ES2911298T3 - Colorantes poliméricos en tándem fluorescentes fotoestables que incluyen complejos de metales luminiscentes - Google Patents

Abstract

Un colorante polimérico en tándem fotoestable que comprende: un multicromóforo polimérico captador de luz soluble en agua que comprende un segmento conjugado que comprende un comonómero de fluoreno sustituido con al menos un grupo solubilizante en agua; y un complejo de rutenio luminiscente enlazado covalentemente al multicromóforo polimérico en proximidad receptora de energía con el mismo, en donde el comonómero de fluoreno está sustituido con al menos un grupo lateral no iónico capaz de impartir una solubilidad en agua superior a 10 mg/ml, en donde el colorante polimérico en tándem se describe mediante la Fórmula (X): **(Ver fórmula)** en donde: F1 es el comonómero de fluoreno; cada M1 y M2 son independientemente un comonómero; L1 es un comonómero de enlace sustituido con un complejo de metal luminiscente enlazado Z1; e es 1; a, b, c, d y f son cada uno independientemente 0 o 1, en donde a+b+c+d+f >= 1; n es 0 o un número entero de 1 a 10 000; m es 0 o un número entero de 1 a 10 000; p es un número entero de 1 a 100 000; y G1 y G2 se seleccionan cada uno independientemente de un grupo terminal, un segmento conjugado π, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado, en donde el complejo de rutenio luminiscente comprende un ligando quelante de metal multidentado sustituido de la estructura: **(Ver fórmula)** en donde de R11 a R18 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo, alquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, arilo, arilo sustituido y enlazador, en donde al menos uno de R11 a R18 está enlazado covalentemente al comonómero de enlace, en donde el colorante polimérico tiene un peso molecular promedio en el intervalo de 10 000 a 100 000.

Description

DESCRIPCIÓN

Colorantes poliméricos en tándem fluorescentes fotoestables que incluyen complejos de metales luminiscentes

Introducción

Los colorantes fluorescentes son compuestos que, cuando se irradian con luz de una longitud de onda que absorben, emiten luz de una longitud de onda (generalmente) diferente. Los colorantes fluorescentes encuentran uso en una variedad de aplicaciones en bioquímica, biología y medicina, por ejemplo, en kits de diagnóstico, en microscopía o en detección de drogas. Los colorantes fluorescentes se caracterizan por una serie de parámetros que permiten al usuario seleccionar un colorante adecuado en dependencia del propósito deseado. Los parámetros de interés incluyen el máximo de longitud de onda de excitación, el máximo de longitud de onda de emisión, el desplazamiento de Stokes, el coeficiente de extinción, el rendimiento cuántico de la fluorescencia y el tiempo de vida de la fluorescencia. Los colorantes pueden seleccionarse de acuerdo con la aplicación de interés para, por ejemplo, permitir la penetración de radiación excitante en muestras biológicas, minimizar la fluorescencia de fondo y/o lograr una alta relación señal/ruido.

El reconocimiento molecular implica la unión específica de dos moléculas. Las moléculas que tienen especificidad de unión para una biomolécula diana encuentran uso en una variedad de aplicaciones en la investigación y el diagnóstico, tales como el marcaje y la separación de analitos, la citometría de flujo, la hibridación in situ, los enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), los análisis de inmunoelectrotransferencia, las separaciones celulares magnéticas y la cromatografía. Las biomoléculas diana pueden detectarse mediante el marcaje con un colorante fluorescente.

Resumen

La invención se expone en el conjunto adjunto de reivindicaciones. Las modalidades no cubiertas por las reivindicaciones adjuntas se proporcionan como referencia.

Se proporcionan colorantes poliméricos en tándem fotoestables. Los colorantes poliméricos en tándem fotoestables incluyen un multicromóforo captador de luz soluble en agua y un complejo de metal luminiscente enlazado covalentemente al multicromóforo y en proximidad receptora de energía con el mismo. También se proporcionan miembros de unión específica marcados que incluyen los colorantes en cuestión. También se proporcionan los métodos para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra y los métodos para marcar una molécula diana en la que los colorantes poliméricos en tándem en cuestión encuentran uso. También se proporcionan sistemas y kits para practicar los métodos en cuestión.

Breve descripción de las figuras

Se entiende que los dibujos, descritos a continuación, son solo para fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.

La Figura 1 ilustra un esquema de un colorante polimérico en tándem fotoestable (100) que incluye un complejo de metal luminiscente como un aceptor. La excitación (101) del multicromóforo captador de luz (102) da como resultado la emisión (103) del complejo de metal luminiscente (104) debido a la transferencia de energía de Forster (FRET) del multicromóforo captador de luz polimérico al complejo de metal.

La Figura 2 ilustra un esquema de un colorante polimérico en tándem fotoestable ilustrativo (MC-Ru) (200), que presenta un complejo de metal derivado de bipiridina de rutenio (Ru(bpy)) (201) adjunto a un multicromóforo captador de luz ilustrativo (MC núcleo) (202).

La Figura 3, los paneles a-b ilustran los espectros de absorbancia (panel a) y emisión (panel b) de una solución 90 nM de MC-Ru en amortiguador PBS antes (pre, línea continua) y después (post, línea discontinua) de la exposición continua a la luz (Aex = 390 nm).

La Figura 4 ilustra los espectros de emisión de MC-Ru en amortiguador PBS cuando se excita por el multicromóforo (Aex = 390 nm; línea negra) y los espectros de emisión del resto del complejo de metal Ru(bpy) conjugado con la cadena principal del polímero cuando se excita directamente (Aex = 450 nm, línea gris.) Recuadro: Primer plano de la banda de emisión observada cuando los restos del complejo de metal Ru(bpy) se excitan directamente con la luz de 450 nm.

La Figura 5 ilustra la fotoestabilidad relativa de un colorante polimérico en tándem fotoestable ilustrativo (MC-Ru) y un multicromóforo captador de luz polimérico ilustrativo (MC núcleo) que no incluye un complejo de metal.

Definiciones

Antes de describir las modalidades ilustrativas con mayor detalle, se establecen las siguientes definiciones para ilustrar y definir el significado y el alcance de los términos usados en la descripción.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado como comúnmente se entiende por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton y otros, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED, John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale y Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan al experto el significado general de muchos de los términos usados en la presente descripción. Aun así, determinados términos se definen a continuación en aras de la claridad y la facilidad de la referencia.

Se observa que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera. Por ejemplo, el término "un cebador" se refiere a uno o más cebadores, es decir, un solo cebador y múltiples cebadores. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de tal terminología exclusiva como "únicamente", "solo", y similares en relación con la exposición de elementos de las reivindicaciones, o el uso de una limitación "negativa".

Como se usa en la presente descripción, el término "muestra" se refiere a un material o mezcla de materiales, en algunos casos en forma líquida, que contiene uno o más analitos de interés. En algunas modalidades, el término, tal como se usa en su sentido más amplio, se refiere a cualquier material vegetal, animal o bacteriano que contiene células o que produce metabolitos celulares, tales como, por ejemplo, tejido o fluido aislado de un individuo (que incluye, pero no se limita a, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, linfa, lágrimas, saliva y secciones de tejido) o de constituyentes de cultivos celulares in vitro, así como también muestras del medio ambiente. El término "muestra" también puede referirse a una "muestra biológica". Como se usa en la presente descripción, el término "una muestra biológica" se refiere a un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, fluidos corporales, que incluyen, pero no se limitan a, sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen). Una "muestra biológica" también puede referirse a un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de este, que incluyen, pero no se limitan a, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secciones externas de la piel, vías respiratorias, intestinales y genitourinarias, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores y órganos. En determinadas modalidades, la muestra se ha extraído de un animal o una planta. Las muestras biológicas pueden incluir células. El término "células" se usa en su sentido convencional para referirse a la unidad estructural básica de los organismos vivos, tanto eucariotas como procariotas, que tienen al menos un núcleo y una membrana celular. En determinadas modalidades, las células incluyen células procariotas, tales como las bacterias. En otras modalidades, las células incluyen células eucariotas, tales como células obtenidas de muestras biológicas de animales, plantas u hongos.

Como se usa en la presente descripción, los términos "unido al soporte" y "enlazado a un soporte" se usan indistintamente y se refieren a un resto (por ejemplo, un miembro de unión específica) que está enlazado de forma covalente o no covalente a un soporte de interés. El enlace covalente puede implicar la reacción química de dos grupos funcionales compatibles (por ejemplo, dos grupos funcionales quimioselectivos, un electrófilo y un nucleófilo, etc.) para formar un enlace covalente entre los dos restos de interés (por ejemplo, un soporte y un miembro de unión específica). En algunos casos, el enlace no covalente puede implicar la unión específica entre dos restos de interés (por ejemplo, dos restos de afinidad tales como un hapteno y un anticuerpo o un resto de biotina y una estreptavidina, etc.). En determinados casos, el enlace no covalente puede implicar la absorción a un sustrato.

Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" se refiere a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que incluyen péptidos que varían de 2-50 aminoácidos de longitud y polipéptidos que tienen más de 50 aminoácidos de longitud. Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción. El término "polipéptido" incluye polímeros de aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados o derivatizados química o bioquímicamente, y polipéptidos que tienen cadenas principales peptídicas modificadas en las que la cadena principal convencional se ha reemplazado por cadenas principales sintéticas o no naturales. Un polipéptido puede ser de cualquier longitud conveniente, por ejemplo, 2 o más aminoácidos, tales como 4 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 20 o más aminoácidos, 50 o más aminoácidos, 100 o más aminoácidos, 300 o más aminoácidos, tales como hasta 500 o 1000 o más aminoácidos. Los "péptidos" pueden ser 2 o más aminoácidos, tales como 4 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 20 o más aminoácidos, tales como hasta 50 aminoácidos. En algunas modalidades, los péptidos tienen una longitud de entre 5 y 30 aminoácidos.

Como se usa en la presente descripción, el término "aislado" se refiere a un resto de interés que es al menos un 60 % libre, al menos un 75 % libre, al menos un 90 % libre, al menos un 95 % libre, al menos un 98 % libre, e incluso al menos un 99 % libre de otros componentes con los que está asociado el resto antes de la purificación.

Una "pluralidad" contiene al menos 2 miembros. En determinados casos, una pluralidad puede tener 10 o más, tales como 100 o más, 1000 o más, 10 000 o más, 100 000 o más, 106 o más, 107 o más, 108 o más o 109 o más miembros.

Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.

Como se usa en la presente descripción, el término "unión específica" se refiere a la capacidad de un agente de captura (o un primer miembro de un par de unión específica) para unirse preferentemente a un analito particular (o un segundo miembro de un par de unión específica) que está presente, por ejemplo, en una mezcla homogénea de diferentes analitos. En algunos casos, una interacción de unión específica discriminará entre analitos deseables e indeseables en una muestra con una especificidad de 10 veces o más para un analito deseable sobre un analito indeseable, tales como 100 veces o más, o 1000 veces o más. En algunos casos, la afinidad entre un agente de captura y el analito cuando se unen específicamente en un complejo de agente de captura/analito es de al menos 10-8 M, al menos 10-9 M, tal como hasta 10-10 M.

Como se usa en la presente descripción, los términos "afinidad" y "avidez" tienen el mismo significado y pueden usarse en la presente descripción de manera intercambiable. "Afinidad" se refiere a la fuerza de la unión, que se correlaciona con una mayor afinidad de unión con una Kd más baja.

Los métodos descritos en la presente descripción incluyen varias etapas. Cada etapa puede realizarse después de que haya transcurrido una cantidad de tiempo predeterminada entre las etapas, según se desee. Como tal, el tiempo entre la realización de cada etapa puede ser de 1 segundo o más, 10 segundos o más, 30 segundos o más, 60 segundos o más, 5 minutos o más, 10 minutos o más, 60 minutos o más y que incluyen 5 horas o más. En determinadas modalidades, cada etapa subsiguiente se realiza inmediatamente después de completar la etapa anterior. En otras modalidades, una etapa puede realizarse después de un tiempo de incubación o de espera después de completar la etapa anterior, por ejemplo, de unos minutos a un tiempo de espera de toda la noche.

Como se usa en la presente descripción, los términos "evaluar", "determinar", "medir" y "calcular" y "ensayar" se usan indistintamente e incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas.

El término "separar", como se usa en la presente descripción, se refiere a la separación física de dos elementos (por ejemplo, por tamaño o afinidad, etc.) así como también a la degradación de un elemento y dejar el otro intacto.

Como se usa en la presente descripción, el término "enlazador" o "enlace" se refiere a un resto de enlace que conecta dos grupos y tiene una cadena principal de 100 átomos o menos de longitud. Un enlazador o enlace puede ser un enlace covalente que conecta dos grupos o una cadena de entre 1 y 100 átomos de longitud, por ejemplo, una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más átomos de carbono de longitud, donde el enlazador puede ser lineal, ramificado, cíclico o de un solo átomo. En algunos casos, el enlazador es un enlazador de ramificación que se refiere a un resto de enlace que conecta tres o más grupos. En determinados casos, uno, dos, tres, cuatro o cinco o más átomos de carbono de una cadena principal del enlazador pueden estar opcionalmente sustituidos con un heteroátomo de azufre, nitrógeno u oxígeno. Los enlaces entre los átomos de la cadena principal pueden ser saturados o insaturados y, en algunos casos, no hay más de uno, dos o tres enlaces insaturados en la cadena principal del enlazador. El enlazador puede incluir uno o más grupos sustituyentes, por ejemplo, con un grupo alquilo, arilo o alquenilo. Un enlazador puede incluir, sin limitaciones, polietilenglicol; éteres, tioéteres, aminas terciarias, alquilos, que pueden ser lineales o ramificados, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, 1 -metiletilo (isopropilo), n-butilo, n-pentilo, 1,1 -dimetiletilo (t-butilo) y similares. La cadena principal del enlazador puede incluir un grupo cíclico, por ejemplo, un grupo arilo, heterociclo o cicloalquilo, donde 2 o más átomos, por ejemplo, 2, 3 o 4 átomos, del grupo cíclico se incluyen en la cadena principal. Un enlazador puede ser escindible o no escindible.

Como se usa en la presente descripción, los términos "óxido de polietileno", "PEO", "polietilenglicol" y "PEG" se usan indistintamente y se refieren a un grupo polimérico que incluye una cadena descrita por la fórmula --(CH²--CH²--O--)n- o un derivado de este. En algunas modalidades, "n" es 5000 o menos, tales como 1000 o menos, 500 o menos, 200 o menos, 100 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos, 15 o menos, tales como de 3 a 15, o de 10 a 15. Se entiende que el grupo polimérico de PEG puede tener cualquier longitud conveniente y puede incluir una variedad de grupos terminales y/o grupos sustituyentes adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, alquilo, arilo, hidroxilo, amino, acilo, aciloxi y amido terminal y/o grupos sustituyentes. Los grupos de PEG que pueden adaptarse para su uso en los multicromóforos en cuestión incluyen los PEG descritos por S. Zalipsky en "Functionalized poly(ethylene glycol) for preparation of biologically relevant conjugates", Bioconjugate Chemistry 1995, 6 (2), 150-165; y por Zhu y otros en "Water-Soluble Conjugated Polymers for Imaging, Diagnosis, and Therapy", Chem. Rev., 2012, 112 (8), pp 4687-4735.

Como se usa en la presente descripción, el término "alquilo" por sí mismo o como parte de otro sustituyente se refiere a un radical de hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada saturado derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alcano original. Los grupos alquilo de interés incluyen, pero no se limitan a, metilo; etilo, propilos tales como propan-1-ilo o propan-2-ilo; y butilos, tales como butan-1-ilo, butan-2-ilo, 2-metil-propan-1-ilo o 2-metil-propan-2-ilo. En algunas modalidades, un grupo alquilo incluye de 1 a 20 átomos de carbono. En algunas modalidades, un grupo alquilo incluye de 1 a 10 átomos de carbono. En determinadas modalidades, un grupo alquilo incluye de 1 a 6 átomos de carbono, tales como de 1 a 4 átomos de carbono. Este término incluye, a modo de ejemplo, grupos hidrocarbilo lineales y ramificados tales como metilo (CH³-), etilo (CH³CH²-), n-propilo (CH³CH²CH²-), isopropilo ((CH³)²CH-), n-butilo (CH³CH²CH²CH²-), isobutilo ((CHa)²CHCH²-), sec-butilo ((CHa)(CHaCH²)CH-), t-butilo ((CH3)3C-), n-pentilo (CH3CH²CH²CH²CH²-) y neopentilo ((CH3)3CCH2-).

El término "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo como se define en la presente descripción en donde uno o más átomos de carbono en la cadena de alquilo se han reemplazado opcionalmente con un heteroátomo tales como -O-, -N-, -S-, -S(O)n-(donde n es de 0 a 2), -NR-(donde R es hidrógeno o alquilo) y que tiene de 1 a 5 sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste en alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO²-alquilo, -SO²-arilo, -SO²-heteroarilo, y -NRaRb, en donde R y R" pueden ser iguales o diferentes y se eligen entre hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo y heterocíclico.

"Arilo" por sí mismo o como parte de otro sustituyente se refiere a un radical de hidrocarburo aromático monovalente derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillos aromáticos. Los grupos arilo de interés incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleyadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, trifenileno, trinaftaleno y similares. En determinadas modalidades, un grupo arilo incluye de 6 a 20 átomos de carbono. En determinadas modalidades, un grupo arilo incluye de 6 a 12 átomos de carbono. Los ejemplos de un grupo arilo son fenilo y naftilo.

"Heteroarilo" por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un radical heteroaromático monovalente derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de un sistema de anillo heteroaromático. Los grupos heteroarilo de interés incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de acridina, arsindol, carbazol, pcarbolina, cromano, cromeno, cinolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolizina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalazina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolizina, quinazolina, quinolina, quinolizina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, triazol, benzotriazol, tiofeno, triazol, xanteno, benzodioxol y similares. En determinadas modalidades, el grupo heteroarilo es un heteroarilo de 5-20 miembros. En determinadas modalidades, el grupo heteroarilo es un heteroarilo de 5-10 miembros. En determinadas modalidades, los grupos heteroarilo son los derivados de tiofeno, pirrol, benzotiofeno, benzofurano, indol, piridina, quinolina, imidazol, oxazol y pirazina.

El término "alcarilo" o "aralquilo" se refiere a los grupos -alquileno-arilo y alquileno-arilo sustituido donde alquileno, alquileno sustituido y arilo se definen en la presente descripción.

"Alquileno" se refiere a grupos hidrocarbilo alifáticos divalentes que tienen preferentemente de 1 a 6 y con mayor preferencia de 1 a 3 átomos de carbono que son de cadena lineal o ramificada, y que están opcionalmente interrumpidos con uno o más grupos que se seleccionan de - O-, -NR10-, -NR10C(O)-, -C(O)NR10- y similares. Este término incluye, a modo de ejemplo, metileno (-CH²-), etileno (-CH²CH²-), n-propileno (-CH²CH²CH²-), isopropileno (-CH²CH(CH³)-), (-C(CH³)²CH²CH²-), (-C(CH³)²CH²C(O)-), (-C(CH³)²CH²C(O)NH-), (-CH(CH³)CH²-) y similares. "Alquileno sustituido" se refiere a un grupo alquileno que tiene de 1 a 3 hidrógenos reemplazados con sustituyentes como se describe para los carbonos en la definición de "sustituido" a continuación.

"Sustituido" se refiere a un grupo en el que uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan independientemente con los mismos o diferentes sustituyentes. Los sustituyentes de interés incluyen, pero no se limitan a, alquilendioxi (tal como metilendioxi), -M, -R60, -O-, =O, -OR60, -SR60, -S‘, =S, -NR60R61, =NR60, -CF³, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO² , =N² , -N³, -S(O)²O-, -S(O)²OH, -S(O)²R60, -OS(O)²O-, -OS(O)²R60, -P(O)(O-)2, -P(O)(OR60) (O-), -OP(O)(OR60)(OR61), -C(O)R60, -C(S)R60, -C(O)OR60, -C(O)NR60R61,-C(O)O-, -C(S) OR60, -NR62C(O)NR60R61, -NR62C(S)NR60R61, -NR62C(NR63)NR60R61 y -C(NR62)NR60R61 donde M es halógeno; R60, R61, R62 y R63 son independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloheteroalquilo, cicloheteroalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido, u opcionalmente R60 y R61 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo cicloheteroalquilo o cicloheteroalquilo sustituido; y R64 y R65 son independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloheteroalquilo, cicloheteroalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido, u opcionalmente R64 y R65 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo cicloheteroalquilo o cicloheteroalquilo sustituido. En determinadas modalidades, los sustituyentes incluyen -M, -R60, =O, -OR60, -SR60, -S‘ , =S, -NR60R61, =NR60, -CF³ , -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO² , =N² , -N³ , -S(O)²R60, -OS(O)²O- -OS(O)²R60, -P(O)(O‘)², -P(O)(OR60)(O-), -OP(O)(OR60)(OR61), -C(O)R60, -C(S)R60, -C(O)OR60, -C(O)NR60R61,-C(O)O-, -NR62C(O)NR60R61. En ^{determinadas modalidades, los sustituyentes incluyen -M, -R60, =O,} -O^r60, ^-SR60, -ⁿR⁶⁰R⁶¹, ^{-CF3, -CN, -NO2, -}S(O)²R60, -P(O)(OR60)(O-), -OP(O)(OR60)(OR61), -C(O)R60, -C(O)OR60, -C(O)NR60R61,-C(O)O-. En determinadas ^{modalidades, los sustituyentes incluyen -M, -R60, =O, -OR60, -SR60,} -nR⁶⁰R⁶¹, ^{-CF3 , -CN, -NO2, -S(O)2R60, -}OP(O)(OR60)(OR61), -C(O)R60, - C(O)OR60,-C(O)O‘, donde R60, R61 y R62 son como se definen anteriormente. Por ejemplo, un grupo sustituido puede tener un sustituyente metilendioxi o uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan de un átomo de halógeno, un grupo alquilo (1-4C) y un grupo alcoxi (1-4C). Cuando el grupo que se sustituye es un grupo arilo o heteroarilo, el(los) sustituyente(s) (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) puede(n) denominarse "sustituyente(s) arilo".

Otras definiciones de términos pueden aparecer a lo largo de la especificación.

Descripción detallada

La invención se expone en el conjunto adjunto de reivindicaciones. Las modalidades no cubiertas por las reivindicaciones adjuntas se proporcionan como referencia.

Como se resume anteriormente, se proporcionan colorantes poliméricos en tándem fotoestables. Los colorantes poliméricos en tándem fotoestables incluyen un multicromóforo captador de luz soluble en agua y un complejo de metal luminiscente enlazado covalentemente al multicromóforo y en proximidad receptora de energía con el mismo. También se proporcionan miembros de unión específica marcados que incluyen los colorantes en cuestión. También se proporcionan los métodos para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra y los métodos para marcar una molécula diana en la que los colorantes poliméricos en tándem en cuestión encuentran uso. También se proporcionan sistemas y kits para practicar los métodos en cuestión.

Antes de que se describan con mayor detalle las diversas modalidades, debe entenderse que las enseñanzas de esta descripción no se limitan a las modalidades particulares descritas y, como tales, pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción tiene el propósito de describir las modalidades particulares únicamente, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de las presentes enseñanzas se limitará únicamente mediante las reivindicaciones adjuntas.

Los encabezados de las secciones que se usan en la presente descripción son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como una limitación del tema descrito de ninguna manera. Si bien las presentes enseñanzas se describen junto con diversas modalidades, no se pretende que las presentes enseñanzas se limiten a tales modalidades. Por el contrario, las presentes enseñanzas abarcan diversas alternativas, modificaciones y equivalentes, como apreciarán los expertos en la técnica.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Aunque cualquier método y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción también pueden usarse en la práctica o la prueba de las presentes enseñanzas, ahora se describen los métodos y los materiales ilustrativos.

La cita de cualquier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que las reivindicaciones de la presente no tienen derecho a ser anterior a tal publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden confirmarse de manera independiente.

Como será evidente para los expertos en la técnica al leer esta descripción, cada una de las modalidades individuales descritas e ilustradas en la presente descripción tiene componentes y características discretas que pueden separarse fácilmente de o combinarse con las características de cualquiera de las otras diversas modalidades sin apartarse del alcance o el sentido de las presentes enseñanzas. Cualquier método expuesto puede llevarse a cabo en el orden de los eventos expuestos o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

Al describir adicionalmente la descripción, los colorantes poliméricos en tándem fotoestables que incluyen multicromóforos captadores de luz donantes y complejos de metales luminiscentes aceptores se describen primero con mayor detalle. A continuación, se describen los miembros de unión específica marcados que incluyen los colorantes poliméricos en tándem fotoestables en cuestión. Luego, se revisan los métodos de interés en los que los colorantes poliméricos en tándem fotoestables encuentran uso. También se describen sistemas y kits que pueden usarse en la práctica de los métodos de la invención.

Colorantes poliméricos en tándem fotoestables

La presente descripción se refiere a colorantes poliméricos en tándem fotoestables. Los colorantes poliméricos en tándem en cuestión incluyen un multicromóforo captador de luz soluble en agua donante y un complejo de metal luminiscente enlazado covalentemente aceptor en la proximidad receptora de energía al multicromóforo. El número de unidades del complejo de metal luminiscente aceptor que están enlazadas al multicromóforo captador de luz soluble en agua donante puede variar, donde en algunos casos el número varía de 1 % en moles a 50 % en moles, tales como de 5 % en moles a 25 % en moles o de 10 % en moles a 25 % en moles. En algunos casos, el complejo de metal luminiscente aceptor es más fotoestable que un colorante fluoróforo orgánico (por ejemplo, un colorante que carece de un ion metálico tal como un colorante de xanteno o cianina). La fotodegradación se refiere a la modificación fotoquímica de una molécula fluorescente que conduce a una molécula modificada con diferentes propiedades de fluorescencia (por ejemplo, fluorescencia reducida en las longitudes de onda de interés). El multicromóforo captador de luz soluble en agua es en sí mismo fluorescente y capaz de transferir energía a un complejo de metal luminiscente enlazado aceptor. Como tal, la excitación del multicromóforo donante conduce a la transferencia de energía y la emisión desde el complejo de metal fotoestable unido covalentemente aceptor.

Específicamente, se proporciona un colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con las reivindicaciones 1-9.

Se proporciona un miembro de unión específica marcado que comprende el colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con las reivindicaciones 1-9 y un miembro de unión específica enlazado covalentemente al multicromóforo polimérico de este colorante polimérico en tándem fotoestable, y es el tema de la reivindicación 11.

Otro aspecto de la descripción reivindicada es:

Un método para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra, el método comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un conjugado de colorante polimérico que se une específicamente al analito diana para producir una muestra en contacto con una composición de marcaje, en donde el conjugado de colorante polimérico comprende:

(i) un colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9; y

(ii) un miembro de unión específica; y

(b) ensayar la muestra en contacto con una composición de marcaje para detectar la presencia de un complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico para evaluar si el analito diana está presente en la muestra.

Otro aspecto de la descripción reivindicada es un método para marcar una molécula diana, el método comprende: poner en contacto la molécula diana con un colorante polimérico fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-9 para producir una molécula diana marcada, en donde el colorante polimérico fotoestable también comprende un marcador de conjugación que se enlaza covalentemente a la molécula diana.

Otro aspecto de la descripción reivindicada es un sistema de citometría de flujo que comprende:

un citómetro de flujo que comprende una ruta de flujo;

una composición en la ruta de flujo, en donde la composición comprende:

una muestra; y

un miembro de unión específica marcado que comprende:

un colorante polimérico fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-9 y un miembro de unión específica que se une específicamente a un analito diana y está enlazado covalentemente al multicromóforo polimérico del colorante polimérico fotoestable.

Como se usa en la presente descripción, el término "fotoestable" se refiere a una molécula fluorescente que es resistente a la fotodegradación, por lo que tiene una señal de emisión que es sustancialmente estable durante la exposición a la luz de excitación incidente durante un período prolongado de tiempo, por ejemplo, una señal de emisión que mantiene al menos 50 % de intensidad durante 20 minutos o más (por ejemplo, 40 minutos o más, 50 minutos o más, 60 minutos o más, 90 minutos o más, 2 horas o más, 3 horas o más, 6 horas o más, o incluso más). En algunos casos, la exposición del colorante fotoestable a la luz de excitación incidente es continua. En determinados casos, la exposición del colorante fotoestable a la luz de excitación incidente es discontinua. Por "luz de excitación incidente" se entiende la luz que tiene una longitud de onda y una intensidad adecuadas para excitar el multicromóforo captador de luz. Por "mantiene al menos un X % de intensidad" se entiende que la intensidad de la señal de emisión del colorante irradiado en un momento dado es al menos un X % de la intensidad de la señal de emisión en el momento cero bajo las mismas condiciones de excitación, donde X % puede referirse a cualquier % de intensidad conveniente de 1 a 100 % de intensidad, por ejemplo, 50 % de intensidad.

En algunas modalidades, un colorante polimérico en tándem fotoestable tiene una señal de emisión que mantiene al menos un 60 % de intensidad durante 20 minutos o más, tales como durante 30 minutos o más, 40 minutos o más, 50 minutos o más, 60 minutos o más, 90 minutos o más, 2 horas o más, 3 horas o más, 6 horas o más, o incluso más. En algunos casos, un colorante polimérico en tándem fotoestable tiene una señal de emisión que mantiene al menos un 70 % de intensidad durante 20 minutos o más, tales como durante 30 minutos o más, 40 minutos o más, 50 minutos o más, 60 minutos o más, 90 minutos o más, 2 horas o más, 3 horas o más, 6 horas o más, o incluso más. En algunos casos, un colorante polimérico en tándem fotoestable tiene una señal de emisión que mantiene al menos un 80 % de intensidad durante 20 minutos o más, tales como durante 30 minutos o más, 40 minutos o más, 50 minutos o más, 60 minutos o más, 90 minutos o más, 2 horas o más, 3 horas o más, 6 horas o más, o incluso más. En determinados casos, un colorante polimérico en tándem fotoestable tiene una señal de emisión que mantiene al menos un 90 % de intensidad durante 20 minutos o más, tales como durante 30 minutos o más, 40 minutos o más, 50 minutos o más, 60 minutos o más, 90 minutos o más, 2 horas o más, 3 horas o más, 6 horas o más, o incluso más.

Los mecanismos para la transferencia de energía desde el multicromóforo captador de luz soluble en agua donante fluorescente hasta el complejo de metal luminiscente enlazado aceptor incluyen, por ejemplo, la transferencia de energía resonante (por ejemplo, transferencia de energía de resonancia de Forster (o fluorescencia), FRET), el intercambio de carga cuántica (transferencia de energía de Dexter) y similares. En algunos casos, estos mecanismos para la transferencia de energía tienen un alcance relativamente corto; es decir, la estrecha proximidad del sistema multicromóforo captador de luz al complejo de metal aceptor proporciona una transferencia de energía eficiente. En algunos casos, en condiciones de transferencia de energía eficiente, la amplificación de la emisión del complejo de metal aceptor se produce cuando el número de complejos de metales individuales en el sistema multicromóforo captador de luz es grande; es decir, la emisión del complejo de metal luminiscente (por ejemplo, cromóforo de señalización) es más intensa cuando la luz incidente (la "luz de la bomba") tiene una longitud de onda que se absorbe por el multicromóforo captador de luz que cuando el complejo de metal luminiscente se excita directamente por la luz de la bomba.

Por transferencia de energía "eficiente" se entiende que el 10 % o más, tales como el 20 % o más o el 30 % o más, de la energía captada por el donante se transfiere al aceptor. Por "amplificación" se entiende que la señal del cromóforo aceptor es 1,5x o mayor cuando se excita mediante la transferencia de energía del multicromóforo captador de luz donante en comparación con la excitación directa con la luz incidente de una intensidad equivalente. La señal puede medirse mediante el uso de cualquier método conveniente. En algunos casos, la señal de 1,5x o mayor se refiere a una intensidad de la luz emitida. En determinados casos, la señal de 1,5x o mayor se refiere a una mayor relación señal/ruido. En determinadas modalidades del colorante polimérico en tándem, la emisión del cromóforo aceptor es 1,5 veces mayor o más cuando se excita por el multicromóforo en comparación con la excitación directa del cromóforo aceptor con la luz incidente.

La emisión del complejo de metal luminiscente enlazado del colorante polimérico en tándem puede tener un rendimiento cuántico de 0,03 o más, tales como un rendimiento cuántico de 0,04 o más, 0,05 o más, 0,06 o más, 0,07 o más, 0,08 o más, 0,09 o más, 0,1 o más, 0,15 o más, 0,2 o más, 0,3 o más o incluso más. En algunos casos, el colorante polimérico en tándem tiene un coeficiente de extinción de 5 * 105 cm-1M-1 o más, tales como 6 * 105 cm-1M-1 o más, 7 * 105 cm-1M-1 o más, 8 * 105 cm-1M-1 o más, 9 * 105 cm-1M-1 o más, tales como 1 * 106 cm-1M-1 o más, 1,5 * 106 cm-1M-1 o más, 2 * 106 cm-1M-1 o más, 2,5 * 106 cm-1M-1 o más, 3 * 106 cm-1M-1 o más, 4 * 106 cm-1M-1 o más, 5 * 106 cm-1M-1 o más, 6 * 106 cm-1M-1 o más, 7 * 106 cm-1M-1 o más, o 8 * 106 cm-1M-1 o más. En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem tiene un coeficiente de extinción molar de 5 * 105 M-1cm-1 o más. En determinadas modalidades, el colorante polimérico en tándem tiene un coeficiente de extinción molar de 1 * 106 M-1cm-1 o más.

Los colorantes poliméricos en tándem en cuestión proporcionan emisiones de fluorescencia fotoestables de complejos de metales luminiscentes que son más brillantes que las emisiones que son posibles de dichos complejos de metales de forma aislada. La emisión del complejo de metal luminiscente enlazado del colorante polimérico en tándem puede tener un brillo de 50 mM-1cm-1 o más, tales como 60 mM-1cm-1 o más, 70 mM-1cm-1 o más, 80 mM-1cm-1 o más, 90 mM-1cm-1 o más, 100 mM-1cm-1 o más, 150 mM-1cm-1 o más, 200 mM-1cm-1 o más, 250 mM-1cm-1 o más, 300 mM-1cm-1 o más, o incluso más. En determinados casos, la emisión del complejo de metal luminiscente enlazado del colorante polimérico en tándem tiene un brillo que es al menos 5 veces mayor que el brillo de un complejo de metal luminiscente excitado directamente, tales como al menos 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 100 veces mayor, al menos 300 veces mayor, o incluso mayor que el brillo de un complejo de metal luminiscente directamente excitado.

Complejos de metales luminiscentes

Los aspectos de los colorantes poliméricos en tándem en cuestión incluyen un complejo de metal luminiscente que está enlazado al multicromóforo captador de luz soluble en agua. Mediante la transferencia de energía de una longitud de onda adecuada desde el multicromóforo captador de luz al complejo de metal luminiscente enlazado, puede aumentarse el brillo del complejo de metal luminiscente en el colorante polimérico en tándem con respecto a un complejo de metal excitado directamente. Cualquier complejo de metal luminiscente conveniente puede usarse en los colorantes poliméricos en tándem en cuestión. En algunos casos, el complejo de metal luminiscente enlazado es un complejo de ligando-metal de transición luminiscente. Cualquier complejo de ligando-metal de transición luminiscente puede usarse en los colorantes en cuestión. Los complejos de ligando-metal de transición pueden tener bandas de absorción anchas en el área de 300 a 500 nm del espectro debido a las transiciones de transferencia de carga de metal a ligando (MLCT). Las transiciones MLCT también pueden conducir a coeficientes de extinción en el intervalo de 10000 a 30000 M ^cm i, que es menor que los coeficientes de extinción de fluoróforos orgánicos tales como xanteno (por ejemplo, fluoresceína) o colorantes de cianina. Los colorantes poliméricos en tándem en cuestión proporcionan emisiones de fluorescencia fotoestables de complejos de ligando-metal de transición luminiscente que son más brillantes que las emisiones que son posibles de dichos complejos de metales de forma aislada. Los complejos de ligando-metal de transición pueden comportarse como una sola unidad cromatófora, en contraste con los complejos de lantánidos y actínidos.

En determinadas modalidades no reivindicadas, el complejo de metal de transición luminiscente incluye un ion metálico de transición de primera fila (es decir, con respecto a la tabla periódica de elementos). En algunos casos, el complejo de metal de transición luminiscente se selecciona de un complejo de hierro, un complejo de cobalto, un complejo de níquel, un complejo de cobre y un complejo de zinc. En determinadas modalidades no reivindicadas, el complejo de metal de transición luminiscente incluye un ion metálico de transición de la segunda fila. En algunos casos no reivindicados, el complejo de metal de transición luminiscente se selecciona de un complejo de renio, un complejo de cadmio, un complejo de plata y un complejo de paladio. En determinadas modalidades no reivindicadas, el complejo de metal de transición luminiscente incluye un ion metálico de transición de la tercera fila. En algunos casos no reivindicados, el complejo de metal de transición luminiscente se selecciona de un complejo de renio, un complejo de osmio, un complejo de iridio, un complejo de platino, un complejo de oro y un complejo de mercurio. En algunos casos no reivindicados, el complejo de metal luminiscente enlazado incluye un ion metálico que se selecciona de rutenio, renio, rodio y osmio.

En determinados casos no reivindicados, el complejo de metal luminiscente enlazado incluye un ion metálico del grupo 13. Cualquier complejo conveniente de iones metálicos del grupo 13 puede usarse en los colorantes en cuestión. En determinadas modalidades, el complejo de metal luminiscente enlazado se selecciona de un complejo de aluminio, un complejo de galio y un complejo de indio. En algunos casos, el ion metálico del grupo 13 forma complejos con un ligando quelante basado en ácido hidroxámico aromático cíclico, por ejemplo, un ligando quelante basado en 1-oxo-2-hidroxi-isoquinolina (1,2-HOIQO).

En determinados casos no reivindicados, el complejo de metal luminiscente enlazado es un complejo de metal de lantánidos luminiscente. Los iones metálicos de lantánidos son fluorescentes, especialmente cuando se encuentran en un estado de oxidación 3, debido a sus configuraciones electrónicas. La energía absorbida por un ligando orgánico puede transferirse a estados excitados de lantánidos (III) para proporcionar bandas de emisión del metal de lantánidos. Cualquier complejo de lantánidos conveniente puede usarse en los colorantes en cuestión. Los complejos de metales de lantánidos de interés incluyen, pero no se limitan a, complejos de Sm(III), Eu(III), Tb(lll) y Dy(lll). En algunos casos, el complejo de metal luminiscente enlazado es un complejo de metal de actínidos luminiscente. Al igual que los lantánidos, todos los actínidos excepto uno son elementos de bloque f y pueden tener configuraciones electrónicas que proporcionan fluorescencia. Los complejos de metales de actínidos de interés incluyen, pero no se limitan a, complejos de U(VI), Am(III) y Cm(lll).

Cualquier ion metálico conveniente de interés puede usarse en el complejo de iones metálicos luminiscentes. Los iones metálicos de interés incluyen, pero no se limitan a, rutenio (por ejemplo, Ru(II)), renio (por ejemplo, Re(I)), rodio (por ejemplo, Rh(I), osmio (por ejemplo, Os(II)), iridio (por ejemplo, Ir(III)), zinc (por ejemplo, Zn(II)), níquel (por ejemplo, Ni(II)), cadmio (por ejemplo, Cd(II)), mercurio (por ejemplo, Hg(II)), cobalto (por ejemplo, Co(II)), plata (por ejemplo, Ag(I)), oro (por ejemplo, Au(I)), platino (por ejemplo, Pt(II)), paladio (por ejemplo, Pd(II)), cobre (por ejemplo, Cu(I)), aluminio (por ejemplo, AI(III)), galio (por ejemplo, Ga(III)), indio (por ejemplo, In(III)), samario (por ejemplo, Sm(III)), europio (por ejemplo, Eu(III)), terbio (por ejemplo, Tb(III)) y disprosio (por ejemplo, Dy(III)).

Los complejos de metales luminiscentes que pueden adaptarse para su uso como un complejo de metal luminiscente enlazado incluyen, bis(2,2'-bipiridina)-(5-aminofenantrolina)rutenio bis(hexafluorofosfato), bis(2,2'-bipiridina)-(5-isotiocianato-fenantrolina)rutenio bis(hexafluorofosfato), bis(2,2'-bipiridina)-4'-metil-4-carboxibipiridinarutenio N-succinimidil éster-bis(hexafluorofosfato), dicloruro de rutenio-tris(2,2'-bipiridilo) (Ru(bpy)³), un complejo de acetiluro de cobre(I), un complejo de acetiluro de renio (I), un complejo de calcogenuro de cobre(I), un complejo de calcogenuro de plata(I), un complejo de calcogenuro de oro(I), un complejo de europio con ácido piridin-2-carboxílico sustituido con bencimidazol, un complejo de europio con ácidos piridin-2-carboxílicos sustituidos con benzotiazol y/o benzoxazol y un complejo de p-dicetonato de europio (III). Se entiende que puede usarse una variedad de contraiones en los complejos de metales enlazados en cuestión, y que los contraiones descritos en la presente descripción son opcionales e intercambiables con cualquier otro contraión conveniente. Se entiende que cualquier ligando conveniente de los complejos de metales descritos en la presente descripción puede seleccionarse y adaptarse para la unión covalente al multicromóforo.

El complejo de metal luminiscente enlazado puede incluir uno o más ligandos donantes de nitrógeno. Los ligandos donantes de nitrógeno que encuentran uso en los complejos de metales en cuestión incluyen, pero no se limitan a, piridinas, bipiridinas, terc-piridinas, fenantrolinas, batofenantrolinas, imidazoles, pirroles, pirazoles, indazoles, triazoles, pirazinas, pirinidinas, piridazinas, purinas, porfirinas y ftalocianinas. En algunos casos, los anillos que contienen nitrógeno de los ligandos también pueden modificarse adicionalmente, tal como por fusión a anillos aromáticos, por ejemplo, para producir un benzotriazol o una biquinolina, o por sustitución, por ejemplo, con un sustituyente heteroarilo o un enlazador.

Los complejos de metales luminiscentes que encuentran uso en los colorantes poliméricos en tándem en cuestión pueden tener una configuración particular de sitios de coordinación alrededor del ion metálico. En algunos casos, el complejo incluye 4, 6 u 8 sitios de coordinación. Una variedad de geometrías encuentra uso en los complejos de metales en cuestión. En algunos casos, la configuración es octaédrica. El complejo de metal puede incluir uno o más ligandos quelantes. Como se usa en la presente descripción, los términos "ligando quelante" y "ligando multidentado" se usan indistintamente para referirse a un ligando que puede coordinarse con un ion metálico a través de dos o más átomos donantes.

En determinados casos, el complejo de metal luminiscente enlazado incluye un ligando quelante de metal multidentado sustituido. En determinados casos, el ligando quelante de metal multidentado sustituido es un ligando basado en oxígeno y/o nitrógeno multidentado. En determinados casos, el ligando quelante de metal multidentado sustituido es un ligando basado en nitrógeno multidentado, por ejemplo, un ligando que incluye múltiples grupos funcionales que contienen N capaces de formar enlaces dativos con un ion metálico. Los ligandos basados en nitrógeno multidentado de interés incluyen, pero no se limitan a, etilendiaminas, tetrametiletilendiaminas, piridinas, polipiridilos (que incluyen bipiridilos, terpiridilos y otros), quinolinas y fenantrolinas. Los ligandos basados en oxígeno multidentado de interés incluyen, pero no se limitan a, bencenodicarboxilatos.

Se entiende que, para cualquiera de los colorantes poliméricos en tándem descritos en la presente descripción, los iones metálicos y/o las porciones unidas de forma no covalente de los ligandos del complejo de metal luminiscente pueden unirse (por ejemplo, quelarse) al polímero en cualquier momento conveniente durante la preparación. Por ejemplo, un ligando quelante puede enlazarse covalentemente a un multicromóforo de interés para producir un precursor conjugado de polímero-ligando que tiene sitios de unión a iones metálicos en ubicaciones seleccionadas de la cadena lateral a lo largo del multicromóforo. Los iones metálicos de interés y los ligandos de coordinación adicionales de interés (por ejemplo, ligandos quelantes unidos de forma no covalente, por ejemplo, Ru(bpy)²Ch) pueden unirse posteriormente al conjugado polímero-ligando conjugado en cualquier momento conveniente antes de su uso (véase, por ejemplo, el Esquema 1 en el que puede añadirse un ion metálico (Mn+) y un ligando de bipiridina (bpy) al precursor, por ejemplo, mediante la adición de un reactivo como Ru(bpy)2Cl2)).

Esquema 1: Representación de una modalidad de un método de preparación de un colorante polimérico en tándem a partir de un precursor conjugado de polímero-ligando que tiene un sitio de unión a iones metálicos. En el esquema, L es un enlazador y el polímero conjugado está representado por tres hexágonos unidos.

Como tal, los aspectos de la presente descripción incluyen precursores conjugados de polímero-ligando de cualquiera de los colorantes poliméricos en tándem en cuestión descritos en la presente descripción. El método particular de preparación de los colorantes poliméricos en tándem en cuestión o los precursores de estos depende de los ligandos y los complejos de metales seleccionados para la unión covalente a un multicromóforo de interés. Se entiende que hay muchas variaciones posibles que pueden producir resultados equivalentes.

En algunas modalidades, el complejo de metal luminiscente enlazado incluye un ligando que tiene al menos dos anillos de piridilo, de acuerdo con la Fórmula (I)

donde los anillos de piridilo tienen los sustituyentes del anillo primario R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 que se seleccionan independientemente de H, halógeno, CN, alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo sustituido, perfluoroalquilo, alcoxi (por ejemplo, alcoxi inferior que tiene de 1-6 átomos de carbono), alcoxi sustituido, carboxi (-COOH), carboxialquilo, carboxialcoxi, carboxialquilamino, carboxilalquiltio (por ejemplo, un sustituyente que tiene 2-7 carbonos), amino, sal de amino (por ejemplo, cuando el contraión es un haluro, sulfato, sulfonato, fosfato, perclorato, tetrafluoroborato, tetrafenilboruro o un anión de un ácido carboxílico aromático o alifático), ácido sulfónico (-SO3H) o una sal de ácido sulfónico, alquilamino; dialquilamino y un enlazador; u opcionalmente, R5 y R6 están enlazados cíclicamente de modo que R5, R6 y Q junto con los átomos a los que están unidos forman un anillo de 6 miembros; Q se selecciona de una unión covalente, un enlazador, un arilo, un arilo sustituido, un heteroarilo y un heteroarilo sustituido; donde al menos uno de R1-R8 y Q está enlazado covalentemente al multicromóforo.

En determinados casos, un ligando del complejo de metal está enlazado covalentemente a un grupo de cadena lateral del multicromóforo captador de luz soluble en agua. En determinados casos de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 el sustituyente del grupo alquilo tiene 1-6 carbonos. En determinados casos, el ligando está sulfonado e incluye al menos un sustituyente que es ácido sulfónico o sal de ácido sulfónico. En determinados casos, los anillos de piridilo incluyen al menos un sustituyente arilo o heteroarilo. En algunos casos, el ligando no tiene más de dos sustituyentes arilo o heteroarilo, que en algunos casos están unidos a R1, R3, R6 y/o R8, en algunos casos a R3 y R6. En determinadas modalidades de Fórmula (I), el ligando es una fenantrolina sustituida. En determinadas modalidades de Fórmula (I), Q es un enlace covalente y el ligando es una bipiridina sustituida.

En algunas modalidades de Fórmula (I), el ligando tiene la Fórmula (II)

donde R11 y R12 son cada uno independientemente H, un alquilo (por ejemplo, un alquilo inferior de 1-6 carbonos), un alquilo sustituido; R1-R8 son como se describe para la Fórmula (I) e Y es uno o dos ácidos sulfónicos opcionales o sales de un ácido sulfónico.

En algunas modalidades de Fórmula (I), Q es un piridilo disustituido en 2,6 y el ligando es un grupo complejante basado en terpiridilo, de acuerdo con la Fórmula (III):

donde R1-R4 y R5-R8 son como se definen anteriormente; los sustituyentes R16, R17 y R18 son independientemente H; alquilo, alquilo sustituido, perfluoroalquilo, alcoxi (por ejemplo, alcoxi inferior que tiene de 1-6 átomos de carbono), ácido sulfónico, sal de ácido sulfónico; amino, alquilamino o dialquilamino, donde cada grupo alquilo tiene de 1-6 carbonos; carboxi; carboxialquilo, carboxialcoxi, carboxialquilamino o carboxialquiltio que tiene de 2-7 carbonos; halógeno o CN. En algunos casos, uno o más de R16, R17 y R18 sirven como punto de unión para el ácido sulfónico o la sal del ácido sulfónico. En determinados casos, R16, R17 y R18 son hidrógeno o ácido sulfónico. En algunos casos, R16 y R18 son hidrógeno y R17 es ácido sulfónico.

Cualquier ligando de bipiridina conveniente puede unirse covalentemente al multicromóforo en la preparación de los colorantes en cuestión. En algunos casos, el complejo de metal incluye un derivado de bipiridina, tal como una bipiridina descrita en la patente de Estados Unidos núm. 6,329,205 de Diwu y otros; la patente de Estados Unidos núm. 6,316,267 de Bhalgat y otros; la patente de Estados Unidos núm. 7,087,384 de Autiero y otros. En las reivindicaciones, el colorante polimérico en tándem incluye un ligando quelante de metal multidentado sustituido (por ejemplo, un ligando de bipiridina) descrito por la Fórmula (IVa):

en donde R11 a R18 son cada uno independientemente H, un alquilo, un alquilo sustituido, un heteroarilo, un heteroarilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido, un alcoxi, un alcoxi sustituido, halógeno, CN, carboxi, carboxialquilamino; amino o sal de amino; ácido sulfónico (-SO3H) o una sal de ácido sulfónico; o un enlazador, en donde al menos uno de R11 a R18 está enlazado covalentemente al multicromóforo (por ejemplo, a través del comonómero de enlace como se describe en la presente descripción). En determinados casos, el ligando quelante de metal multidentado sustituido se describe mediante la Fórmula (Va):

en donde R13 es H, un alquilo, un alquilo sustituido; y L es un enlazador que está enlazado covalentemente al multicromóforo (por ejemplo, a través del comonómero de enlace como se describe en la presente descripción). En determinados casos de Fórmula (Va), R13 es H. En determinados casos de Fórmula (Va), R13 es un alquilo (por ejemplo, un alquilo inferior que tiene 1-6 carbonos). En determinados casos de Fórmula (Va), R13 es un alquilo sustituido (por ejemplo, un alquilo inferior sustituido que tiene 1-6 carbonos).

En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem incluye un ligando quelante de metal multidentado sustituido descrito por la Fórmula (IVb):

en donde de R11 a R13 y de R16 a R20 son cada uno independientemente H, un alquilo, un alquilo sustituido, un heteroarilo, un heteroarilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido, un alcoxi, un alcoxi sustituido, halógeno, CN, carboxi, carboxialquilamino; amino o sal de amino; ácido sulfónico (-SO³ H) o una sal de ácido sulfónico; o un enlazador, en donde al menos uno de R11 a R18 está enlazado covalentemente al multicromóforo (por ejemplo, a través del comonómero de enlace como se describe en la presente descripción).

En determinados casos, el ligando quelante de metal multidentado sustituido se describe mediante una de las Fórmulas (Vb) y (Vc):

en donde R13 es H, un alquilo, un alquilo sustituido; y L es un enlazador que está enlazado covalentemente al multicromóforo (por ejemplo, a través del comonómero de enlace como se describe en la presente descripción). En determinados casos de Fórmulas (Vb) y (Vc), R13 es H. En determinados casos de Fórmulas (Vb) y (Vc), R13 es un alquilo (por ejemplo, un alquilo inferior que tiene 1-6 carbonos). En determinados casos de Fórmulas (Vb) y (Vc), R13 es un alquilo sustituido (por ejemplo, un alquilo inferior sustituido que tiene 1-6 carbonos). En determinados casos de Fórmulas (lVa-b) y (Va-c), el enlazador (por ejemplo, L) está enlazado covalentemente a un comonómero de enlace del multicromóforo a través de un resto de enlace que tiene una cadena principal de 1-12 carbonos y que incluye uno o más grupos de enlace o cadena principal amido (-CONH-) y/o éter (-O-) opcionales.

En determinadas modalidades, el ligando de cualquiera de las Fórmulas de (I) a (V) proporciona dos sitios de coordinación para el ion metálico de interés. En determinados casos, el ligando proporciona tres sitios de coordinación. Como tal, en dependencia de la naturaleza del ion metálico y los ligandos seleccionados, el complejo de metal puede incluir además ligandos adicionales (por ejemplo, dos o más, o tres o más ligandos adicionales) que se unen al ion metálico. En determinados casos, el complejo de metal enlazado es de Fórmula (VI):

[(ligando).(Mn+).(X)p] (VI)

en donde:

cada X es cualquier ligando monodentado o multidentado conveniente;

p es 2, 3 o 4;

Mn+ es un ion metálico donde n es 1,2 o 3 (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); y el ligando es un ligando multidentado enlazado que coordina el ion metálico y está enlazado covalentemente al multicromóforo. Se entiende que los corchetes de la Fórmula (VI) se usan para indicar un complejo de metal que puede tener una carga global en dependencia de las cargas de Mn+ y los ligandos coordinados y, en consecuencia, el complejo puede incluir cualquier contraión conveniente. En determinados casos de Fórmula (VI), el ligando multidentado enlazado es un ligando de cualquiera de las Fórmulas de (I) a (V).

En algunos casos de Fórmula (VI), el complejo de metal enlazado es de Fórmula (VII):

[(ligando). (Mn+). (BL)²] (VIII)

donde BL es cualquier ligando bidentado conveniente (BL), Mn+ es un ion metálico donde n es 1,2 o 3 (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), y el ligando es un ligando bidentado enlazado de cualquiera de las Fórmulas de (I) a (V) que está enlazado covalentemente al multicromóforo. En determinados casos, Mn+ se selecciona de rutenio, osmio, renio y rodio. En determinados casos, Mn+ es Ru2+. En determinados casos, Mn+ es Os2+. En determinados casos, Mn+ es Re+. En algunos casos, el complejo de metal luminiscente enlazado es un complejo de tri(bipiridina)rutenio sustituido.

En determinadas modalidades, el complejo de metal enlazado se describe mediante la Fórmula (VIII):

en donde de R11 a R18 son cada uno independientemente H, un alquilo, un alquilo sustituido, un heteroarilo, un heteroarilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido, un alcoxi, un alcoxi sustituido, halógeno, CN, carboxi, carboxialquilamino; amino o sal de amino; ácido sulfónico (-SO3H) o una sal de ácido sulfónico; o un enlazador; u opcionalmente, R14 y R15 están enlazados cíclicamente para formar un anillo fusionado de 6 miembros, en donde al menos uno de R11 a R18 está enlazado covalentemente al multicromóforo (por ejemplo, a través del comonómero de enlace como se describe en la presente descripción);

De R21 a R28 y de R31 a R38 son cada uno independientemente H, un alquilo, un alquilo sustituido, un heteroarilo, un heteroarilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido, un alcoxi, un alcoxi sustituido, halógeno, CN, carboxi, carboxialquilamino; amino o sal de amino; ácido sulfónico (-SO³H) o una sal de ácido sulfónico; y

Mn+ es un ion metálico (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), en donde, en algunos casos, n es 1, 2 o 3. En determinadas modalidades de Fórmula (VIII), de R21 a R28 y de R31 a R38 son cada uno H. En algunas modalidades de Fórmulas (VI) - (VIII), el ion metálico se selecciona de rutenio, osmio, renio y rodio ion. En ^{determinados casos de Fórmulas} (Vi) ^{- (VIII), Mn+ es Ru2+. En determinados casos de Fórmulas (VI) - (VIII), Mn+ es} Os2+. En determinados casos de Fórmulas (Vi) -(VIII), Mn+ es Re+.

En algunas modalidades de Fórmula (VIII), el complejo de metal tiene la Fórmula (IX):

en donde R11-R13, R16-R18, de R21 a R28 y de R31 a R38 son como se describe para la Fórmula (VIII) y R19 y R20 son independientemente H, un alquilo, un alquilo sustituido, un heteroarilo, heteroarilo sustituido, un arilo, un arilo sustituido, un alcoxi, un alcoxi sustituido, halógeno, CN, carboxi, carboxialquilamino; amino o sal de amino; ácido sulfónico (-SO3H) o una sal de ácido sulfónico; o un enlazador; en donde al menos uno de R11 a R13 y de R16 a R20 está enlazado covalentemente al multicromóforo (por ejemplo, a través del comonómero de enlace como se describe en la presente descripción); Mn+ es un ion metálico (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), en donde n es 1,2 o 3.

En determinadas modalidades de Fórmula (IX), de R21 a R28 y de R31 a R38 son cada uno H. En algunas modalidades de Fórmula (IX), el ion metálico se selecciona de rutenio, osmio, renio y rodio. En determinados casos de Fórmula (IX), Mn+ es Ru2+. En determinados casos de Fórmula (IX), Mn+ es Os2+. En determinados casos de Fórmula (IX), Mn+ es Re+. En algunas modalidades de Fórmulas (VI)-(IX), el complejo es un complejo de rutenio luminiscente.

Multicromóforos captadores de luz

Los aspectos de la presente descripción incluyen un multicromóforo captador de luz que tiene un segmento conjugado que comprende un comonómero de fluoreno. Como se usa en la presente descripción, los términos "multicromóforo captador de luz", "colorante polimérico" y "polímero conjugado" se usan indistintamente y se refieren a un polímero conjugado que tiene una estructura capaz de captar luz con una longitud de onda máxima de absorción particular y convertirla en luz emitida a una longitud de onda máxima de emisión más larga. En algunos casos, el multicromóforo captador de luz es en sí mismo fluorescente. Los polímeros conjugados (CP) se caracterizan por una estructura electrónica deslocalizada y pueden tener una longitud de conjugación efectiva que es sustancialmente más corta que la longitud de la cadena del polímero, porque la cadena principal puede contener una gran cantidad de segmentos conjugados muy próximos. En algunos casos, los polímeros conjugados son eficientes para la captación de luz y proporcionan amplificación óptica a través de la transferencia de energía de Forster a un aceptor.

Como se usa en la presente descripción, el término "unidad" se refiere a una subunidad estructural de un polímero. El término unidad pretende incluir monómeros, comonómeros, cobloques, segmentos conjugados, unidades repetitivas y similares. Una "unidad repetitiva" es una subunidad de un polímero que se define por el número mínimo de características estructurales distintas que se requieren para que la unidad se considere monomérica, de modo que cuando la unidad se repite n veces, la estructura resultante describe el polímero o un bloque de este. En algunos casos, el polímero puede incluir dos o más unidades repetitivas diferentes, por ejemplo, cuando el polímero es un polímero multibloque, cada bloque puede definir una unidad repetitiva distinta. En algunos casos, una unidad repetitiva del polímero incluye un único grupo monomérico. En determinados casos, una unidad repetitiva del polímero incluye dos o más grupos monoméricos, es decir, grupos comonómeros, tales como dos, tres, cuatro o más grupos comonómeros. Como se usa en la presente descripción, el término "comonómero" o "grupo comonómero" se refiere a una unidad estructural de un polímero que puede formar parte de una unidad repetitiva del polímero. En algunas modalidades, el polímero conjugado incluye un copolímero de bloques que se compone de bloques de monómeros polimerizados. En tales casos, el copolímero de bloque puede describirse como que tiene distintas unidades repetitivas, cada una de las cuales corresponde a un cobloque distinto del polímero. En algunos casos, el polímero es un copolímero dibloque que contiene dos cobloques diferentes. En tales casos, el polímero puede describirse como que incluye cobloques, donde cada cobloque puede estar compuesto de comonómeros, tales como uno, dos, tres o más comonómeros.

Cualquier multicromóforo captador de luz conveniente puede adaptarse para incluir un comonómero modificador de la absorbancia para proporcionar un multicromóforo que tenga un máximo de absorción conveniente y un máximo de emisión conveniente para su uso en la transferencia de energía a un complejo de metal enlazado. Los multicromóforos captadores de luz de interés que pueden adaptarse para su uso en los colorantes poliméricos en tándem en cuestión incluyen, pero no se limitan a, los multicromóforos descritos por Gaylord y otros en las publicaciones de Estados Unidos núms. 20040142344, 20080293164, 20080064042, 20100136702, 20110256549, 20120028828, 20120252986 y 20130190193 y las patentes de Estados Unidos núms. 8,575,303 y 8,802,450; y Gaylord y otros, J. Am. Chem. Soc., 2001, 123 (26), pp 6417-6418; Feng y otros, Chem. Soc. Rev., 2010,39, 2411 -2419; y Traina y otros, J. Am. Chem. Soc., 2011, 133 (32), pp 12600-12607.

En algunas modalidades, los multicromóforos incluyen una pluralidad de primeras unidades ópticamente activas que forman un sistema conjugado, que tiene una longitud de onda de absorción (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) en la que las primeras unidades ópticamente activas absorben luz para formar un estado excitado. En determinados casos, el multicromóforo incluye un segmento polimérico conjugado o una estructura oligomérica que incluye unidades repetitivas conjugadas n que reducen la banda prohibida.

Los colorantes poliméricos en tándem pueden incluir un multicromóforo que comprende uno o más comonómeros que se seleccionan de un comonómero de fenilenovinileno, un comonómero de fenilenoetinileno, un comonómero de carbazol, un comonómero de alquino C²-C¹², un comonómero de arileno-etinileno, un comonómero de heteroarilenoetinileno, un comonómero de arileno y un comonómero de heteroarileno. En algunos casos, el colorante polimérico en tándem incluye un multicromóforo basado en fenilenovinileno (por ejemplo, un polímero conjugado que incluye al menos un 50 % en moles de comonómeros de fenilenovinileno). En algunos casos, el colorante polimérico en tándem incluye un multicromóforo basado en fenilenoetinileno (por ejemplo, un polímero conjugado que incluye al menos un 50 % en moles de comonómeros de fenilenoetinileno). En algunos casos, el colorante polimérico en tándem incluye un multicromóforo basado en carbazol (por ejemplo, un polímero conjugado que incluye al menos un 50 % en moles de comonómeros de carbazol). En algunos casos, el colorante polimérico en tándem incluye un multicromóforo basado en alquino C²-C¹² (por ejemplo, un polímero conjugado que incluye al menos un 50 % en moles de comonómeros de alquino C²-C¹²). En algunos casos, el colorante polimérico en tándem incluye un multicromóforo basado en arileno o heteroarileno-etinileno (por ejemplo, un polímero conjugado que incluye al menos un 50 % en moles de comonómeros de arileno o heteroarileno-etinileno). En algunos casos, el colorante polimérico en tándem incluye un multicromóforo basado en arileno o heteroarileno (por ejemplo, un polímero conjugado que incluye al menos un 50 % en moles de comonómeros de arileno o heteroarileno). En determinados casos, además de los comonómeros descritos anteriormente, el multicromóforo incluye un comonómero de enlace que tiene un grupo de enlace al que puede unirse cualquier resto conveniente de interés (por ejemplo, un complejo de metal o un miembro de unión específica).

En algunos casos, el colorante polimérico en tándem se basa en un multicromóforo sin fluoreno (por ejemplo, un polímero conjugado que no incluye comonómeros de fluoreno). Se entiende que cualquiera de los comonómeros descritos anteriormente (por ejemplo, un comonómero de fenilenovinileno, un comonómero de fenilenoetinileno, un comonómero de carbazol, un comonómero de alquino C²-C¹², un comonómero de arileno-etinileno, un comonómero de heteroarileno-etinileno, un comonómero de arileno o un comonómero de heteroarileno) pueden usarse en las fórmulas multicromóforas descritas en la presente descripción (por ejemplo, Fórmulas (X), (XVII) y (XIX)-(XXIV) en lugar de un comonómero de fluoreno (por ejemplo, F1).

Los multicromóforos en cuestión pueden ser solubles en agua. Cualquier grupo solubilizante en agua conveniente puede incluirse en el multicromóforo para proporcionar una mayor solubilidad en agua. Si bien el aumento de la solubilidad puede variar, en algunos casos el aumento (en comparación con el compuesto sin WSG(s)) es de 2 veces o más, por ejemplo, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces o más. El término "grupo solubilizante en agua" (WSG) se refiere a un grupo que está bien solvatado en ambientes acuosos, por ejemplo, en condiciones fisiológicas, y que imparte una mejor solubilidad en agua a las moléculas a las que está unido. En algunas modalidades, un WSG aumenta la solubilidad del multicromóforo en una solución predominantemente acuosa, en comparación con un multicromóforo de control que carece del WSG. En algunos casos, los WSG del multicromóforo son grupos laterales no iónicos capaces de proporcionar una solubilidad en agua superior a 10 mg/ml. Los grupos solubilizantes en agua pueden ser cualquier grupo hidrofílico conveniente que esté bien solvatado en ambientes acuosos. En algunos casos, el grupo hidrofílico solubilizante en agua está cargado, por ejemplo, con carga positiva o negativa. En determinados casos, el grupo hidrofílico solubilizante en agua es un grupo hidrofílico neutro. En algunas modalidades, el WSG es un polímero hidrofílico, por ejemplo, un polietilenglicol, una celulosa, un quitosano o un derivado de este. Los grupos solubilizantes en agua de interés incluyen, pero no se limitan a, carboxilato, fosfonato, fosfato, sulfonato, sulfato, sulfinato, sulfonio, éster, polietilenglicoles (p Eg ) y PEG modificados, hidroxilo, amina, amonio, guanidinio, piridinio, poliamina y sulfonio, polialcoholes, sacáridos de cadena lineal o cíclicos, aminas y poliaminas primarias, secundarias, terciarias o cuaternarias, grupos fosfonato, grupos fosfinato, grupos ascorbato, glicoles, que incluyen poliéteres, -COOM', -SO³M', -PO³M', -NR³+, Y', (CH²CH²O)pR y las mezclas de estos, donde Y' puede ser cualquier halógeno, sulfato, sulfonato u anión que contenga oxígeno, p puede ser de 1 a 500, cada R puede ser independientemente H o un alquilo (tal como metilo) y M' puede ser un contraión catiónico o hidrógeno, --(CH²CH²O)yyCH²CH²XRyy,-(CH²CH²O)yyCH²CH²X--, --X(CH²CH²O)yyCH²CH²--, glicol y polietilenglicol, en donde yy se selecciona de 1 a 1000, X se selecciona de O, S y NRZZ y RZZ y RYY se seleccionan independientemente de H y alquilo C^1-3. En algunos casos, un WSG es (CH²)x(OCH²CH²)yOCH³ donde cada x es independientemente un número entero de 0 a 20, cada y es independientemente un número entero de 0 a 50.

Pueden incluirse múltiples WSG en una sola ubicación en los multicromóforos en cuestión a través de un enlazador de ramificación. En determinadas modalidades, el enlazador de ramificación es un sustituyente aralquilo, además disustituido con grupos solubilizantes en agua. Como tal, en algunos casos, el grupo enlazador de ramificación es un sustituyente del multicromóforo que conecta el multicromóforo a dos o más grupos solubilizantes en agua. En algunos casos, la incorporación de múltiples WSG a través de enlazadores de ramificación imparte una solubilidad conveniente en el multicromóforo. En algunos casos, el WSG es un grupo de cadena lateral no iónico capaz de impartir una solubilidad en agua superior a 10 mg/ml.

En algunas modalidades, el multicromóforo incluye sustituyente(s) que se selecciona(n) del grupo que consiste en un grupo alquilo, un aralquilo y un grupo heterocíclico, cada grupo sustituido adicionalmente con un grupo polimérico hidrofílico que incluye grupos solubilizantes en agua, tal como un polietilglicol (PEG) (por ejemplo, un grupo de PEG de 2-20 unidades).

En determinadas modalidades, el multicromóforo tiene una longitud de onda máxima de absorción de 500 nm o menos, tales como una longitud de onda de 450 nm o menos, 440 nm o menos, 430 nm o menos, 420 nm o menos,

410 nm o menos, 400 nm o menos, o incluso menos. En determinadas modalidades, el multicromóforo absorbe solo luz UV. En determinados casos, el multicromóforo tiene una longitud de onda máxima de absorción en el intervalo de

300 nm a 400 nm. En determinados casos, el multicromóforo tiene una longitud de onda máxima de absorción en el intervalo de 400 nm a 450 nm. En algunos casos, el multicromóforo tiene una longitud de onda máxima de emisión en el intervalo de 375 a 900 nm (tales como en el intervalo de 380 nm a 900 nm, de 390 nm a 900 nm o de 400 nm a

900 nm).

El multicromóforo puede tener cualquier longitud conveniente. En algunos casos, el número particular de unidades repetitivas monoméricas o segmentos del multicromóforo puede estar dentro del intervalo de 2 a 500 000, tales como de 2 a 100000, de 2 a 30000, de 2 a 10000, de 2 a 3000 o de 2 a 1000 unidades o segmentos, o tal como de

5 a 100000, de 10 a 100 000, de 100 a 100 000, de 200 a 100 000 o de 500 a 50 000 unidades o segmentos. En algunos casos, el número particular de unidades repetitivas monoméricas o segmentos del multicromóforo puede estar dentro del intervalo de 2 a 1000, tales como de 2 a 500, de 2 a 100, de 3 a 100, de 4 a 100, de 5 a 100, de 6 a

100, de 7 a 100, de 8 a 100, de 9 a 100 o de 10 a 100 unidades o segmentos.

El multicromóforo puede tener cualquier peso molecular (MW) conveniente. En algunos casos, el MW del multicromóforo puede expresarse como un peso molecular promedio. En algunos casos, el colorante polimérico tiene un peso molecular medio en el intervalo de 500 a 500000, tal como de 1000 a 100 000, de 2000 a 100 000, de 10000 a 100000 o incluso un peso molecular medio en el intervalo de 50000 a 100000.

En algunas modalidades, el comonómero modificador de la absorbancia constituye el 5 % o más por molaridad (por ejemplo, 5 % en moles) del multicromóforo, tales como el 10 % o más, el 15 % o más, el 20 % o más, el 25 % o más, el 30 % o más, el 40 % o más, el 45 % o más, el 50 % o más, el 60 % o más, el 70 % o más, o incluso más por molaridad del multicromóforo. En tales casos, el multicromóforo puede incluir 5 o más unidades repetitivas, tales como 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, 10000 o más, o incluso más unidades repetitivas. En tales casos, el multicromóforo puede incluir 5 o más unidades de comonómero, tales como 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, 10000 o más, o incluso más unidades de comonómero. En determinadas modalidades, el comonómero modificador de la absorbancia constituye el 25 % o más por molaridad del multicromóforo, tal como el 30 % o más, el 40 % o más, el 45 % o más, el 50 % o más, o incluso más por molaridad del multicromóforo, que incluye 5 o más unidades repetitivas, tales como 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más unidades repetidas.

El multicromóforo sujeto puede tener una o más propiedades espectroscópicas convenientes, tales como una longitud de onda máxima de absorción particular, una longitud de onda máxima de emisión particular, coeficiente de extinción, rendimiento cuántico y similares. En algunas modalidades, el multicromóforo tiene una longitud de onda máxima de emisión en el intervalo de 300 a 900 nm, tal como de 350 a 850 nm, de 350 a 600 nm, de 360 a 500 nm, de 370 a 500 nm, de 380 a 500 nm, de 390 a 500 nm o de 400 a 500 nm, donde los ejemplos específicos de emisión máxima de interés incluyen, pero no se limitan a: 395 nm ± 5 nm, 460 nm ± 5 nm, 490 nm ± 5 nm, 550 nm ± 5 nm,

560 nm ± 5 nm, 605 nm ± 5 nm, 650 nm ± 5 nm, 680 nm ± 5 nm, 700 nm ± 5 nm, 805 nm ± 5 nm. En determinados casos, el multicromóforo tiene una longitud de onda máxima de emisión que se selecciona del grupo que consiste en

395 nm, 460 nm, 490 nm, 550 nm, 560 nm, 605 nm, 650 nm, 680 nm, 700 nm y 805 nm. En determinados casos, el multicromóforo tiene una longitud de onda máxima de emisión de 395 nm ± 5 nm.

En algunos casos, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción de 5 x 105 cm'1M'1 o más, tales como 6 x 105 cm'1M'1 o más, 7 x 105 cm'1M'1 o más, 8 * 105 cm'1M'1 o más, 9 * 105 cm'1M'1 o más, tales como 1 * más, 1,5 * 106 cm'1M'1 o más, 2 * 106 cm'1M'1 o más, 2,5 * 106 cm'1M'1 o más, 3 * 106 cm'1M'1 o más, 4 * 106 cm-1M-1 o más, 5 * 106 cm'1M'1 o más, 6 * 106 cm'1M'1 o más, 7 * 106 cm'1M'1 o más, o 8 * 106 cm'1M'1 o más. En tales casos, el multicromóforo puede tener 5 o más unidades repetitivas, tales como 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más,

10 o más, o incluso más unidades repetitivas. En algunas modalidades, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción molar de 5 x 105 M-1cm-1 o más. En determinadas modalidades, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción molar de 1 x 106 M-1cm-1 o más.

En algunos casos, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción de 40000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, tales como 45 000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 50000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 55 000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 60000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 70000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 80 000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 90000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, 100000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más, o incluso más. En algunos casos, los 40 000 cm-1M-1 por unidad repetitiva o más descritos en la presente descripción es un coeficiente de extinción promedio. En determinados casos, la unidad repetida del multicromóforo puede incluir un solo monómero, dos comonómeros o tres o más comonómeros. En algunos casos, el multicromóforo tiene un coeficiente de extinción de 40000 cm-1M-1 por comonómero o más, tales como 45000 cm-1M-1 por comonómero o más, 50 000 cm-1M-1 por comonómero o más, 55 000 cm-1M-1 por comonómero o más, 60 000 cm-1M-1 por comonómero o más, 70 000 cm-1M-1 por comonómero o más, 80 000 cm-1M-1 por comonómero o más, 90000 cm-1M-1 por comonómero o más, 100000 cm-1M-1 por comonómero o más, o incluso más. En algunos casos, los 40000 cm-1M-1 por comonómero o más es un coeficiente de extinción promedio.

Se entiende que en algunos casos los multicromóforos en cuestión pueden incluir cobloques (por ejemplo, cobloques n y m). Los multicromóforos en cuestión pueden incluir cualquier disposición lineal conveniente de cobloques n y m de varias longitudes dentro de la estructura del polímero global. Además, los multicromóforos pueden incluir cualquier disposición conveniente de comonómeros dentro de dichos cobloques n y/o m. Puede usarse una variedad de métodos de síntesis de polímeros para preparar comonómeros y cobloques de interés en la preparación de los multicromóforos en cuestión. Se entiende que, en algunos casos, los métodos de polimerización pueden producir una composición que incluye una población de polímeros conjugados que incluye alguna variación con respecto a la longitud particular y/o grupos terminales (es decir, grupos finales) presentes en cada polímero conjugado de la población. Las fórmulas representadas en la presente descripción pueden referirse a un solo compuesto o a una población o subpoblación de compuestos poliméricos.

, El multicromóforo reivindicado se describe mediante la Fórmula (X):

donde:

F1 es el comonómero de flúor;

cada M1 y M2 son cada uno independientemente un comonómero (por ejemplo, un comonómero modificador de la absorbancia);

L1 es un comonómero de enlace sustituido con un complejo de metal luminiscente enlazado Z1 como se define en las reivindicaciones;

e es 1;

a, b, c, d y f son cada uno independientemente 0 o 1, en donde a+b+c+d+f>1;

cada n es 0 o un número entero de 1 a 100000;

cada m es 0 o un número entero de 1 a 10000;

p es un número entero de 1 a 100000; y

G1 y G2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un grupo terminal, un segmento conjugado n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado. En algunos casos de Fórmula (X), L1 es un comonómero de fluoreno. En determinadas modalidades de Fórmula (X), L1 es un comonómero de carbazol. En algunos casos de Fórmula (X), L1 es un comonómero de fluoreno. En algunos casos de Fórmula (X), M1 es un comonómero de fluoreno. En algunos casos de Fórmula (X), el comonómero de enlace L1 es un comonómero de fluoreno. En determinadas modalidades de Fórmula (X), L1 es un comonómero modificador de la absorbancia (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En determinadas modalidades de Fórmula (X), M1 es un comonómero modificador de la absorbancia (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En determinadas modalidades de Fórmula (X), M2 es un comonómero modificador de la absorbancia (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunas modalidades de Fórmula (X), b es 1. En algunos casos de Fórmula (X), a es 0. En algunos casos de Fórmula (X), c es 0. En algunos casos de Fórmula (X), a es 1. En algunos casos de Fórmula (X), c es 1. En algunos casos de Fórmula (X), a+c es >1. En determinadas modalidades de Fórmula (X), d es 0. En determinados casos de Fórmula (X), f es 0. En determinadas modalidades de Fórmula (X), d es 1. En determinados casos de Fórmula (X), f es 1. En algunos casos de Fórmula (X), d+f es >1. En algunas modalidades de Fórmula (X), a c+d f = 1 (es decir, a es 1, c es 1, d es 1 o f es 1). En algunas modalidades de Fórmula (X), a c d f = 2. En algunas modalidades de Fórmula (X), a c d f = 3. En algunas modalidades de Fórmula (X), a c d f = 4. En determinadas modalidades de Fórmula (X), e es 1 y d o f es 1, de modo que d e f = 2. En determinados casos de Fórmula (X), e es 1 y d y f son cada uno 0. En determinados casos, e es 1, d f < 1 y m > 1. En determinados casos, e es 1, d y f son cada uno 0 y m > 1. En determinados casos, e es 1; d f = 1 y m > 1. En algunos casos, d es 1 y f es 0. En algunos casos, d es 0 y f es 1. En algunas modalidades de Fórmula (X), n, m y p se seleccionan de manera que el multicromóforo incluya de 2 a 100 000 unidades repetidas (es decir, unidades monoméricas repetidas) en total, donde el multicromóforo puede incluir una variedad de unidades monoméricas repetidas distintas. En algunos casos, cuando m es 0, p es 1 y n es 2 a 100 000. En algunas modalidades de Fórmula (X), L1 es un comonómero de fluoreno. Se entiende que el polímero conjugado de Fórmula (X) también puede representarse mediante una fórmula que proporciona valores de % en moles para cada comonómero en el polímero.

Un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado es un comonómero que incluye un grupo aromático tricíclico que tiene tres anillos fusionados en la configuración 6-5-6, es decir, dos anillos benzo fusionados con un anillo central de 5 miembros. El anillo de 5 miembros puede ser un carbociclo o un heterociclo y además puede incluir un sustituyente de cadena lateral en el átomo del anillo que no está fusionado con un anillo benzo (es decir, en Y1). En determinados casos, el comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado que encuentra uso en el multicromóforo en cuestión se describe mediante la siguiente Fórmula (XI):

donde:

Y1 es -C(R1)²- o -N(R1)-;

cada R es independientemente H o uno o más sustituyentes arilo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); y

cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en un alquilo, un alquilo sustituido, un aralquilo, un aralquilo sustituido, un resto PEG y -L1-Z2, donde L1 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, un marcaje que incluye un grupo funcional quimioselectivo), un WSG o un complejo de metal enlazado. En algunas modalidades, cuando Y1 es -N(R1)-, el comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado es un comonómero de carbazol. Puede usarse cualquier comonómero de carbazol conveniente en los multicromóforos en cuestión. En algunas modalidades, cuando Y1 es -C(R1)2-, el comonómero tricíclico 6­ 5-6 fusionado es un comonómero de fluoreno. Cualquier comonómero de fluoreno conveniente puede usarse en los multicromóforos en cuestión.

Un comonómero de fluoreno es un comonómero que incluye un grupo aromático que tiene una estructura del núcleo de 9H-fluoreno sustituido en la posición 9 con cualquier sustituyente de cadena lateral conveniente. En algunos casos, el comonómero de fluoreno es un fluoreno disustituido en 9,9. El comonómero de fluoreno se conjuga con grupos poliméricos adyacentes de la cadena principal a través de cualquier posición conveniente de la estructura del núcleo de fluoreno, como dos posiciones cualesquiera de las posiciones 1-8 (consulte el esquema de numeración a continuación). En algunas modalidades, la estructura del núcleo de fluoreno está enlazada a grupos adyacentes de la cadena principal polimérica a través de las posiciones 2 y 7. En determinadas modalidades, el comonómero de fluoreno se describe mediante la siguiente Fórmula (XII):

donde: cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en un alquilo, un alquilo sustituido, un aralquilo, un aralquilo sustituido, un resto PEG y -L2-Z2, donde L2 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, un marcador que incluye un grupo funcional quimioselectivo), un WSG o un complejo de metal enlazado. En algunos casos, Z2 es un marcador quimioselectivo que encuentra uso en el enlace covalente del multicromóforo a un complejo de metal aceptor (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En determinadas modalidades, L2 es un enlazador ramificado (por ejemplo, un grupo bencilo sustituido) que se enlaza a dos o más grupos Z2 (por ejemplo, WSG tales como grupos de Pe G de 2-20 unidades de polietilenglicol). Como se usa en la fórmula en la presente descripción, * indica un sitio para la unión covalente a la cadena principal insaturada de un polímero conjugado o un grupo terminal.

En determinados casos, el comonómero de fluoreno se describe mediante la Fórmula (XIII):

donde: cada R1 es como se define anteriormente; y R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, un grupo solubilizante en agua (WSG) o un sustituyente arilo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunos casos, el comonómero de fluoreno se describe mediante la Fórmula (XIV):

donde cada R2 es un alquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua o un enlazador ramificado conectado a dos o más grupos solubilizantes en agua (por ejemplo, un bencilo disustituido con PEG o un alquilo sustituido con PEG). En determinadas modalidades, el comonómero de fluoreno se describe mediante la siguiente Fórmula (XV):

donde R3 es un alquilo o un aralquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua (por ejemplo, un alquilo o aralquilo sustituido con PEG), y R4 es L2-Z2 donde L2 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo o un complejo de metal enlazado. En algunos casos, el comonómero de fluoreno se describe mediante la Fórmula (XVI):

en donde:

R3 es un sustituyente que comprende un grupo solubilizante en agua;

R4 es L2-Z2 en donde L2 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, para la conjugación con un complejo de metal aceptor); y

R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, un grupo solubilizante en agua y un sustituyente arilo (por ejemplo, un alquilo, un alquilo sustituido, un alcoxi, un alcoxi sustituido, un halógeno o un nitro).

En algunas modalidades de Fórmula (X), a, c, d y f son cada uno 0 y b y e son cada uno 1. En determinadas modalidades de Fórmula (X), F1 es un comonómero de fluoreno de Fórmula (XIV) como se describe en la presente descripción, donde cada R2 es independientemente un alquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua, tal como cada R2 es -(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3 donde cada x es independientemente 0 o un número entero de 1-20, cada y es independientemente 0 o un número entero de 1 a 50. En determinadas modalidades de Fórmula (X), L1 es un comonómero de fluoreno de Fórmula (XV) como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades de Fórmula (X), al menos uno de G1 y G2 es un grupo arilo sustituido, por ejemplo, un grupo arilo sustituido con un enlazador (por ejemplo, un enlazador de alquilo C1-C6) terminado con un grupo funcional de ácido carboxílico.

En algunos casos de Fórmula (X):

a, c, d y f son cada uno 0 y b y e son cada uno 1;

F1 es un comonómero de fluoreno de Fórmula (XIV) donde cada R2 es independientemente un alquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua, tal como cada R2 es -(CH²)x(OCH²CH²)yOCH³ donde cada x es independientemente 0 o un número entero de 1-20, cada y es independientemente 0 o un número entero de 1 a 50;

L1 es un comonómero de fluoreno de Fórmula (XV) donde R3 es un alquilo o un aralquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua (por ejemplo, un alquilo o aralquilo sustituido con PEG), y R4 es L2-Z2 en donde L2 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, un grupo amino, -NH2) o un complejo de metal enlazado;

al menos uno de G1 y G2 es un grupo arilo sustituido, por ejemplo, un grupo arilo sustituido con un enlazador (por ejemplo, un enlazador de alquilo C1-C6) terminado con un grupo funcional de ácido carboxílico o un miembro de unión específica enlazado (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunos casos, los multicromóforos incluyen, como parte de la cadena principal polimérica, la siguiente Fórmula (XVII):

donde cada R3 es independientemente un grupo solubilizante en agua conectado a través de un enlazador opcional, o un grupo alquilo, aralquilo o arilo opcionalmente sustituido; Ar es un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; y n es un número entero de 1 a 100000. En determinadas modalidades, cada R3 es independientemente un grupo alquilo sustituido. En determinadas modalidades, cada R3 es independientemente un grupo aralquilo sustituido. En algunos casos, cada R3 y cada Ar están sustituidos independientemente (mediante un enlazador opcional) con un grupo solubilizante en agua, un cromóforo aceptor (por ejemplo, complejo de metal enlazado), un grupo funcional quimioselectivo o un resto de unión específica.

En algunas modalidades de Fórmulas (XI)-(XVII), uno o más de R1, R2, R3 y/o R4 se seleccionan independientemente de (CH²)x(OCH²CH²)yOCH³ donde cada x es independientemente un número entero de 0-20, cada y es independientemente un número entero de 0 a 50; y un bencilo opcionalmente sustituido con uno o más halógeno, hidroxilo, alcoxi C i-C i2 o (OCH2CH2)zOCH3 donde cada z es independientemente un número entero de 0 a 50. En algunos casos, cada uno o más de R1, R2, R3 y/o R4 es (CH2)3(OCH2CH2)11OCH3. En algunas modalidades de Fórmulas (XI)-(XVII), uno o más de R1, R2, R3 y/o R4 es un bencilo sustituido con al menos un grupo WSG (por ejemplo, uno o dos grupos WSG) que se selecciona de (CH2)x(OCH2CH2)yOCH3 donde cada x es independientemente un número entero de 0-20 y cada y es independientemente un número entero de 0 a 50.

Como se usa en la presente descripción, los términos "grupo funcional quimioselectivo" y "marcador quimioselectivo" se usan indistintamente y se refieren a un grupo funcional que puede reaccionar selectivamente con otro grupo funcional compatible para formar un enlace covalente, en algunos casos, después de la activación opcional de uno de los grupos funcionales Los grupos funcionales quimioselectivos de interés incluyen, entre otros, tioles y maleimida o yodoacetamida, aminas y ácidos carboxílicos o ésteres activos de estos, así como también grupos que pueden reaccionar entre sí a través de la química de Click, por ejemplo, grupos azida y alquino (por ejemplo, grupos ciclooctino), así como también hidroxilo, hidrazido, hidrazino, aldehído, cetona, azido, alquino, fosfina, epóxido y similares.

Cualquier comonómero de enlace conveniente (L1) puede incorporarse en los multicromóforos en cuestión para proporcionar un grupo de enlace al que puede unirse cualquier resto conveniente de interés (por ejemplo, un complejo de metal revestido). Los comonómeros de enlace de interés incluyen, pero no se limitan a, un comonómero de fluoreno (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), un comonómero de fenilenovinileno, un comonómero de fenilenoetinileno, un comonómero de carbazol, un comonómero de alquino C2-C12, un comonómero de arileno-etinileno, un comonómero de heteroarileno-etinileno, un comonómero de arileno y un comonómero de heteroarileno.

Cualquier grupo funcional quimioselectivo conveniente puede incluirse en los multicromóforos en cuestión (por ejemplo, en los grupos terminales -Z2 y/o G1 o G2, que incluyen, pero no se limitan a, ácido carboxílico, éster activo (por ejemplo, NHS o éster de sulfo-NHS), amino, hidroxilo, tiol, maleimida, yodoacetilo, hidrazido, hidrazino, aldehído, cetona, azido, alquino, fosfina y epóxido. Se entiende que, en las estructuras del colorante polimérico en tándem descritas en la presente descripción, en algunos casos, los grupos Z1 y Z2 aparecen en una posición equivalente en la estructura donde estos grupos pueden usarse indistintamente para referirse a un complejo de metal enlazado o un grupo funcional quimioselectivo que es capaz de conjugarse posteriormente a un complejo de metal para producir el complejo de metal enlazado.

En determinados casos, el comonómero de enlace es un comonómero de arilo sustituido. En determinados casos, el comonómero de enlace es un comonómero de heteroarilo sustituido. En determinados casos, el comonómero de enlace es un 1,4-fenilo no sustituido o sustituido, un 1,3-fenilo sustituido o no sustituido, un 4,4'-bifenilo sustituido o no sustituido, un 2,5-piridilo sustituido o no sustituido y un 2,6-piridilo sustituido o no sustituido. En algunos casos, el comonómero de enlace es un comonómero de fluoreno. En determinados casos, el comonómero de enlace es un comonómero modificador de la absorbancia (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

Cualquier grupo final conveniente (por ejemplo, G1 y G2) puede usarse en los terminales de los multicromóforos en cuestión. Como se usa en la presente descripción, los términos "grupo final" y "grupo terminal" se usan indistintamente para referirse a los grupos ubicados en los terminales de la estructura polimérica del multicromóforo, por ejemplo, como se describe en la presente descripción. Los grupos G1 y G2 de interés incluyen, pero no se limitan a, un grupo de protección terminal, un segmento conjugado n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado. En algunas modalidades, un grupo de protección terminal es un grupo monovalente que se conjuga con la cadena principal del multicromóforo después de la polimerización. En determinados casos, el grupo de protección terminal es un arilo, un arilo sustituido, un heteroarilo, un heteroarilo sustituido, un alquilo o un alquilo sustituido. En determinados casos, el grupo de protección terminal se deriva de un monómero usado en el método de polimerización, por ejemplo, un grupo terminal como un halógeno (por ejemplo, Br), un ácido borónico o un éster borónico, que es capaz de sufrir una conjugación adicional. En algunos casos, G1 y/o G2 es un segmento conjugado n. Como se usa en la presente descripción, un segmento conjugado n se refiere a cualquier segmento conveniente de un polímero conjugado al que puede conjugarse el multicromóforo, es decir, que permite la deslocalización del electrón pi a través de unidades adyacentes. En determinadas modalidades, G1 y/o G2 es un enlazador, tal como un enlazador que incluye un grupo funcional adecuado para la conjugación con un resto de unión específica. Se entiende que los enlazadores ubicados en las posiciones G1 y/o G2 del multicromóforo pueden seleccionarse para que sean ortogonales a cualquier otro enlazador, que incluyen los marcadores quimioselectivos que pueden estar presentes en una cadena lateral del multicromóforo (por ejemplo, en Z2). En determinadas modalidades, un grupo funcional amino o derivado de este se incluye en G1 y/o G2 y un grupo funcional de ácido carboxílico o derivado de este se incluye en Z2. En determinadas modalidades, un grupo funcional de ácido carboxílico o derivado de este se incluye en G1 y/o G2 y un grupo funcional amino o derivado de este se incluye en Z2.

En algunas modalidades, el comonómero modificador de la absorbancia es un comonómero de arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido. Cualquier comonómero de arilo o heteroarilo conveniente puede usarse en los multicromóforos en cuestión como comonómeros modificadores de la absorbancia. El comonómero modificador de la absorbancia o la unidad modificadora del intervalo de banda puede distribuirse uniforme o aleatoriamente a lo largo del polímero conjugado. En determinadas modalidades, el comonómero modificador de la absorbancia es un comonómero opcionalmente sustituido que se selecciona de 2,1,3-benzotiadiazol, 2,1,3-benzoxadiazol, benzoxidazol, benzoselenadiazol, benzotelurodiazol, naftoselenadiazol, 4,7-di(tien-2-il)-2,1,3-benzotiadiazol, colorantes de escuaraína, quinoxalinas, perileno, diimidas de perileno, dicetopirrolopirrol, colorantes comerciales de baja banda prohibida de tienopirazina, olefinas y olefinas sustituidas con ciano e isómeros de estas.

En algunos casos, los comonómeros de arilo y heteroarilo que encuentran uso en los multicromóforos en cuestión se seleccionan de a'-k' que tienen la estructura:

donde * = un sitio para la unión covalente a la cadena principal insaturada y cada R es independientemente H, un grupo lateral no iónico capaz de impartir solubilidad en agua (por ejemplo, un WSG), o -L2-Z2, donde L2 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo o un complejo de metal enlazado. En determinados casos de a'-k', cada R es un alquilo o un bencilo sustituido con uno o más (CH2)x(OCH2CH2)yOCH3 donde cada x es independientemente un número entero de 0-20, cada y es independientemente un número entero de 0 a 50. En determinados casos de a'-k', cada R es (CH2)3(OCH2CH2)nOCH3.

En determinadas modalidades, el multicromóforo de Fórmula (X) incluye un comonómero modificador de la absorbancia que tiene la estructura de uno de los comonómeros a'-k', como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, el multicromóforo de Fórmula (X) incluye un comonómero modificador de la absorbancia que tiene la Fórmula (XVIII):

donde X es O o S, R41 y R42 son cada uno independientemente, H, halógeno, un WSG, un alquilo, un alquilo sustituido, un alcoxi y un alcoxi sustituido. En determinados casos, X es O. En algunos casos, X es S. En determinadas modalidades, el comonómero modificador de la absorbancia se selecciona de uno de los siguientes:

en donde * = sitio para la unión covalente a la cadena principal insaturada.

En algunos casos, el comonómero modificador de la absorbancia es un comonómero de fenilo, bifenilo o piridilo sustituido o no sustituido. En determinadas modalidades, el comonómero modificador de la absorbancia es un comonómero de arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido que se selecciona del grupo que consiste en 1,4-fenilo sustituido o no sustituido, un 1,3-fenilo sustituido o no sustituido, un 4,4'-bifenilo sustituido o no sustituido, un 2,5-piridilo sustituido o no sustituido y un 2,6-piridilo sustituido o no sustituido. En determinados casos, el comonómero modificador de la absorbancia es un comonómero de arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido que se selecciona de una de las siguientes estructuras:

donde Z2-Z5 son cada uno independientemente CR o N, donde al menos un Z2-Z5 es N; y cada R y cada R11-R16 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, grupo solubilizante en agua, halógeno, ciano, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilo y alquilo sustituido. En determinadas modalidades, uno y solo uno de Z2-Z5 es N. En determinadas modalidades, dos y solo dos de Z2-Z5 es N. En determinados casos, R11, R12 y R14 son cada uno H. En algunos casos, R12 y R14 son cada uno H. En algunos casos, R11 y R13 son cada uno H. En algunos casos, R15 y R16 son cada uno H. En algunos casos, el halógeno es flúor.

En algunos casos, el comonómero modificador de la absorbancia es un comonómero de arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido que se selecciona de uno de los siguientes:

donde n es 1-20 y R' es H o alquilo inferior. En algunas modalidades de las estructuras de comonómero de arilo o heteroarilo sustituido, n es un número entero de 3 a 20.

En algunas modalidades, el multicromóforo incluye un comonómero de arilo sustituido descrito por la siguiente estructura:

donde n es 1-20 y R' es H o alquilo inferior. En determinados casos, n es de 3 a 12.

En algunas modalidades, el multicromóforo incluye un comonómero de arilo sustituido descrito por la siguiente estructura:

donde cada n es independientemente 1-20 y cada R' es independientemente H o alquilo inferior. En determinadas modalidades de las estructuras de comonómero de arilo o heteroarilo sustituido que se muestran anteriormente, n es 3. En determinados casos, R' es metilo. En determinados casos, R' es hidrógeno. En algunas modalidades, el multicromóforo incluye un comonómero de arilo sustituido descrito por la siguiente estructura:

En algunas modalidades, el multicromóforo incluye un comonómero de arilo sustituido descrito por la siguiente estructura:

Cualquiera de los comonómeros modificadores de la absorbancia descritos anteriormente puede usarse en los multicromóforos en cuestión, por ejemplo, multicromóforos de Fórmulas (X) y (XIX)-(XX).

En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la Fórmula (XIX):

donde F1, M1, M2, a, b, c, e, L1, Z1, p, G1 y G2 son como se describe para la Fórmula (X). En algunos casos de Fórmula (XIX), F1 es un comonómero de fluoreno. En determinados casos de Fórmula (XIX), F1 es un comonómero de carbazol. En algunas modalidades de Fórmula (XIX), L1 es un comonómero de fluoreno. En determinadas modalidades de Fórmula (XIX), L1 es un comonómero de carbazol. En algunas modalidades de Fórmula (XIX), L1 es un comonómero de arilo o heteroarilo sustituido. En algunas modalidades de Fórmula (XIX), M1 y M2 son cada uno independientemente un comonómero modificador de la absorbancia (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunos casos de la Fórmula (XIX), a y c son cada uno 0 y b y e son cada uno 1. En algunos casos de Fórmula (XIX), b es 1 y a+c > 1. En determinados casos de Fórmula (XIX), a c = 1 (por ejemplo, a es 1 y c es 0, o a es 0 y c es 1). En determinadas modalidades de Fórmula (XIX), a c = 2. En algunos casos de Fórmula (XIX), F1 es un comonómero de fluoreno y L1 es un comonómero de arilo o heteroarilo sustituido. En algunos casos de Fórmula (XIX), F1 y L1 son independientemente un comonómero de fluoreno. En algunos casos de Fórmula (XIX), G1 es un grupo terminal; y G2 es un grupo terminal, un enlazador o un miembro de unión específica enlazado. En determinados casos, G2 es un miembro de unión específica enlazado. En algunos casos, G2 es un enlazador, donde el enlazador puede incluir un marcador quimioselectivo.

En algunos casos de Fórmula (XIX):

a y c son cada uno 0 y b y e son cada uno 1;

F1 es un comonómero de fluoreno de Fórmula (XIV) donde cada R2 es independientemente un alquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua, tal como cada R2 es -(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3 donde cada x es independientemente 0 o un número entero de 1-20, cada y es independientemente 0 o un número entero de 1 a 50;

L1 es un comonómero de fluoreno de Fórmula (XV) donde R3 es un alquilo o un aralquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua (por ejemplo, un alquilo o aralquilo sustituido con PEG), y R4 es L2-Z2 en donde L2 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, un grupo amino, -NH2) o un complejo de metal enlazado (Z1);

al menos uno de G1 y G2 es un grupo arilo sustituido, por ejemplo, un grupo arilo sustituido con un enlazador (por ejemplo, un enlazador de alquilo C1-C6) terminado con un grupo funcional de ácido carboxílico o un miembro de unión específica enlazado (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunos casos, el multicromóforo se describe mediante la Fórmula (XX):

donde F1, M2, b, c, e, f, L1, Z1, n, m, p, G1 y G2 son como se describe para la Fórmula (X). En algunos casos de Fórmula (XX), F1 es un comonómero de fluoreno. En determinados casos de Fórmula (XX), F1 es un comonómero de carbazol. En algunas modalidades de Fórmula (XIX), L1 es un comonómero de fluoreno. En algunas modalidades de Fórmula (XX), L1 es un comonómero de arilo o heteroarilo sustituido. En algunas modalidades de Fórmula (XX), M1 y M2 son cada uno independientemente un comonómero modificador de la absorbancia (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunas modalidades de Fórmula (XX), b es 1; c es 0 o 1; e es 1; f es 0 o 1; G1 es un grupo terminal; y G2 es un grupo terminal, un enlazador o un miembro de unión específica enlazado. En determinados casos de Fórmula (XX), c es 1. En determinados casos de Fórmula (XX), c es 0. En determinados casos de Fórmula (XX), f es 1. En determinados casos de Fórmula (XX), f es 0. En determinados casos, G2 es un miembro de unión específica enlazado. En algunos casos, G2 es un enlazador, donde el enlazador puede incluir un marcador quimioselectivo.

En algunos casos de Fórmula (XX):

c y f son cada uno 0 y b y e son cada uno 1;

F1 es un comonómero de fluoreno de Fórmula (XIV) donde cada R2 es independientemente un alquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua, tal como cada R2 es -(CH²)x(OCH²CH²)yOCH³ donde cada x es independientemente 0 o un número entero de 1-20, cada y es independientemente 0 o un número entero de 1 a 50;

L1 es un comonómero de fluoreno de Fórmula (XV) donde R3 es un alquilo o un aralquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua (por ejemplo, un alquilo o aralquilo sustituido con PEG), y R4 es L2-Z2 en donde L2 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, un grupo amino, -NH2) o un complejo de metal enlazado (Z1);

al menos uno de G1 y G2 es un grupo arilo sustituido, por ejemplo, un grupo arilo sustituido con un enlazador (por ejemplo, un enlazador de alquilo C1-C6) terminado con un grupo funcional de ácido carboxílico o un miembro de unión específica enlazado (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunos casos de Fórmulas (X) y (XIX) a (XX), L1 se describe mediante la estructura:

en donde:

R1 es un sustituyente que incluye un grupo solubilizante en agua (por ejemplo, un alquilo sustituido con PEG); R2 es L2-Z2 en donde L2 es un enlazador y Z2 es el complejo de metal aceptor; y

R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, un grupo solubilizante en agua, un alquilo, un alquilo sustituido, un alcoxi, un alcoxi sustituido, un halógeno y un nitro. En determinados casos, cada uno de R3 y R4 es hidrógeno.

En algunas modalidades de Fórmulas (X) y (XIX) a (XX), al menos uno de G1 y G2 es -L3-Z4 donde L3 es un enlazador (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) y Z4 es un miembro de unión específica (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunas modalidades de Fórmulas (X) y (XIX) a (XX), al menos uno de G1 y G2 es -L3-Z 3 donde L3 es un enlazador (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) y Z3 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En algunos casos, Z3 se selecciona del grupo que consiste en ácido carboxílico, éster activo (por ejemplo, éster de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) o sulfo-NHS), amino, maleimida, yodoacetilo y tiol. En determinadas modalidades de Fórmulas (X) y (XIX) a (XX), al menos uno de G1 y G2 se describe mediante la siguiente estructura:

*-Ar-L -Z

donde Ar es un grupo arilo conjugado con n, L es un enlazador y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica. En determinadas modalidades de Fórmulas (X) y (XIX) a (XX), al menos uno de G1 y G2 se describe mediante la siguiente estructura:

en donde:

q es 0 o un número entero de 1 a 12;

L es un enlazador opcional; y

Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica.

En determinadas modalidades, Z es una biomolécula. Las biomoléculas de interés incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos, polinucleótidos, carbohidratos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales de estos y combinaciones de estos. En determinados casos, Z es un anticuerpo. En algunos casos, Z es un fragmento de anticuerpo o un derivado de unión de este. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo o el derivado de unión de este se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un diacuerpo y un triacuerpo.

En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la Fórmula (XXI):

donde: cada R1 es independientemente un alquilo o aralquilo sustituido con uno o más WSG, o un grupo de ramificación sustituido adicionalmente con dos o más WSG; MU es un comonómero modificador de la absorbancia (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); R2 es L2-Z2 en donde L2 es un enlazador y Z2 es el complejo de metal luminiscente aceptor; L es un enlazador y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica enlazado; G1 es un grupo final; y n, m y p son cada uno independientemente un número entero de 1 a 100 000. En algunos casos, G1 es un grupo final arilo. En algunos casos, G1 es un fenilo. En determinadas modalidades, Z se selecciona de un ácido carboxílico, un amino o una maleimida. En determinados casos, Z es un miembro de unión específica enlazado. En algunos casos, L es un ácido alquilcarboxílico, tal como -(CH²)³COOH. En determinadas modalidades, uno o más de los grupos R1 es un grupo de ramificación sustituido adicionalmente con dos o más WSG. En determinados casos, el grupo de ramificación es un aralquilo sustituido, tal como un grupo bencilo sustituido, que está disustituido con dos grupos de PEG.

En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la Fórmula (XXIII):

donde: cada R2 es independientemente un alquilo o aralquilo sustituido con uno o más WSG, o un grupo de ramificación sustituido adicionalmente con dos o más WSG; R3 es un alquilo o un alquilo sustituido (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); R4 es L2-Z2 en donde L2 es un enlazador y Z2 es el complejo de metal luminiscente aceptor; L es un enlazador y Z es un marcador quimioselectivo o un miembro de unión específica enlazado; G1 es un grupo final; y n, m y p son cada uno independientemente un número entero de 1 a 100000. En algunos casos, G1 es un grupo final arilo. En algunos casos, G1 es un fenilo. En determinadas modalidades, Z se selecciona de un ácido carboxílico, un amino o una maleimida. En determinados casos, Z es un miembro de unión específica enlazado. En algunos casos, L-Z es un ácido alquilcarboxílico, tal como -(CH²)³COOH. En determinadas modalidades, uno o más de los grupos R2 es un grupo de ramificación sustituido adicionalmente con dos o más WSG. En determinados casos, el grupo de ramificación es un aralquilo sustituido, como un grupo bencilo sustituido, que está disustituido con dos grupos de PEG. En algunos casos de Fórmula (XXIII): cada R2 es independientemente un alquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua, tal como cada R2 es -(CH²)x(OCH²CH²)yOCH³ donde cada x es independientemente 0 o un número entero de 1-20, cada y es independientemente 0 o un número entero de 1 a 50; R3 es un alquilo o un aralquilo sustituido con un grupo solubilizante en agua (por ejemplo, un alquilo o aralquilo sustituido con PEG), y R4 es L2-Z2 en donde L2 es un enlazador y Z2 es un marcador quimioselectivo (por ejemplo, un grupo amino, -NH2) o un complejo de metal enlazado (Z1). En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la Fórmula (XXIV):

donde: cada R1 y cada R2 es independientemente un alquilo sustituido con un WSG (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), o un grupo de ramificación sustituido adicionalmente con dos o más WSG (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); MU1 y MU2 son independientemente un comonómero modificador de la absorbancia (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); L es un enlazador y Z1 es un complejo de metal enlazado; G1 y G2 son cada uno independientemente un grupo final; y w, x, y y z son los valores de % en moles de los comonómeros en el polímero conjugado.

En algunas modalidades, el colorante polimérico en tándem se describe mediante la Fórmula (XXII):

(XXII) donde: cada R1 y cada R2 es independientemente un alquilo sustituido con un WSG, o un grupo de ramificación sustituido adicionalmente con dos o más WSG (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); MU es un comonómero modificador de la absorbancia (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); L es un enlazador y Z1 es un complejo de metal enlazado; G1 y G2 son cada uno independientemente un grupo final; y w, x, y y z son los valores de % en moles de los comonómeros en el polímero conjugado. En algunos casos, G1 es un grupo final arilo. En algunos casos, G1 es un fenilo sustituido. En determinados casos, G1 o G2 comprenden un miembro de unión específica enlazado. En algunos casos, L comprende un alquil-amido, tal como -(c H2)3CONH-. En determinadas modalidades, cada grupo R1 es un grupo de ramificación sustituido adicionalmente con dos o más WSG. En determinados casos, el grupo de ramificación es un aralquilo sustituido, tal como un grupo bencilo sustituido, que está sustituido con dos grupos de PEG.

En algunos casos de Fórmula (XXII), w es 10 % en moles o más, tales como 15 % en moles o más, 20 % en moles o más, 25 % en moles o más, o incluso más. En algunos casos de Fórmula (XXII), x es 0. En algunos casos de Fórmula (XXII), x es 10 % en moles o más, tales como 15 % en moles o más, 20 % en moles o más, 25 % en moles o más, o incluso más. En algunos casos de Fórmula (XXII), y es 0. En algunos casos de Fórmula (XXII), y es 10 % en moles o más, tales como 15 % en moles o más, 20 % en moles o más, 25 % en moles o más, o incluso más. En algunos casos de Fórmula (XXII), z es 10 % en moles o más, tales como 15 % en moles o más, 20 % en moles o más, 25 % en moles o más, o incluso más.

En algunos casos de los multicromóforos de cualquiera de las Fórmulas (X), (XVII) y (XIX)-(XXIV), el % en moles de las unidades del complejo de metal luminiscente aceptor en el multicromóforo (por ejemplo, el % en moles de comonómeros de enlace a los que se enlazan complejos de metales luminiscentes en el captador de luz soluble en agua donante) varía de 1 mol % a 50 % en moles, tales como de 5 % en moles a 25 % en moles o de 10 % en moles a 25 % en moles; o tales como de 5 % en moles a 25 % en moles o de 10 % en moles a 25 % en moles; o tales como de 1 % en moles a 25 % en moles, de 1 % en moles a 10 % en moles o de 1 % en moles a 5 % en moles

Se entiende que, para cualquiera de las estructuras y las fórmulas representadas en la presente descripción, en algunos casos del multicromóforo en cuestión, los grupos finales representados pueden estar ubicados en los extremos opuestos a los que se muestran, por ejemplo, los grupos finales G1 y -Ph-L-Z pueden estar cambiados. En algunas modalidades de los multicromóforos descritos en la presente descripción (por ejemplo, las Fórmulas (X), (XVII) y (XIX)-(XXIV), al menos uno de G1 y G2 se selecciona de una de las siguientes estructuras 1-33:

*=sitio de unión covalente a la cadena principal insaturada;

en donde R' es independientemente H, halógeno, alquilo C i-C i2, (alquilo C i-C i 2)NH2, alqueno C2-C i2, alquino C²-C¹², cicloalquilo C³-C¹², haloalquilo C¹-C¹², (hetero)arilo C²-C¹⁸, (hetero)arilamino C²-C¹⁸, —[CH²-CH²]r-Z1 o alcoxi (C¹-C¹²)-X1; y en donde Z1 es -OH o -COOH; X1 es -NH² , -NHCOOH, -NHCOOC(CH³)³ , -NHCOcicloalquilo(C3-C12)alquilo(C1-C4)-N-maleimida; o -NhCO[CH2-CH2-O]s(CH2)sNH2; r' es un número entero de 1 a 20; y cada s' es independientemente un número entero de 1 a 20, (CH2)3(OCH2CH2)xOCH3 donde x" es independientemente un número entero de 0 a 50, o un bencilo opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, hidroxilo, alcoxi C¹-C¹², o (OCH²CH²VCH ³ donde cada y" es independientemente un número entero de 0 a 50 y R' es diferente de R;

en donde k es 2, 4, 8, 12 o 24;

en donde R15 se selecciona del grupo que consiste en I-u que tiene la estructura:

*=sitio de unión covalente a la cadena principal.

Miembros de unión específica marcados

Los aspectos de la presente descripción incluyen miembros de unión específica marcados. Un miembro de unión específica marcado es un conjugado de un colorante polimérico en tándem en cuestión (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) y un miembro de unión específica. Cualquiera de los colorantes poliméricos en tándem descritos en la presente descripción puede conjugarse con un miembro de unión específica. El miembro de unión específica y el colorante polimérico en tándem pueden conjugarse (por ejemplo, enlazarse covalentemente) entre sí en cualquier ubicación conveniente de las dos moléculas, a través de un enlazador opcional.

Como se usa en la presente descripción, el término "miembro de unión específica" se refiere a un miembro de un par de moléculas que tienen especificidad de unión entre sí. Un miembro del par de moléculas puede tener un área en su superficie, o una cavidad, que se une específicamente a un área en la superficie de, o una cavidad en el otro miembro del par de moléculas. Así, los miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente entre sí para producir un complejo de unión. En algunas modalidades, la afinidad entre miembros de unión específica en un complejo de unión se caracteriza por una Kd (constante de disociación) de 10-6 M o menos, tales como 10-7 M o menos, que incluyen 10-8 M o menos, por ejemplo, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, que incluye 10-15 M o menos. En algunas modalidades, los miembros de unión específica se unen específicamente con gran avidez. Por alta avidez se entiende que el miembro de unión se une específicamente con una afinidad aparente caracterizada por una Kd aparente de 10 x 10-9 M o menos, tales como 1 x 10-9 M o menos, 3 x 10-10 M o menos, 1 x 10-10 M o menos, 3 x 10-11 M o menos, 1 x 10-11 M o menos, 3 x 10-12 M o menos o 1 x 10-12 M o menos.

El miembro de unión específica puede ser proteico. Como se usa en la presente descripción, el término "proteico" se refiere a un resto que está compuesto por residuos de aminoácidos. Un resto proteico puede ser un polipéptido. En determinados casos, el miembro de unión específica proteico es un anticuerpo. En determinadas modalidades, el miembro de unión específica proteico es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de unión de un anticuerpo que se une específicamente a un colorante polimérico. Como se usa en la presente descripción, los términos "anticuerpo" y "molécula de anticuerpo" se usan indistintamente y se refieren a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por todos o parte de los genes de inmunoglobulina reconocidos. Los genes de inmunoglobulina reconocidos, por ejemplo, en humanos, incluyen los loci genéticos kappa (k), lambda (I) y de cadena pesada, que juntos comprenden la miríada de genes de la región variable y los genes de la región constante mu (u), delta (d), gamma (g), sigma (e) y alfa (a) que codifican los isotipos IgM, IgD, IgG, IgE e IgA respectivamente. Una región variable de la cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina consiste en una región "marco" (FR) interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". La extensión de la región marco y las CDR se han definido con precisión (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat y otros, U.S. Department of Health and Human Services, (1991)). La numeración de todas las secuencias de aminoácidos de anticuerpos discutidas en la presente descripción se ajusta al sistema de Kabat. Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligera y pesada constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR. Las CDR son las principales responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. El término anticuerpo pretende incluir anticuerpos de longitud completa y puede hacer referencia a un anticuerpo natural de cualquier organismo, un anticuerpo modificado genéticamente o un anticuerpo generado de forma recombinante para fines experimentales, terapéuticos u otros, como se define más adelante.

Los fragmentos de anticuerpos de interés incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a antígenos, ya sea producidos por la modificación de anticuerpos completos o aquellos sintetizados de novo mediante el uso de tecnologías de A d N recombinante. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden tener otras actividades específicas sobre las células (por ejemplo, anticuerpos antagonistas, agonistas, neutralizantes, inhibidores o estimuladores). Se entiende que los anticuerpos pueden tener sustituciones de aminoácidos conservadoras adicionales que sustancialmente no tienen efecto sobre la unión al antígeno u otras funciones del anticuerpo.

En determinadas modalidades, el miembro de unión específica es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un diacuerpo o un triacuerpo. En determinadas modalidades, el miembro de unión específica es un anticuerpo. En algunos casos, el miembro de unión específica es un anticuerpo murino o un fragmento de unión de este. En determinados casos, el miembro de unión específica es un anticuerpo recombinante o un fragmento de unión de este.

En algunas modalidades, el miembro de unión específica marcado incluye: un multicromóforo captador de luz soluble en agua (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) que comprende un segmento conjugado que incluye: un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado (por ejemplo, un comonómero de fluoreno, como se describe en la presente descripción); y un complejo de metal luminiscente enlazado covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con el mismo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); y un miembro de unión específica enlazado covalentemente al multicromóforo.

En algunos casos del miembro de unión específica marcado, el multicromóforo se describe mediante cualquiera de las Fórmulas (X) y (XIX)-(XII) (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), en donde: G1 y G2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un grupo terminal (por ejemplo, un grupo final), un segmento conjugado n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado, en donde al menos uno de G1 y G2 es un miembro de unión específica enlazado. En algunos casos, F1 es un comonómero de fluoreno.

Métodos

Como se resume anteriormente, los aspectos de la invención incluyen métodos para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra. Los aspectos del método incluyen poner en contacto la muestra con un conjugado de colorante polimérico que se une específicamente al analito diana para producir una muestra en contacto con una composición de marcaje. Como se usa en la presente descripción, los términos "conjugado de colorante polimérico" y "miembro de unión específica marcado" se usan indistintamente. Como tal, el conjugado de colorante polimérico puede incluir: (i) un multicromóforo captador de luz soluble en agua (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) que incluye un segmento conjugado que incluye: un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado (por ejemplo, un comonómero de fluoreno, como se describe en la presente descripción); y un complejo de metal luminiscente enlazado covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con el mismo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); y (ii) un miembro de unión específica (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

Puede usarse cualquier método conveniente para poner en contacto la muestra con un conjugado de colorante polimérico que se une específicamente al analito diana para producir la muestra en contacto con una composición de marcaje. En algunos casos, la muestra se pone en contacto con el conjugado de colorante polimérico en condiciones en las que el miembro de unión específica se une específicamente al analito diana, si está presente. Para la unión específica del miembro de unión específica del conjugado con el analito diana, puede usarse una solución apropiada que mantenga la actividad biológica de los componentes de la muestra y el miembro de unión específica. La solución puede ser una solución salina balanceada, por ejemplo, solución salina normal, PBS, solución salina balanceada de Hank, etc., convenientemente complementada con suero de ternero fetal, lisado de plaquetas humanas u otros factores, junto con un amortiguador aceptable a baja concentración, tal como de 5-25 mM. Los amortiguadores convenientes incluyen HEPES, amortiguadores de fosfato, amortiguadores de lactato, etc. Hay varios medios disponibles comercialmente y pueden usarse de acuerdo con la naturaleza del analito diana, que incluyen dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, medio de Iscove, etc., en algunos casos complementados con suero de ternero fetal o lisado de plaquetas humanas. Los componentes finales de la solución pueden seleccionarse en función de los componentes de la muestra que se incluyan.

La temperatura a la que tiene lugar la unión específica del miembro de unión específica del conjugado al analito diana puede variar, y en algunos casos puede variar de 5 °C a 50 °C, tales como de 10 °C a 40 °C, de 15 °C a 40 °C, de 20 °C a 40 °C, por ejemplo, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C o 37 °C (por ejemplo, como se describe anteriormente). En algunos casos, la temperatura a la que tiene lugar la unión específica se selecciona para que sea compatible con la actividad biológica del miembro de unión específica y/o el analito diana. En determinados casos, la temperatura es de 25 °C, 30 °C, 35 °C o 37 °C. En determinados casos, el miembro de unión específica es un anticuerpo o fragmento de este y la temperatura a la que tiene lugar la unión específica es la temperatura ambiente (por ejemplo, 25 °C), 30 °C, 35 °C o 37 °C. Puede seleccionarse cualquier tiempo de incubación conveniente para la unión específica para permitir la formación de una cantidad conveniente de complejo de unión y, en algunos casos, puede ser 1 minuto (min) o más, como 2 min o más, 10 min o más, 30 min o más, 1 hora o más, 2 horas o más, o incluso 6 horas o más.

Cualquier miembro de unión específica conveniente puede usarse en el conjugado. Los miembros de unión específica de interés incluyen, pero no se limitan a, aquellos agentes que se unen específicamente a las proteínas de la superficie celular de una variedad de tipos de células, que incluyen, pero no se limitan a, células madre, por ejemplo, células madre pluripotentes, células madre hematopoyéticas, linfocitos T, linfocitos T reguladores, células dendríticas, linfocitos B, por ejemplo, linfocitos B de memoria, linfocitos B específicos al antígeno, granulocitos, células de leucemia, células de linfoma, células virales (por ejemplo, células de VIH), células NK, macrófagos, monocitos, fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales células y células eritroides. Las células diana de interés incluyen células que tienen un marcador de superficie celular conveniente o antígeno que puede capturarse por un conjugado de miembro de unión específica conveniente. En algunas modalidades, la célula diana se selecciona de células que contienen VIH, células Treg, poblaciones de linfocitos T específicos al antígeno, células tumorales o células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) de sangre total, médula ósea o sangre de cordón umbilical. Cualquier proteína de la superficie celular o marcador celular conveniente puede ser la diana para la unión específica a los conjugados de colorantes poliméricos en los métodos en cuestión. En algunas modalidades, la célula diana incluye un marcador de superficie celular que se selecciona de un receptor celular y un antígeno de superficie celular. En algunos casos, la célula diana puede incluir un antígeno de superficie celular tales como CD11b, CD123, CD14, CD15, CD16, CD19, CD193, CD2, CD25, CD27, CD3, CD335, CD36, CD4, CD43, CD45RO, CD56, CD61, CD7, CD⁸ , CD34, CD1c, CD23, CD304, CD235a, receptor de linfocitos T alfa/beta, receptor de linfocitos T gamma/delta, CD253, CD95, CD20, CD105, CD117, CD120b, Notch4, Lgr5 (extremo N), SSEA-3, antígeno TRA-1-60, disialogangliósido GD2 y CD71.

Puede seleccionarse cualquier diana conveniente para la evaluación mediante el uso de los métodos en cuestión. Las dianas de interés incluyen, pero no se limitan a, un ácido nucleico, tales como una molécula de ARN, ADN, PNA, CNA, HNA, LNA o ANA, una proteína, tales como una proteína de fusión, una proteína modificada, tales como una proteína fosforilada, proteína glucosilada, ubiquitinada, SUMOilada o acetilada, o un anticuerpo, un péptido, una biomolécula agregada, una célula, una molécula pequeña, una vitamina y una molécula de fármaco. Como se usa en la presente descripción, el término "una proteína diana" se refiere a todos los miembros de la familia diana y los fragmentos de esta. La proteína diana puede ser cualquier proteína de interés, tales como una diana terapéutica o diagnóstica, que incluye, pero no se limita a: hormonas, factores de crecimiento, receptores, enzimas, citocinas, factores osteoinductores, factores estimulantes de colonias e inmunoglobulinas. El término "proteína diana" pretende incluir moléculas recombinantes y sintéticas, que pueden prepararse mediante el uso de cualquier método de expresión recombinante conveniente o mediante el uso de cualquier método sintético conveniente, o comprarse comercialmente. En algunas modalidades, los conjugados de colorantes poliméricos incluyen un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Cualquier analito diana conveniente que se una específicamente a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de interés puede ser diana en los métodos en cuestión.

En algunas modalidades, el analito diana está asociado con una célula. En determinados casos, el analito diana es un marcador de superficie celular de la célula. En determinados casos, el marcador de superficie celular se selecciona del grupo que consiste en un receptor celular y un antígeno de superficie celular. En algunos casos, el analito diana es una diana intracelular y el método incluye además la lisis de la célula.

En algunas modalidades, la muestra puede incluir una población celular heterogénea a partir de la cual se aíslan las células diana. En algunos casos, la muestra incluye sangre total periférica, sangre total periférica en la que los eritrocitos se han lisado antes del aislamiento celular, sangre de cordón umbilical, médula ósea, células mononucleares de sangre periférica purificadas con gradiente de densidad o tejido homogeneizado. En algunos casos, la muestra incluye células progenitoras hematopoyéticas (por ejemplo, células CD34+) en sangre total, médula ósea o sangre de cordón umbilical. En determinadas modalidades, la muestra incluye células tumorales en sangre periférica. En determinados casos, la muestra es una muestra que incluye (o se sospecha que incluye) células virales (por ejemplo, VIH).

Los miembros de unión específica marcados encuentran uso en los métodos en cuestión, por ejemplo, para marcar una célula diana, partícula, diana o analito con un colorante polimérico o un colorante polimérico en tándem. Por ejemplo, los miembros de unión específica marcados encuentran uso en el marcaje de células para ser procesadas (por ejemplo, detectadas, analizadas y/o clasificadas) en un citómetro de flujo. Los miembros de unión específica marcados pueden incluir anticuerpos que se unen específicamente, por ejemplo, a proteínas de la superficie celular de una variedad de tipos de células (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). Los miembros de unión específica marcados pueden usarse para investigar una variedad de propiedades o procesos biológicos (por ejemplo, celulares), tales como el ciclo celular, la proliferación celular, la diferenciación celular, la reparación del ADN, la señalización de linfocitos T, la apoptosis, la expresión y/o la presentación de proteínas de la superficie celular, etcétera. Los miembros de unión específica marcados pueden usarse en cualquier aplicación que incluya (o pueda incluir) el marcaje mediado por anticuerpos de una célula, partícula o analito.

En algunos casos del método, el miembro de unión específica marcado incluye un multicromóforo de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas (X) y (XIX)-(XII) (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), en donde: G¹ y G² se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un grupo terminal, un segmento conjugado n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado, en donde al menos uno de G¹ y G² es un miembro de unión específica enlazado. En algunos casos, F¹ es un comonómero de fluoreno.

Los aspectos del método incluyen ensayar la muestra en contacto con una composición de marcaje para detectar la presencia de un complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico para evaluar si el analito diana está presente en la muestra. Una vez que la muestra se ha puesto en contacto con el conjugado de colorante polimérico, puede usarse cualquier método conveniente para analizar la muestra en contacto con una composición de marcaje que se produce para detectar la presencia de un complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico. El complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico es el complejo de unión que se produce tras la unión específica del miembro de unión específica del conjugado al analito diana, si está presente. El ensayo de la muestra en contacto con una composición de marcaje puede incluir la detección de una señal fluorescente del complejo de unión, si está presente. En algunos casos, el ensayo incluye una etapa de separación en el que el analito diana, si está presente, se separa de la muestra. Puede usarse una variedad de métodos para separar un analito diana de una muestra, por ejemplo, mediante inmovilización en un soporte. Los métodos de ensayo de interés incluyen, pero no se limitan a, cualquier método y formato de ensayo conveniente en los que sean de interés pares de miembros de unión específicas tales como avidina-biotina o anticuerpos anti-hapteno-hapteno. Los métodos y los formatos de ensayo de interés que pueden adaptarse para su uso con las composiciones en cuestión incluyen, pero no se limitan a, métodos de citometría de flujo, métodos de hibridación in situ, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunoelectrotransferencia, ensayos de separación celular magnética y cromatografía de purificación de fluorocromos.

En determinadas modalidades, el método incluye además poner en contacto la muestra con un segundo miembro de unión específica que se une específicamente al analito diana. En determinados casos, el segundo miembro de enlace específico está unido por soporte. Puede usarse cualquier soporte conveniente para inmovilizar un componente de los métodos en cuestión (por ejemplo, un segundo miembro de unión específica). En determinados casos, el soporte es una partícula, tal como una partícula magnética. En algunos casos, el segundo miembro de unión específica y el conjugado de colorante polimérico producen un complejo tipo sándwich que puede aislarse y detectarse, si está presente, mediante el uso de cualquier método conveniente. En algunas modalidades, el método incluye además el análisis por citometría de flujo del complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico, es decir, un analito diana marcado con fluorescencia. El ensayo de la presencia de un complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico puede proporcionar resultados de ensayo (por ejemplo, datos de ensayo cualitativos o cuantitativos) que pueden usarse para evaluar si el analito diana está presente en la muestra.

Puede usarse cualquier soporte conveniente en los métodos en cuestión para inmovilizar cualquier componente conveniente de los métodos, por ejemplo, un miembro de unión específica marcado, diana, un miembro de unión específica secundario, etc. Los soportes de interés incluyen, pero no se limitan a: sustratos sólidos, donde el sustrato puede tener una variedad de configuraciones, por ejemplo, una lámina, una perla u otra estructura, tales como una placa con pocillos; perlas, polímeros, partículas, una malla fibrosa, hidrogeles, matriz porosa, un pin, una superficie de micromatriz, un soporte de cromatografía y similares. En algunos casos, el soporte se selecciona del grupo que consiste en una partícula, un sustrato sólido plano, una malla fibrosa, un hidrogel, una matriz porosa, un pin, una superficie de micromatriz y un soporte de cromatografía. El soporte puede incorporarse a un sistema que proporcione el aislamiento celular asistido por cualquier método conveniente, tal como una jeringa manual, una centrífuga o un sistema automatizado de manejo de líquidos. En algunos casos, el soporte encuentra uso en un sistema automatizado de manejo de líquidos para el aislamiento de células de alto rendimiento, tal como un citómetro de flujo.

En algunas modalidades del método, la etapa de separación incluye aplicar un campo magnético externo para inmovilizar una partícula magnética. Puede usarse cualquier imán conveniente como una fuente del campo magnético externo (por ejemplo, gradiente de campo magnético). En algunos casos, el campo magnético externo se genera por una fuente magnética, por ejemplo, por un imán permanente o un electroimán. En algunos casos, la inmovilización de las partículas magnéticas significa que las partículas magnéticas se acumulan cerca de la superficie más cercana a la fuente del gradiente del campo magnético, es decir, el imán.

La separación puede incluir además una o más etapas de lavado opcionales para eliminar el material sin unir de la muestra del soporte. Puede usarse cualquier método de lavado conveniente, por ejemplo, lavar el soporte inmovilizado con un amortiguador biocompatible que conserva la interacción de unión específica del colorante polimérico y el miembro de unión específica. La separación y el lavado opcional del material sin unir de la muestra del soporte proporcionan una población enriquecida de células diana de la que pueden eliminarse las células y el material no deseados.

En determinadas modalidades, el método incluye además la detección de la diana marcada. La detección de la diana marcada puede incluir excitar el multicromóforo con uno o más láseres y, posteriormente, detectar la emisión de fluorescencia del colorante polimérico en tándem mediante el uso de uno o más detectores ópticos. La detección de la diana marcada puede realizarse mediante el uso de cualquier instrumento y método conveniente, que incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, sistemas FACS, microscopía de fluorescencia; detección de fluorescencia, luminiscencia, ultravioleta y/o luz visible mediante el uso de un lector de placas; cromatografía líquida de alta resolución (HPLC); y espectrometría de masas. Cuando se usan componentes marcados con fluorescencia en los métodos y las composiciones de la presente descripción, se reconoce que pueden usarse diferentes tipos de sistemas de detección de fluorescencia para practicar los métodos en cuestión. En algunos casos, puede realizarse una selección de alto rendimiento, por ejemplo, sistemas que usan placas de microtitulación de 96 pocillos o más. Puede usarse una variedad de métodos para realizar ensayos en materiales fluorescentes, tales como los métodos descritos en, por ejemplo, Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, en: Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, vol. 30, ed. Taylor, D. L. y Wang, Y. L., San Diego: Academic Press (1989), pp. 219­ 243; Turro, N.J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc. (1978), pp. 296-361.

La fluorescencia en una muestra puede medirse mediante el uso de un fluorímetro. En algunos casos, la radiación de excitación, procedente de una fuente de excitación que tiene una primera longitud de onda, pasa a través de la óptica de excitación. La óptica de excitación hace que la radiación de excitación excite la muestra. En respuesta, las dianas marcadas con fluorescencia en la muestra emiten radiación que tiene una longitud de onda que es diferente de la longitud de onda de excitación. La óptica de recolección luego recolecta la emisión de la muestra. El dispositivo puede incluir un controlador de temperatura para mantener la muestra a una temperatura específica mientras se escanea. En determinados casos, una etapa de traslación de múltiples ejes mueve una placa de microtitulación que contiene una pluralidad de muestras para colocar diferentes pocillos para ser expuestos. La etapa de traducción de múltiples ejes, el controlador de temperatura, la función de enfoque automático y la electrónica asociada con la captura de imágenes y datos pueden administrarse mediante un ordenador digital programado apropiadamente. El ordenador también puede transformar los datos recolectados durante el ensayo a otro formato para su presentación.

En algunas modalidades, el método para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra incluye además la detección de fluorescencia en un citómetro de flujo. En algunas modalidades, el método para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra incluye además la formación de imágenes de la muestra en contacto con una composición de marcaje mediante el uso e microscopía de fluorescencia. Las imágenes de microscopía de fluorescencia pueden usarse para identificar un complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico en la muestra en contacto para evaluar si el analito diana está presente. Los métodos de microscopía de interés que encuentran uso en los métodos en cuestión incluyen microscopía confocal de barrido láser.

También se proporcionan métodos para marcar una molécula diana. Los colorantes poliméricos en tándem en cuestión encuentran uso en una variedad de métodos de marcaje, separación, detección y/o análisis. En algunas modalidades, el método incluye: poner en contacto la molécula diana con un colorante polimérico en tándem para producir una molécula diana marcada, en donde el colorante polimérico incluye: un multicromóforo captador de luz soluble en agua que comprende un segmento conjugado que comprende: un comonómero de fluoreno; y un complejo de metal luminiscente enlazado covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con el mismo; y un marcador de conjugación que se enlaza covalentemente a la molécula diana.

En algunos casos del método, el miembro de unión específica marcado incluye un multicromóforo de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas (X) y (XIX)-(XII) (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), donde uno de G¹ y G² es un grupo terminal y el otro de G¹ y G² es el marcador de conjugación. En algunos casos, F¹ es un comonómero de fluoreno.

Como se usa en la presente descripción, el término "marcador de conjugación" se refiere a un grupo que incluye un grupo funcional quimioselectivo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) que puede enlazarse covalentemente con un grupo funcional compatible de una molécula diana, después de la activación y/o la desprotección opcional. Puede usarse cualquier marcador de conjugación conveniente en los colorantes poliméricos en cuestión para conjugar el colorante con una molécula diana de interés. En algunas modalidades, el marcador de conjugación incluye un grupo funcional terminal que se selecciona de un amino, un ácido carboxílico o un derivado de este, un tiol, un hidroxilo, una hidrazina, una hidrazida, una azida, un alquino y un grupo reactivo de proteína (por ejemplo, reactivo con amino, reactivo con tiol, reactivo con hidroxilo, reactivo con imidazolilo o reactivo con guanidinilo).

Cualquier método y reactivo convenientes pueden adaptarse para su uso en los métodos de marcaje en cuestión con el fin de enlazar covalentemente el marcador de conjugación a la molécula diana. Los métodos de interés para marcar una diana incluyen, pero no se limitan a, los métodos y los reactivos descritos por Hermanson, Bioconjugate Techniques, tercera edición, Academic Press, 2013. La etapa de poner en contacto puede realizarse en una solución acuosa. En algunos casos, el marcador de conjugación incluye un grupo funcional amino y la molécula diana incluye un grupo funcional éster activado, tal como un éster NHS o un éster sulfo-NHS, o viceversa. En determinados casos, el marcador de conjugación incluye un grupo funcional maleimida y la molécula diana incluye un grupo funcional tiol, o viceversa.

Puede seleccionarse cualquier molécula diana conveniente para marcar mediante el uso de los métodos en cuestión. Las moléculas diana de interés incluyen, pero no se limitan a, un ácido nucleico, tales como una molécula de ARN, ADN, PNA, CNA, HNA, LNA o a Na , una proteína, tales como una proteína de fusión, una proteína modificada, tales como una proteína fosforilada, glucosilada, ubiquitinada, SUMOilada o acetilada, o un anticuerpo, un péptido, una biomolécula agregada, una célula, una molécula pequeña, una vitamina y una molécula de fármaco. Como se usa en la presente descripción, el término "una proteína diana" se refiere a todos los miembros de la familia diana y los fragmentos de esta. La proteína diana puede ser cualquier proteína de interés, tales como una diana terapéutica o diagnóstica, que incluye, pero no se limita a: hormonas, factores de crecimiento, receptores, enzimas, citocinas, factores osteoinductores, factores estimulantes de colonias e inmunoglobulinas. El término "proteína diana" pretende incluir moléculas recombinantes y sintéticas, que pueden prepararse mediante el uso de cualquier método de expresión recombinante conveniente o mediante el uso de cualquier método sintético conveniente, o comprarse comercialmente. En algunas modalidades, la molécula diana es un miembro de unión específica (por ejemplo, como se describe en la presente descripción). En determinados casos, el miembro de unión específica es un anticuerpo. En algunos casos, el miembro de unión específica es un fragmento de anticuerpo o un derivado de unión de este. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo o el derivado de unión de este se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')², un scFv, un diacuerpo y un triacuerpo.

En algunos casos, el método incluye una etapa de separación en el que la molécula diana marcada se separa de la mezcla de reacción, por ejemplo, un exceso de reactivos o diana no marcada. Puede usarse una variedad de métodos para separar una diana de una muestra, por ejemplo, mediante inmovilización en un soporte, precipitación, cromatografía y similares.

En algunos casos, el método incluye además detectar y/o analizar la molécula diana marcada. En algunos casos, el método incluye además la detección fluorescente de la molécula diana marcada. Puede usarse cualquier método conveniente para detectar y/o analizar la molécula diana marcada junto con los métodos y las composiciones en cuestión. Los métodos para analizar una diana de interés que encuentran uso en los métodos en cuestión incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia, hibridación in situ, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunoelectrotransferencia, ensayos de separación celular magnética y cromatografía de purificación de fluorocromos. Los métodos de detección de interés incluyen, pero no se limitan a, espectroscopia de fluorescencia, microscopia de fluorescencia, secuenciación de ácidos nucleicos, hibridación in situ con fluorescencia (FISH), espectroscopia de masas de proteínas, citometría de flujo y similares.

La detección puede lograrse directamente a través del colorante polimérico en tándem, o indirectamente mediante un sistema de detección secundario. Este último puede basarse en uno cualquiera o en una combinación de varios principios diferentes, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos antiespecie marcados con anticuerpos y otras formas de puentes inmunológicos o no inmunológicos y sistemas de amplificación de señales (por ejemplo, tecnología de biotina-estreptavidina, tecnología mediada por proteína A y proteína G, o sondas de ácido nucleico/sondas anti-ácido nucleico, y similares). Las moléculas indicadoras adecuadas pueden ser las conocidas en el campo de la inmunocitoquímica, biología molecular, microscopía de luz, fluorescencia y electrónica, inmunofenotipado celular, clasificación celular, citometría de flujo, visualización celular, detección, enumeración y/o cuantificación de salida de señal. Puede marcarse y usarse más de un anticuerpo de naturaleza específica y/o no específica de manera simultánea o secuencial para mejorar la detección, identificación y/o análisis de dianas.

Sistemas

Los aspectos de la invención incluyen además sistemas para su uso en la práctica de los métodos y las composiciones en cuestión. Un sistema de análisis de muestras puede incluir un campo de visión de muestra o un canal de flujo cargado con una muestra y un miembro de unión específica marcado. En algunas modalidades, el sistema es un sistema de citometría de flujo que incluye: un citómetro de flujo que incluye una ruta de flujo; una composición en la ruta de flujo, en donde la composición incluye: una muestra; y un miembro de unión específica marcado (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunas modalidades, el sistema para analizar una muestra es un sistema de microscopía de fluorescencia, que incluye: un microscopio de fluorescencia que comprende un campo de visión de la muestra; y una composición dispuesta en el campo de visión de la muestra, en donde la composición comprende una muestra; y un miembro de unión específica marcado (por ejemplo, como se describe en la presente descripción).

En algunos casos de los sistemas, el miembro de unión específica marcado incluye: un multicromóforo captador de luz soluble en agua (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) que comprende un segmento conjugado que incluye: un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado (por ejemplo, un comonómero de fluoreno, como se describe en la presente descripción); y un complejo de metal luminiscente enlazado covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con el mismo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); y un miembro de unión específica enlazado covalentemente al multicromóforo.

En algunos casos de los sistemas en cuestión, el miembro de unión específica marcado, el multicromóforo, se describe mediante cualquiera de las Fórmulas (X) y (XIX)-(XII) (por ejemplo, como se describe en la presente descripción), en donde: G¹ y G² se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un grupo terminal, un segmento conjugado n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado, en donde al menos uno de G¹ y G² es un miembro de unión específica enlazado. En algunos casos, F¹ es un comonómero de fluoreno.

En determinadas modalidades de los sistemas, la composición incluye además un segundo miembro de unión específica que se une al soporte y se une específicamente al analito diana. En algunos casos, el soporte incluye una partícula magnética. Como tal, en determinados casos, el sistema también puede incluir un campo paramagnético externo controlable configurado para su aplicación a una región de ensayo del canal de flujo.

La muestra puede incluir una célula. En algunos casos, la muestra es una muestra biológica que contiene células. En algunos casos, la muestra incluye un miembro de unión específica marcado unido específicamente a una célula diana. En determinados casos, el analito diana que se une específicamente al miembro de unión específica es un marcador de la superficie celular de la célula. En determinados casos, el marcador de superficie celular se selecciona del grupo que consiste en un receptor celular y un antígeno de superficie celular.

En determinados aspectos, el sistema también puede incluir una fuente de luz configurada para dirigir la luz a una región de ensayo del canal de flujo o campo de visión de la muestra. El sistema puede incluir un detector configurado para recibir una señal de una región de ensayo del canal de flujo o un campo de visión de la muestra, en donde la composición fluorescente proporciona la señal. Opcionalmente, además, el sistema de análisis de muestras puede incluir uno o más detectores y/o fuentes de luz adicionales para la detección de una o más señales adicionales.

En determinados aspectos, el sistema puede incluir además sistemas basados en ordenadores para detectar la presencia de la señal fluorescente. Un "sistema basado en ordenadores" se refiere a los componentes físicos de un ordenador, los programas informáticos y los medios de almacenamiento de datos usados para analizar la información de la presente invención. El componente físico mínimo de los sistemas basados en ordenadores de la presente invención incluye una unidad central de procesamiento (CPU), medios de entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que cualquiera de los sistemas basados en ordenadores actualmente disponibles es adecuado para su uso en los sistemas en cuestión. Los medios de almacenamiento de datos pueden incluir cualquier fabricación que incluya un registro de la presente información como se ha descrito anteriormente, o un medio de acceso a la memoria que pueda acceder a dicha fabricación.

"Registrar" datos, programación u otra información en un medio legible por ordenador se refiere a un proceso para almacenar información, mediante el uso de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Puede elegirse cualquier estructura de almacenamiento de datos conveniente, basándose en los medios usados para acceder a la información almacenada. Puede usarse una variedad de programas y formatos de procesamiento de datos para el almacenamiento, por ejemplo, archivo de texto de procesamiento de texto, formato de base de datos, etc.

Un "procesador" hace referencia a cualquier combinación de componentes físicos de un ordenador y/o programas informáticos que realizará las funciones que se le exigen. Por ejemplo, cualquier procesador en la presente descripción puede ser un microprocesador digital programable tal como el disponible en forma de controlador electrónico, unidad central, servidor u ordenador personal (de escritorio o portátil). Cuando el procesador es programable, la programación adecuada puede comunicarse desde una ubicación remota al procesador, o puede guardarse previamente en un producto de programa de ordenador (tal como un medio de almacenamiento legible por ordenador portátil o fijo, ya sea basado en un dispositivo magnético, óptico o de estado sólido). Por ejemplo, un medio magnético o disco óptico puede llevar la programación y puede ser leído por un lector adecuado que se comunique con cada procesador en su estación correspondiente.

Además del dispositivo sensor y el módulo de procesamiento de señales, por ejemplo, como se describe anteriormente, los sistemas de la invención pueden incluir una serie de componentes adicionales, tales como dispositivos de salida de datos, por ejemplo, monitores y/o altavoces, dispositivos de entrada de datos, por ejemplo, interfaz puertos, teclados, etc., componentes de manejo de fluidos, fuentes de alimentación, etc.

En determinados aspectos, el sistema incluye un citómetro de flujo. Los citómetros de flujo de interés incluyen, pero no se limitan a, los dispositivos descritos en las patentes de Estados Unidos núms.: 4,704,891; 4,727,029; 4,745,285; 4,867,908; 5,342,790; 5,620,842; 5,627,037; 5,701,012; 5,895,922; y 6,287,791. Otros sistemas pueden encontrar uso en la práctica de los métodos en cuestión. En determinados aspectos, el sistema puede ser un fluorímetro o microscopio cargado con una muestra que tenga una composición fluorescente de cualquiera de las modalidades discutidas en la presente descripción. El fluorímetro o el microscopio pueden incluir una fuente de luz configurada para dirigir la luz a la región de ensayo del canal de flujo o campo de visión de la muestra. El fluorímetro o el microscopio también pueden incluir un detector configurado para recibir una señal de una región de ensayo del canal de flujo o campo de visión, en donde la composición fluorescente proporciona la señal.

Kits

Los aspectos de la invención incluyen además kits para su uso en la práctica de los métodos y las composiciones en cuestión. Las composiciones de la invención pueden incluirse como reactivos en kits, ya sea como materiales de partida o pueden proporcionarse para su uso, por ejemplo, en las metodologías descritas anteriormente.

Un kit puede incluir un colorante polimérico en tándem (por ejemplo, como se describe en la presente descripción) que incluye un multicromóforo captador de luz soluble en agua que incluye un segmento conjugado que incluye: un comonómero tricíclico 6-5-6 fusionado; y un complejo de metal luminiscente enlazado covalentemente al multicromóforo en proximidad receptora de energía con el mismo (por ejemplo, como se describe en la presente descripción); y uno o más componentes que se seleccionan del grupo que consiste en un colorante polimérico en tándem, un fluoróforo, un miembro de unión específica, un conjugado de miembro de unión específica, un miembro de unión específica unido a un soporte, una célula, un soporte, un amortiguador de elución acuoso biocompatible e instrucciones de uso. En algunas modalidades del kit, el multicromóforo está enlazado covalentemente a un miembro de unión específica. En algunos casos, el miembro de unión específica es un anticuerpo. En determinados casos, el miembro de unión específica es un fragmento de anticuerpo o un derivado de unión de este. En determinados casos, el fragmento de anticuerpo o el derivado de unión de este se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un diacuerpo y un triacuerpo.

En determinadas modalidades, el kit encuentra uso para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra, tal como una diana intracelular. Como tal, en algunos casos, el kit incluye uno o más componentes adecuados para lisar células. Uno o más componentes adicionales del kit pueden proporcionarse en recipientes separados (por ejemplo, tubos, botellas o pocillos separados en una tira o placa de múltiples pocillos).

En determinados aspectos, el kit incluye además reactivos para realizar un ensayo de citometría de flujo. Los reactivos de interés incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores para reconstitución y dilución, amortiguadores para poner en contacto una muestra celular con el multicromóforo, amortiguadores de lavado, células de control, perlas de control, perlas fluorescentes para la calibración del citómetro de flujo y las combinaciones de estos. El kit también puede incluir uno o más reactivos de fijación celular, tales como paraformaldehído, glutaraldehído, metanol, acetona, formalina o cualquier combinación o amortiguador de estos. Además, el kit puede incluir un reactivo de permeabilización celular, tales como metanol, acetona o un detergente (por ejemplo, tritón, NP-40, saponina, Tween 20, digitonina, leucoperma o cualquier combinación o amortiguador de estos). Otros inhibidores del transporte de proteínas, reactivos de fijación de células y reactivos de permeabilización de células familiares para el experto en la técnica están dentro del alcance de los kits en cuestión.

Las composiciones del kit pueden proporcionarse en una composición líquida, tal como cualquier amortiguador adecuado. Alternativamente, las composiciones del kit pueden proporcionarse en una composición seca (por ejemplo, pueden liofilizarse) y el kit puede incluir opcionalmente uno o más amortiguadores para reconstituir la composición seca. En determinados aspectos, el kit puede incluir alícuotas de las composiciones proporcionadas en recipientes separados (por ejemplo, tubos, botellas o pocillos separados en una tira o placa de pocillos múltiples).

Además, pueden combinarse uno o más componentes en un solo recipiente, por ejemplo, un vial, tubo o botella de vidrio o plástico. En determinados casos, el kit puede incluir además un recipiente (por ejemplo, tales como una caja, una bolsa, un recipiente aislado, una botella, un tubo, etc.) en el que están presentes todos los componentes (y sus recipientes separados). El kit puede incluir además un embalaje que esté separado o unido al recipiente del kit y sobre el que se imprima información sobre el kit, los componentes y/o las instrucciones para el uso del kit.

Además de los componentes anteriores, los kits en cuestión pueden incluir además instrucciones para practicar los métodos en cuestión. Estas instrucciones pueden presentarse en los kits en cuestión en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden presentarse en el kit. Una forma en la cual estas instrucciones pueden presentarse es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una hoja u hojas de papel en las cuales se imprime la información, en el embalaje del kit, en un prospecto, etc. Otro medio más sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, disquete, CD, DVD, memoria flash, etc., en el cual se ha grabado la información. Otro medio más que puede presentarse es una dirección de sitio web la cual puede usarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.

Utilidad

Los colorantes poliméricos en tándem, las composiciones, los métodos y los sistemas que se describen en la presente descripción pueden encontrar uso en una variedad de aplicaciones, que incluyen aplicaciones de diagnóstico e investigación, en las que es conveniente la detección y/o el análisis de marcaje de una diana de interés. Dichas aplicaciones incluyen metodologías tales como citometría, microscopía, inmunoensayos (por ejemplo, competitivos o no competitivos), evaluación de un analito libre, evaluación del ligando unido al receptor, etc. Las composiciones, el sistema y los métodos descritos en la presente descripción pueden ser útiles en el análisis de una serie de muestras, que incluyen, pero no se limitan a, fluidos biológicos, muestras de cultivo celular y muestras de tejido. En determinados aspectos, las composiciones, el sistema y los métodos descritos en la presente descripción pueden encontrar uso en métodos en los que los analitos se detectan en una muestra, si están presentes, mediante el uso de marcadores fluorescentes, tales como en clasificación o análisis de células activadas por fluorescencia, inmunoensayos, inmunotinción y similares. En determinados casos, las composiciones y los métodos encuentran uso en aplicaciones donde es de interés evaluar la presencia de un analito diana en una muestra.

En algunos casos, los métodos y las composiciones encuentran uso en cualquier formato de ensayo en el que la detección y/o el análisis de una diana de una muestra sea de interés, que incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia, hibridación in situ, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunoelectrotransferencia, ensayos de separación celular magnética y cromatografía de purificación de fluorocromos. En determinados casos, los métodos y las composiciones encuentran uso en cualquier aplicación en la que sea de interés el marcaje fluorescente de una molécula diana. Las composiciones en cuestión pueden adaptarse para su uso en cualquier aplicación conveniente en la que se usen pares de miembros de unión específica, tales como biotina-estreptavidina y anticuerpo anti-hapteno-hapteno.

Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis del colorante polimérico en tándem fotoestable MC-Ru

Se preparó un colorante polimérico en tándem (MC-Ru) que presenta un análogo de bipiridina de rutenio conjugado con un polímero de núcleo multicromóforo (Figura 2) de acuerdo con el siguiente procedimiento ilustrativo.

Materiales:

1.Multicromóforo que incluye comonómero de enlace de fluoreno que tiene grupos funcionales amino de cadena lateral (-NH²) (MC núcleo):

2.Ru(bpy)-NHS; bis(2,2-bipiridina)-4'-metil-4-carboxibipiridina-rutenio N-succinimidil ésterbis(hexafluorofosfato) (Sigma, Cat: 96631; PM: 1014,66 g mol-1).

Procedimiento:

1. Preparar una solución madre de 80 mg.ml^-1 de MC núcleo en EtOH al 20 % (v/v) en DMSO. Disolver 25,9 mg de MC núcleo en 323 ^l de la solución de EtOH/DMSO. Asumir un MW de 60 kDa para MC núcleo, 25, 9 mg son 0,43 ^mol. 80 mg/ml de MC núcleo = 1,33 mM

2. Disolver 5 mg (4,9 ^mol) de Ru(bpy)-NHS en 500 ^l de DMSO para hacer una solución de 9,8 mM.

3. En un tubo Eppendorf de 1,5 ml, coloque:

a. 37,7 ^l de MC núcleo 1,33 mM

b. 862 |jl de PBS, pH = ⁸

c. 100 ^l de 9,8 mM Ru(bpy)-NHS, añadir en porciones de 4 * 25 ^l con mezcla entre cada porción.

4. Mezclar la solución, que contenía aprox. MC núcleo 50 ^M y Ru(bpy)-NHS de 1 mM, en la oscuridad a TA mediante el uso de una gradilla de tubos Eppendorf giratoria.

5. Después de 4 horas, retirar el Ru(bpy) que no haya reaccionado mediante el uso de una columna giratoria Zeba con un corte de MW de 7 kDa, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

Ejemplo 2: Propiedades del colorante polimérico en tándem fotoestable MC-Ru

Para caracterizar las propiedades fotofísicas de MC-Ru, se obtuvieron los espectros de absorbancia y emisión del colorante polimérico en tándem, se midió el rendimiento cuántico y se llevó a cabo un ensayo de fotoestabilidad in vitro.

Se obtuvieron los espectros de absorbancia y emisión de MC-Ru. La Figura 3 muestra los espectros de absorbancia (panel a) y emisión (panel b) de una solución 90 nM de MC-Ru en amortiguador PBS (solución salina amortiguada con fosfato) antes (pre, línea continua) y después (post, línea discontinua) de la exposición continua a luz de excitación incidente (Aex = 390 nm). La muestra se irradió continuamente con luz (Aex = 450) durante 60 min. Los anchos de rendija de excitación y emisión fueron de 1 mm (4 nm) y 0,25 mm (1 nm), respectivamente. La intensidad de la fluorescencia se controló a Aem = 640 nm. Los datos se informan como un porcentaje de la intensidad normalizada (intensidad normalizada = (1640 nm/inicial 640 nm) * 100). Los escaneos de longitud de onda de emisión se adquirieron antes (pre) y después (post) del estudio de fotoestabilidad. El espectro de absorbancia de MC-Ru parece análogo al espectro de absorbancia del cromóforo captador de luz del MC núcleo con la excepción de una pequeña banda en Aabs = 288 nm, que se asigna a la transición n ^ n* de los ligandos de bipiridina (consulte la Figura 3, panel a). Cuando se excita la solución de MC-Ru (A ex = 390 nm), se observan bandas de emisión tanto del polímero del MC núcleo (Aem = 425 y 450 nm) como del complejo Ru(bpy) (Aem = 640 nm) (Figura 3b).

La Figura 4 muestra el espectro de emisión de MC-Ru en el amortiguador PBS cuando se excita el multicromóforo polimérico MC núcleo (Aex = 390 nm; línea negra) o se excita directamente el resto del ligando metálico Ru(bpy) conjugado con la cadena principal del multicromóforo polimérico (Aex = 450 nm, línea gris). El espectro insertado es un primer plano de la banda de emisión observada cuando los restos de ligando metálico Ru(bpy) se excitan directamente con luz de 450 nm. Si el resto del complejo de metal Ru(bpy) de MC-Ru se excita directamente (Aex = 450), se observa una señal de emisión (Aem = 640 nm) que es aproximadamente 25 veces menos intensa que cuando el complejo de metal se excita indirectamente, por ejemplo, a través de la excitación del multicromóforo captador de luz MC a 390 nm y la transferencia de energía (recuadro de la Figura 4). La mejora de 25 veces en la emisión de fluorescencia para MC-Ru a 640 nm demuestra que MC-Ru supera la falta de brillo observada en la mayoría de los complejos de metales luminiscentes, una limitación significativa que ha limitado la utilidad de los complejos de metales luminiscentes en la detección de fluorescencia.

Para comprender mejor la fotofísica de MC-Ru, se calcularon los rendimientos cuánticos de un multicromóforo polimérico (MC núcleo) y un colorante polimérico en tándem MC-Ru como se muestra en la Tabla 1. Los rendimientos cuánticos se determinaron mediante el uso de 4-metilumbeliferona (4-MU) como un colorante de referencia ^{( 9} = 0,7 a pH 10). La longitud de onda de excitación usada para todas las mediciones fue de 390 nm. Se encontró que MC-Ru y MC núcleo tienen rendimientos cuánticos del 3 % y 43 %, respectivamente. La gran disminución en el rendimiento cuántico de MC-Ru se atribuye al bajo rendimiento cuántico del colorante aceptor Ru(bpy), que se sabe que es aproximadamente del ⁶ % en amortiguador aireado (Suzuki, 2009). Sin embargo, debido al gran coeficiente de extinción del polímero de MC núcleo, el brillo de MC-Ru, definido como el producto del coeficiente de extinción (e) y el rendimiento cuántico (⁹ ), es comparable al de la fluoresceína en condiciones similares (Tabla 2).

^ -

Tabla 2. Com aración de brillo de MC núcleo MC-RU otros colorantes fluorescentes.

Se compararon la fotoestabilidad de MC-Ru y un colorante polimérico en tándem MC (Figura 5). La fotoestabilidad de los colorantes se evaluó al irradiar continuamente las soluciones de los colorantes y al observar la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo. Las soluciones se expusieron a la irradiación continua de luz durante un período de 60 min. Durante la exposición, se controló la intensidad de emisión de cada compuesto y los valores se normalizaron a la intensidad de emisión inicial. MC-Ru fue relativamente fotoestable en estas condiciones, perdiendo solo aproximadamente el 30 % de la intensidad de la señal. Por el contrario, la emisión de MC-tándem disminuyó en un 50 % en solo ⁸ min y perdió >99 % de intensidad después de 60 min. La Figura 5 muestra las fotoestabilidades normalizadas de MC-Ru frente a MC-tándem que incluye un multicromóforo captador de luz MC núcleo y un fluoróforo orgánico conjugado.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un colorante polimérico en tándem fotoestable que comprende:

un multicromóforo polimérico captador de luz soluble en agua que comprende un segmento conjugado que comprende un comonómero de fluoreno sustituido con al menos un grupo solubilizante en agua; y un complejo de rutenio luminiscente enlazado covalentemente al multicromóforo polimérico en proximidad receptora de energía con el mismo,

en donde el comonómero de fluoreno está sustituido con al menos un grupo lateral no iónico capaz de impartir una solubilidad en agua superior a ¹⁰ mg/ml,

en donde el colorante polimérico en tándem se describe mediante la Fórmula (X):

en donde:

F¹ es el comonómero de fluoreno;

cada M¹ y M² son independientemente un comonómero;

L¹ es un comonómero de enlace sustituido con un complejo de metal luminiscente enlazado Z1; e es ¹ ;

a, b, c, d y f son cada uno independientemente ⁰ o ¹ , en donde a+b+c+d+f > ¹ ;

n es 0 o un número entero de 1 a 10000;

m es ⁰ o un número entero de ¹ a ^{10 0 0 0} ;

p es un número entero de ¹ a ^{100 0 0 0} ; y

G¹ y G² se seleccionan cada uno independientemente de un grupo terminal, un segmento conjugado n, un enlazador y un miembro de unión específica enlazado,

en donde el complejo de rutenio luminiscente comprende un ligando quelante de metal multidentado sustituido de la estructura:

en donde de R¹¹ a R¹⁸ se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo, alquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, arilo, arilo sustituido y enlazador, en donde al menos uno de R¹¹ a R¹⁸ está enlazado covalentemente al comonómero de enlace,

en donde el colorante polimérico tiene un peso molecular promedio en el intervalo de ^{10 0 0 0} a ¹⁰⁰ 000.

2. El colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el complejo de metal luminiscente está configurado para excitarse por el multicromóforo polimérico y para producir una emisión del complejo de metal luminiscente que es fotoestable durante 30 minutos o más.

3. El colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la emisión del complejo de metal luminiscente tiene un rendimiento cuántico de 0,03 o más.

4. El colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la emisión del complejo de metal luminiscente tiene un brillo de 50 mM-¹cm^-1 o más.

5. El colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el al menos un grupo lateral no iónico se selecciona de (CH²)x(OCH²CH²)yOCH3, en donde cada x es independientemente un número entero de ^{0 - 2 0} y cada y es independientemente un número entero de ⁰ a 50, y un bencilo sustituido con al menos un grupo (OCH²CH²)zOCH³ en donde cada z es independientemente un número entero de 0 a 50.

6. El colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

b es ¹ ;

n es un número entero de ¹ a ^{10 0 0 0} ; y

m es un número entero de ¹ a ^{10 0 0 0}.

7. El colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el colorante polimérico en tándem se describe mediante la Fórmula (XX):

8. El colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1­ ⁶ , en donde el colorante polimérico en tándem se describe mediante la Fórmula (XIX):

9. El colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los comonómeros M¹ y M² son independientemente un comonómero de arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido.

10. Un miembro de unión específica marcado, que comprende:

(a) un colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de ¹ a 9 y

(b) un miembro de unión específica enlazado covalentemente al multicromóforo polimérico del colorante polimérico en tándem fotoestable.

11. Un método para evaluar la presencia de un analito diana en una muestra, el método comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un conjugado de colorante polimérico que se une específicamente al analito diana para producir una muestra en contacto con una composición de marcaje, en donde el conjugado de colorante polimérico comprende:

(i) un colorante polimérico en tándem fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9; y

(ii) un miembro de unión específica; y

(b) ensayar la muestra en contacto con una composición de marcaje para detectar la presencia de un complejo de unión analito diana-conjugado de colorante polimérico para evaluar si el analito diana está presente en la muestra.

12. Un método para marcar una molécula diana, el método comprende:

poner en contacto la molécula diana con un colorante polimérico fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-9 para producir una molécula diana marcada, en donde el colorante polimérico fotoestable también comprende un marcador de conjugación que se enlaza covalentemente a la molécula diana.

13. Un sistema de citometría de flujo, que comprende:

un citómetro de flujo que comprende una ruta de flujo;

una composición en la ruta de flujo, en donde la composición comprende:

una muestra; y

un miembro de unión específica marcado que comprende:

un colorante polimérico fotoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-9 y

un miembro de unión específica que se une específicamente a un analito diana y está enlazado covalentemente al multicromóforo polimérico del colorante polimérico fotoestable.