ES2567143T3 - Métodos y materiales fluorescentes para amplificación dirigida de señales de biomarcadores - Google Patents

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Abstract

Un complejo multicromoforo que comprende: un multicromoforo unido de forma covalente a al menos una biomolecula seleccionada entre el grupo que consiste en una biomolecula sensora y un bioconjugado, en donde el multicromoforo se une adicionalmente de forma covalente a un cromoforo de senalizacion y en donde el multicromoforo comprende la estructura**Fórmula** en la que R1 es un grupo de solubilizacion seleccionado entre el grupo que consiste en oligomeros de etilenglicol, polimeros de etilenglicol, sales de alcoxi ω-amonio y sales de alcoxi ω-sulfonato.

Description

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en la que R1 es un grupo de solubilización, que incluyen, pero no se limitan a, oligómeros de etilenglicol, polímeros de etilenglicol, sales de alcoxi ω-amonio, y sales de alcoxi ω-sulfonato. En una realización en particular el 5 multicromóforo es un polímero conjugado, por ejemplo un polímero conjugado policatiónico, un polímero conjugado aniónico y/o un polímero conjugado con carga neutra.
En una realización al menos uno del primer y segundo bioconjugados es un anticuerpo. En una realización en particular el primer y segundo bioconjugados son anticuerpos.
10 En general, en otro aspecto se proporciona un método de ensayo que incluye las etapas de proporcionar una muestra de la que se sospecha que contiene una biomolécula diana, proporcionar un multicromóforo que comprende un primer bioconjugado unido de forma covalente, proporcionar un complejo de biomolécula de sensor que comprende una biomolécula de sensor capaz de interactuar con la molécula diana, un cromóforo de señalización, y
15 un segundo bioconjugado unido de forma covalente capaz de unirse con el primer bioconjugado, en el que después de tal excitación de unión del multicromóforo es capaz de transferir energía al cromóforo de señalización, poner en contacto la muestra con el complejo de biomolécula de sensor en una solución en condiciones en las que la biomolécula de sensor se puede unir a la biomolécula diana si estuviera presente, poner en contacto la solución con el multicromóforo, aplicar una fuente de luz a la muestra que puede excitar el multicromóforo, y detectar si la luz se
20 emite desde el cromóforo de señalización. En una realización en particular el multicromóforo es un polímero conjugado, por ejemplo un polímero conjugado policatiónico, un polímero conjugado aniónico y/o un polímero conjugado con carga neutra.
En una realización el primer y segundo bioconjugados incluyen, pero no se limitan a, una proteína, un anticuerpo y
25 un ácido nucleico. En una realización relacionada el primer biococonjugado es estreptavidina o biotina, la biomolécula de sensor es un anticuerpo, y el segundo biococonjugado es biotina en la que el primer biococonjugado es estreptavidina o biotina en la que el primer biococonjugado es estreptavidina. En otra realización el primer biococonjugado es estreptavidina o biotina, la biomolécula de sensor es un ácido nucleico y el segundo biococonjugado es biotina en la que el primer biococonjugado es estreptavidina o biotina en la que el primer
30 biococonjugado es estreptavidina.
En general, en otro aspecto se proporciona un complejo de biorreconocimiento para identificar una biomolécula. El complejo puede incluir un bioconjugado, un cromóforo de señalización unido de forma covalente al bioconjugado, un multicromóforo unido de forma covalente al bioconjugado, en el que la excitación del multicromóforo es capaz de
35 transferir energía al cromóforo de señalización.
En una realización el bioconjugado puede incluir, pero no se limita a, un anticuerpo o estreptavidina. En una realización en particular el multicromóforo es un polímero conjugado, por ejemplo un polímero conjugado policatiónico, un polímero conjugado aniónico y/o un polímero conjugado con carga neutra.
40 En general, en un aspecto se proporciona un método de ensayo que incluye las etapas de proporcionar una muestra de la que se sospecha que contiene una biomolécula diana, proporcionar un complejo de biorreconocimiento que comprende un bioconjugado, un cromóforo de señalización unido de forma covalente al bioconjugado y un multicromóforo unido de forma covalente al bioconjugado, en el que la excitación del multicromóforo es capaz de
45 transferir energía al cromóforo de señalización, poner en contacto la muestra con el complejo de biorreconocimiento en una solución en condiciones en las que el bioconjugado se puede unir a la biomolécula diana o una biomolécula asociada a diana si estuviera presente, aplicar una fuente de luz a la solución que puede excitar al multicromóforo, y detectar si la luz se emite desde el cromóforo de señalización. En una realización en particular el multicromóforo es un polímero conjugado, por ejemplo un polímero conjugado policatiónico, un polímero conjugado aniónico y/o un
50 polímero conjugado con carga neutra.
En general en otro aspecto, se proporciona un complejo de biorreconocimiento para identificar una biomolécula diana que incluye un bioconjugado, un multicromóforo unido de forma covalente al bioconjugado, y un cromóforo de señalización unido de forma covalente al multicromóforo, en el que la excitación del multicromóforo es capaz de
55 transferir energía al cromóforo de señalización. En una realización el bioconjugado es un anticuerpo. En otra realización el bioconjugado es estreptavidina. En una realización en particular el multicromóforo es un polímero conjugado, por ejemplo un polímero conjugado policatiónico, un polímero conjugado aniónico y/o un polímero
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imagen7
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onda de excitación (láser, filtro, etc). Esto permite la detección simultánea de múltiples dianas (multiplexación). Algunos detalles adicionales que se refieren a multicromóforos y sus usos se desvelan en los siguientes documentos: Solicitud de Patente de Estados Unidos con n.º de Serie 11/329.495, presentada el 10 de enero de 2006, publicada como documento US 2006-0183140 A1; Solicitud de Patente de Estados Unidos con n.º de Serie
5 11/329.861, presentada el 10 de enero de 2006, publicada como documento US 2006-0216734 A1; Solicitud de Patente de Estados Unidos con n.º de Serie 11/344.942, presentada el 31 de enero de 2006, publicada como documento US 2006-0204984 A1; Solicitud de Patente de Estados Unidos con n.º de Serie 10/648.945, presentada el 26 de agosto de 2003, publicada como documento US 2004-0142344 A1; Solicitud de Patente de Estados Unidos con n.º de Serie 10/600.286, presentada el 20 de junio de 2003, publicada como documento US 2004-0219556 A1; Solicitud de Patente de Estados Unidos con n.º de Serie 10/666.333, presentada el 17 de septiembre de 2003, publicada como documento US 2005-0059168 A1; y Solicitud de Patente de Estados Unidos con n.º de Serie 10/779.412, presentada el 13 de febrero de 2004, publicada como documento US 2005-0003386 A1.
Antes de describir la presente invención con mayor detalle, se debe entender que la presente invención no se limita
15 a la metodología, dispositivos, soluciones o aparatos descritos en particular, dado que tales métodos, dispositivos, soluciones o aparatos pueden, por supuesto, variar. También se debe entender que la terminología usada en el presente documento es para la finalidad de describir solamente realizaciones en particular, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención.
El uso de las formas "un", "uno" y "el" en singular incluyen preferencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un sensor de agregación" incluye una pluralidad de sensores de agregación, la referencia a "una sonda" incluye una pluralidad de sondas, y similares. Además, el uso de referencias específicas en plural, tales como "dos", "tres", etc., leídas en números más grandes se refieren al mismo objeto a menos que el contexto lo indique claramente de otro.
25 Los términos tales como "conectado", "asociado", "conjugado" y "unido" se usan indistintamente en el presente documento que incluyen conexión, asociación, unión o conjugación directa así como indirecta a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo; en un ejemplo, la expresión "polímero conjugado" se usa de acuerdo con su significado habitual en la técnica y se refiere a un polímero que contiene una serie prolongada de enlaces insaturados, y ese contexto indica que el término "conjugado" se debería interpretar como algo más que simplemente una conexión, asociación o unión directa o indirecta.
Cuando se menciona un intervalo de valores, se debe entender que cada valor entero que aparece, y cada fracción del mismo, entre los límites superior e inferior de ese intervalo mencionados también se desvelan de forma 35 específica, junto con cada subintervalo entre tales valores. Los límites superior e inferior de cualquier intervalo se pueden incluir independientemente o excluir del intervalo, y cada intervalo en el que se incluye cualquiera, ninguno o ambos límites también está incluido dentro de la invención. Cuando un valor que se está analizando tiene límites inherentes, por ejemplo cuando un componente puede estar presente a una concentración de un 0 % a un 100 %, o cuando el pH de una solución acuosa puede variar de 1 a 14, esos límites inherentes se desvelan de forma específica. Cuando un valor se menciona de forma explícita, se debe entender que los valores que tienen aproximadamente la misma cantidad o suma que el valor mencionado también están dentro del alcance de la invención, ya que son intervalos basados en los mismos. Cuando se desvela una combinación, cada subcombinación de los elementos de esa combinación también se desvela de forma específica y está dentro del alcance de la invención. Por el contrario, cuando se desvelan diferentes elementos o grupos de elementos, también
45 se desvelan combinaciones de los mismos. Cuando se desvela cualquier elemento de una invención como con una pluralidad de alternativas, algunos ejemplos de esa invención en la que cada alternativa se excluye de forma individual o en cualquier combinación con las otras alternativas también se desvelan por la presente; más de un elemento de una invención puede tener tales exclusiones, y todas las combinaciones de elementos que tienen tales exclusiones se desvelan por la presente.
A menos que se defina de otro modo o el contexto lo indique claramente de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que normalmente entiende un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento se puede usar en la práctica o ensayo de la invención,
55 a continuación se describen los métodos y materiales preferentes.
Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento son para la finalidad de desvelar y describir los materiales y metodologías en particular para los que se mencionó la referencia. Las publicaciones analizadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. En el presente documento nada se debe interpretar como una admisión de que la invención no tiene derecho a preceder a tal divulgación en virtud de la invención anterior.
Definiciones
65 En la descripción de la presente invención, se usarán los siguientes términos, y se pretende su definición como se indica a continuación.
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colorante, independientemente de la presencia o ausencia del otro colorante, lo que indica un buen potencial para formar multiplexación. Se prevén resultados paralelos con diagnóstico de proteínas.
Dado el potencial para análisis de multiplexación, se prevé que el multicromóforo se pueda unir a un número de
5 colorantes, que incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, 6-FAM, rodamina, Rojo Texas, tetrametilrodamina, una carboxirrodamina, carboxirrodamina 6G, carboxirrodol, carboxirrodamina 110, Azul Cascade, Amarillo Cascade, cumarina, Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, Cy-Chrome, ficoeritrina, PerCP (Proteína clorofila-a peridinina), PerCP-Cy5.5, JOE (6-carboxi-4’,5’-dicloro-2’,7’-dimetoxifluoresceína), NED, ROX (5-(y -6)-carboxi-X-rodamina), HEX, Amarillo Lucifer, Azul Marina, Verde Oregon 488, Verde Oregon 500, Verde Oregon 514, Alexa Fluor.RTM. 350, Alexa Fluor®430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, ácido 7-amino-4-metilcumarina-3-acético, BOD-IPY.RTM. FL, BODIPY® FL-Br.sub.2, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY® 564/570, BODIPY® 576/589, BODIPY® 581/591, BODIPY® 630/650, BODIPY® 650/665, BODIPY® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY® TR, conjugados de los mismos, y combinaciones de los mismos.
15 Se prevé que la invención descrita en el presente documento se pueda usar para aumentar la sensibilidad de cualquiera de un número de ensayos disponibles en el mercado que incluyen, pero no se limitan a, el Ensayo de Anticuerpo VIH-1/2 OraQuick Rapid, fabricado por OraSure Technologies, Inc. (Bethlehem, PA), que es un ensayo de diagnóstico del VIH aprobado por la FDA para muestras de fluido oral. Este ensayo puede proporcionar resultados de identificación sistemática con más de un 99 por ciento de precisión en un período tan breve como 20 minutos.
Multicromóforos
25 Los sistemas de multicromóforo de captación de luz pueden transferir energía de forma eficaz a especies luminiscentes cercanas. Algunos mecanismos para transferencia de energía incluyen, por ejemplo, transferencia de energía de resonancia (transferencia de energía de resonancia (o fluorescencia) de Forster, FRET), intercambio de carga cuántica (transferencia de energía de Dexter) y similares. Por lo general, sin embargo, estos mecanismos de transferencia de energía son de un intervalo relativamente corto, y es necesaria una proximidad cercana del sistema de multicromóforo de captación de luz para el cromóforo de señalización para una transferencia de energía eficaz. La amplificación de la emisión se puede reducir cuando el número de cromóforos individuales en el sistema de multicromóforo de captación de luz es grande; la emisión es de un fluoróforo puede ser más intensa cuando la luz incidente (la "luz de bombeo") está a una longitud de onda que es absorbida por el sistema de multicromóforo de captación de luz y se transfiere al fluoróforo que cuando el fluoróforo se excita directamente por la luz de bombeo.
35 Los multicromóforos usados en la presente invención pueden ser de carga neutra, catiónicos o aniónicos. En algunas realizaciones los multicromóforos son multicromóforos policatiónicos.
En realizaciones en las que el multicromóforo es policatiónico, pueden interactuar con una biomolécula que comprende múltiples grupos aniónicos, por ejemplo polisacáridos, polinucleótidos, péptidos, proteínas, anticuerpos, etc. En algunas realizaciones, el multicromóforo puede interactuar con un anticuerpo o polinucleótido diana de forma electrostática y por lo tanto poner a un cromóforo de señalización en un polinucleótido de sensor sin carga en proximidad que recibe energía en virtud del reconocimiento de anticuerpo-antígeno o hibridación entre un polinucleótido de sensor y un polinucleótido diana. En los métodos descritos se puede usar cualquier multicromóforo
45 policatiónico que pueda absorber luz y preferentemente emitir o transferir energía. Algunos multicromóforos a modo de ejemplo que se pueden usar incluyen polímeros conjugados (CP), polímeros saturados o dendrímeros que incorporan múltiples cromóforo de cualquier manera viable, y nanocristales semiconductores (SCNC). El CP, polímero saturados y dendrímeros se pueden preparar para incorporar múltiples especies catiónicas o se pueden derivatizar para convertirlos en policatiónicos después de la síntesis; algunos nanocristales semiconductores se pueden convertir en policatiónicos mediante la adición de especies catiónicas a su superficie. En algunas realizaciones, el multicromóforo policatiónico no se detecta por su capacidad para transferir energía cuando se excita, y por lo tanto algunos métodos que implican tales esquemas de detección no requieren que el multicromóforo emita ni transfiera energía.
55 En algunas realizaciones, el multicromóforo es un CP. En una realización particular, el CP es uno que comprende "unidades de repetición de banda prohibida inferior " de un tipo y en una cantidad que contribuye a una absorción con respecto al polímero en el intervalo de aproximadamente 450 nm a aproximadamente 1000 nm. Las unidades de repetición de banda prohibida inferior pueden presentar o no tal absorción antes de la polimerización, pero presentan esa absorción cuando se incorporan en el polímero conjugado. Tales características de absorción permiten que el polímero se extienda a longitudes de onda que producen menos fluorescencia de fondo en diversos entornos, incluyendo en el análisis de muestras biológicas y formación de imágenes y/o detección de moléculas. El desplazamiento de la absorbancia del CP hasta una energía menor y una longitud de onda más larga permite de este modo métodos más sensibles y sólidos. Además, muchos instrumentos disponibles en el mercado incorporan componentes de formación de imágenes que funcionan a tales longitudes de onda al menos en parte para evitar
65 tales cuestiones. Por ejemplo, hay disponibilidad de cicladores térmicos que realizan detección en tiempo real durante reacciones de amplificación y lectores de micromatrices que funcionan en esta región. La provisión de
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biomoléculas y elementos indicadores para señalizar la presencia de una biomolécula en particular, por ejemplo una biomolécula diana o una biomolécula asociada a diana. Un ejemplo convencional de esto sería el uso sucesivo de anticuerpos. En estos ensayos, un anticuerpo primario se unía la diana, el anticuerpo secundario se une al anticuerpo primario, un tercer anticuerpo se puede unir al secundario y así sucesivamente. Con cada capa sucesiva 5 adicional se pueden añadir grupos indicadores. Otra estrategia es el uso de una adición repetitiva de capas alternativas de dos (o más) componentes que se pueden reconocer mutuamente, o más de dos componentes en una relación de reconocimiento de cadena, que comprende uno o ambos de los componentes en una forma de estructura multimérica. En tal configuración, uno o más del grupo o grupos funcionales en cada una de las estructuras multiméricas se puede etiquetar con grupo o grupos indicadores y el grupo o grupos funcionales no ocupados puede servir como el sitio de reconocimiento para el otro componente o componentes, y este sistema proporcionará posteriormente una plataforma para amplificación de señales. Un ejemplo habitual de este enfoque es el uso de conjugado de estreptavidina-conjugado de indicador y anticuerpo anti-estreptavidina biotinilado. En tales ensayos, se puede usar una molécula de sensor biotinilada (ácido nucleico anticuerpo) para unirse a una biomolécula diana, que posteriormente se reconoce mediante un sistema de detección que contiene un conjugado de estreptavidina
15 indicador y anticuerpo anti-estreptavidina biotinilado. La estructura de sándwich en este caso se puede construir con sucesivas rondas de interacción de anticuerpos biotinilados y complejos de estreptavidina etiquetados para conseguir la amplificación de la señal. Con una conjugación adicional de un multicromóforo con cualquiera del anticuerpo biotinilado o el complejo de estreptavidina-indicador, es posible aumentar adicionalmente la salida de la señal. En esencia, la integración de un multicromóforo en este tipo de sistema de amplificación de señales puede amplificar adicionalmente señales hasta un nivel superior.
Los complejos de polímero bioconjugado que se describen en las FIGS. 6, 7, 8, 14, 16 y 17 se pueden usar para crear ensayos de sándwich potenciados de forma óptica mediante integración de forma directa de un multicromóforo de captación de luz en elementos de reconocimiento usados normalmente. Los beneficios de las estructuras
25 conjugadas con multicromóforo también se pueden aplicar directamente a los elementos primarios de reconocimiento de diana sin la necesidad de elementos de reconocimiento sucesivos. Por ejemplo, un anticuerpo primario se puede conjugar directamente con un complejo de multicromóforo-colorante tal como se muestra en la FIG. 14. Tal complejo se puede usar para investigar directamente la presencia de una biomolécula diana.
Polinucleótidos
Los polinucleótidos diana amplificados se pueden someter a tratamientos posteriores de amplificación. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser deseable fragmentar el polinucleótido diana antes de hibridación para proporcionar segmentos a los que se puede acceder más fácilmente. La fragmentación de los ácidos nucleicos se puede realizar
35 con cualquier método que produzca fragmentos de un tamaño útil en el ensayo que se está realizando; en la técnica se conocen algunos métodos físicos, químicos y enzimáticos adecuados.
Una reacción de amplificación se puede realizar en condiciones que permiten que el polinucleótido sensor se divida con el producto de amplificación durante al menos parte de un ciclo de amplificación. Cuando el ensayo se realiza de esta manera, la detección en tiempo real de este suceso de hibridación se puede producir mediante el control de la emisión de luz durante la amplificación.
El análisis de productos de PCR en tiempo real (y PCR de transcripción inversa en tiempo real relacionadas) proporciona una técnica bien conocida para el control de PCR en tiempo real que se ha usado en diversos
45 contextos, que se puede adaptar para uso con los métodos que se describen en el presente documento (véase Laurendeau et al., (1999) "TaqMan PCR-based gene dosage assay for predictive testing in individuals from a cancer family with INK4 locus haploinsufficiency" Clin Chem 45 (7): 982-6; Laurendeau et al., (1999) "Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reverse transcription-PCR assay" Clin Chem 59 (12): 2759-65; y Kreuzer et al., (1999) "LightCicler technology for the quantitation ofbcr/abl fusion transcripts" Cancer Research 59 (13): 3171-4).
La Muestra
En principio, la muestra puede ser cualquier material sospechoso de contener un agregante capaz de causar la
55 agregación del sensor de agregación. En algunas realizaciones, la muestra puede ser cualquier fuente de material biológico que comprende polinucleótidos que se pueden obtener a partir de un organismo vivo directa o indirectamente, incluyendo células, tejido o fluido, y los depósitos dejados por ese organismo, incluyendo virus, micoplasmas y fósiles. La muestra puede comprender un agregante preparado a través de medios sintéticos, en su totalidad o en parte. Por lo general, la muestra se obtiene o se dispersa en un medio predominantemente acuoso. Algunos ejemplos no limitantes de la muestra incluyen sangre, orina, semen, leche, esputo, moco, un hisopo bucal, un hisopo vaginal, un hisopo rectal, un aspirado, una biopsia de aguja, una sección de tejido obtenida por ejemplo mediante cirugía o autopsia, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secreciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, tumores, órganos, muestras de componentes de cultivo celular in vitro (que incluyen, pero no se limitan a, medio acondicionado resultante del crecimiento de células
65 en medio de cultivo celular, células supuestamente infectadas por virus, células recombinantes, y componentes celulares), y una biblioteca recombinante que comprende secuencias de polinucleótidos.
23
La muestra puede ser una muestra de control positivo que se sabe que contiene el agregante o un sustituto del mismo. También se puede usar una muestra de control negativo que, aunque no se espera que contenga el agregante, se sospecha que lo contiene (a través de contaminación de uno o más de los reactivos) u otro componente capaz de producir un falso positivo, y se somete al ensayo para confirmar la ausencia de contaminación
5 por el polinucleótido diana de los reactivos usados en un ensayo dado, así como para determinar si un conjunto dado de condiciones de ensayo produce falsos positivos (una señal positiva incluso en ausencia de polinucleótido diana en la muestra).
La muestra se puede diluir, disolver, suspender, extraer o tratar de otro modo para solubilizar y/o purificar cualquier polinucleótido diana presente o para que sea accesible a reactivos que se usan en un esquema de amplificación o para detección de reactivos. Cuando la muestra contiene células, las células se pueden lisar o permeabilizar para liberar los polinucleótidos dentro de las células. Se pueden usar tampones de permeabilización de una etapa para lisar células que permitan la realización de etapas adicionales directamente después de la lisis, por ejemplo una reacción en cadena de la polimerasa.
15 Cromóforos de Señalización
En algunas realizaciones, se puede usar un cromóforo o fluoróforo de señalización, por ejemplo para recibir energía transferida desde un estado excitado de una unidad prácticamente activa, o para intercambiar energía con una sonda etiquetada, o en múltiples esquemas de transferencia de energía. Algunos fluoróforos útiles en las invenciones descritas en el presente documento incluyen cualquier sustancia que pueda absorber energía de una longitud de onda apropiada y emitir o transferir energía. Para ensayos multiplexados, se puede usar una pluralidad de fluoróforos diferentes con espectros de emisión diferentes que se pueden detectar. Algunos fluoróforos habituales incluyen colorante fluorescentes, nanocristales semiconductores, quelatos de lantánidos, y proteína fluorescente de
25 color verde.
Algunos colorantes fluorescentes a modo de ejemplo incluyen fluoresceína, 6-FAM, rodamina, Rojo Texas , tetrametilrodamina, una carboxirrodamina, carboxirrodamina 6G, carboxirrodol, carboxirrodamina 110, Azul Cascade, Amarillo Cascade, cumarina, Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, Cy-Chrome, ficoeritrina, PerCP (Proteína clorofila-a peridinina), PerCPCy5.5, JOE (6-carboxi-4’,5’-dicloro-2’,7’-dimelhoxifluoresceína), NED, ROX (5-(and-6)carboxi-X-rodamina), HEX, Amarillo Lucifer, Azul Marina, Verde Oregon 488, Verde Oregon 500, Verde Oregon 514, Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, ácido 7-amino-4metilcumarina-3-acético, BODIPY® FL, BODIPY® FL-Br2, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY®
35 564/570, BODIPY® 576/589, BODIPY® 581/591, BODIPY® 630/650, BODIPY® 650/665, BODPY® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY® TR, conjugados de los mismos, y combinaciones de los mismos. Algunos quelatos de lantánidos a modo de ejemplo incluyen quelatos de europio, quelatos de terbio y quelatos de samario.
En la técnica se conoce una amplia diversidad de nanocristales semiconductores fluorescentes ("SCNC"); algunos métodos para producir y usar nanocristales semiconductores se describen en: Publ. de PCT n.º WO 99/26299 publicada el 27 de mayo de 1999, inventores Bawendi et al.; documento USPN 5.990.479 presentado el 23 de noviembre de 1999 de Weiss et al.; y Bruchez et al., Science 281: 2013, 1998. Algunos nanocristales semiconductores se pueden obtener con bandas de emisión muy estrechas con longitudes de onda de emisión con picos bien definidos, que permiten un gran número de diferentes SCNC a usar como cromóforos de señalización en
45 el mismo ensayo, opcionalmente en combinación con otros tipos de cromóforos de señalización que no son SCNC.
Algunos colorantes específicos de polinucleótido a modo de ejemplo incluyen naranja de acridina, homodímero de acridina, actinomicina D, 7-aminoactmomicina D (7-AAD), 9-amino-6-clor-2-metoxiacridina (ACMA), yoduro de BOBO™-1 (462/481), yoduro de BOBO™-3 (570/602), yoduro de BO-PRO™-1 (462/481), yoduro de BO-PRO™-3 (575/599), 4’,6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI), 4’,6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI), 4’,6diamidino-2-fenilindol, dilactato (DAPI, dilactato), dihidroetidio (hidroetidina), dihidroetidio (hidroetidina), dihidroetidio (hidroetidina), bromuro de etidio, cloruro de diazida de etidio, homodímero-1 de etidio (EthD-1), homodímero-2 de etidio (EthD-2), bromuro de monoazida de etidio (EMA), yoduro de hexidio, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, Hoechst S769121, hidroxistilbamidina, metanosulfonato, yoduro de JOJO™-1 (529/545), yoduro de JO55 PRO™-1 (530/546), yoduro de LOLO™-1 (565/579), yoduro de LO-PRO™-1 (567/580), NeuroTrace™ 435/455, NeuroTrace™ 500/525, NeuroTrace™ 515/535, NeuroTrace™ 530/615, NeuroTrace™ 640/660, OliGreen, PicoGreen® ssDNA, PicoGreen® dsDNA, yoduro de POPO™-1 (434/456), yoduro de POPO™-3 (534/570), yoduro de PO-PRO™-1 (435/455), yoduro de PO-PRO™-3 (539/567), yoduro de propidio, RiboGreen®, SlowFade®, SIowFade® Light, SYBR® Verde I, SYBR® Verde II, SYBR® Oro, SYBR® 101, SYBR®) 102, SYBR® 103, SYBR® DX, TO-PRO®-1, TO-PRO®-3, TO-PRO®-5, TOTO®-1, TOTO®-3, YO-PRO®-1 (amarillo de oxazol), YO-PRO®-3, YOYO®-1, YOYO®-3, TO, SYTOX® Azul, SYTOX® Verde, SYTOX® Naranja, SYTO® 9, SYTO® BC, SYTO® 40, SYTO® 41, SYTO® 42, SYTO® 43, SYTO® 44, SYTO® 45, SYTO® Azul, SYTO® 11, SYTO® 12, SYTO® 13, SYTO® 14, SYTO® 15, SYTO® 16, SYTO® 20, SYTO® 21, SYTO® 22, SYTO® 23, SYTO® 24, SYTO® 25, SYTO® Verde, SYTO® 80, SYTO® 81, SYTO® 82, SYTO® 83, SYTO® 84, SYTO® 85, SYTO® Naranja, SYTO® 65 17, SYTO® 59, SYTO® 60, SYTO® 61, SYTO® 62, SYTO® 63, SYTO® 64, SYTO® Rojo, netropsina, distamicina, naranja de acridina, 3,4-benzopireno, naranja de tiazol, TOMEHE, daunomicina, acridina, pentil-TOTAB, y butil
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biotinil-fluoresceína (BFL) Avidina DN (ADN) TBS
5 Procedimiento:
1. En un tubo Eppendorf, combina reactivos como se indica en la tabla que sigue a continuación. asegurarse de la adición de ADN en último lugar y mezclar en conjunto otros reactivos antes de la adición de ADN. Diluir las combinaciones 100 veces antes de la medida en un fluorómetro, ya sea 1 ul en 100 ul para el fluorómetro
10 NanoDrop, o 10 ul en una cubeta de 1 ml para un fluorómetro de sobremesa.
2.
Excitar la fluoresceína de forma directa a 488 nm así como de forma indirecta a través de FRET mediante excitación del polímero a 380 nm.
3.
Recoger datos en alturas de los picos a longitudes de onda relevantes. Restar el fondo de los alturas de los picos, incluyendo estas fuentes
15 3a) Tamponar solamente el control 3b) Seguir el pico del polímero (~5 %) de FRET con respecto a picos de fluoresceína
TBS
B-FL 5 uM CA 5 uM BCA 5 uM ADN 5 uM Exc. (nm) alt. pico a 415 nm alt. pico a 533 nm alt. pico a 533 nm
solamente TBS
20 ul 488 -
solamente BFL
20 ul 1 ul 488 -
solamente CA
20 ul 1 ul 380
BFL+CA+ADN, 1:1:1
20 ul 1 ul 1 ul 1 ul 488
380
BFL+BCA+ADN, 1:1:1
20 ul 1 ul 1 ul 1 ul 488
380
BFL+CA+ADN, 1:2:1
20 ul 1 ul 2 ul 1 ul 488
380
BFL+BCA+ADN, 1:2:1
20 ul 1 ul 2 ul 1 ul 488
380
20 Ejemplo 7
Análisis de amplificación de señal con Biotinil-CA001, Avidina DN, y Biotinil-fluoresceína:
La Figura 27A muestra la biotinilación de CA001. El polímero de amina, CA001 (precursor para el polímero de
25 biotinilo) no se debería unir a la avidina, y se usa como el polímero de control negativo. La Figura 27B representa el ensayo de forma esquemática. El colorante biotinilado y el polímero se ponen juntos de forma específica mediante unión de biotina-avidina. El polímero de control negativo (polímero de amina, CA001, indicado como CA) no se debería unir a la avidina. La Figura 27C muestra los espectros de fluorescencia resultantes del ensayo seguido en el protocolo mencionado anteriormente (Ejemplo 6). La línea de puntos muestra los espectros de fluorescencia
30 después de excitación a 380 nm del polímero no especificó (CA) en solución con Avidina DN (AvDN) y fluoresceína biotinilada (B-F1). Solamente se observa la emisión del polímero, centrada en 420 nm. La línea continua muestra los espectros de fluorescencia después de excitación a 380 nm del polímero biotinilado (BCA) en solución con Avidina DN (AvDN) y fluoresceína biotinilada (B-F1). Se observa una fuerte transferencia de energía, dando como resultado la emisión adicional que surge de la fluoresceína, entrada a 530 nm. FRET se produce solamente para biotinil
35 CA001, lo que indica que el biotinil-CA 001 dador y la fluoresceína aceptora se ponen muy cerca de través de unión de biotina-avidina. Esto corrobora la biotinilación de CA001 después del procedimiento de Pierce (Ejemplo 5). La excitación directa del colorante a 488 nm se muestra como una línea discontinua. La comparación de la línea discontinua con la línea continúa revela una amplificación del colorante de 19 veces cuando se excita indirectamente (a través de FRET) con respecto a directamente.
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Claims (1)

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