos, muestras de cultivo celular y muestras de tejido. En determinados aspectos, las composiciones, el sistema y los métodos descritos en la presente descripción pueden encontrar uso en métodos en los que los analitos se detectan en una muestra, si están presentes, mediante el uso de marcadores fluorescentes, tales como en clasificación o análisis de células activadas por fluorescencia, inmunoensayos, inmunotinción y similares. En determinados casos, las composiciones y los métodos encuentran uso en aplicaciones donde es de interés evaluar la presencia de un analito diana en una muestra.
En algunos casos, los métodos y las composiciones encuentran uso en cualquier formato de ensayo en el que la detección y/o el análisis de una diana de una muestra sea de interés, que incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, hibridación in situ, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunoelectrotransferencia, ensayos de separación celular magnética y cromatografía de purificación de fluorocromos. En determinados casos, los métodos y las composiciones encuentran uso en cualquier aplicación en la que sea de interés el marcaje fluorescente de una molécula diana. Las composiciones en cuestión pueden adaptarse para su uso en cualquier aplicación conveniente en la que se usen pares de miembros de unión específica, tales como biotina-estreptavidina y anticuerpo anti-haptenohapteno.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Experimental
Ejemplo 1
Se prepararon una serie de colorantes en tándem basados en una estructura de núcleo 1 que se muestra más abajo, que incluye una serie de fluoróforos enlazados, DY 633, DY 651, DY 682 y DY 752.
Figure imgf000043_0001
La Figura 1 muestra la absorción y emisión de colorantes poliméricos en tándem basados en la estructura de núcleo 1 unida a una variedad de colorantes aceptores en el sitio enlazador interno (por ejemplo, colorantes DY 633, DY 651, DY682 y DY 752). No se une ningún miembro de unión específica a estas estructuras.
Se preparó una segunda serie de colorantes en tándem basados en una estructura de núcleo 1 representada anteriormente que incluye una serie de fluoróforos de colorantes aceptores enlazados en el sitio enlazador interno, DY 633, DY 654, DY682, DY 754 y DY 752. La Figura 2 ilustra la fluorescencia de estos colorantes poliméricos en tándem basados en la estructura 1 con una variedad de moléculas de colorante unidas en el sitio enlazador interno. La absorción para todas las soluciones es de 0,04 OD. Tenga en cuenta que la intensidad de emisión es significativamente mayor para los polímeros con un cromóforo aceptor unido en relación con el polímero solo. No se une ningún miembro de unión específica a estos polímeros.
El rendimiento cuántico de los pares en tándem es más brillante que el polímero central solo. Para la estructura 1 se unió una variedad de cromóforos aceptores y los pares en tándem resultantes se compararon espectroscópicamente con el polímero sin un cromóforo secundario. Todas las soluciones preparadas tenían la misma densidad óptica para la longitud de onda de excitación de 562 nm. Como se puede observar en la Figura 2, la altura del pico y el área del pico para los pares en tándem (picos 2-6) son más grandes que la emisión del polímero subyacente (pico 1). De esta manera, la extensa creación de prototipos de polímeros subyacentes cada vez más brillantes es innecesaria y los pares en tándem tienen un brillo limitado en gran parte debido al rendimiento cuántico del aceptor.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un colorante polimérico en tándem soluble en agua que comprende:
un multicromóforo que es un polímero conjugado que comprende unidades de BODIPY conjugadas en n; y un cromóforo aceptor que se une covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con este,
en donde el multicromóforo se describe mediante la fórmula (II):
Figure imgf000044_0001
en donde:
B1 y B2 son cada uno independientemente una unidad de BODIPY;
cada M1 y cada M2 son independientemente un comonómero conjugado en n que está conjugado en n con B1 o B2;
a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 , 1 o 2 , en donde b+e > 1;
n es 0 o n y m son un número entero de 1 a 100000, en donde n+m > 1;
p es un número entero de 1 a 100000; y
cada L2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo terminal, un segmento conjugado en n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado,
en donde el colorante se describe mediante la fórmula (III):
Figure imgf000044_0002
o la fórmula (VI)
Figure imgf000044_0003
en donde cada L1 es un enlazador opcional y cada C1 es un cromóforo aceptor,
o en donde el colorante se describe mediante la fórmula (IV):
Figure imgf000045_0001
o la fórmula (V)
Figure imgf000045_0002
en donde cada L1 es un enlazador opcional y cada C1 es un cromóforo aceptor,
y en donde para las fórmulas (III), (IV), (V), (VI), B1, B2, M1, M2, n, m, p y cada L2 es como se define para la fórmula (II).
2. El colorante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la unidad de BODIPY se describe mediante la estructura:
Figure imgf000045_0003
en donde:
cada uno de R1, R2, R3 y R4 se selecciona independientemente de H, un alquilo y un alquilo sustituido; R5 se selecciona del grupo que consiste en un alquilo, un alquilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido, un heteroarilo, un heteroarilo sustituido, en donde R5 está opcionalmente sustituido con un grupo que se solubiliza en agua; y
cada R se selecciona del grupo que consiste en F, OH, H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquinilo y alquinilo sustituido.
3. El colorante de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde:
cuando b es 0 , a y c son cada uno 1;
cuando e es 0 , d y f son cada uno 1;
cuando b es 1, a c > 1; y
cuando e es 1, d f > 1.
4. El colorante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el colorante tiene una relación de cromóforos aceptores a unidades repetidas del multicromóforo en el intervalo de 1:40 a 1:4.
5. El colorante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde B1 y B2 *se describen cada uno independientemente mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000046_0001
en donde R6 es un arilo o un heteroarilo, opcionalmente sustituido con uno o más grupos que se solubilizan en agua.
6. El colorante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos un L2 se describe mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000046_0002
en donde:
q es un número entero de 1-12; y
Z es un miembro de unión específica.
7. El colorante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
L1 es un resto alquilo, un alquilo sustituido, un alquil-amido, un alquil-amido-alquilo o un PEG; y
C1 se selecciona del grupo que consiste en un colorante de cianina, un colorante de xanteno, un colorante de cumarina, un colorante de tiazina y un colorante de acridina.
8. El colorante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde cada M1 y M2 se seleccionan cada uno independientemente de un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado, un comonómero de fluoreno, un comonómero de carbazol, un comonómero de vinileno, un comonómero de arileno-etinileno y un comonómero de arileno-vinileno, opcionalmente sustituido con un grupo que se solubiliza en agua.
9. Un miembro de unión específica marcado, que comprende:
un colorante polimérico en tándem de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-8 y un miembro de unión específica unido covalentemente al multicromóforo.
10. Un método para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra, el método comprende:
(a) poner en contacto la muestra con un conjugado de colorante polimérico en tándem que se une específicamente al analito diana para producir una muestra en contacto con una composición de marcaje, en donde el conjugado de colorante polimérico en tándem comprende:
(i) un colorante polimérico en tándem de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-8; Z y
(ii) un miembro de unión específica; y
(b) evaluar la muestra en contacto con una composición de marcaje para detectar la presencia de un complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico en tándem para evaluar si el analito diana está presente en la muestra.
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