JP2005530182A - 集光性多発色団を用いてポリヌクレオチドを検出及び分析するための方法並びに組成物 - Google Patents

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Abstract

標的ポリヌクレオチドについてサンプルをアッセイするための方法、組成物及び製品を提供する。標的ポリヌクレオチドの含有が疑われるサンプルを、ポリカチオン多発色団、及び該標的ポリヌクレオチドに対して相補的なセンサＰＮＡと接触させる。センサＰＮＡは、励起された多発色団からのエネルギーを吸収し、前記標的ポリヌクレオチドの存在下で発光するシグナル伝達発色団を含む。本方法は、マルチプレックス形式で用いることができる。かかる方法を実施するための試薬を含むキットもまた提供する。

Description

本発明は、サンプル中のポリヌクレオチドを検出及び分析するための方法、物、並びに組成物に関する。
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明に至るまでの研究は、米国国立衛生研究所から付与された助成金番号GM62958-01、米国国立科学財団から付与された助成金番号DMR-0097611及び米国海軍研究事務所から付与された助成金番号N00014-98-1-0759の下で実施した。米国政府は本発明に関して一定限度の権利を持つものとする。
リアルタイムで感度の高いＤＮＡ配列検出を可能にする方法は、科学的及び経済的に重要である1,2,3。それらの用途としては、医学的診断、遺伝子突然変異の同定、遺伝子送達のモニタリング及び特定のゲノム技術が挙げられる4。臭化エチジウム及びチアゾールオレンジなどのカチオン有機色素は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の溝内に挿入されると発光し、直接ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして機能するものの、配列特異性に欠けている5,6。鎖特異的アッセイ用のエネルギー／電子移動発色団対が存在するが、これらは２つの核酸の化学標識、又は同一改変鎖の二重修飾（例えば、分子ビーコン）を必要とする7,8。２箇所のＤＮＡ部位を標識するのは困難であるため、収率が低くなり、コストが嵩み、さらに一方だけが標識された不純物が生じたりして、結果的に検出感度が低下する9。
ペプチド核酸（ＰＮＡ）が近年導入されたことで、新たな研究及び診断用途の機会が提供された10,11。ＰＮＡでは、ＤＮＡ中では負に帯電しているリン酸結合がペプチドミメティックな中性アミド結合と置き換えられている。ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体は、類似のＤＮＡ／ＤＮＡ複合体よりも高い結合エネルギーでより迅速に形成され、かつより特異的である12。これらの増強された特性は、負に帯電したＤＮＡ鎖の間で発生するクーロン反発力が無いことに起因する。従って、ＰＮＡ複合体はより熱安定性を示し、またその骨格のおかげでヌクレアーゼ、プロテアーゼ及びペプチダーゼによる生分解の影響を受けにくい13,14。さらに、ハイブリダイゼーション中のイオン強度及びｐＨに対するそれらの全般的な非感受性は、ＤＮＡ検出のためのより広い基盤となる18。
サンプル中の特定のポリヌクレオチドを検出及び分析するための方法、並びにかかる方法に有用な組成物及び製品が当分野で必要とされている。
サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出及びアッセイするための方法、組成物並びに製品を提供する。標的ポリヌクレオチドの含有が疑われるサンプルを、ポリカチオン多発色団、及び該標的ポリヌクレオチドに対して相補的なセンサ・ペプチド核酸（ＰＮＡ）と接触させる。センサＰＮＡはシグナル伝達発色団（signaling chromophore）と共役している。理論に縛られたくはないが、サンプル中に標的ポリヌクレオチドが存在する場合、シグナル伝達発色団は、センサＰＮＡにハイブリダイズした該標的ポリヌクレオチドの骨格との静電相互作用を利用してカチオン多発色団に接近すると考えられている（図１を参照されたい）。その結果、シグナル伝達発色団は、励起されたポリカチオン多発色団からエネルギーを獲得し、検出可能な光を発することができる。標的ポリヌクレオチドは、サンプル中に天然に存在する形で分析してもよいし、あるいは分析に先立って、または分析と同時に増幅してもよい。本発明の方法を実施する際に有用な試薬を含む溶液を、かかる試薬を含有するキットとして提供する。該方法は、複数の異なるセンサＰＮＡを使用して複数の異なる標的ポリヌクレオチドをアッセイするマルチプレックス環境で使用することができる。該方法は、任意により表面上で、例えば表面に会合させたポリカチオン多発色団を用いて実施することができる（つまり、該表面をセンサとすることができる）。また、該方法を均一フォーマットで提供することもできる。本明細書中に記載した方法及び物は、ポリヌクレオチドを検出するための他の技術に代わるものとして使用することができる。
ＤＮＡ及びＲＮＡセンサ（「ジーン・チップ」及び「ＤＮＡチップ」を含む）に関する現在の技術は、１本鎖ＤＮＡへの蛍光タグ（発光団（lumophore））の共有結合に依存している。これらのセンサの大部分は被分析サンプルの標識に頼らざるを得ないが、サンプル間の標識反応効率のばらつきを原因とする問題を回避できないため、複雑な相互校正が必要となる。他の系は「分子ビーコン」アプローチに基づいているが、該アプローチでは正確に設計された配列に発光団と消光団（quencher）を付加する必要がある。
本発明の方法の１つは、サンプルを、主に水性の溶液中で少なくとも２つの成分：（ａ）例えば，水溶性の、共役ポリマー、半導体量子ドット又は樹脂状構造などの集光性発光多発色団系；及び（ｂ）発光シグナル伝達発色団と共役させたセンサＰＮＡ（すなわちＰＮＡ−Ｃ＊）、と接触させることを含む。多発色団を励起した際のシグナル伝達発色団−Ｃ＊特有の光波長を有する発光は、溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在を示唆している。それぞれに異なる塩基配列および異なるシグナル伝達発色団を有する多数の異なるセンサＰＮＡ（ＰＮＡ１−Ｃ１ ＊、ＰＮＡ２−Ｃ２ ＊、ＰＮＡ３−Ｃ３ ＊、ＰＮＡ４−Ｃ４ ＊など）を使用することで、多数の異なるポリヌクレオチドを別個に検出し、アッセイすることができる。
集光性発色団及びシグナル伝達発色団（Ｃ＊）は、これら２つの発色団の吸収バンドのオーバーラップが最小となるように、またこれら２つの種の発光スペクトルが異なる波長を持つように、選択する。水溶液中で調製する場合、集光性発光多発色団系は正に帯電しているか又はカチオン性であり、好ましくはポリカチオン性（例えば、ポリカチオン共役高分子電解質）である。センサＰＮＡは帯電していないため、センサＰＮＡとカチオン集光性発光多発色団系との間のクーロン相互作用は極めて小さい。センサＰＮＡの配列に対して相補的な標的ポリヌクレオチドを加えると、該標的ポリヌクレオチドはセンサＰＮＡとハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドは負に帯電しているので、センサＰＮＡはポリカチオン多発色団と会合することにより、例えばForster型エネルギー移動機構を介して、該ポリカチオン多発色団からシグナル伝達発色団へのエネルギー移動を可能にする。センサＰＮＡの塩基配列に対して相補的ではない配列を有するポリヌクレオチドを加えた場合、塩基対のハイブリダイゼーションは起こらず、多発色団とセンサＰＮＡとの間の静電による複合体形成も生じない。ポリカチオン多発色団とシグナル伝達発色団との間の平均距離はかかるハイブリダイゼーションの非存在下で効率的なエネルギー移動を行うには広すぎるため、シグナル伝達発色団からの発光は殆ど又は全くみられない。全般的なスキームは、試験溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する際に役立つ。またＰＮＡは、ｄｓＤＮＡに結合してこれに侵入し、さらに同一配列を有するＤＮＡ鎖と入れ代わることによって３重らせん構造を形成する能力も有する15,16,17。かかるセンサＰＮＡ／ポリカチオン多発色団基盤を、直接ｄｓＤＮＡ検出のための系に組み込むことができる18。
前記の方法に加えて、本発明は、少なくとも２つの成分、すなわち（ａ）カチオン多発色団、及び（ｂ）シグナル伝達発色団に共役させたペプチド核酸を含む「センサＰＮＡ」（ＰＮＡ−Ｃ＊）、を含む、主に水性の溶液を提供する。
実施例中で示すように、共役ポリマーなどの水溶性多発色団により提供される光増幅を利用してＰＮＡセンサへのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することができる。該増幅は、より分子量の高い水溶性共役ポリマー又は他の構造を本明細書中に記載のポリカチオン多発色団として使用することによって増進できる。本発明は、蛍光検出方法の容易さを利用し、かつＰＮＡ−ＤＮＡ相互作用に見られる増進されたハイブリダイゼーション挙動を活用する均一フォーマットで提供することができる。本発明を使用すれば増幅された標的ポリヌクレオチドを検出することができるし、または本発明が大きなシグナルの増幅であることから、ポリヌクレオチドを増幅する必要の無い独立したアッセイとして使用することができる。
従って、現行のジーン・チップ技術を上回る本発明特有の利点としては、分析に先立ってサンプル中に含有されているか又はサンプルから得たポリヌクレオチドに発光団又は発色団を共有結合させることにより分析しようとする各サンプルを最初に標識するという必要条件を回避することが挙げられる。それらの結合方法では結合効率を再現することが本質的に困難であるため、サンプル間の相互校正が必要となる。
本明細書中に記載した発明は、サンプルを標的ポリヌクレオチドについて調べることのできるアッセイであれば、そのいずれにとっても有用である。典型的なアッセイではサンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在若しくはその相対量を決定することを必要とするので、該アッセイは定量的なものであっても半定量的なものであってもよい。
本発明の方法は、その全てをマルチプレックス・フォーマットで実施することができる。複数の異なるセンサＰＮＡを使用することにより、各センサＰＮＡに共役させた異なるシグナル伝達発色団を利用してサンプル中の対応する異なる標的ポリヌクレオチドを検出することができる。対応する異なる標的ポリヌクレオチドについてアッセイするために同時に使用しうる２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、４００個又はそれ以上の異なるセンサＰＮＡを用いるマルチプレックス方法を提供する。
前記方法は基板上並びに溶液中で実施することができるが、溶液フォーマットは拡散するためにより迅速であると予想される。従って、前記アッセイを、例えば基板上のアレイフォーマット（これをセンサとすることができる）で実施することができる。これはアッセイ成分（例えば、センサ・ポリヌクレオチド、ポリカチオン多発色団、若しくはその両方）を基板上に固定するか又は別の方法で組み込むことにより達成できる。これらの基板は、ガラス、シリコン、紙、プラスチックの表面、又は光電子変換器として用いられる光電子半導体（例えば、限定するものではないが、インジウム添加窒化ガリウム又は高分子ポリアニリンなど）の表面であってもよい。所与のセンサ・ポリヌクレオチドの位置は、公知の位置であってもアレイフォーマットで決定しうる位置であってもよく、また該アレイフォーマットはマイクロアドレスを指定可能なもの（microaddressable）であってもナノアドレスを指定可能なもの（nanoaddressable）であってもよい。
本発明をさらに詳しく記載する前に、本発明は記載されている特定の方法論、道具、解決策又は装置に限定されないことを理解されたい。何故なら、かかる方法、道具、解決方策又は装置は、当然変更しうるからである。また、本明細書中で使用する用語は、単に特定の実施形態を記載することを目的としたものであって、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。
単数形「a」、「an」及び「the」を使用する場合、文中で特に明確に指定しない限り、複数形の表現が含まれているものとする。従って、例えば「標的ポリヌクレオチド（a target polynucleotide）」という表現には複数の標的ポリヌクレオチドが含まれ、「シグナル伝達発色団（a signaling chromophore）」という表現には複数のかかる発色団が含まれ、また「センサＰＮＡ（a sensor PNA）」という表現には複数のセンサＰＮＡが含まれ、他についても同様である。さらに、「２つの（two）」、「３つの（three）」などの具体的な複数形の表現を使用する場合には、文中で特に明確に指定しない限り、多数の同一物を指すものと解釈する。
「接続（connected）」、「付加（attached）」、「連結（linked）」及び「共役（conjugated）」などの用語は本明細書中では同義的に使用されるものとし、また文中で特に明確に指示しない限り、直接的並びに間接的な接続、付加、連結又は共役を包含するものとする。ある数値範囲が示された場合、示された該範囲の上限値と下限値の間にある各整数、及びそれら各々の分数もまた、かかる数値間の各下位範囲と共に具体的に開示されるものと理解されたい。どんな範囲の上限値及び下限値であっても、それらを別個に該範囲内に含めること、または該範囲から除外することが可能であり、これらの限界値の一方を含む範囲、いずれも含まない範囲、又は両方を含む範囲もまた本発明に包含されるものとする。議論されている数値が固有の限界値を有する場合、例えばある成分が０〜１００％の濃度で存在しうる場合、又は水溶液のｐＨが１〜１４まで変動しうる場合、それらの固有の限界値は具体的に開示されているものとする。ある数値が明示された場合、示された数値とほぼ同数又は同量の数値もまた、それらの数値を根拠とする範囲として本発明の範囲に含まれるものと理解されたい。ある組み合わせが開示された場合、その組み合わせの要素からなる下位の組み合わせ各々もまた、具体的に開示され、かつ本発明の範囲に含まれるものとする。逆に、異なる要素又は要素集団が開示された場合、それらの組み合わせもまた開示されるものとする。複数の代替物を有するある発明のいずれかの要素が開示された場合、各代替物が別々に、又は他の代替物とのいずれかの組み合わせで除外されている該発明の実施例もまた、本明細書中に開示されるものとする。ある発明の２つ以上の要素がかかる除外を受ける可能性があり、かかる除外を受けた要素の全ての組み合わせが本明細書中に開示されるものとする。
特に定義しない限り、又は文中で特に明確に指定しない限り、本明細書中で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野において通常の知識を有する者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載した方法及び材料と類似又は同等のものはいずれも本発明を実施又は試験する際に使用できるが、好適な方法及び材料は本明細書中に記載されている。
本明細書中で言及した全ての刊行物は、それらを参照するきっかけとなった特定の材料及び方法論を開示しかつ記載することを目的として、参照により本明細書に含めるものとする。本明細書中で議論されている刊行物は、本出願の出願日に先立ってそれらを開示するためだけに提供されたものである。本明細書の如何なる内容も、本発明が、それらが先行発明であるという理由で、かかる開示に先行する資格を持たないことを認めたものと解釈されるべきではない。
定義
本発明を説明するにあたって次の用語を使用するが、これらは以下の通りに定義されるものとする。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」という用語は、本明細書中ではある長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を指すために同義的に使用されるものとし、また該用語にはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、その類似体、又はそれらの混合物が含まれるものとする。これらの用語は分子の１次構造のみを指す。従って、前記用語には、３本鎖、２本鎖及び１本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、並びに３本鎖、２本鎖及び１本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）が含まれる。また、例えばアルキル化及び／又はキャッピングにより修飾された形態のポリヌクレオチド、及び非修飾形態のポリヌクレオチドも含まれる。
修飾されているか否かに関わらず、ポリマー標的ヌクレオチドは、本明細書中に記載の方法においてポリカチオン多発色団と静電気的に相互作用するのに十分な負電荷を帯びたポリアニオン骨格（好ましくは糖−リン酸バックグラウンド）を備えていなければならないが、他の力が該相互作用にさらに関与していてもよい。センサ・ポリヌクレオチドをペプチド核酸として例示するが、標的の非存在下では多発色団との相互作用が極めて小さくなる他の非荷電ポリヌクレオチドを使用することができる。所与のアッセイ・フォーマットのための適切なハイブリダイゼーション条件は当業者により決定されるが、調整しうる非限定的パラメータとしては、アッセイ成分の濃度、ｐＨ、使用する塩とその濃度、イオン強度、温度などが挙げられる。
より詳しく述べると、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」という用語には、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、例えばスプライシングを受けたか又は受けていないｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含むポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン又はピリミジン塩基のＮ−又はＣ−配糖体である他のタイプのポリヌクレオチド、リン酸又は他のポリアニオン骨格を含む他のポリマー、並びに他の合成配列特異的核酸ポリマー（ただし、該ポリマーは、ＤＮＡ及びＲＮＡ中に見出されるような塩基対の形成と塩基のスタッキングを可能にする立体配置をとる核酸塩基を含有するものとする）が含まれる。従って、これらの用語には、例えば３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホルアミデート、２’−Ｏ−アルキル−置換ＲＮＡ、２本鎖及び１本鎖ＤＮＡ、２本鎖及び１本鎖ＲＮＡ、並びに例えばＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドを含むそれらのハイブリッドが含まれ、さらに公知のタイプの修飾物、例えば標識によるもの、アルキル化によるもの、「キャップ」によるもの、１つ以上のヌクレオチドがその類似体で置換されたもの、ヌクレオチド間修飾物、例えば負に帯電した連結によるもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、例えばタンパク質（ヌクレアーゼなどの酵素、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなどを含む）などの付属部分を含有するもの、インターカレート剤（例えばアクリジン、ソラレンなど）によるもの、キレート（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属などのキレート）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結によるもの（例えば、αアノマー核酸など）、並びに非修飾形態のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドも含まれる。
本明細書中で使用する場合、「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語には、公知のプリン及びピリミジン塩基だけでなく他の修飾された複素環式塩基も含有する部分が含まれることが理解されよう。かかる修飾物としては、メチル化プリン若しくはピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の複素環が挙げられる。また、修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドとしては、その糖部分が修飾されたもの、例えば１つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基と置き換えられているか、又はエーテル、アミンなどとして機能化されているものも挙げることができる。「ヌクレオチド単位」という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドを包含するものとする。
さらに、ヌクレオチド単位に対する修飾としては、それぞれに相補的なピリミジン又はプリンとの水素結合を形成するプリン若しくはピリミジン塩基上の官能基の再配置、付加、置換又は別の方法による変更が挙げられる。その結果得られる修飾ヌクレオチド単位は、任意で、同様に修飾した他のヌクレオチド単位（ただしＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ又はＵ以外）と塩基対を形成していてもよい。ポリヌクレオチドの機能を妨げない脱塩基部位が含まれていてもよいが、好ましくは、ポリヌクレオチドは脱塩基部位を含まない。ポリヌクレオチド中の一部又は全ての残基は、任意で、１つ以上の方法で修飾することができる。
標準的なＡ−Ｔ及びＧ−Ｃ塩基対は、チミジンのＮ３−Ｈ及びＣ４−オキシとそれぞれアデノシンのＮ１−及びＣ６−ＮＨ２との間、並びにシチジンのＣ２−オキシ、Ｎ３及びＣ４−ＮＨ２とそれぞれグアノシンのＣ２−ＮＨ２、Ｎ’−Ｈ及びＣ６−オキシとの間に水素結合が形成されうる条件下で形成される。従って、例えば、グアノシン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を修飾することにより、イソグアノシン（２−オキシ−６−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を形成してもよい。かかる修飾により、もはやシトシンとの標準的な塩基対を効果的に形成することのないヌクレオシド塩基が生成する。しかし、シトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノ−ピリミジン）を修飾することによりイソシトシン（ｌ−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキシ−ピリミジン）を形成すれば、グアノシンとの塩基対を効果的に形成することはないがイソグアノシンとの塩基対を形成する修飾ヌクレオチドが生成する。イソシトシンはSigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から入手可能であり、イソシチジンはSwitzeret al. (1993) Biochemistry 32:10489-10496及びその文中で引用された参考文献に記載の方法により調製してもよく、２’−デオキシ−５−メチル−イソシチジンはToret al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467及びその文中で引用された参考文献に記載の方法により調製してもよく、またイソグアニン・ヌクレオチドはSwitzeret al. (1993) 上掲、及びMantschet al. (1993) Biochem. 14:5593-5601に記載の方法を利用して、又はCollinsらに発行された米国特許第5,780,610号に記載の方法により調製してもよい。他の非天然塩基対は、２，６−ジアミノピリミジン及びその相補体（１−メチルピラゾロ−［４，３］ピリミジン−５，７−（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）の合成についてPiccirilli et al. (1990) Nature 343:33-37に記載された方法により合成してもよい。固有の塩基対を形成する他のかかる修飾ヌクレオチド単位、例えばLe
ach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683及びSwitzer et al. 上掲、に記載されたものが知られている。
「相補的」又は「実質的に相補的」とは、ヌクレオチド若しくは核酸同士（例えば、センサ・ペプチド核酸と標的ポリヌクレオチドとの間など）でハイブリダイズするか又は塩基対を形成する能力を指す。相補的ヌクレオチドは、一般に、Ａ及びＴ（若しくはＡ及びＵ）、又はＣ及びＧである。２つの１本鎖ポリヌクレオチド又はＰＮＡは、最適となるようにアライメント及び比較され、かつ適切な挿入又は欠失を含む一方の鎖の塩基が、他方の鎖の塩基の少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは約９８〜１００％と塩基対を形成する場合に、実質的に相補的であると言える。
あるいは、ポリヌクレオチド又はＰＮＡが選択的ハイブリダーゼーション条件下でその相補配列にハイブリダイズする場合に、実質的な相補性が存在する。典型的には、少なくとも１４〜２５個の塩基からなる範囲にわたり少なくとも約６５％相補的、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％相補的である場合に、選択的ハイブリダイゼーションが起こる。M. Kanehisa Nucleic Acids Res. 12:203 (1984)を参照されたい。
「示差結合」又は「示差ハイブリダイゼーション」とは、あるポリヌクレオチド又はＰＮＡがサンプル中のその相補配列に結合する傾向が、該サンプル中の非相補的ポリマーに結合する傾向に比べて高いことを指す。
ハイブリダイゼーション条件としては、典型的には約１Ｍ未満、より通常は約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度が挙げられる。ペプチド核酸とポリアニオンポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合、該ハイブリダイゼーションは殆ど又は全く塩を含有しない溶液中で行うことができる。ハイブリダイゼーション温度は最低で５℃とすることができるが、典型的には２２℃より高く、より典型的には約３０℃より高く、好ましくは約３７℃を上回る温度とする。断片が長くなるにつれて、特異的ハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度が必要となる場合がある。他の要因が塩基組成及び相補鎖の長さ、有機溶媒の存在及び塩基ミスマッチ形成の程度を含むハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える場合があり、また使用するパラメータの組み合わせはいずれか１つのみの絶対基準よりも重要である。制御しうる他のハイブリダイゼーション条件には、緩衝液の種類及び濃度、溶液のｐＨ、バックグラウンド結合を減らすためのブロッキング試薬（反復配列又はブロッキングタンパク質溶液など）の存在及び濃度、洗浄液の種類及び濃度、ポリヌクレオチドの相対濃度を高めるポリマーなどの分子、金属イオン及びそれらの濃度、キレート剤及びそれらの濃度、並びに当分野で公知の他の条件が含まれる。
本明細書中でいう「マルチプレックス」とは、多数の被分析物を同時にアッセイしうるアッセイ又は他の分析方法を指す。
「任意の」又は「任意で」とは、続いて記載される事象又は状況が生じても生じなくてもよいこと、またその記載には該事象又は状況が生じる場合と生じない場合とが含まれることを意味する。
サンプル
標的ポリヌクレオチドを含んでいるか又は含んでいることが疑われるサンプルの一部は、直接的又は間接的に生物（例えば細胞、組織又は体液）から取得できるポリヌクレオチド、並びに生物が残した物（例えばウイルス、マイコプラズマ及び化石）から取得できるポリヌクレオチド、を含む生体材料のうちのいずれかをその供給源とすることができる。サンプルは、その全部又は一部を合成手段により調製した標的ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。典型的には、サンプルは、主に水性の媒体として取得するか、又は該媒体中に分散させる。サンプルの非限定的な例としては、血液、尿、精液、乳、痰、粘液、口腔内の採取物、膣内の採取物、直腸内の採取物、吸引物、針生検、例えば外科手術又は検視解剖により得られた組織切片、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、気道、腸管、及び尿生殖路の外分泌物、涙、唾液、腫瘍、器官、in vitro細胞培養成分のサンプル（細胞培養培地における細胞増殖の結果得られた条件培地、ウイルスに感染したと推定される細胞、組換え細胞、及び細胞成分を含むがこれらに限定されない）、並びにポリヌクレオチド配列を含む組換えライブラリが挙げられる。
サンプルは、標的ポリヌクレオチド又はその代用物を含有することが知られている陽性対照サンプルとすることができる。また、標的ポリヌクレオチドを含有することは期待されていないが、該標的ポリヌクレオチド又は偽陽性を呈しうる別の成分を（１つ以上の試薬の汚染を介して）含有することが疑われており、かつ所与のアッセイで使用された試薬の標的ポリヌクレオチドによる汚染が無いことを確認したり、所与のセットのアッセイ条件が偽陽性（サンプル中に標的ポリヌクレオチドが存在しない場合でも陽性のシグナル）を呈するか否かを決定したりするために試験される陰性対照サンプルを使用することもできる。
サンプルを希釈、溶解、懸濁、抽出又は別の方法で処理することにより、存在する標的ポリヌクレオチドを可溶化及び／若しくは精製するか、又は該標的ポリヌクレオチドが増幅スキームで使用する試薬若しくは検出試薬に接近しやすくすることができる。サンプルが細胞を含有している場合、該細胞を溶解又は透過処理することにより該細胞内のポリヌクレオチドを放出させることができる。ワンステップ透過処理用緩衝液を使用して細胞を溶解すれば、溶解直後にさらに別の工程（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）を実施することができる。
標的ポリヌクレオチド及び該標的ポリヌクレオチドから生成された増幅産物
標的ポリヌクレオチドは１本鎖、２本鎖、又はより高次のものであってよく、直鎖状又は環状であってもよい。１本鎖標的ポリヌクレオチドの例としては、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ又はｓｓＤＮＡウイルスゲノムが挙げられるが、これらのポリヌクレオチドは内部に相補配列及び重要な二次構造を含有していてもよい。２本鎖標的ポリヌクレオチドの例としては、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡウイルスゲノム、プラスミド、ファージ、及びウイロイドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドは合成により調製することができるし、又は生物源から精製することができる。標的ポリヌクレオチドを精製することにより、サンプルの１つ以上の望ましくない成分を取り除くか若しくは減らしてもよいし、又は該標的ポリヌクレオチドを濃縮してもよい。逆に、標的ポリヌクレオチドが特定のアッセイにとって濃縮されすぎている場合には、該標的ポリヌクレオチドを希釈してもよい。
サンプルの収集と任意の核酸抽出を行った後、標的ポリヌクレオチドを含むサンプルの核酸部分を１つ以上の調製反応に供することができる。これらの調製反応としては、in vitro転写（ＩＶＴ）、標識、断片化、増幅及び他の反応が挙げられる。検出及び／又は増幅に先立って、ｍＲＮＡを最初に逆転写酵素とプライマーで処理することにより、ｃＤＮＡを作製することができる。この処理は、精製ｍＲＮＡを用いてin vitroで、又はin situで（例えばスライドに貼り付けられた細胞又は組織内で）行うことができる。核酸増幅によって標的ポリヌクレオチドなどの対象配列のコピー数が増える。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自律的配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｑβレプリカーゼの使用、逆転写、ニックトランスレーションなどを含む様々な増幅方法が使用に適している。
標的ポリヌクレオチドが１本鎖である場合、最初の増幅サイクルで該標的ポリヌクレオチドに対して相補的なプライマー伸張産物が形成される。標的ポリヌクレオチドが１本鎖ＲＮＡである場合、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを最初の増幅で使用することによりＲＮＡをＤＮＡへと逆転写し、追加の増幅サイクルを実施することにより、プライマー伸張産物を複製することができる。ＰＣＲ用のプライマーは、当然、増幅しうる断片を生成するそれらの対応する鋳型内の領域にハイブリダイズするよう設計されていなければならない。従って、各プライマーは、その３’ヌクレオチドが、使用した該プライマーの３’ヌクレオチドの３’側に位置するその相補的鋳型鎖中のヌクレオチドとの対を形成することによって、ＰＣＲにおいて該相補的鋳型鎖を複製するようにハイブリダイズしなければならない。
典型的には、標的ポリヌクレオチドの１つ以上の鎖をプライマー及び適切な活性を有するポリメラーゼと接触させて該プライマーを伸張し、また同時に該標的ポリヌクレオチドを複製し、それによって相補的ポリヌクレオチドの全長又はその小部分を生成することにより、標的ポリヌクレオチドを増幅する。標的ポリヌクレオチドを複製しうるポリメラーゼ活性を有する酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、１種以上のポリメラーゼ活性を有する酵素）はいずれも使用可能であり、また該酵素は熱不安定性なもの又は熱安定性なものとすることができる。酵素の混合物を使用することもできる。酵素の例としては、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼＩ（「Pol I」）、Pol Iのクレノウ断片、T4、T7、Sequenase(登録商標)T7、Sequenase(登録商標)バージョン2.0 T7、Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli及びパイロコッカスsp.（Pyrococcus sp）のGB-D DNAポリメラーゼなど）、ＲＮＡポリメラーゼ（大腸菌（E. coli）、SP6、T3及びT7 RNAポリメラーゼなど）、並びに逆転写酵素（AMV、M-MuLV、MMLV、RNアーゼH-MMLV（SuperScript(登録商標)）、SuperScript(登録商標) II、ThermoScript(登録商標)、HIV-1、及びRAV2逆転写酵素など）が挙げられる。これらの酵素は全て市販されている。多数の特異性を備えたポリメラーゼの例としては、RAV2及びTli（エキソ）ポリメラーゼが挙げられる。熱安定性ポリメラーゼの例としては、Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli及びパイロコッカスsp.（Pyrococcus sp.）のGB-D DNAポリメラーゼが挙げられる。
ｐＨ、緩衝液、イオン強度、１種以上の塩の存在及び濃度、ヌクレオチド及びマグネシウム及び／又は他の金属イオン（例えばマンガン）などの反応物質及び補因子の存在及び濃度、任意の共溶媒、温度、ポリメラーゼ連鎖反応を含む増幅スキームのための熱サイクルプロフィールを含む適切な反応条件は、標的ポリヌクレオチドの増幅が可能となるように選択するが、その一部は使用するポリメラーゼ及びサンプルの性質に左右される可能性がある。共溶媒としては、ホルムアミド（典型的には約２〜約１０％）、グリセロール（典型的には約５〜約１０％）、及びＤＭＳＯ（典型的には約０．９〜約１０％）が挙げられる。増幅スキームにおいて技術を駆使することにより、増幅中に生成する偽陽性の物質又は人工物の生成を最小限に抑えてもよい。これらの技術としては、「タッチダウン」ＰＣＲ、ホットスタート技術、nestedプライマーの使用、又はデザイニングＰＣＲプライマーが挙げられるが、これらはプライマー−ダイマーが形成されるとステムループ構造を形成するので、増幅されない。ＰＣＲを促進するための技術、例えば、サンプル内をより大きく対流させることが可能であって、かつサンプルを急速に加熱及び冷却するための赤外線加熱工程を含む遠心ＰＣＲを使用することができる。１回以上の増幅サイクルを実施することができる。あるプライマーを過剰に使用するとＰＣＲで該プライマーの伸張産物を過剰に生成することができるが、好ましくは、過剰に生産された該プライマー伸張産物は検出しようとする増幅産物である。複数の異なるプライマーを使用することにより、サンプル中の異なる標的ポリヌクレオチド又は特定の標的ポリヌクレオチドの異なる領域を増幅してもよい。
増幅された標的ポリヌクレオチドを増幅後の処理に供してもよい。例えば、場合によっては、ハイブリダイゼーション前に標的ポリヌクレオチドを断片化しておくことで、より容易に接近しうるセグメントを提供することが望ましいだろう。核酸の断片化は、実施しようとするアッセイに役立つサイズの断片を生成する方法により実施可能であり、また適切な物理的、化学的及び酵素的方法が当分野で公知である。
増幅反応は、ある増幅サイクルの少なくとも一過程中にセンサ・ポリヌクレオチドが増幅産物にハイブリダイズしうる条件下で実施することができる。アッセイをこのように実施する場合、増幅スキーム中のかかるハイブリダイゼーション時に生じるシグナル伝達発色団からの発光の変化を観察することにより、このハイブリダイゼーション事象のリアルタイム検出を行うことができる。
ポリカチオン多発色団
集光性多発色団系は、それらが多数の発色団を含むという理由で効率的な光吸収材であることが証明されている。具体例としては、限定するものではないが、共役ポリマー、共役分子の集合体、側鎖を介して飽和ポリマーに付加された発光色素、半導体量子ドット及び樹枝状構造が挙げられる。例えば、共役ポリマー上の各繰り返し単位は発色団の１つと考えることができるし、量子ドットは多くの原子で構成されており、飽和ポリマーはその側鎖上の多くの発光色素分子により機能化しうるし、また多くの共有結合された個々の発色団を含有するデンドリマーを合成することができる。ポリマービーズ又は表面などの固形支持体上への発色団集合体の付加を、集光目的で利用することもできる。
集光性多発色団系は、近接する発光種（例えば、「シグナル伝達発光団」）へエネルギーを効率的に移動することができる。エネルギー移動の機構としては、例えば、共鳴エネルギー移動（Forster型（又は蛍光）共鳴エネルギー移動、すなわちＦＲＥＴ）、量子電荷交換（Dexter型エネルギー移動）などが挙げられる。しかし通常は、これらのエネルギー移動機構はその移動距離が比較的短い。つまり、効率的なエネルギー移動のためには、集光性多発色団系がシグナル伝達発色団に密接していることが必要とされる。効率的なエネルギー移動のための条件下では、集光性多発色団系中の個々の発色団の数が多いとシグナル伝達発色団からの発光が増幅される。つまり、シグナル伝達発色団からの発光は、入射光（「ポンプ光」）が集光性多発色団系により吸収される波長を持つ場合のほうが、該シグナル伝達発色団がポンプ光により直接励起される場合よりも強い。
共役ポリマー（ＣＰ）は非局在化した電子構造を特徴とし、化学及び生物標的に対する高反応性の光レポーターとして使用することができる19,20。効果的な共役の長さはポリマー鎖の長さよりも実質的に短いため、その骨格には密接し合う多数の共役セグメントが含まれている。従って、共役ポリマーは集光にとって効率的であり、また該共役ポリマーによりFroster型エネルギー移動を介した光増幅が可能となる21。水溶性のＣＰは逆電荷に帯電した受容体の存在下で優れた蛍光消光能を示すので、生物学的認識事象を伝達する際には特に重要である22,23。
カチオン高分子電解質とＤＮＡとの間の自発的なポリマー間複合体形成反応については既に記載されており、また該反応は協同静電気力によるところが大きい24,25,26。芳香族ポリマー単位とＤＮＡ塩基との間の疎水性相互作用もまた最近になって認められた27,28。高分子電解質／ＤＮＡ相互作用の自由エネルギーは、ｐＨ、イオン強度、及び温度などの溶液の可変要素と併せて使用する参加化学種の構造によって制御される29。これらの相互作用の強さ及び特異性は、最近になって、プラスミドＤＮＡの三次構造を認識するように調整された30。
本発明で使用する多発色団はポリカチオン性であるため、標的ポリヌクレオチドと静電気的に相互作用することにより、非荷電センサＰＮＡと該標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して、該センサＰＮＡ上のシグナル伝達発色団をエネルギーを受容する距離まで近付けることができる。光を吸収しかつセンサＰＮＡ上のシグナル伝達発色団にエネルギーを移動しうるポリカチオン多発色団はいずれも、前記の方法に使用することができる。使用しうる多発色団の例としては、多数の発色団を実行可能な様式で組み入れた共役ポリマー（オリゴマーを含む）、飽和ポリマー又はデンドリマー、及び半導体ナノ結晶（ＳＣＮＣ）が挙げられる。共役ポリマー、飽和ポリマー及びデンドリマーを調製することにより複数のカチオン種を組み入れることができるし、又はこれらを合成後に誘導体化してポリカチオン性とすることができる。半導体ナノ結晶は、その表面にカチオン種を加えることでポリカチオン性とすることができる。
好適な実施形態では、共役ポリマーをポリカチオン多発色団として使用する。その具体例を、カチオン水溶性共役ポリマーがヨウ化物対アニオンを有するポリ（（９，９−ビス（６’−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）−ヘキシル）−フルオレンフェニレン）である構造１（以後はポリマー１と記す）23に示す。このポリマーの粒径は、該ポリマーが光を吸収しかつ接近したシグナル伝達発色団へエネルギーを移動しうる限りは重要ではない。「ｎ」の典型的な値は２〜約100,000の範囲内にある。この特有の分子構造は重要ではなく、比較的高い発光量子効率を有する水溶性カチオン共役ポリマーであればいずれも使用することができる。
Figure 2005530182
水溶性共役オリゴマーをポリカチオン多発色団として使用することもできる。ヨウ化物対イオンを有する、かかる水溶性でカチオン性の発光共役オリゴマーの１例（本明細書中ではオリゴマー２と記す）を以下に示す。
Figure 2005530182
より小さいオリゴマー２は高分子量ポリマーに特徴的な大きなシグナル増幅を示さないが、かかる小分子は、ポリマーに見られる固有の多分散性及びバッチ間変動のせいで判別しにくい構造物性相関を解明する際に役に立つ。さらに、水性媒体中では２などのオリゴマーはそれらのポリマー対応物より溶けやすく、また中性ＰＮＡとの疎水性相互作用は、２の場合はポリマー構造の場合ほど重要ではないと予想される。従って、オリゴマーの集合体は特定の用途にとって望ましいだろう。
センサＰＮＡ
アッセイしようとする標的ポリヌクレオチドに対して相補的であり、かつ所定の配列を有するセンサＰＮＡを提供する。センサＰＮＡは分岐状、多重結合型又は環状でありうるが、典型的には直鎖状であり、また非天然塩基を含有しうる。ＰＮＡの分子構造は周知である。所望の塩基配列を有するＰＮＡを調製することができる。シグナル伝達発色団をセンサＰＮＡに付加するための化学的手法は周知である10。発色団に共役させた構造を含む特定のセンサＰＮＡ構造は、商業的供給源を利用して特注するか、又は化学的に合成することができる。
シグナル伝達発色団
本明細書中に記載した本発明に有用な発色団としては、適切な溶液中のポリカチオン多発色団からのエネルギーを吸収し、かつ発光しうる全ての物質が挙げられる。マルチプレックス式アッセイの場合、検出可能な程度に異なる発光スペクトルを有する複数の異なるシグナル伝達発色団を使用することができる。発色団は、発光団であっても、又は蛍光団であってもよい。典型的な蛍光団としては、蛍光色素、半導体ナノ結晶、ランタニド・キレート、及び緑色蛍光タンパク質が挙げられる。
蛍光色素の例としては、フルオレセイン、6-FAM、ローダミン、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン6G、カルボキシロードル（carboxyrhodol）、カルボキシローダミン110、カスケードブルー、カスケードイエロー、クマリン、Cy2(登録商標)、Cy3(登録商標)、Cy3.5(登録商標)、Cy5(登録商標)、Cy5.5(登録商標)、Cy-クロム、フィコエリトリン、PerCP（ペリオジニンクロロフィル−プロテイン）、PerCP-Cy5.5、JOE（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、NED、ROX（５−（及び−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、HEX、ルシファーイエロー、マリナブルー、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、Alexa Fluor(登録商標)350、Alexa Fluor(登録商標)430、Alexa Fluor(登録商標)488、Alexa Fluor(登録商標)532、Alexa Fluor(登録商標)546、Alexa Fluor(登録商標)568、Alexa Fluor(登録商標)594、Alexa Fluor(登録商標)633、Alexa Fluor(登録商標)647、Alexa Fluor(登録商標)660、Alexa Fluor(登録商標)680、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、BODIPY(登録商標)FL、BODIPY(登録商標)FL-Br2、BODIPY(登録商標)530/550、BODIPY(登録商標)558/568、BODIPY(登録商標)564/570、BODIPY(登録商標)576/589、BODIPY(登録商標)581/591、BODIPY(登録商標)630/650、BODIPY(登録商標)650/665、BODIPY(登録商標)R6G、BODIPY(登録商標)TMR、BODIPY(登録商標)TR、それらの共役体、及びそれらの組み合わせが挙げられる。ランタニド・キレートの例としては、ユウロピウム・キレート、テルビウム・キレート、及びサマリウム・キレートが挙げられる。
多種多様な蛍光半導体ナノ結晶（ＳＣＮＣ）が当分野で公知であり、半導体ナノ結晶を生成及び利用する方法は、1999年5月27日に公開されたPCT公報第WO 99/26299号（発明者はBawendiら）、1999年11月23日にWeissらに発行された米国特許第5,990,479号、及びBruchez et al., Science 281:2013, 1998に記載されている。明確な発光波長ピークを有する非常に幅の狭い発光バンドを呈する半導体ナノ結晶を得ることができるため、多数の異なるＳＣＮＣを同一アッセイにおいてシグナル伝達発色団として（任意で他の非ＳＣＮＣ型のシグナル伝達発色団と組み合わせて）用いることが可能となる。
「緑色蛍光タンパク質」という用語は、天然のイクオレア（Aequorea）緑色蛍光タンパク質と、変更された励起及び発光最大値並びに異なる形状の励起及び発光スペクトルを含む、変更された蛍光特性を示すことが確認されている変異型（Delagrave, S. et al. (1995) Bio/Technology 13:151-154; Heim, R. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504; Heim, R. et al. (1995) Nature 373:663-664）の両方を指す。Delgraveらは、励起スペクトルが赤方偏移しているクローン化オワンクラゲ（Aequorea victoria）ＧＦＰの変異体を単離した（Bio/Technology 13:151-154 (1995)）。Heim, R.らは、青色蛍光を有する変異体（Tyr66がHisに変異している）を報告した（Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) USA 91:12501-12504）。
基板
基板は、多様な材料、生物学的材料、非生物学的材料、有機材料、無機材料、又はこれらのいずれかの組み合わせを含みうる。例えば、基板は、重合したラングミュアー・ブロジェット膜、機能性ガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、修飾シリコン、又は多種多様なゲル若しくはポリマー（（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチドコグリコリド）、ポリ酸無水物、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセタート）、ポリシロキサン、高分子シリカ、ラテックス、デキストランポリマー、エポキシ樹脂、ポリカーボネート、若しくはそれらの組み合わせ）のうちのいずれか１つであってよい。導電性ポリマー及び光伝導性材料を使用することができる。
基板は、シリカベースの基板（例えばガラス、石英など）などの平面結晶基板、又は例えば半導体及びマイクロプロセッサ産業で使用される結晶基板（例えばシリコン、ガリウムヒ素、インジウム添加ＧａＮなど）とすることが可能であり、半導体ナノ結晶がこれに含まれる。
基板は、光ダイオード、光半導体チップ若しくは光薄膜半導体などの光電センサ、又はバイオ素子の形態をとりうる。基板上の個々のセンサ・ポリヌクレオチドの位置は、そのアドレスを指定可能なものとすることができる。これは高密度フォーマットで行うことが可能であり、またその位置はマイクロアドレスが指定可能なもの、又はナノアドレスが指定可能なものとすることができる。
シリカ・エーロゲルを基板として使用することも可能であり、これは当分野で公知の方法により調製することができる。エーロゲル基板を自立基板として、又は別の基板材料用の表面塗料として使用してもよい。
基板はどんな形態もとりうるが、典型的にはプレート、スライド、ビーズ、ペレット、ディスク、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、より糸、沈殿物、任意で多孔質のゲル、シート、チューブ、球体、容器、毛管、パッド、薄片、フィルム、チップ、マルチウェルプレート又は皿、光ファイバーなどである。基板は、硬質又は半硬質の形態をとることもできる。基板はセンサ・ポリヌクレオチド又は他のアッセイ成分が配置された凸又は凹領域を含んでいてもよい。基板の表面を周知技術を用いてエッチング処理することにより、所望の表面特徴、例えば溝、Ｖ溝、メサ構造などを提供することができる。
基板上の表面は、基板と同一の材料で構成するか又は別の材料から作製することが可能であり、また該表面を化学的若しくは物理的手段により基板上に結合することができる。このように結合された表面は、多種多様な材料、例えばポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカ又はシリカベースの材料、カーボン、金属、無機ガラス、膜のうちのいずれか、又は前記基板材料のうちのいずれかで構成されていてもよい。表面を任意で透明にすることができるし、また該表面にシリカ表面で見られるような表面Ｓｉ−ＯＨ機能を持たせることもできる。
基板及び／又はその任意の表面は、使用する合成及び／又は検出方法にとって適切な光学特性を提供するように選択する。基板及び／又は表面を透明にすることで、複数の方向から当てた光に基板を曝露することができる。反射「鏡」構造を備えた基板及び／又は表面を提供することにより光の回収率を高めてもよい。
基板及び／又はその表面は、通常、使用時に曝露される条件に対して耐性であるか又は耐性となるよう処理されており、該基板及び／又はその表面を任意で処理することによりかかる条件に曝露した後の耐性材料を除去することができる。
センサ・ポリヌクレオチドは、適切な方法、例えば米国特許第5,143,854号、PCT公報第WO 92/10092号、1990年12月6日に出願された米国特許出願第07/624,120号（既に放棄されている）、Fodor et al., Science, 251: 767-777 (1991)、及びPCT公報第WO 90/15070号に記載された方法により、基板上で組み立てるか又は基板に付加することができる。力学的合成方法を利用してこれらのアレイを合成するための技術は、例えばPCT公報第WO 93/09668号及び米国特許第5,384,261号に記載されている。
さらに別の技術としては、PCT出願第PCT/US93/04145号に記載されているようなビーズを用いる技術、及び米国特許第5,288,514号に記載されているようなピンを用いる方法が挙げられる。
センサ・ポリヌクレオチドを基板へ付加する際に適用しうる追加的フローチャネル法（additional flow channel）又はスポット法は、1992年12月20日に出願された米国特許出願第07/980,523号及び米国特許第5,384,261号に記載されている。試薬は、（１）所定の領域上の定められたチャネル内を流れることにより、又は（２）所定の領域上に「スポット」することにより、基板へと送達される。親水性又は疎水性の被膜（溶媒の性質によって決まる）などの保護被膜を、時には他の領域ではこの反応液による加湿を容易にする材料と共に、保護しようとする基板の一部に対して使用することができる。このようにして、流動溶液がその指定された流路の外に流れ出すのをさらに防ぐ。
典型的なディスペンサーとしては、任意でロボット制御されているマイクロピペット、インクジェットプリンタ、一連のチューブ、多岐管、数多くのピペットなどが挙げられ、これらにより種々の試薬を連続して、又は同時に、反応領域へ送達することができる。
発色団の励起及び検出
ポリカチオン多発色団を励起することが可能であって、かつ検出しようとする発光波長よりも短い波長を提供する道具は、いずれも励起のために使用することができる。好ましくは、励起源はシグナル伝達発色団を直接的には有意に励起しない。励起源は、適切なフィルタを備えた重水素ランプなどの広帯域ＵＶ光源、キセノンランプ又は重水素ランプなどの白色光源が所望の波長を取り出すための単色光分光器を通過した後の出力、持続波（ｃｗ）気体レーザー、固体ダイオードレーザー、又はいずれかのパルスレーザーであってもよい。シグナル伝達発色団からの発光はいずれかの適切な装置又は技術を介して検出することが可能であり、多くの適切なアプローチが当分野で公知である。例えば、蛍光光度計又は分光光度計を使用することにより、多発色団を励起した場合に試験サンプルがシグナル伝達発色団に特徴的な波長の光を放出するか否かを検出してもよい。
キット
本発明の方法を実施する際に有用な試薬を含むキットもまた提供する。ある実施形態では、キットには対象の標的ポリヌクレオチドに対して相補的な１本鎖センサＰＮＡとポリカチオン多発色団が含まれている。センサＰＮＡはシグナル伝達発色団と共役している。サンプル中に標的ポリヌクレオチドが存在する場合、センサＰＮＡは該標的とのハイブリダイゼーションが生じると多発色団に接近し、このポリカチオン多発色団と静電気により会合する。
キットの成分は、ハウジング（housing）により維持することができる。キットを使用して本発明の方法を実施するための使用説明書は、ハウジングと共に提供することができるし、または何らかの固定媒体中に提供することができる。使用説明書をハウジングの内側又は外側に配置したり、またハウジングを形成している表面の内部又は外部に印刷したりすることにより、該使用説明書を読みやすくしてもよい。キットは、対応する異なる標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしうる複数の１つ以上の異なるセンサＰＮＡを含有するマルチプレックス形式であってもよい。
以下の実施例は、当業者に本発明の作製方法及び用途についての十分な説明を提供するために記載されているのであって、本発明とみなされるものの範囲を制限するものではない。使用する数字（例えば量、温度など）の精度を裏付けるための努力が為されてはいるが、多少の実験誤差及び偏差は考慮すべきである。特に指示しない限り、部は重量部、温度はセ氏度、及び圧力は大気圧前後であり、また全ての材料は市販されているものとする。
実施例１．ＦＲＥＴのための多発色団／シグナル伝達発色団対の同定
集光性多発色団系からセンサＰＮＡ上のシグナル伝達発色団へエネルギーを移動する能力を、カチオン水溶性共役ポリマーであるポリ（（９，９−ビス（６’−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）−ヘキシル）−フルオレンフェニレン）、すなわち記載された通りに調製したヨウ化物対アニオンを有するポリマー１23、及び配列5'-CAGTCCAGTGATACG-3'を有しかつその５’位でフルオレセイン（Ｃ＊）と共役しているセンサ・ペプチド核酸、すなわちＰＮＡ−Ｃ＊を用いて実証した。ポリマー１及びセンサ・ペプチド核酸ＰＮＡ−Ｃ＊の各吸収（緑色とオレンジ色）及び発光（青色と赤色）スペクトルを図２に示す。１及びＰＮＡ−Ｃ＊は、それぞれ３８０及び４８０ｎｍで励起した。データは、ポリマー１の特異的励起のための光学ウィンドウが存在することを示している。また、ポリマー１の発光とＣ＊の吸収との間には顕著なオーバーラップが存在するため、ＦＲＥＴが可能となる31。
実施例２．標的ポリヌクレオチド存在下でのFRETの実演
前記ＰＮＡ−Ｃ＊プローブ（［ＰＮＡ−Ｃ＊］＝２．５×１０−８Ｍ）を、ポリマー１の非存在下で別々の容器において、等モル量の相補的な１５塩基対からなるｓｓＤＮＡ、すなわち（5'-CGTATCACTGGACTG-3'）３、及び全く同じやり方で非相補的な１５塩基からなるｓｓＤＮＡ、すなわち（5'-ACTGACGATAGACTG-3'）４と接触させた。アニーリング工程は緩衝液の非存在下で、すなわち低イオン強度で、ＰＮＡ−Ｃ＊のＴｍ（１０−８Ｍ、ｐＨ＝５．５で７２℃）32,33より２℃低い温度にて実施した。融解試験を行い、その吸光度を２６０ｎｍでＵＶ／Ｖｉｓ分光分析によりモニタリングした18。温度を上げると、相補的ｓｓＤＮＡを含有するサンプル中のハイブリダイズした２本鎖が融解する際の吸光度が上昇した。何故なら、２つの１本鎖はハイブリダイズした２本鎖よりも多くの光を吸収するからである。予想通り、非相補的ｓｓＤＮＡを含有するサンプルはそのような吸光度の上昇を示さなかった。これは、該サンプル中には２本鎖が形成されなかったからである。
ＦＲＥＴは、相補的及び非相補的ｓｓＤＮＡ並びにポリマー１（［１］＝２．３×１０−７Ｍ）を含有するアニーリング済サンプル中で測定した。相補的（赤色）及び非相補的（黒色）ＤＮＡの存在下でポリマー１を励起した場合のＰＮＡ−Ｃ＊の正規化発光スペクトルを図３に示す。ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドについては、非相補的な対と比べるとその１１倍を上回る高いＦＲＥＴ比が検出された34。ＦＲＥＴのこの違いにより、所与の標的ポリヌクレオチドに対する本開示方法の特異性が証明される。さらに、フルオレセインの発光は、１の非存在下で直接Ｃ＊を励起して得られるものより８倍以上強かった35。センサＰＮＡ、標的ポリヌクレオチド及びポリカチオン多発色団を含むエネルギー移動複合体においてＣ＊の発光がこのように増強されたということは、多発色団（ポリマー１）により光増幅が提供されたことを示唆している。この増感アクセプタによる発光は、相補的な標的ポリヌクレオチドの存在下でのみ示される。
実施例３．エネルギー移動の最適化
化合物１とＰＮＡ−Ｃ＊との比率を変えることにより、エネルギー移動を最適化した。濃度［ＰＮＡ−Ｃ＊］＝２．５×１０−８Ｍでは、１の初期の添加により直ちにＦＲＥＴ比が上昇した。［１］が［ＰＮＡ−Ｃ＊］を大きく上回る場合には低下が観察された。ＦＲＥＴ比の最大値は、以前に公表された分子量情報23によると、ポリマー鎖とＰＮＡ鎖との比において１：１付近に相当する。［１］／［ＰＮＡ−Ｃ＊］が１未満である場合は全てのｓｓＤＮＡ／ＰＮＡ−Ｃ＊ハイブリッド鎖が独立したポリマー鎖と効率的に複合体を形成するとは限らないので、かかる相関は予想されていた。逆に、［１］／［ＰＮＡ−Ｃ＊］が１より大きい場合でも、１（ドナー）が利用しうる光子全てをＤＮＡ／ＰＮＡ−Ｃ＊ハイブリッド（アクセプタ）に移動できるわけではない。飽和点におけるＣ＊の発光は直接Ｃ＊を励起して得られるものより２５倍以上強く、このことは、ポリマー１の多発色団構造によるシグナル増幅のさらなる証拠となる点に注目されたい。
実施例４．バックグラウンドのシグナル伝達を減少させるための有機溶媒の使用
図３をよく見ると、ハイブリダイズしていないＰＮＡプローブ由来の小さなフルオレセイン・シグナルに気が付くが、これは１とＰＮＡ−Ｃ＊の間の疎水性相互作用によって生成したものであろう。実施例２に示した試験と同一の条件下でアッセイ溶液にエタノールを加えて最終濃度を１０％エタノールとしたところ、バックグラウンドのＣ＊の発光が弱まった。有機溶媒の存在により疎水性相互作用が低下し、バックグラウンドのＣ＊の発光が３分の１に減った。この時点で、バックグランドのシグナルは標準的な蛍光光度計37を使用しても殆ど検出できなくなった。
実施例５．第２のポリカチオン多発色団を使用した標的ポリヌクレオチドの検出
記載された通りに調製した水溶性共役オリゴマー２（ｎの平均値＝２０）23を集光性発色団として利用した。相補的（赤色）及び非相補的（黒色）ＤＮＡの存在下でオリゴマー２を励起した場合のＰＮＡ−Ｃ＊の正規化発光スペクトルを図４に示す。アッセイは、［２］＝６．７×１０−８Ｍ及び［ＰＮＡ−Ｃ＊］＝２．５×１０−８Ｍで実施例２に記載した通りに実施した。図４は、相補的な標的ポリヌクレオチドが存在する場合にのみＣ＊の発光が検出されたことを示している。図３と４を比較すると、より高い分子量を有する共役ポリマー（オリゴマー）を使用するほどＦＲＥＴ比が高くなることが明らかとなる。従って、本実施例で使用したものよりも高い分子量のポリカチオン多発色団を用いれば、有意に高いＦＲＥＴ比と、これに相応する高い感度を期待することができる。
好適な実施形態を引用して本発明を詳細に記載してきたが、当業者であれば、本明細書中の教示内容を考慮すれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく一定の変更及び修正を行いうることが分かるだろう。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ制限される。
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33 参照28のインタラクティブバージョンは、applied biosystems社のカスタムプローブデザイナーウェブサイト： www.appliedbiosystems.com/cgi-bin/calculator/ab_configured/oligodesigner/designer.cgiに掲載されている
34 FRET比は、供与体の積分発光強度に対する受容体の積分発光強度であると定義されている
35 pH=5.5におけるフルオレセインは量子収率が高いその2価アニオン形態をとらないため、pHが高くなるとＣ＊の発光も強まるが、その分ＰＮＡ−Ｃ＊複合体上の電荷の中性度が失われるだろうと予想した
36 Gaylord, B.S. ; Wang, S. ; Heeger, A.J. ; Bazan, G.C. J. Am. Chem. Soc. 2001 123 6417.
37 キセノンランプ励起源とHamamatsu PMTを備え付けたPTI Quantum Master蛍光光度計である。
図1は、ポリカチオンポリマーを集光性多発色団として用いる本発明の方法を描写したものである。シグナル伝達発色団を含み、かつ対象の標的ポリヌクレオチドに対して相補的な塩基配列を有するセンサＰＮＡ（ＰＮＡ−Ｃ＊）を提供する。サンプル中の標的ポリヌクレオチドと接触すると、ポリカチオン多発色団は該標的ポリヌクレオチドとの静電相互作用に基づいてシグナル伝達発色団に接近する。次いで該多発色団が励起されると、該シグナル伝達発色団から光が放出される。 図２は、ポリマー１（下記参照）及びセンサ・ペプチド核酸ＰＮＡ−Ｃ＊の各吸収スペクトル（緑色とオレンジ色）及び発光スペクトル（青色と赤色）を表す。１及びＰＮＡ−Ｃ＊は、それぞれ３８０及び４８０ｎｍで励起した。 図３は、相補的（赤色）及び非相補的（黒色）ＤＮＡの存在下でポリマー１を励起した場合のＰＮＡ−Ｃ＊の発光スペクトルを表す。ＰＮＡ−Ｃ＊及び各ＤＮＡは、ｐＨ＝５．５で同時に水中に加えた。図中のスペクトルは、ポリマー１の発光について正規化したものである。 図４は、相補的（赤色）及び非相補的（黒色）ＤＮＡの存在下でオリゴマー２を励起した場合のＰＮＡ−Ｃ＊の発光スペクトルを表す。ＰＮＡ−Ｃ＊及び各ＤＮＡは、ｐＨ＝５．５で同時に水中に加えた。図中のスペクトルは、オリゴマー２の発光について正規化したものである。

Claims (30)

  1. アッセイ方法であって、以下：
    標的ポリヌクレオチドの含有が疑われるサンプルを提供すること、
    前記標的ポリヌクレオチドと静電気的に相互作用し、かつ励起されるとエネルギーをシグナル伝達発色団へ移動する能力のあるポリカチオン多発色団を提供すること、
    １本鎖でかつ前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的なセンサ・ペプチド核酸（ＰＮＡ）であって、前記シグナル伝達発色団と共役している該センサＰＮＡを提供すること、
    前記標的ポリヌクレオチドが存在する場合にはこれに前記センサＰＮＡがハイブリダイズしうる条件下で、前記サンプルを溶液中で前記センサＰＮＡ及び前記多発色団と接触させること、
    前記溶液に、前記多発色団を励起しうる光源を当てること、及び
    前記シグナル伝達発色団から光が放出されるか否かを検出すること
    を含む上記アッセイ方法。
  2. 前記多発色団が、飽和ポリマー、共役ポリマー、デンドリマー、及び半導体ナノ結晶から選択される構造を含む、請求項１記載の方法。
  3. 前記多発色団が飽和ポリマーを含む、請求項２記載の方法。
  4. 前記多発色団がデンドリマーを含む、請求項２記載の方法。
  5. 前記多発色団が半導体ナノ結晶を含む、請求項２記載の方法。
  6. 前記多発色団が共役ポリマーを含む、請求項２記載の方法。
  7. 前記共役ポリマーが、下記構造：
    Figure 2005530182
     を有する、請求項６記載の方法。
  8. 前記共役ポリマーが、下記構造：
    Figure 2005530182
     を有する、請求項６記載の方法。
  9. 前記サンプルを、およそ１：１の電荷比の前記センサＰＮＡ及び前記多発色団と接触させる、請求項１記載の方法。
  10. 前記サンプルを、前記センサＰＮＡと前記多発色団との間の疎水性相互作用を低下させるのに十分な量の有機溶媒の存在下で、前記センサＰＮＡ及び前記多発色団と接触させる、請求項１記載の方法。
  11. 前記サンプルを、対応する異なる配列を有する複数の異なるセンサＰＮＡであって対応する異なるシグナル伝達発色団を含むそれらの異なるセンサＰＮＡと接触させるが、ただしそれらの異なるセンサＰＮＡは各々が対応する異なる標的ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズできるものとする、請求項１記載の方法。
  12. 前記発色団が蛍光団である、請求項１記載の方法。
  13. 前記蛍光団が、半導体ナノ結晶、蛍光色素、及びランタニド・キレートから選択される、請求項１２記載の方法。
  14. 前記蛍光団が半導体ナノ結晶である、請求項１３記載の方法。
  15. 前記蛍光団が蛍光色素である、請求項１３記載の方法。
  16. 前記蛍光色素がフルオレセインである、請求項１５記載の方法。
  17. 前記蛍光団がランタニド・キレートである、請求項１３記載の方法。
  18. 前記標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載の方法。
  19. 前記標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１記載の方法。
  20. 前記サンプルが１本鎖の標的ポリヌクレオチドを含む、請求項１記載の方法。
  21. 前記サンプルが２本鎖の標的ポリヌクレオチドを含む、請求項１記載の方法。
  22. 前記標的ポリヌクレオチドが増幅反応により提供される、請求項１記載の方法。
  23. １本鎖でかつ標的ポリヌクレオチドに対して相補的なセンサ・ペプチド核酸（ＰＮＡ）であって、シグナル伝達発色団に付加されている該センサＰＮＡ、
    前記標的ポリヌクレオチドのリン酸骨格と静電気的に相互作用することが可能であり、かつ前記センサＰＮＡの前記標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを介してシグナル伝達発色団に接近した場合に励起されるとエネルギーを該シグナル伝達発色団へ移動することができるポリカチオン多発色団、
    を含むポリヌクレオチド検出溶液。
  24. １本鎖でかつ標的ポリヌクレオチドに対して相補的なセンサ・ペプチド核酸（ＰＮＡ）であって、シグナル伝達発色団と共役している該センサＰＮＡ、及び
    前記標的ポリヌクレオチドのリン酸骨格と静電気的に相互作用することが可能であり、かつ前記センサＰＮＡの前記標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを介してシグナル伝達発色団に接近した場合に励起されるとエネルギーを該シグナル伝達発色団へ移動することができるポリカチオン多発色団、
    を含む、サンプルを標的ポリヌクレオチドについてアッセイするためのキット。
  25. 前記シグナル伝達発色団から放出された閾値を上回る光が、前記サンプル中に前記標的ポリヌクレオチドが存在することを示唆する、請求項１記載の方法。
  26. 前記シグナル伝達発色団から放出された光の量を定量し、これを利用して前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドの量を決定する、請求項１記載の方法。
  27. 前記蛍光団が緑色蛍光タンパク質である、請求項１２記載の方法。
  28. 前記標的ポリヌクレオチドを増幅しない、請求項１記載の方法。
  29. 基板上で実施する、請求項１記載の方法。
  30. 前記基板が複数の異なるセンサＰＮＡと共役している、請求項２９記載の方法。
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