JP7405904B2 - 紫外線吸収性ポリマー色素およびそれを使用する方法 - Google Patents
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Description
35U.S.C.§119(e)に従って、本出願は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、2015年3月12日出願の米国仮特許出願第62/132,449号明細書の出願日に対する優先権を主張する。
より詳細に例示的な実施形態を説明する前に、本明細書で使用される用語の意味および範囲を説明および定義するために以下の定義が示される。
本明細書で使用される「生体試料」という用語は、生物全体またはその組織のサブセット、細胞または構成要素(例えば、限定されないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液および精液を含む体液)を意味する。「生体試料」とは、限定されないが、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸管、および尿生殖路の外部セクション、涙、唾液、乳、血球、腫瘍および臓器など、生物全体またはその組織のサブセット、細胞または構成要素、またはその画分もしくはその一部から調製されたホモジネート、溶解物又は抽出物も意味し得る。
特定の実施形態において、試料は、動物または植物から取り出されている。生体試料は細胞を含み得る。「細胞」という用語は、核および細胞膜を少なくとも有する真核生物と原核生物との両方の生物体の基本構造単位を意味するために、その従来の意味で使用される。特定の実施形態において、細胞は、細菌由来の細胞などの原核細胞を含む。他の実施形態において、細胞は、動物、植物または菌類由来の生体試料から得られた細胞などの真核細胞を含む。
ポリペプチドは、簡便な長さ、例えば、4個以上のアミノ酸、10個以上のアミノ酸、20個以上のアミノ酸、50個以上のアミノ酸、100個以上のアミノ酸、300個以上のアミノ酸、例えば500個まで、または1000個まで、またはそれを超えるアミノ酸など、2個以上のアミノ酸の長さであり得る。「ペプチド」は、4個以上のアミノ酸、10個以上のアミノ酸、20個以上のアミノ酸、例えば50個までのアミノ酸など、2個以上のアミノ酸であり得る。一部の実施形態において、ペプチドは、5~30アミノ酸の長さである。
主鎖原子間の結合は飽和または不飽和結合であり、場合により、1、2または3個以下の不飽和結合がリンカー主鎖に存在する。リンカーは、1個以上の置換基、例えばアルキル、アリールまたはアルケニル基を含んでもよい。リンカーとしては、限定されないが、ポリエチレングリコール;エーテル、チオエーテル、第3級アミン、アルキル(直鎖状または分岐状であり得る)、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、1-メチルエチル(イソ-プロピル)、n-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルエチル(t-ブチル)等が挙げられる。リンカーの主鎖は、環状基、例えば、アリール、複素環またはシクロアルキル基を含んでもよく、環状基の2個以上、例えば、2、3または4個の原子が主鎖に含まれる。リンカーは切断可能であるか、または切断不可能であり得る。
対象の多発色団で使用するために適応され得るPEGグループとしては、S.Zalipskyによる“Functionalized poly(ethylene glycol) for preparation of biologically relevant conjugates”,Bioconjugate Chemistry 1995,6(2),150-165;およびZhuらによる“Water-Soluble Conjugated Polymers for Imaging,Diagnosis,and Therapy”,Chem.Rev.,2012,112(8),pp4687-4735に記述されるPEGが挙げられる。
一部の実施形態において、アルキル基は炭素原子1~10個を含む。特定の実施形態において、アルキル基は、炭素原子1~4個など、炭素原子1~6個を含む。この用語は、一例として、直鎖状および分岐状ヒドロカルビル基、例えばメチル(CH3-)、エチル(CH3CH2-)、n-プロピル(CH3CH2CH2-)、イソプロピル((CH3)2CH-)、n-ブチル(CH3CH2CH2CH2-)、イソブチル((CH3)2CHCH2-)、s-ブチル((CH3-)(CH3CH2)CH-)、t-ブチル((CH3)3C-)、n-ペンチル(CH3CH2CH2CH2CH2-)、およびネオペンチル((CH3)3CCH2-)を含む。
特定の実施形態において、ヘテロアリール基は、5~20員ヘテロアリールである。特定の実施形態において、ヘテロアリール基は5~10員ヘテロアリールである。特定の実施形態において、ヘテロアリー基は、チオフェン、ピロール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ピリジン、キノリン、イミダゾール、オキサゾールおよびピラジンから誘導される基である。
特定の実施形態において、置換基としては、-M、-R60、=O、-OR60、-SR60、-S-、=S、-NR60R61、=NR60、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、=N2、-N3、-S(O)2R60、-OS(O)2O-、-OS(O)2R60、-P(O)(O-)2、-P(O)(OR60)(O-)、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(S)R60、-C(O)OR60、-C(O)NR60R61、-C(O)O-、-NR62C(O)NR60R61が挙げられる。特定の実施形態において、置換基としては、-M、-R60、=O、-OR60、-SR60、-NR60R61、-CF3、-CN、-NO2、-S(O)2R60、-P(O)(OR60)(O-)、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(O)OR60、-C(O)NR60R61、-C(O)O-が挙げられる。
特定の実施形態において、置換基としては、-M、-R60、=O、-OR60、-SR60、-NR60R61、-CF3、-CN、-NO2、-S(O)2R60、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(O)OR60、-C(O)O-が挙げられ、式中、R60、R61およびR62は以下で定義される通りである。例えば、置換基は、メチレンジオキシ基、または、ハロゲン原子、(1~4C)アルキル基および(1~4C)アルコキシ基から選択される1、2または3個の置換基を有し得る。置換されている基がアリールまたはヘテロアリール基である場合、置換基(例えば、本明細書に記載される)は、「アリール置換基」と呼ばれ得る。
上記にまとめられるように、本発明の開示内容は、紫外線吸収極大を有する集光性多発色団を提供する。一部の実施形態において、多発色団は、6-5-6縮合三環系コモノマー;および紫外線吸光度修飾コモノマーを有する共役セグメントを含み、その多発色団は紫外線吸収極大を有する。本明細書で使用される「紫外線吸収極大」という用語は、電磁スペクトルの紫外線領域にある吸収極大波長、例えば、10~400nmの範囲の吸収極大波長など、400nm以下の波長を意味する。
特定の場合において、ポリマーの反復単位は、2つ以上のモノマー基、すなわち、2、3、4個以上のコモノマー基などのコモノマー基を含む。本明細書で使用される「コモノマー」または「コモノマー基」という用語は、それ自体がポリマーの反復単位の一部であり得るポリマーの構造単位を意味する。一部の実施形態において、共役系ポリマーは、重合モノマーのブロックで構成されるブロックコポリマーを含む。かかる場合において、ブロックコポリマーは、それぞれがポリマーの別々のコブロックに相当する、異なる反復単位を有すると説明され得る。場合により、ポリマーは、2つの異なるコブロックを含有するジブロックコポリマーである。かかる場合において、ポリマーは、コブロックを含むと説明することができ、各コブロックは、1、2、3個以上のコモノマーなどのコモノマーで構成され得る。
場合により、親水性水溶性基は、帯電しており、例えば正または負の電荷を有する。特定の場合において、親水性水溶性基は中性親水性基である。一部の実施形態において、WSGは、親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、セルロース、キトサン、またはその誘導体である。対象の水溶性基としては、限定されないが、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、スルホネート、スルフェート、スルフィネート、スルホニウム、エステル、ポリエチレングリコール(PEG)および修飾PEG、ヒドロキシル、アミン、アンモニウム、グアニジニウム、ピリジニウム、ポリアミンおよびスルホニウム、多価アルコール、直鎖または環状サッカリド、第1級、第2級、第3級、または第4級アミンおよびポリアミン、ホスホネート基、ホスフィネート基、アスコルビン酸基、グリコール、例えばポリエーテル、-COOM’、-SO3M’、-PO3M’、-NR3 +、Y’、(CH2CH2O)pRおよびその混合物(Y’は、ハロゲン、スルフェート、スルホネート、または酸素含有アニオンであることができ、pは1~500であることができ、Rは、それぞれ独立してHまたはアルキル(メチルなど)であることができ、M’は、カチオン性対イオンまたは水素、--(CH2CH2O)yyCH2CH2XRyy、--(CH2CH2O)yyCH2CH2X--、--X(CH2CH2O)yyCH2CH2--、グリコール、およびポリエチレングリコールであることができ、ここで、yyは、1~1000から選択され、Xは、O、S、およびNRZZから選択され、RZZおよびRYYは独立して、HおよびC1~3アルキルから選択される)が挙げられる。
特定の場合において、多発色団は300~400nmの吸収極大波長を有する。一部の場合において、多発色団は、範囲300~400nm(300~390nm、300~380nm、300~370nm、300~360nmまたは300~325nmの範囲など)の吸収極大波長および範囲375~900nm(380~900nm、390~900nm、または400~900nmの範囲など)の発光極大波長を有する。特定の場合において、多発色団は可視光を吸収せず、例えば、波長405nm以上など、400nmを超える波長では吸収しない。特定の場合において、多発色団は、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、または99%以上など、積分吸収強度(吸収ライン下の面積)の80%以上が波長400nm以下の紫外線領域にある、吸収スペクトルを有する。
特定の場合において、多発色団の反復単位は、1個のモノマー、2個のコモノマー、または3個以上のコモノマーを含み得る。一部の場合において、多発色団は、40,000cm-1M-1以上/コモノマー、例えば45,000cm-1M-1以上/コモノマー、50,000cm-1M-1以上/コモノマー、55,000cm-1M-1以上/コモノマー、60,000cm-1M-1以上/コモノマー、70,000cm-1M-1以上/コモノマー、80,000cm-1M-1以上/コモノマー、90,000cm-1M-1以上/コモノマー、100,000cm-1M-1以上/コモノマー、またはそれを超える吸光係数を有する。一部の場合において、40,000cm-1M-1以上/コモノマーが平均吸光係数である。
F1は、6-5-6縮合三環系コモノマーであり;
M1およびM2は、それぞれ独立して紫外線吸光度修飾コモノマーであり;
bは、1または2であり;
a、c、d、eおよびfは、それぞれ独立して0または1であり、ここで、a+c+d+f≧1であり;
L1は、化学選択的タグ-Z1を含む連結性コモノマーであり;
nは、それぞれ1~100,000の整数であり;
mは、それぞれ0または1~10,000の整数であり;
pは、1~100,000の整数であり;かつ
G1およびG2は、それぞれ独立して、末端基、π共役セグメント、リンカーおよび連結された特異的結合性メンバーから選択される。
Zは、-C(R1)2-または-N(R1)-であり;
Rは、それぞれ独立してHまたは1つもしくは複数のアリール置換基であり;
R1は、それぞれ独立して、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、PEG部位および-L1-Z1(L1はリンカーであり、かつZ1は化学選択的タグ(例えば、化学選択的官能基を含むタグ)である)またはWSGから選択される。本明細書に記載の式のいずれかで使用される*は、共役系ポリマーの不飽和主鎖への共有結合の部位または末端基を意味する。
一部の実施形態において、Zが-N(R1)-である場合、6-5-6縮合三環系コモノマーはカルバゾールコモノマーである。簡便なカルバゾールコモノマーを主題の多発色団において用いることができる。一部の実施形態において、Zは-C(R1)2-である場合、6-5-6縮合三環系コモノマーはフルオレンコモノマーである。簡便なフルオレンコモノマーを主題の多発色団において用いることができる。6-5-6縮合三環系コモノマーの特定の場合において、R1は、それぞれ1、2個以上のPEG部位で置換されたベンジル基または2個以上のPEG部位で置換されたアルキル基から選択される。
特定の場合において、Z1は、アクセプター発色団に共有結合で連結するためのアミノ基を含む。特定の場合において、Z1は、アクセプター発色団に共有結合で連結するためのカルボン酸基またはその誘導体を含む。特定の実施形態において、L1は、2個以上のZ1基(例えば、WSG)へ連結する分岐状リンカーである。特定の場合において、フルオレンコモノマーは、1、3、4、5、6および8位から選択される1個、2個又はそれ以上の位に位置するR5および/またはR6置換基でさらに置換されており、R5およびR6は独立して、水溶性基(WSG)およびアリール置換基(例えば、本明細書に記載される)から選択される。
フルオレンコモノマーの特定の場合において、R2は、それぞれ1つの-O(CH2CH2O)nR’基で(例えば、2、3または4位において)置換されているベンジル基であり、R’はHまたはアルキルであり、nは1~20、例えば3~16であり、例えばnは8~16である。
フルオレンコモノマーの特定の場合において、R2は、それぞれ2つの-O(CH2CH2O)nR’基で(例えば、2,4-、3,4-または3,5-位において)置換されているベンジル基であり、R’は、それぞれ独立してHまたはアルキルであり、nは、それぞれ独立して1~20、例えば3~16であり、例えばnは8~16である。フルオレンコモノマーの特定の場合において、R2は、それぞれ3つの-O(CH2CH2O)nR’基で(例えば、2,2,4,6-、2,4,5-または3,4,5-位において)置換されているベンジル基であり、R’はHまたはアルキルであり、nは1~20、例えば3~16であり、例えばnは8~16である。フルオレンコモノマーの特定の場合において、R2は、それぞれ三価分岐状基で置換されている低級アルキル基であり、それぞれが2つのPEG部位(例えば、-CO-NR’’2または-O(CH2R’’)2三価分岐状基)で置換されており、R’’は、それぞれ独立してPEG部位(例えば、-O(CH2CH2O)nR’(R’はHまたはアルキルであり、nは1~20、例えば3~16であり、例えばnは8~16である)である。
R3は、水溶性基(例えば、本明細書に記載される)を含む置換基であり;
R4は、L2-Z2であり、ここで、L2はリンカーであり、かつZ2は化学選択的タグ(例えば、アクセプター発色団への結合のための)であり;かつ
R5およびR6は、独立して、H、水溶性基およびアリール置換基(例えば、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロゲンまたはニトロ)から選択される。フルオレンコモノマーの特定の場合において、R3は、三価分岐状基で置換されている低級アルキル基であり、それぞれが2つのPEG部位(例えば、-CO-NR’’2または-O(CH2R’’)2三価分岐状基)で置換されており、R’’は、PEG部位(例えば、-O(CH2CH2O)nR’(R’はHまたはアルキルであり、nは1~20、例えば3~16であり、例えばnは8~16である)である。
一部の場合において、G1および/またはG2はπ共役セグメントである。本明細書で使用されるπ共役セグメントとは、多発色団が共役され得る、すなわち隣接単位にわたってπ電子の非局在化が可能となる、共役系ポリマーの簡便なセグメントを意味する。特定の実施形態において、G1および/またはG2は、特異的結合性部位への共役に適した官能基を含むリンカーなどである。多発色団のG1および/またはG2位に位置するリンカーは、多発色団の側鎖に(例えば、Z1において)存在し得る化学選択的タグを含む他のリンカーに対して直交するように選択され得ることが理解される。特定の実施形態において、アミノ官能基またはその誘導体は、G1および/またはG2において含有され、カルボン酸官能基またはその誘導体はZ1において含有される。特定の実施形態において、カルボン酸官能基またはその誘導体は、G1および/またはG2において含有され、アミノ官能基またはその誘導体はZ1において含有される。
度修飾コモノマーは、以下:
のうちの1つから選択される、任意選択的に置換されているアリールまたはヘテロアリールコモノマーである。置換アリール又はヘテロアリールコモノマー構造の一部の実施形態において、nは3~20の整数である。一部の実施形態において、多発色団は、以下の構造:
によって示される置換アリールコモノマーを含む。特定の場合において、nは3~12である。一部の実施形態において、多発色団は、以下の構造:
一部の実施形態において、集光性多発色団はポリマータンデム色素である。ポリマータンデム色素は、2つの共有結合部位:ドナー集光性多発色団(例えば、本明細書に記載される)およびアクセプター発色団を含む。特定の実施形態において、ポリマータンデム色素は、6-5-6縮合三環系コモノマー(例えば、本明細書に記載される);および紫外線吸光度修飾コモノマー(例えば、本明細書に記載される)などの共役セグメントを含む水溶性集光性多発色団であって、紫外線吸収極大(例えば、本明細書に記載される)を有する多発色団と、そのエネルギー受容近位で多発色団に共有結合で連結されたアクセプター発色団とを含み得る。
一部の場合において、アクセプター発色団は失活剤である。特定の場合において、アクセプター発色団は蛍光色素である。本明細書で使用される「アクセプター発色団」という用語は、多発色団から移動されたエネルギーを受け取り、または吸収することができる光吸分子を意味する。場合により、アクセプター発色団は、多発色団から受けるエネルギーを光として発するか、または熱としてエネルギーを放散し得る。別段の指定がない限り、本明細書に示す構造および式において、「色素」というラベルは、「アクセプター発色団」を意味する。本明細書で使用される「失活剤」という用語は、多発色団からのエネルギーを吸収し、かつ発光しないが、エネルギーを熱として放散し得るアクセプター発色団を意味する。
一部の場合において、これらのエネルギー移動メカニズムは比較的短い範囲であり;すなわち、アクセプター発色団に対して集光性多発色団システムが近傍にあることにより、効率的なエネルギー移動が行われる。一部の場合において、効率的なエネルギー移動のための条件下において、集光性多発色団システムにおける個々の発色団の数が多い場合、アクセプター発色団からの発光の増幅が起こる;すなわち、その入射光(「ポンプライト」)が集光性多発色団によって吸収される波長にある場合、シグナル伝達発色団の発光は、ポンプライトによってシグナル伝達発色団が直接励起された場合よりも強い。
対象の蛍光色素としては、限定されないが、フルオレセイン、6-FAM、ローダミン、TexasRed、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン6G、カルボキシロードール、カルボキシローダミン110、Cascade Blue、Cascade Yellow、クマリン、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy-クロム、フィコエリトリン、PerCP(ペリジニンクロロフィル-aタンパク質)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン)、NED、ROX(5-(および-6)-カルボキシ-X-ローダミン)、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸、BODIPY FL、BODIPY FL-Br.sub.2、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、その共役体、およびその組み合わせが挙げられる。対象のランタニドキレートとしては、限定されないが、ユーロピウムキレート、テルビウムキレートおよびサマリウムキレートが挙げられる。
一部の実施形態において、ポリマータンデム色素としては、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa 488、Alexa 647およびAlexa 700から選択されるアクセプターフルオロフォアに連結されたポリマー色素を意味する。特定の実施形態において、ポリマータンデム色素としては、Dyomics色素(例えば、DY 431、DY 485XL、DY 500XL、DY 530、DY 610、DY 633、DY 640、DY 651、DY 654、DY 682、DY 700、DY 701、DY 704、DY 730、DY 731、DY 732、DY 734、DY 752、DY 754、DY 778、DY 782、DY 800またはDY 831)、Biotium CF 555、Cy 3.5、およびジエチルアミノクマリンから選択されるアクセプターフルオロフォアに連結されたポリマー色素が挙げられる。
F1は、6-5-6縮合三環系コモノマー(例えば、本明細書に記載される)であり;
M1およびM2は、それぞれ独立して紫外線吸光度修飾コモノマー(例えば、本明細書に記載される)であり;
bは、1または2であり;
a、c、dおよびfは、それぞれ独立して0または1であり、ここで、a+c+d+f≧1であり;
eは、1または2であり;
L1は、アクセプター発色団-C1に連結された連結性コモノマーであり;
nは、1~10,000の整数であり;
mは、1~10,000の整数であり;
pは、1~100,000の整数であり;かつ
G1およびG2は、それぞれ独立して、末端基、π共役セグメント、リンカーおよび連結された特異的結合性メンバーから選択される。式(V)の特定の実施形態において、eは1である。式(V)の一部の場合において、d+f≦1(すなわち、dは1であり、かつfは0であり、またはdは0であり、かつfは1である)であり、m≧1である。式(V)の一部の場合において、F1はフルオレンコモノマーである。式(V)の特定の場合において、F1はカルバゾールコモノマーである。
R1は、水溶性基を含む置換基(例えば、PEG置換アルキル)であり;
R2は、L2-Z2(L2はリンカーであり、かつZ2はアクセプター発色団である)であり;かつ
R3およびR4は、独立してH、水溶性基、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロゲンおよびニトロである。特定の場合において、R3およびR4は、それぞれ独立して水素である。
*-Ar-L-Z
によって示され、式中、Arは、π共役系アリール基であり、Lはリンカーであり、かつZは化学選択的タグまたは特異的結合性メンバーである。式(I)~(VII)の特定の実施形態において、G1およびG2のうちの少なくとも1つが、以下の構造:
qは、0または1~12の整数であり;
Lは、任意選択的なリンカーであり;かつ
Zは、化学選択的タグまたは特異的結合性メンバーである。式(I)~(VII)の特定の実施形態において、少なくとも1つのL2基が、構造:
特定の実施形態において、Zは、カルボン酸、アミノまたはマレイミドから選択される。特定の場合において、Zは、連結された特異的結合性メンバーである。一部の場合において、Lは、-(CH2)3COOHなどのアルキル-カルボン酸である。特定の実施形態において、R1基のうちの1つまたは複数は、2個以上のWSGでさらに置換された分岐状基である。特定の場合において、分岐状基は、2個のPEG基で置換されている、置換ベンジル基などの置換アラルキルである。
特定の場合において、Zは、連結された特異的結合性メンバーである。一部の場合において、Lは、-(CH2)3COOHなどのアルキル-カルボン酸である。一部の実施形態において、Akは、C1~6アルキルである。一部の場合において、Akは、それぞれ-CH2-である。場合により、R1は、それぞれ-プロピル-O-mPEG11である。特定の場合において、n1は、それぞれ5~15である。特定の場合において、n2は、3~12、例えば3である。
特定の場合において、Zは、連結された特異的結合性メンバーである。一部の場合において、Lは、-(CH2)3COOHなどのアルキル-カルボン酸である。一部の実施形態において、Akは、C1~6アルキルである。特定の場合において、n1は、それぞれ5~15である。特定の場合において、n2は、それぞれ3~12、例えば3である。一部の場合において、UV修飾コモノマーのAkは-CH2-である。一部の場合において、フルオレンコモノマーのAkそれぞれは、-(CH2)3-である。
本発明の開示内容の態様は、標識化特異的結合性メンバーを含む。標識化特異的結合性メンバーは、主題の多発色団(例えば、本明細書に記載される)と特異的結合性メンバーとの共役体である。多発色団はポリマー色素であり得る。多発色団はポリマータンデム色素であり得る。本明細書に記載の多発色団のいずれも特異的結合性メンバーと共役し得る。特異的結合性メンバーおよび多発色団は、多発色団の簡便な位置を介して、任意選択的なリンカーを介して互いに共役(共有結合)され得る。
本明細書で使用される「抗体」および「抗体分子」という用語は、区別なく使用され、認識される免疫グロブリン遺伝子のすべてまたは一部によって実質的にコードされる、1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。例えばヒトにおいて、認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ(k)、ラムダ(l)、および重鎖遺伝子座(共に無数の可変領域遺伝子を含む)、および定常領域遺伝子ミュー(u)、デルタ(d)、ガンマ(g)、シグマ(e)、およびアルファ(a)(IgM、IgD、IgG、IgE、およびIgAアイソタイプをそれぞれコードする)が挙げられる。免疫グロブリン光または重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」とも呼ばれる、3つの超可変領域によって割り込まれる「フレームワーク」領域(FR)からなる。フレームワーク領域およびCDRの程度は正確に定義されている(“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”E.Kabat et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1991)参照)。
本明細書に記述されるすべての抗体アミノ酸配列の番号付けは、Kabatシステムに準拠する。異なる光または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内に比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち光および重鎖成分の合体されたフレームワーク領域は、CDRを位置付け、整列させる役割を果たす。CDRは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。
F1は、6-5-6縮合三環系コモノマーであり;
M1およびM2は、それぞれ独立して紫外線吸光度修飾コモノマーであり;
bは、1または2であり;
a、c、d、eおよびfは、それぞれ独立して0または1であり、ここで、a+c+d+f≧1であり;
L1は、-Z1に連結されている連結性コモノマーであり、ここで、Z1は、化学選択的タグまたはアクセプター発色団であり;
nは、1~10,000の整数であり;
mは、1~10,000の整数であり;
pは、1~100,000の整数であり;かつ
G1およびG2は、それぞれ独立して、末端基、π共役セグメント、リンカーおよび連結された特異的結合性メンバーから選択され、ここで、G1およびG2のうちの少なくとも1つは、連結された特異的結合性メンバーである。式(VIII)の一部の場合において、F1はフルオレンコモノマーである。式(VIII)の特定の場合において、F1はカルバゾールコモノマーである。
式(VIII)の一部の場合において、アクセプター発色団は、シアニン色素、キサンテン色素、クマリン色素、チアジン色素およびアクリジン色素から選択される。式(VIII)の特定の場合において、アクセプター発色団は、DY 431、DY 485XL、DY 500XL、DY 610、DY 640、DY 654、DY 682、DY 700、DY 701、DY 704、DY 730、DY 731、DY 732、DY 734、DY 752、DY 778、DY 782、DY 800、DY 831、Biotium CF 555、Cy3.5およびジエチルアミノクマリンから選択される。
R1は、それぞれ独立して、WSGで置換されたアルキルまたは2個以上のWSGでさらに置換された分岐状基であり;
特異的結合性メンバーは、生体分子であり;かつ
nは、1~100,000の整数である。特定の実施形態において、R1基は、それぞれ2個以上のWSGでさらに置換された分岐状基である。特定の場合において、分岐状基は、置換アラルキル、例えば2個のPEG基で置換されている置換ベンジル基である。
式(II)~(XII)のいずれか1つのフルオレンコモノマーの特定の場合において、R1またはR2側鎖基は、それぞれ1つの-O(CH2CH2O)nR’基で(例えば、2、3または4位において)置換されたベンジル基であり、式中、R’はHまたはアルキルであり、nは1~20、例えば3~16であり、nは8~16などである。式(II)~(XII)のいずれか1つのフルオレンコモノマーの特定の場合において、R1またはR2側鎖基は、それぞれは2つの-O(CH2CH2O)nR’基で(例えば、2,4-、3,4-または3,5-位において)置換されたベンジル基であり、式中、R’はHまたはアルキルであり、nは、それぞれ独立して1~20、例えば3~16であり、nは8~16などである。式(II)~(XII)のいずれか1つのフルオレンコモノマーの特定の場合において、R1またはR2側鎖基は、それぞれ3つの-O(CH2CH2O)nR’基で(例えば、2,4,6-、2,4,5-または3,4,5-位において)置換されたベンジル基であり、式中、R’は、それぞれ独立してHまたはアルキルであり、nは、それぞれ独立して1~20、例えば3~16であり、nは8~16などである。式(I)~(VIII)のいずれか1つのフルオレンコモノマーの特定の場合において、R1またはR2側鎖基は、それぞれ三価分岐状基で置換された低級アルキル基であり、それぞれが2つのPEG部位(例えば、-CO-NR’’2または-O(CH2R’’)2三価分岐状基)で置換されており、R’’は、それぞれ独立してPEG部位(例えば、-O(CH2CH2O)nR’(R’はHまたはアルキルであり、nは1~20、例えば3~16であり、例えばnは8~16である))である。
G1-(M1)v(F1)x(M2)y(L1)z-G2
G1-(M1)v(F1)x(M2)y-G2
G1-(F1)x(M2)y(L1)z-G2
G1-(F1)x(M2)y-G2
のうちの1つによって表すことができ、式中、v、x、yおよびzは、共役系ポリマーにおけるコモノマーのモル%値であり、L1は、C1またはZ1(例えば、本明細書に記載される)に連結されることができる。
その式の一部の場合において、vは、1モル%以上、例えば5モル%以上、10モル%以上、15モル%以上、20モル%以上、または25モル%以上である。その式の一部の場合において、vは、25モル%以下、例えば20モル%以下、15モル%以下、10モル%以下、8モル%以下、6モル%以下、5モル%以下、2モル%以下、1モル%以下、またはそれ未満である。その式の一部の場合において、xは、1モル%以上、例えば2モル%以上、3モル%以上、4モル%以上、5モル%以上、10モル%以上、15モル%以上、20モル%以上、25モル%以上、30モル%以上、35モル%以上、40モル%以上、45モル%以上、50モル%以上、またはそれを超える。その式の特定の場合において、xは、1~50モル%の範囲、例えば5~25モル%または10~25モル%;または例えば5~25モル%または10~25モル%;または例えば、1~25モル%、1~10モル%、または1~5モル%の範囲である。
その式の一部の場合において、zは、10モル%以上、例えば15モル%以上、20モル%以上、25モル%以上、30モル%以上、35モル%以上、40モル%以上、45モル%以上、50モル%以上、またはそれを超える。その式の一部の場合において、zは、25モル%以下、例えば20モル%以下、15モル%以下、10モル%以下、8モル%以下、6モル%以下、5モル%以下、2モル%以下、1モル%以下、またはそれ未満である。その式の一部の場合において、yは、1モル%以上、例えば5モル%以上、10モル%以上、15モル%以上、20モル%以上、または25モル%以上である。その式の一部の場合において、yは、25モル%以下、例えば20モル%以下、15モル%以下、10モル%以下、8モル%以下、6モル%以下、5モル%以下、2モル%以下、1モル%以下、またはそれ未満である。
*は不飽和主鎖への共有結合のための部位である;
式中、R’は独立して、H、ハロゲン、C1~C12アルキル、(C1~C12アルキル)NH2、C2~C12アルケン、C2~C12アルキン、C3~C12シクロアルキル、C1~C12ハロアルキル、C2~C18(ヘテロ)アリール、C2~C18(ヘテロ)アリールアミノ、-[CH2-CH2]r’-Z1、または(C1~C12)アルコキシ-X1であり;かつZ1は、-OHまたは-COOHであり;X1は、-NH2、-NHCOOH、-NHCOOC(CH3)3、-NHCO(C3~C12)シクロアルキル(C1~C4)アルキル-N-マレイミド;または-NHCO[CH2-CH2-O]s’(CH2)s’NH2(r’は、1~20の整数であり;s’は、それぞれ独立して1~20の整数である)、(CH2)3(OCH2CH2)x’’OCH3(x’’は独立して、0~50の整数である)または1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1~C12アルコキシで任意選択的に置換されているベンジル、または(OCH2CH2)y’’CH3(y’’は、それぞれ独立して0~50の整数である)であり、R’はRと異なり;kは、2、4、8、12または24であり;R15は、構造:
*は主鎖への共有結合のための部位である。
上記でまとめられるように、本発明の態様は、標的検体の存在について試料を評価する方法を含む。一部の実施形態において、その方法は、(a)標的検体に特異的に結合するポリマー色素共役体と試料を接触させて、標識化組成物が接触した試料を生成する工程であって、そのポリマー色素共役体が、(i)水溶性集光性多発色団(例えば、本明細書に記載される)であって、6-5-6縮合三環系コモノマー(例えば、本明細書に記載される);および紫外線吸光度修飾コモノマー(例えば、本明細書に記載される)を含み、紫外線吸収極大を有する水溶性集光性多発色団;および(ii)特異的結合性メンバー(例えば、本明細書に記載される)を含む、工程と、(b)ポリマー色素共役体-標的検体結合性複合体の存在について、標識化組成物が接触した試料をアッセイして、標的検体が試料中に存在するかどうかを評価する工程とを含む。
その溶液は、平衡塩溶液、例えば通常の生理食塩水、PBS、ハンクス液等であることができ、好都合には、5~25mMなどの低濃度の許容可能な緩衝液と組み合わせて、ウシ胎仔血清、ヒト血小板ライセートまたは他の因子を追加することもできる。簡便な緩衝液としては、HEPES、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が挙げられる。様々な培地が市販されており、dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、イスコフ(Iscove)培地等の様々な培地を標的検体の性質に応じて使用することができ、場合により、ウシ胎仔血清またはヒト血小板ライセートを追加してもよい。溶液の最終成分は、含有される試料の成分に応じて選択され得る。
「標的タンパク質」という用語は、いずれかの簡便な組換え発現法を用いてもしくは簡便な合成法を用いて製造することができ、または購入することができる、組換えおよび合成分子を包含することが意図される。一部の実施形態において、ポリマー色素共役体としては、抗体または抗体断片が挙げられる。対象の抗体または抗体断片に特異的に結合するいずれかの簡便な標的検体が主題の方法において標的化され得る。
F1は、6-5-6縮合三環系コモノマーであり;
M1およびM2は、それぞれ独立して紫外線吸光度修飾コモノマーであり;
bは、1または2であり;
a、c、d、eおよびfは、それぞれ独立して0または1であり、ここで、a+c+d+f≧1であり;
L1は、-Z1に連結されている連結性コモノマーであり、ここで、Z1は、化学選択的タグまたはアクセプター発色団であり;
nは、1~10,000の整数であり;
mは、1~10,000の整数であり;
pは、1~100,000の整数であり;かつ
G1およびG2は、それぞれ独立して、末端基、π共役セグメント、リンカーおよび連結された特異的結合性メンバーから選択され、G1およびG2のうちの少なくとも1つは、連結された特異的結合性メンバーである。式(IX)の一部の場合において、F1はフルオレンコモノマーである。式(IX)の特定の場合において、F1はカルバゾールコモノマーである。
様々な方法を用いて、例えば担体上での固定化により、試料から標的検体を分離することができる。対象のアッセイ方法としては、限定されないが、アビジン-ビオチンまたはハプテン-抗ハプテン抗体などの特異的結合性メンバーの対の使用が見出され、対象となる、簡便な方法およびアッセイ方式が挙げられる。主題の組成物と共に使用するために適応され得る、対象の方法およびアッセイ方式としては、限定されないが、フローサイトメトリー法、in-situハイブリダイゼーション法、酵素免疫測定法(ELISA)、ウェスタンブロット分析、磁気細胞分離アッセイおよび蛍光色素精製クロマトグラフィーが挙げられる。
F1は、6-5-6縮合三環系コモノマーであり;
M1およびM2は、それぞれ独立して紫外線吸光度修飾コモノマーであり;
bは、1または2であり;
a、c、d、eおよびfは、それぞれ独立して0または1であり、ここで、a+c+d+f≧1であり;
L1は、連結性コモノマーであり、ここで、Z1は、化学選択的タグまたはアクセプター発色団であり;
nは、1~10,000の整数であり;
mは、0または1~10,000の整数であり;
pは、1~100,000の整数であり;かつ
G1およびG2のうちの一方は、末端基であり、G1およびG2のうちの他方は、共役タグである。特定の実施形態において、Z1は、アクセプター発色団である。特定の実施形態において、Z1は、化学選択的タグである。特定の場合において、eは0である。式(X)の一部の場合において、F1はフルオレンコモノマーである。式(X)の特定の場合において、F1はカルバゾールコモノマーである。
「標的タンパク質」という用語は、簡便な組換え発現法を用いて若しくは簡便な合成法を用いて製造することができ、または購入することができる、組換えおよび合成分子を包含することが意図される。一部の実施形態において、標的分子は特異的結合性メンバー(例えば、本明細書に記載される)である。特定の場合において、特異的結合性メンバーは抗体である。一部の場合において、特異的結合性メンバーは、抗体断片またはその結合性誘導体である。一部の場合において、抗体断片またはその結合性誘導体は、Fab断片、F(ab’)2断片、scFv、ダイアボディおよびトリアボディから選択される。
適切なレポーター分子は、免疫細胞化学、分子生物学、光、蛍光、および電子顕微鏡法、細胞免疫表現型検査(immunophenotyping)、細胞選別、フローサイトメトリー、細胞可視化、検出、数え上げ法(enumeration)、および/またはシグナル出力定量化の分野で知られる分子であり得る。対象の標識としては、限定されないが、フルオロフォア、発光標識、金属錯体、ラジオアイソトープ、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素、または他の検出標識並びに酵素および発光(luminogenic)基質などの標識の組み合わせが挙げられる。対象の酵素およびその基質としては、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびルシフェラーゼ等が挙げられる。
特異的および/または非特異的性質の複数の抗体が、標的の検出、同定、および/または分析の向上のために、同時にまたは逐次的に、標識化され、使用され得る。対象の標識としては、限定されないが、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、AMCA(7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸)、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 350、DyLight350、フィコエリトリン、アロフィコシアニンおよび核を検出する染色、例えばHoechst 33342、LDS751、TO-PROおよびDAPIなどが挙げられる。
本発明の態様は、主題の方法および組成物の実施に使用されるシステムをさらに含む。試料分析システムは、試料および標識化特異的結合性メンバーがロードされるフローチャネルを含み得る。一部の実施形態において、このシステムは、流路を含むフローサイトメーター;流路における組成物(その組成物は、試料;標識化特異的結合性メンバー(例えば、本明細書に記載される)を含む)を含む、フローサイトメトリーシステムである。このシステムの一部の場合において、標識化特異的結合性メンバーは、6-5-6縮合三環系コモノマー;および紫外線吸光度修飾コモノマーを含む共役セグメントを含む水溶性集光性多発色団(紫外線吸収極大を有する)と、標的検体に特異的に結合し、かつ多発色団に共有結合で連結されている特異的結合性メンバーとを含む。多発色団は、それ自体が蛍光性であるポリマー色素であり得る。多発色団はポリマータンデム色素であり得る。特定の場合において、標識化特異的結合性メンバーは、そのエネルギー受容近位で多発色団に共有結合で連結されたアクセプター発色団をさらに含む。一部の実施形態において、標識化特異的結合性メンバーは、式(XI):
F1は、6-5-6縮合三環系コモノマーであり;
M1およびM2は、それぞれ独立して紫外線吸光度修飾コモノマーであり;
bは、1または2であり;
a、c、d、eおよびfは、それぞれ独立して0または1であり、ここで、a+c+d+f≧1であり;
L1は、-Z1に連結されている連結性コモノマーであり、ここで、Z1は、化学選択的タグまたはアクセプター発色団であり;
nは、1~10,000の整数であり;
mは、1~10,000の整数であり;
pは、1~100,000の整数であり;かつ
G1およびG2のうちの一方は、末端基であり、G1およびG2の他方は、連結された特異的結合性メンバーである。式(XI)の一部の場合において、F1はフルオレンコモノマーである。式(XI)の特定の場合において、F1はカルバゾールコモノマーである。
本発明の態様は、主題の方法を実施するのに使用されるキットおよび組成物をさらに含む。本発明の組成物は、出発原料としての試剤、または、例えば上述の方法論における使用のために提供された試剤として、キットに含まれ得る。
本明細書に記載の組成物、方法およびシステムは、対象の標的の標識化検出および/または分析が望まれる、診断および研究用途などの様々な用途での使用が見出され得る。かかる用途としては、血球計算、顕微鏡検査法、イムノアッセイ(例えば、競合的または非競合的)、遊離検体の評価、レセプター結合リガンドの評価等の方法論が挙げられる。本明細書に記載の組成物、システムおよび方法は、限定されないが、生物体液、細胞培養試料、および組織試料などの多くの試料のいずれかの分析において有用であり得る。特定の態様において、本明細書に記載の組成物、システムおよび方法は、蛍光標識を用いた、例えば蛍光活性化細胞選別または分析、イムノアッセイ、免疫染色などの、検体が存在する場合に試料中で検出される方法での使用が見出され得る。特定の場合において、組成物および方法は、標的検体の存在についての試料の評価が対象となる用途における使用が見出される。
実施例1
一連の結合されたフルオロフォアを含む以下に示すコア構造1に基づいて、一連のタンデム色素を製造した。図1は、様々な異なるアクセプター発色団に連結された多発色団コア構造1に基づく、様々なポリマータンデム色素の蛍光発光プロファイルを例示する。
1.6-5-6縮合三環系コモノマーおよび紫外線吸光度修飾コモノマーを含む共役セグメントを含み、紫外線吸収極大を有する水溶性集光性多発色団。
2.範囲300~400nmの吸収極大波長および範囲375~900nmの発光極大波長を有する、条項1に記載の多発色団。
3.紫外線吸光度修飾コモノマーの25%以上(モル濃度による)を含み、かつ5個以上のモノマー反復単位を含む共役系ポリマーである、条項1または2のいずれか一節に記載の多発色団。
4.モル吸光係数5×105M-1cm-1以上を有する、条項1~3のいずれか一節に記載の多発色団。
5.量子収量0.3以上を有する、条項1~4のいずれか一節に記載の多発色団。
6.式(I):
7.eが0である場合にはd、fおよびmがそれぞれ0であり、eが1である場合にはd+f≦1およびm≧1である、条項6に記載の多発色団。
8.式(II):
9.式(III):
10.bが1であり、かつa+c≧1であり;G1が末端基であり;かつG2が末端基、リンカーまたは連結された特異的結合性メンバーである、条項8~9のいずれか一節に記載の多発色団。
11.a+c=1である、条項8~10のいずれか一節に記載の多発色団。
12.式(IV):
13.bが1であり;cが0または1であり;eおよびfがそれぞれ0または1であり、ここで、e+f≧1であり;G1が末端基であり;かつG2が末端基、リンカーまたは連結された特異的結合性メンバーである、条項12に記載の多発色団。
14.cが1である、条項12~13のいずれか一節に記載の多発色団。
15.紫外線吸光度修飾コモノマーが任意選択的に置換されているアリールまたはヘテロアリールコモノマーである、条項1~14のいずれか一節に記載の多発色団。
16.任意選択的に置換されているアリールまたはヘテロアリールコモノマーが、置換または未置換1,4-フェニル、置換または未置換1,3-フェニル、置換または未置換4,4’-ビフェニル、置換または未置換2,5-ピリジル、および置換または未置換2,6-ピリジルからなる群から選択される、条項15に記載の多発色団。
17.任意選択的に置換されているアリールまたはヘテロアリールコモノマーが、以下:
18.任意選択的に置換されているアリールまたはヘテロアリールコモノマーが、以下:
19.F1が、構造:
によって示される、条項6~18のいずれか一節に記載の多発色団。
20.L1がフルオレンコモノマーである、条項6~19のいずれか一節に記載の多発色団。
21.L1が、構造:
によって示される、条項6~20のいずれか一節に記載の多発色団。
22.6-5-6縮合三環系コモノマーおよび紫外線吸光度修飾コモノマーを含む共役セグメントを含み、紫外線吸収極大を有する水溶性集光性多発色団と、そのエネルギー受容近位で多発色団に共有結合で連結されたアクセプター発色団とを含むポリマータンデム色素。
23.多発色団が範囲300~400nmの吸収極大波長および範囲375~900nmの発光極大波長を有する、条項22に記載の色素。
24.紫外線吸光度修飾コモノマーが多発色団の25%以上(モル濃度による)を占め;かつ多発色団が、5個以上の反復単位を含む共役系ポリマーである、条項22~23のいずれか一節に記載の色素。
26.多発色団が量子収量0.3以上を有する、条項22~25のいずれか一節に記載の色素。
27.アクセプター発色団がフルオロフォアである、条項22~26のいずれか一節に記載の色素。
28.アクセプター発色団が失活剤である、条項22~26のいずれか一節に記載の色素。
29.アクセプター発色団の発光が、入射光でのアクセプター発色団の直接的な励起と比較して、多発色団によって励起された場合に1.5倍以上である、条項27に記載の色素。
30.多発色団が、式(V):
によって示される、条項22~29のいずれか一節に記載の色素。
31.eが1であり、d+f≦1であり、かつm≧1である、条項30に記載の色素。
32.多発色団が、式(VI):
33.多発色団が、式(VII):
34.bが1であり;cが0または1であり;eが1であり;fが0または1であり;G1が末端基であり;かつG2が末端基、リンカーまたは連結された特異的結合性メンバーである、条項33に記載の多発色団。
35.cが1である、条項33~34のいずれか一節に記載の色素。
36.紫外線吸光度修飾コモノマーが任意選択的に置換されている置換アリールまたはヘテロアリールコモノマーである、条項22~35のいずれか一節に記載の色素。
37.任意選択的に置換されているアリールまたはヘテロアリールコモノマーが、置換または未置換1,4-フェニル、置換または未置換1,3-フェニル、置換または未置換4,4’-ビフェニル、置換または未置換2,5-ピリジル、および置換または未置換2,6-ピリジルからなる群から選択される、条項36に記載の色素。
38.任意選択的に置換されているアリールまたはヘテロアリールコモノマーが、以下:
のうちの1つから選択される、条項36~37のいずれか一節に記載の色素。
39.任意選択的に置換されているアリールまたはヘテロアリールコモノマーが、以下:
40.F1が、構造:
によって示される、条項30~39のいずれか一節に記載の色素。
41.L1はフルオレンコモノマーである、条項30~40のいずれか一節に記載の色素。
42.L1は、構造:
によって示される、条項30~41のいずれか一節に記載の色素。
43.G1およびG2のちの少なくとも1つが-L3-Zであり、ここで、L3はリンカーであり、かつZは特異的結合性メンバーである、条項30~42のいずれか一節に記載の色素。
44.G1およびG2のちの少なくとも1つが、以下の構造:
によって示される、条項30~43のいずれか一節に記載の色素。
45.Zが生体分子である、条項43~44のいずれか一節に記載の色素。
46.Zが抗体である、条項43~45のいずれか一節に記載の色素。
47.Zが抗体断片またはその結合性誘導体である、条項43~45のいずれか一節に記載の色素。
48.抗体断片またはその結合性誘導体が、Fab断片、F(ab’)・BR>Q断片、scFv、ダイアボディおよびトリアボディからなる群から選択される、条項47に記載の色素。
49.C1が、任意選択的なリンカーを介してL1に連結されているシアニン色素、キサンテン色素、クマリン色素、チアジン色素およびアクリジン色素からなる群から選択される、条項30~48のいずれか一節に記載の色素。
51.アクセプター発色団が、DY 431、DY 485XL、DY 500XL、DY 610、DY 640、DY 654、DY 682、DY 700、DY 701、DY 704、DY 730、DY 731、DY 732、DY 734、DY 752、DY 778、DY 782、DY 800、DY 831、Biotium CF 555、Cy3.5およびジエチルアミノクマリンからなる群から選択される、条項22~50のいずれか一節に記載の色素。
52.6-5-6縮合三環系コモノマーおよび紫外線吸光度修飾コモノマーを含む共役セグメントを含み、紫外線吸収極大を有する水溶性集光性多発色団と、多発色団に共有結合で連結された特異的結合性メンバーとを含む標識化特異的結合性メンバー。
53.多発色団が範囲300~400nm吸収極大波長および範囲375~900nmの発光極大波長を有する、条項52に記載の標識化特異的結合性メンバー。
54.紫外線吸光度修飾コモノマーが多発色団の25%以上(モル濃度による)を占め;かつ多発色団が、5個以上の反復単位を含む共役系ポリマーである、条項52~53のいずれか一節に記載の標識化特異的結合性メンバー。
56.多発色団が量子収量0.3以上を有する、条項52~55のいずれか一節に記載の標識化特異的結合性メンバー。
57.標識化特異的結合性メンバーが、そのエネルギー受容近位で多発色団に共有結合されたアクセプター発色団をさらに含む、条項52~56のいずれか一節に記載の標識化特異的結合性メンバー。
58.アクセプター発色団がフルオロフォアである、条項57に記載の標識化特異的結合性メンバー。
59.アクセプター発色団の発光が、入射光でのアクセプター発色団の直接的な励起と比較して、多発色団によって励起された場合に1.5倍以上である、条項58に記載の標識化特異的結合性メンバー。
60.多発色団が、式(VIII):
によって示される、条項52~59のいずれか一節に記載の標識化特異的結合性メンバー。
62.特異的結合性メンバーが抗体断片またはその結合性誘導体である、条項52~60のいずれか一節に記載の標識化特異的結合性メンバー。
63.抗体断片またはその結合性誘導体が、Fab断片、F(ab’)2断片、scFv、ダイアボディおよびトリアボディからなる群から選択される、条項62に記載の標識化特異的結合性メンバー。
64.アクセプター発色団が、シアニン色素、キサンテン色素、クマリン色素、チアジン色素またはアクリジン色素からなる群から選択される、条項57~59のいずれか一節に記載の標識化特異的結合性メンバー。
65.アクセプター発色団が、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa488、Alexa647およびAlexa700からなる群から選択される、条項64に記載の標識化特異的結合性メンバー。
66.標的検体の存在について試料を評価する方法であって、(a)標的検体に特異的に結合するポリマー色素共役体と試料を接触させて、標識化組成物が接触した試料を生成する工程であって、ポリマー色素共役体が、(i)水溶性集光性多発色団であって、6-5-6縮合三環系コモノマーおよび紫外線吸光度修飾コモノマーを含む共役セグメントを含み、紫外線吸収極大を有する水溶性集光性多発色団、並びに(ii)特異的結合性メンバーを含む、工程と、(b)ポリマー色素共役体-標的検体結合性複合体の存在について、標識化組成物が接触した試料をアッセイして、標的検体が試料中に存在するかどうかを評価する工程とを含む方法。
67.ポリマー色素共役体が、そのエネルギー受容近位で多発色団に共有結合で連結されたアクセプター発色団をさらに含む、条項66に記載の方法。
68.共役体が、式(IX):
によって示される、条項66および67のいずれか一節に記載の方法。
70.担体が磁気粒子を含む、条項69に記載の方法。
71.標的検体が細胞と会合されている、条項66~70のいずれか一節に記載の方法。
72.標的検体が細胞の細胞表面マーカーである、条項71に記載の方法。
73.細胞表面マーカーが、細胞レセプターおよび細胞表面抗原からなる群から選択される、条項72に記載の方法。
74.標的検体が細胞内標的であり、かつ方法が細胞を溶解することをさらに含む、条項73に記載の方法。
76.標的分子を標識化する方法であって、標的分子をポリマー色素と接触させて、標識化標的分子を生成する工程であって、ポリマー色素が、6-5-6縮合三環系コモノマーおよび紫外線吸光度修飾コモノマーを含む共役セグメントを含み、紫外線吸収極大を有する水溶性集光性多発色団と、標的分子に共有結合で連結する共役タグとを含む、工程を含む方法。
77.標識化標的分子を蛍光的に検出することをさらに含む、条項76に記載の方法。
78.ポリマー色素が、そのエネルギー受容近位で多発色団に共有結合で連結されたアクセプター発色団をさらに含む、条項76~77のいずれか一節に記載の方法。
79.ポリマー色素が、式(X):
によって示される、条項76~78のいずれか一節に記載の方法。
80.Z1がアクセプター発色団である、条項79に記載の方法。
82.標的分子が特異的結合性メンバーである、条項76~81のいずれか一節に記載の方法。
83.特異的結合性メンバーが抗体である、条項82に記載の方法。
84.特異的結合性メンバーが抗体断片またはその結合性誘導体である、条項82に記載の方法。
85.抗体断片またはその結合性誘導体が、Fab断片、F(ab’)2断片、scFv、ダイアボディおよびトリアボディからなる群から選択される、条項84に記載の方法。
86.フローサイトメトリーシステムであって、流路を含むフローサイトメーターと、流路における組成物とを含み、組成物は、試料と、標識化特異的結合性メンバーとを含み、標識化特異的結合性メンバーは、6-5-6縮合三環系コモノマーおよび紫外線吸光度修飾コモノマーを含む共役セグメントを含み、紫外線吸収極大を有する水溶性集光性多発色団と、標的検体に特異的に結合し、かつ多発色団に共有結合で連結されている特異的結合性メンバーとを含む、フローサイトメトリーシステム。
87.標識化特異的結合性メンバーが、そのエネルギー受容近位で多発色団に共有結合で連結されたアクセプター発色団をさらに含む、条項86に記載のシステム。
88.標識化特異的結合性メンバーが、式(XI):
89.組成物が、担体結合されており、かつ標的検体に特異的に結合する第2特異的結合性メンバーをさらに含む、条項86~88のいずれか一節に記載のシステム。
91.試料が細胞を含む、条項86~90のいずれか一節に記載のシステム。
92.標的検体が細胞の細胞表面マーカーである、条項91に記載のシステム。
93.細胞表面マーカーが、細胞レセプターおよび細胞表面抗原からなる群から選択される、条項92に記載のシステム。
94.6-5-6縮合三環系コモノマーおよび紫外線吸光度修飾コモノマーを含む共役セグメントを含み、紫外線吸収極大を有する水溶性集光性多発色団と、ポリマータンデム色素、フルオロフォア、特異的結合性メンバー、特異的結合性メンバー共役体、担体結合された特異的結合性メンバー、細胞、担体、生体適合性水性溶出緩衝液、および使用説明書からなる群から選択される1つまたは複数の構成要素とを含むキット。
96.特異的結合性メンバーが抗体である、条項95に記載のキット。
97.特異的結合性メンバーが抗体断片またはその結合性誘導体である、条項95に記載のキット。
98.抗体断片またはその結合性誘導体が、Fab断片、F(ab’)2断片、scFv、ダイアボディおよびトリアボディからなる群から選択される、条項97に記載のキット。
99.多発色団が、そのエネルギー受容近位で多発色団に共有結合で連結されたアクセプター発色団をさらに含む、条項94~98のいずれか一節に記載のキット。
さらに、かかる均等物は、現在既知の均等物と、未来に開発される均等物、すなわち構造に関わらず同じ機能を果たす、開発されたいずれかの要素の両方を包含することが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示し、かつ記述される例示的な実施形態に限定されないことが意図される。むしろ、本発明の範囲および趣旨は以下によって具体化される。
Claims (7)
- 6-5-6縮合三環系コモノマーと、
紫外線吸光度修飾コモノマーとを含む共役セグメントを含んでおり、
紫外線吸収極大を有しており、
式(I):
によって示され、
前記紫外線吸光度修飾コモノマーは、下記の複数のコモノマーの中のいずれか一つであり、
ここで、nは1~20であり、R’はH又は炭素原子1~6個を含むアルキル基であり、
F1は、6-5-6縮合三環系コモノマーであり、
M1およびM2は、それぞれ独立して前記紫外線吸光度修飾コモノマーであり、
bは、1または2であり、
a、c、dおよびfは、それぞれ独立して0または1であり、ここで、a+c+d+f≧1であり、
eは、1であり、
L1は、化学選択的タグ-Z1に連結されている連結性コモノマーであり、
nは、1~10,000の整数であり、
mは、1~10,000の整数であり、
pは、1~100,000の整数であり、かつ
G1およびG2は、それぞれ独立して、末端基と、π共役セグメントと、リンカーおよび連結された特異的結合性メンバーと、からなる群から選択される、
水溶性集光性多発色団。 - G1又はG2は、抗体又は抗体の結合性断片である、請求項1乃至3のいずれか一つに記載の多発色団。
- 請求項1乃至4のいずれか一つに記載の水溶性集光性多発色団と、
そのエネルギー受容近位で前記多発色団に共有結合で連結されたアクセプター発色団と
を含み、
前記多発色団に含まれるG 1 又はG 2 は、連結された特異的結合性メンバーである
ポリマータンデム色素。 - 標的検体の存在について試料を評価する方法であって、
前記標的検体に特異的に結合する請求項5に記載のポリマータンデム色素と前記試料とを接触させる工程と、
ポリマータンデム色素-標的検体結合性複合体の存在について、前記ポリマータンデム色素が接触した試料をアッセイして、前記標的検体が前記試料中に存在するかどうかを評価する工程と
を含む方法。 - 前記標的検体は細胞と会合されている、請求項6に記載の方法。
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