CN102300861B - 包含磺酰胺基团的呫吨染料 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及荧光染料。本发明提供各种荧光染料和含有这些染料的试剂盒，其适用于标记各种生物分子、细胞和微生物。本发明还提供利用所述荧光染料进行研究和开发、法医鉴定、环境研究、疾病诊断、预后和/或治疗的各种方法。

Description

包含磺酰胺基团的呫吨染料
交叉参考
本申请要求2009年2月3日提交的美国临时申请系列号61/149,603的权益，该申请通过引用全文纳入本文。
发明背景
荧光染料广泛用于生物学研究和医学诊断。荧光染料优于常规的放射性材料，因为荧光染料通常具有足够的检测灵敏度、廉价且低毒。具体地说，具有可区分颜色范围的各种荧光团使得能平行检测多种生物学靶标的多重试验更加实际。在体外和体内描述不同生物学靶标之间在空间和时间上的关系常要求能平行显现多个靶标。此外，产生大量荧光染料为进行高通量和自动化试验打开了新的通道，因而极大降低了每次试验的单位成本。此外，荧光染料的低毒性便于体外操控，还能更安全地进行生物学活性的体内成像。
虽然荧光染料有各种优点，但常规染料有许多深远的局限性。例如，常规荧光染料通常易发生染料间淬灭，已知该现象能减弱染料的亮度。常将给定靶标偶联于多个染料分子以便最大程度提高标记靶标，例如生物分子，如蛋白质或DNA的亮度。对于许多常规荧光染料，标记靶标的荧光强度常不与所连接染料分子数成正比，由于，例如靶标所连多个染料之间的淬灭而弱于预计的强度。此类淬灭效应部分是因为所连染料分子之间的物理相互作用可能形成无荧光的染料二聚体。疏水相互作用可驱动二聚体形成。由于许多传统荧光染料，例如各种罗丹明染料和花青染料是高度疏水性芳族化合物，这些常用的染料尤其易在标记的生物分子上形成二聚体。将磺酸基团加入染料显示能减少二聚体形成。参见，例如美国专利号5,268,486、6,977,305、6,130,101和Panchuk-Voloshina等，J.Histochem.Cytochem.47(9)，1179(1999)。然而，虽然磺化可减少二聚体形成，但也在生物分子中引入负电荷，因此可能增加破坏标记生物分子的生物学活性的风险。
磺化染料(例如，AF488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546和Alexa Fluor568)可用于抗体标记或标记其它大分子，其中多个染料分子通常很接近。在一些情况中，如果背景荧光信号的降低依赖于染料之间的相互作用，染料的电荷可影响标记生物分子的活性。在一些情况中，标记的抗体可在某些细胞染色中产生高背景。为降低背景，可能需要利用带负电的聚合物以用作阻断剂(美国专利申请2008/0038772)。
为最大程度提高荧光信号，需要在其最大吸收(波长)或附近激发荧光染料。现有激发光源的波长有限。例如，荧光显微镜、流式细胞术、PCR仪器、DNA测序仪器和其它荧光生物医学仪器通常利用488nm氩激光。许多常规染料光稳定性差，在强激光下发生快速光漂白，当要长时间追踪荧光信号时，已知该现象减弱染料的有效亮度。对于许多常规染料，荧光还对pH改变敏感。
在一些情况中，染料的磺化克服光稳定性低和pH敏感的缺点。磺化还增强水溶性和蓝移，即，染料的吸收波长向接近488nm氩离子激光线(argon ionlaser line)的漂移。然而，多个磺化基团造成染料相对不溶于非极性有机溶剂。在某些情况中，涉及相对非极性底物的标记反应优选非极性有机溶剂。
发明概述
因此，仍极其需要改进的组合物和方法从而能方便和有效地标记各种应用中的大量分子。本发明解决了此类需求并提供额外的优点。
因此，本发明提供可能具有任何或所有以下特征的荧光化合物。在一方面，利用本发明荧光化合物制备的标记生物分子显示二聚体形成明显减少。在其它方面，本发明的化合物和标记生物分子显示其它所需特性，例如水溶性较高、荧光量子产量提高、光稳定性改善、合成相对简单、标记偶联物的特异性改善。
在一些实施方式中，本文提供式I所示化合物：
式中：
X是O、S或-C(CH3)2-；
A是-OR1或-NR1R1a；
B是＝O或＝N+R4R4a；
C是-OR4或-NR4R4a；
R1、R1a、R4和R4a各自独立为H或烷基，其是未取代的或用-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物或用-L-Rx取代；或者一对或多对R1和R1a或R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中的任一个取代；或者R1、R1a、R4或R4a中至少一个是酶底物或保护基团；
R2、R3、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、或反应活性磺酰胺；或者一对或多对R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、或反应活性磺酰胺取代；
R7’是H、OH、CN或C1-C6烷氧基；或者R7’与R7组合形成5-或6-元螺内酯(spirolactone)或螺磺内酯(spirosultone)环；
Rx是反应活性基团；
L是键或(Q)n；
各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、(C＝X’)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd是毗连的，没有两个O毗连；
各X’独立为NRd、S或O；
n是1-20；
各Rd是H、取代或未取代的烷基；
只要该化合物包含至少一个反应活性磺酰胺。
在一些实施方式中，X是O。在其它实施方式中，A是-NR1R1a，B是＝N+R4R4a。在还有其它实施方式中，一对或多对的R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、-L-SO3 -、-L-Rx或反应活性磺酰胺取代。
在式I的一些实施方式中，反应活性磺酰胺部分具有式IIa所示结构：
式中：
R10是H或取代或未取代的C1-C12烷基；或
R10和L与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和的环。
在一些实施方式中，R10是H、磺基丙基或磺基丁基。在其它实施方式中，Rx是异硫氰酸酯、异氰酸酯、一氯三嗪、二氯三嗪、卤素-取代的吡啶、卤素-取代的二嗪、亚磷酰胺、马来酰亚胺、氮丙啶、磺酰卤、酰卤、羟基琥珀酰亚胺酯、羟基磺基琥珀酰亚胺酯、吡咯-2，5-二酮、四氟苯酚酯、亚胺酯、肼、叠氮基硝基苯基、叠氮化物、炔烃、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺、乙二醛或醛。例如，Rx与氨基、巯基或羟基亲核试剂形成共价键。在一些实施方式中，Rx是活化的羧酸酯基团。在其它实施方式中，活化的羧酸酯基团是N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
在其它实施方式中，R2、R3、R5和R9独立选自：H、卤素、-PO3 2-、-SO3 -或无反应活性磺酰胺、或
在一些实施方式中，R7是H、取代或未取代的烷基或取代或未取代的芳基。在一些实施方式中，R7是被-CO2 -、羧酰胺、-SO3 -、氯、氟或Rx取代的苯基。
在一些实施方式中，本发明化合物具有式IIIa所示结构：
式中：
R3是H、-SO3 -、或无反应活性的磺酰胺；
R11是-CO2 -或-SO3 -；和
R11a是H、-SO3 -或无反应活性的磺酰胺。
在一些实施方式中，R3是H或-SO3 -；和L是Qn，其中至少4个Q是-(CH2CH2O)-。
在一些实施方式中，本发明化合物的最大荧光激发波长是约488nm。
在一些实施方式中，本发明化合物具有式IV所示结构：
式中：
R3是H、-SO3 -、或无反应活性的磺酰胺；
R10是H、磺基丙基或磺基丁基；
R11是-CO2 -或-SO3 -；
R11a是H、-SO3 -、或无反应活性磺酰胺；和
R12、R13、R14、R15、R16和R17各自独立为H或甲基。
在本发明化合物的一些实施方式中，该化合物的最大荧光激发波长是约514nm。
在其它实施方式中，本发明化合物具有式V所示结构：
式中：
R3是H、-SO3 -、或无反应活性的磺酰胺；
R10是H、磺基丙基或磺基丁基；
R11是-CO2 -或-SO3 -；
R11a是H、-SO3 -、或无反应活性磺酰胺；
R12、R13、R14、R15、R16和R17各自独立为H或甲基，和
在本发明化合物的一些实施方式中，该化合物的最大荧光激发波长是约532nm。
在其它实施方式中，本发明化合物具有式VI所示结构：
式中：
R11和R11a各自独立为H、-SO3 -、或无反应活性磺酰胺；
R10是H、磺基丙基或磺基丁基；
L是键或Qn；其中至少1个Q是-(CH2CH2O)-；和
Rx是反应活性基团。
在一些实施方式中，所述化合物的最大荧光激发波长是约633nm。
本发明还提供式VII所示化合物：
式中：
Z是金属螯合剂；
X是O、S、或-C(CH3)2-；
A是-OR1或-NR1R1a；
B是＝O或＝N+R4R4a；
C是-OR4或-NR4R4a；
R1、R1a、R4和R4a各自独立为H或烷基，其是未取代的或被-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物、或被-L-Rx取代；或者一对或多对R1和R1a或R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和的环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中任一个取代；或者R1、R1a、R4、或R4a中至少一个是酶底物或保护基团；
R3、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺或中性或带正电荷无反应活性磺酰胺；或者一对或多对的R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺或中性或带正电荷无反应活性磺酰胺取代；
Rx是反应活性基团；
L是键或(Q)n；
各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、(C＝X’)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd毗连，没有两个O毗连；
各X’独立为NRd、S或O；
n是1-20；和
各Rd是H、取代或未取代的烷基。
在一些实施方式中，Z是选自以下的靶离子的螯合剂：Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Na+、K+、Hg2+、Pb2+、Cd2+和As3+。在一个实施方式中，Z是基于BAPTA的Ca2+螯合剂。
还提供检测或定量测定金属离子存在与否的方法，包括：
a.将样品与式VII所示化合物温育：
式中：
Z是金属螯合剂；
X是O、S或-C(CH3)2-；
A是-OR1或-NR1R1a；
B是＝O或＝N+R4R4a；
C是-OR4或-NR4R4a；
R1、R1a、R4和R4a各自独立为H或烷基，其是未取代的或被-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物、或被-L-Rx取代；或者一对或多对R1和R1a或R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和的环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中任一个取代；或者R1、R1a、R4或R4a中至少一个是酶底物或保护基团；
R3、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺或中性或带正电荷的无反应活性磺酰胺；或者一对或多对R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，所述环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺或中性或带正电荷的无反应活性磺酰胺取代；
Rx是反应活性基团；
L是键或(Q)n；
各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、(C＝X’)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd毗连，没有两个O毗连；
各X’独立为NRd、S或O；
n是1-20；和
各Rd是H、取代或未取代的烷基；和
b.测定所述化合物的荧光或光学特性改变，藉此确定所述金属离子的存在或量。
在一些实施方式中，所述改变是所述化合物的吸收或发射的增加或降低。或者，所述改变是该化合物的最大吸收或最大发射波长的漂移。
本发明还提供式Ia或Ib所示化合物；
式中：
X是O、S或-C(CH3)2-；
A是-OR1或-NR1R1a；
B是＝O或＝N+R4R4a；
C是-OR4或-NR4R4a；
R1、R1a、R4和R4a各自独立为H或烷基，其是未取代的或用-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物或用-L-Rx取代；或者一对或多对R1和R1a或R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中的任一个取代；或者R1、R1a、R4或R4a中至少一个是酶底物或保护基团；
R2、R3、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺、或中性或带正电荷的无反应活性磺酰胺；或者一对或多对R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、或反应活性磺酰胺、或中性或带正电荷的无反应活性磺酰胺取代；
R7’是H、OH、CN或C1-C6烷氧基；或者R7’与R7组合形成5-或6-元螺内酯或螺磺内酯环；
Rx是反应活性基团；
L是键或(Q)n；
各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、(C＝X’)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd是毗连的，没有两个O毗连；
各X’独立为NRd、S或O；
n是1-20；
各Rd是H、取代或未取代的烷基；
只要该化合物包含至少一个中性或带正电荷的无反应活性磺酰胺。
在一个实施方式中，无反应活性磺酰胺的分子量小于约350。在另一实施方式中，所述无反应活性磺酰胺部分具有式IIb所示结构：
式IIb
式中Rm和Rn各自独立为H、烷基或杂烷基；其中无反应活性磺酰胺部分不带电荷或携带正电荷。
在一些实施方式中，Rm和Rn各自独立为H或C1-C12烷基。在其它实施方式中，本发明的化合物具有式IIIb所示结构：
式中：
R3是-SO3 -；
Rm和Rn各自独立为H、烷基或杂烷基；
R11是-CO2 -或-SO3 -；和
R11a是H、-CO2-、-SO3 -或-L-Rx。
本文还提供制备标记生物分子的方法，包括将生物分子与具有式VIIIa或VIIIb所示结构的化合物反应：
式中：
X是O、S或-C(CH3)2-；
A是-OR1或-NR1R1a；
B是＝O或＝N+R4R4a；
C是-OR4或-NR4R4a；
R1、R1a、R4和R4a各自独立为H或烷基，其是未取代的或用-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物或用-L-Rx取代；或者一对或多对R1和R1a或R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中的任一个取代；或者R1、R1a、R4或R4a中至少一个是酶底物或保护基团；
R2、R3、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺或无反应活性磺酰胺；或者一对或多对R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺或无反应活性磺酰胺取代；
R7’是H、OH、CN或C1-C6烷氧基；或者R7’与R7组合形成5-或6-元螺内酯或螺磺内酯环；
Rx是反应活性基团；
L是键或(Q)n；
各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、(C＝X’)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd是毗连的，没有两个O毗连；
各X’独立为NRd、S或O；
n是1-20；
各Rd是H、取代或未取代的烷基；
只要该化合物包含至少一个反应活性基团。
本文还提供试剂盒，其装有：
i)本文提供的任一结构式所示的化合物；ii)缓冲液；iii)纯化偶联产物的材料或装置；和iv)指导化合物使用的使用说明书。
本文提供包含标记物的生物分子，所述标记物具有本发明化合物的结构，其中所述化合物的至少一个反应活性部分经历将所述标记物连接于所述生物分子的反应。
在一些实施方式中，所述生物分子包含多核苷酸。在一些实施方式中，所述生物分子包含多肽。在一些实施方式中，所述多肽还包含抗原结合位点。在一些实施方式中，所述多肽是完整的免疫球蛋白。在一些实施方式中，所述多肽是Fab片段。
包含具有本发明(化合物)结构的标记物的免疫球蛋白，其中所述化合物的至少一个反应活性部分经历将所述标记物连接于所述免疫球蛋白的反应，其中所述免疫球蛋白是特异性结合癌细胞上抗原的抗体。
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白是结合erb2的抗体。
在一些实施方式中，标记生物分子的方法包括将包含反应活性基团的本发明化合物与底物生物分子在足以实现该化合物与底物生物分子之间交联的条件下反应。在一些实施方式中，所述底物生物分子是蛋白质、多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质、金属螯合剂或它们的组合。在一些实施方式中，所述底物生物分子是多核苷酸。
本文提供标记细胞群内某细胞的方法，藉此该细胞相对于该群内的邻近细胞作差异性标记，该方法包括将该细胞与标记的生物分子接触，其中所述生物分子包含与结合伴侣相结合的靶向部分，而所述结合伴侣指示该细胞，藉此相对于该群内的邻近细胞差异性标记该细胞。
在一些实施方式中，所述方法还包括使该细胞成像的步骤，所述成像步骤包括：
i)将激发波长引向该细胞；和
ii)检测该细胞发射的荧光。
在一些实施方式中，标记在体外进行。在一些实施方式中，标记在体内进行。
本文提供用本发明荧光化合物标记的免疫球蛋白，所述化合物包含最大吸收波长约488nm的荧光团。
本文提供用本发明荧光化合物标记的免疫球蛋白，所述化合物包含最大吸收波长约514nm的荧光团。
本文提供用本发明荧光化合物标记的免疫球蛋白，所述化合物包含最大吸收波长约532nm的荧光团。
本文提供用本发明荧光化合物标记的免疫球蛋白，所述化合物包含最大吸收波长约633nm的荧光团。
在一些实施方式中，免疫球蛋白在偶联于荧光化合物后保留与靶标的结合特异性。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白是特异性结合癌细胞上抗原的抗体。在一些实施方式中，所述抗体结合erb2。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白包含式I所示荧光化合物。
本文提供标记多肽的方法，包括：形成包含所述多肽与结合剂的复合物，其中所述结合剂包含含有反应活性部分的本发明荧光标记物，其中所述荧光标记物的至少一个反应活性部分经历将所述标记物连接于所述结合剂的反应。
在一些实施方式中，所述结合剂是抗体。
在该方法的一些实施方式中，所述复合体包含(a)结合所述多肽的一抗，和(b)用作二抗的结合剂，所述二抗表现出与所述一抗的结合能力。
在一些实施方式中，标记在固体基材上发生。
在一些实施方式中，所述复合体产生的信噪比大于约100，其中所述信噪比由下式计算：
(复合体的荧光信号，其中所述复合体包含的多肽与一抗结合，进而与结合剂结合)/(多肽、同种型对照一抗和结合剂的混合物的荧光信号)。
在一些实施方式中，所述复合体产生的信噪比大于约250，其中所述信噪比由下式计算：
(复合体的荧光信号，其中所述复合体包含的多肽与一抗结合，进而与结合剂结合)/(多肽、同种型对照一抗和结合剂的混合物的荧光信号)。
在一些实施方式中，所述复合体产生的信噪比大于约270，其中所述信噪比由下式计算：
(复合体的荧光信号，其中所述复合体包含的多肽与一抗结合，进而与结合剂结合)/(多肽、同种型对照一抗和结合剂的混合物的荧光信号)。
通过引用纳入
与各份出版物或专利申请专门和单独表明通过引用纳入本文的程度一样，本说明书中提到的所有出版物和专利申请通过引用纳入本文。
附图简述
所附权利要求中具体说明了本发明的新颖特征。参考以下详述和附图可更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出了采用本发明原理的说明性实施方式，附图中：
图1是显示偶联于山羊抗小鼠IgG的4c号化合物(5.3DOL)在PBS中(实施例26)的吸收和发射光谱的示意图。吸收光谱显示仅有单峰，表明缺乏染料聚集。此外，吸收峰波长极其接近488nm氩离子激光线。
图2显示在水性缓冲液中，相同蛋白质浓度下，以488nm激发时4c号化合物(实施例6)、Alexa Fluor 488和DyLight 488的山羊抗-家兔IgG偶联物的总荧光与标记程度(DOL)。数据显示本发明的荧光基团在宽标记范围上具有优秀的荧光量子产率。参见实施例26。
图3A是显示用各种荧光标记抗体染色的Jurkat细胞的相对荧光水平的流式细胞术图谱。首先用小鼠抗人CD3抗体标记细胞，然后用所示标记程度(DOL)的4c号化合物(实施例6)、Alexa Fluor 488或DyLight 488标记的山羊抗小鼠IgG染色(淡灰色柱)。为检测各标记二抗的背景荧光，还利用同种型一抗替代CD3抗体进行染色实验(黑色柱)。结果显示用本发明的抗体偶联物染色的细胞具有优秀的信号。图3B显示图3A染色的信噪比。即便在非常高的DOL下，本发明的染料亦显示优秀的信噪比。参见实施例31。
图4显示在显微照射下比较4c号化合物(实施例6)和FITC在细胞染色中的光稳定性。参见实施例32。
图5显示利用α-微管蛋白一抗和4c号化合物标记(DOL～4.8)的二抗染色细胞微管。参见实施例33。
发明详述
虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然明白提供此类实施方式仅是示例性的。本领域技术人员能想到各种变化、改变和替代方式而不脱离本发明。应该理解可采用本文所述本发明实施方式的各种备选方案实施本发明。以下权利要求应限定本发明的范围，从而涵盖这些权利要求及其等价方式范围内的诸方法和结构。
本发明公开了包含至少一个反应活性磺酰胺基团的荧光化合物。此类化合物可具有所需特性，例如分子内迁移率受限、荧光量子产率升高、聚集降低、在，例如非极性有机溶剂中的溶解度升高，淬灭减少和体内及体外稳定性增加。可利用这些化合物标记分子和生物分子，例如多肽、多核苷酸和/或金属螯合剂，这些化合物适用于各种领域，包括诊断和成像系统。
本发明的荧光化合物和标记分子可显示聚集降低。染料聚集常是荧光淬灭的主要原因。在本发明中，防止聚集可不用过量带负电荷的磺酸基团来实现。如此反而有助于标记生物分子，例如蛋白质，因为标记的蛋白质具有的等电点与底物蛋白质的相当，藉此可更好地维持其生物学特异性。利用磺酰胺基团有助于减少染料上的负电荷。因此，本发明的标记蛋白质，例如标记抗体在细胞染色中可具有更好的信噪比。
在一些方面，本文公开的化合物的荧光团上存在磺酰胺部分还有助于增加染料在非极性有机溶剂中的溶解度。非极性溶剂中的溶解度增加能标记相对非极性的底物。本文公开的染料还可增加荧光基团的荧光量子产率。在一些方面，存在磺酰胺部分使荧光染料的激发或吸收波长向共同激光线(common laserline)的波长或接近该波长漂移(例如，488nm、514nm、532nm和633nm)，从而导致更有效的荧光激发。此外，本发明化合物和标记分子可显示较高的光稳定性和耐受荧光基团的漂白。
定义
本发明化合物可具有不对称中心、手性轴和手性面(如E.L.Eliel和S.H.Wilen，《碳化合物的立体化学》(Stereo-chemistry of Carbon Compounds)，约翰韦利父子公司(John Wiley & Sons)，纽约，1994，第1119-1190页所述)，其可以是外消旋物、外消旋混合物和单个非对映体，其中本发明包括所有可能的异构体及其混合物，包括光学异构体。此外，本文公开的化合物可存在互变异构体，两种互变异构形式均应包括在本发明的范围内，即使仅描述了一种互变异构结构。
当任何组成中任何变量(例如，Rx、L、Q)出现多于一次时，其每次出现的定义不依赖于其它各情况。取代基和变量可以组合，前提是此类组合产生稳定的化合物。从取代基到环体系内的线表明所示的键可以连接于任何可取代的环碳原子。如果该环体系为多元环，该键应仅连接于最接近环的任一合适碳原子。经由某取代基取代环通常使得该取代基成为与该环稠合的环状结构。
应该知道本领域普通技术人员能选择本发明化合物上的取代基和取代模式以提供便于通过本领域已知技术以及下文所示那些方法从易得起始材料合成的化学稳定化合物。如果取代基本身被多个基团取代，应该知道这些多个基团可以在同一碳上或在不同碳上，只要产生稳定的结构。短语“用一个或多个取代基任选取代”应理解为等同于短语“用至少一个取代基任选取代”，可包括2、3、4、5或更多个取代基。
本文所用的″烷基″应包括支链、直链和环状的饱和脂族烃基团。烷基特别包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等等，以及环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、四氢萘、亚甲基环己基等等。例如，指定为C1-C20的烷基链可具有1到20个碳原子。″烷氧基″表示通过氧桥连接的烷基。
术语″烯基″指直链、支链或环状非芳族烃基，含有至少一个碳-碳双键。烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基和环己烯基。例如，指定为C2-C20的烯基链可具有2到20个碳原子。烯基的直链、支链或环状部分可含有双键，可以是取代的，如果标明为取代的烯基的话。
术语″炔基″指直链、支链或环状非芳族烃基，含有至少一个碳-碳三键。炔基包括但不限于乙炔基、丙炔基和丁炔基。例如，指定为C2-C20的炔基链可具有2到20个碳原子。炔基的直链、支链或环状部分可含有三键，可以是取代的，如果标明为取代的炔基的话。
本文所用的“芳基”应表示各环中最多7个原子的任何稳定的单环或多环碳环，其中至少一个环是芳族的。此类芳基元素的例子包括苯基、萘基、四氢萘基、2，3-二氢化茚基、联苯基、菲基、蒽基或苊基(acenaphthyl)。例如，芳基可以是6-碳单环或10-碳双环芳族环体系，其中各环的0、1、2、3或4个原子可以被取代基取代。在芳基取代基是双环，一个环是非芳族的情况中，应该知道连接是经由芳族环。
本文所用的术语“杂芳基”应表示各环中最多7个原子的稳定的单环或双环，其中至少一个环是芳族的并含有1-4个选自O、N或S的杂原子。该定义范围内的杂芳基包括但不限于咪唑基、苯并咪唑基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、唑基、异唑基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氢喹啉、呫吨基和香豆酰基(coumarinyl)。在杂芳基取代基是双环和一个环是非芳族或不含杂原子的情况下，应该知道连接分别经由芳族环或经由含杂原子的环。
本文所用的术语“杂环”或“杂环基”应表示含有至少一个杂原子的5-到10-元芳族或非芳族杂环，所述杂原子是O、N或S。该定义包括双环基团。因此，“杂环基”包括以上提到的杂芳基及其二氢和四氢类似物。“杂环基”的其它例子包括但不限于：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基(benzofurazanyl)、苯并吡唑基、苯并三唑基，苯并苯硫基、苯并唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、吲哚并吖嗪基(indolazinyl)，吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异唑基、萘并吡啶基(naphthpyridinyl)、二唑基、唑基、唑啉、异唑啉、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基(pyridopyridinyl)、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四唑吡喃基、四唑基、四氢吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、氮杂环丙烷基、1，4-二烷基、六氢氮杂基(hexahydroazepinyl)、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并苯硫基、二氢苯并唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异唑基、二氢异噻唑基、二氢二唑基，二氢唑基，二氢吡嗪基、二氢吡唑基，二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲基二氧代苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基。
除非另有专门定义，烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基取代基可以是取代或未取代的。例如，烷基可以用选自以下的一个或多个取代基取代：OH、氧代、卤代、烷氧基、二烷基氨基、-PO3 -、-SO3 2-、-CO2 -、反应活性基团或杂环基，例如吗啉基或哌啶基。
术语“卤代”或“卤素”应包括氯、氟、溴和碘基团。
术语“芳族”以其通常意义使用，包括跨越多个键的基本上不定域的不饱和性，例如围绕环。
术语“取代基”指替代被取代化学基团、基团、分子、部分或化合物中的氢的原子、基团或化学基团。在一些情况中，“取代基”可以指替代氮上孤对电子的原子、基团或化学基团。在此类情况中，取代基还可称为季铵化基团或季铵化取代基。
除非另有表述，应用于任何分子或化合物的术语“基团”指分子或化合物的部分、片段或基团，而非“自由基”。基团可通过共价键连接于另一部分。
术语“反应活性基团”指能与基材或底物分子上的反应伴侣反应以形成共价键的化学部分。可利用本发明化合物标记各种含有合适反应伴侣或经衍生含有合适反应伴侣的分子或底物。“反应活性基团”和“反应伴侣”可指本发明化合物上的基团或待标记分子上的基团。在本文中，为方便起见(但不限于)，化合物上的成键基团通常称为反应活性基团，底物分子上的成键基团通常称为反应伴侣。本文件中“反应底物”、“底物”和“反应伴侣”通篇可互换使用。
术语“反应活性磺酰胺基团”指通过键或连接部分连接于反应活性基团的任何磺酰胺基团。
术语“无反应活性磺酰胺基团”指未连接于反应活性基团的任何磺酰胺基团。
连接部分(例如，Q)可以是将两个部分，例如荧光团、磺酰胺基团和/或反应活性基团彼此连接或连接于本发明化合物所包含的任何其它基团的任何基团。可合成性和合成方便程度通常决定了各连接部分的性质。在一些实施方式中，连接部分是含有约1-100个原子的基团，由选择的一个或多个化学键组成，从而该基团是稳定的部分。在其它实施方式中，连接部分由一个或多个以下键形成：碳-氢、碳-氮、碳-氧、碳-硫、碳-磷、氮-氢、硫-氢、磷-氢、硫-氧、硫-氮、硫-磷、磷-氧、磷-氮和氧-氮键，其中此类键可以是所选的单键、双键、三键、芳族键和杂芳族键，从而连接部分是稳定的。连接部分可以是，例如二价烷基。或者，连接部分可以是含有额外醚、胺、酰胺、酯、磺酰基、硫醚、羧酰胺、磺酰胺、酰肼或吗啉子基的烷基、芳基和杂芳基。
连接部分通常由约1-100个原子构成。在一些实施方式中，连接部分由1-50个非氢原子以及额外的氢原子构成。此类原子可以是，例如C、N、O、P或S。在其它实施方式中，含有两个基团的连接部分在基团之间包含1-50个连续的键。一些连接部分可具有1-40、1-30、1-20、1-10、1-5、5-25、或5-20个此类连续的键。
非限制性示范性连接部分如下所示：
在上图中，n表示大量重复的亚甲基单元，n可变从而能提供所需长度的接头。n通常是1-约50。一些接头的n为1到40、1到30、1到20、1到10、1到5、5到30、5到20或5到15。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”、“探针”和“寡核苷酸”可互换使用。它们指任何长度的聚合形式的核苷酸，即，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，可执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的编码或非编码区、连接分析测定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装前或后修饰核苷酸结构。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。可在聚合后进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分偶联。还可利用“多核苷酸”指肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、苏呋喃糖基核酸(threofuranosyl nucleic acid)(TNA)和其它非天然核酸或核酸模拟物。该定义包括本领域已知的其它碱基和主链修饰。参见，例如DeMesmaeker等(1997)Pure & Appl.Chem.，69，3，第437-440页。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线形、环状或支链的，其可包含修饰的氨基酸，其可被非氨基酸中断。这些术语还包括经修饰的氨基酸聚合物，例如通过磺化、糖基化、脂化、酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、转运RNA介导氨基酸加入蛋白质，例如精氨酰化，泛素化、或任何其它操作，例如与标记组分偶联。本文所用的术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，和氨基酸类似物及肽模拟物。
本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即，含有特异性结合抗原(“与之免疫反应”)的抗原结合位点的分子。在结构上，最简单的天然产生抗体(例如，IgG)包含二硫键相互连接的4条多肽链，两条重链(H)和两条轻链(L)。免疫球蛋白表示包括几类分子，例如IgD、IgG、IgA、IgM和IgE的分子大家族。术语“免疫球蛋白分子”包括，例如杂交抗体或改变的抗体及其片段。现已证明天然产生抗体的片段可执行抗体的抗原结合功能。这些片段统称为“抗原结合单位”。根据分子结构可将抗原结合单位大致分为“单链”(″Sc″)和“非单链”(″Nsc″)型。
术语“抗体”还包括各种物种来源，包括无脊椎动物和脊椎动物的免疫球蛋白分子。应用于抗体或抗原结合单位的术语“人”指人基因表达的免疫球蛋白分子或其片段。应用于非人(例如，啮齿类或灵长类)抗体的术语“人源化”是含有衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的杂交免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和性能的非人物种(供者抗体)，例如小鼠、大鼠、家兔或灵长类的CDR的残基替代。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含既未在受者抗体，又未在输入CDR或框架序列中发现的残基。作这些修饰以进一步精制和优化抗体性能并最大程度降低引入人体时的免疫原性。人源化抗体通常包含基本上所有、至少一个、通常两个可变区，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
术语“稳定”指具有足够化学稳定性的组合物和化合物，其能从反应混合物中分离至有用的纯度以便用于所需应用。
术语“荧光基团”、“荧光团”、“染料”或“荧光基团”可互换地指荧光性的分子或基团。应用于化合物的分子的术语“荧光”用于指化合物能一定时间内吸收能量(例如，紫外、可见或IR射线)并将该能量的至少一部分作为光重新发出的特性。荧光基团、化合物或荧光团包括但不限于：离散的化合物、分子、蛋白质和大分子复合物。荧光团还包括显示长寿命荧光衰减的化合物，例如镧系离子和含有机配体增敏剂的镧系复合物。
本文所用的“对象”指含有表达的遗传材料的生物学实体。在各种实施方式中，所述生物学实体是脊椎动物。在一些实施方式中，所述生物学实体是哺乳动物。在其它实施方式中，所述对象是包括人在内的生物学实体。
“对照”是为比较目的而用于实验中的其它对象或样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，如果实验的目的是检测受所关注疾病影响的细胞或组织中差异表达的转录物或多肽，通常优选利用阳性对照(表现出此类差异表达和该疾病的特征性症状的对象或对象的样品)和阴性对照(缺乏差异表达和该疾病的临床症状的对象或对象的样品)。
术语“FRET”指荧光共振能量转移。在本发明中，FRET指至少两个荧光化合物之间，荧光化合物和非荧光组分之间，或荧光组分和非荧光组分之间的能量转移过程。
“结合剂”是对其所结合的结合伴侣或靶分子显示结合选择性的分子。结合剂可以是生物分子，例如多肽，如抗体或蛋白质、基于多肽的毒素、氨基酸、核苷酸、多核苷酸，包括DNA和RNA，脂质、和碳水化合物或它们的组合。结合剂还可以是半抗原、药物、离子络合剂，例如金属螯合剂、微粒、合成或天然聚合物、细胞、病毒或其它荧光分子，包括本发明的染料分子。
“靶向部分”是结合剂中与结合伴侣结合的部分。靶向部分可以是但不限于多核苷酸内选择性结合另一多核苷酸或多肽的核苷酸序列。靶向部分的另一非限制性例子可以是较大多肽序列中特异性结合多核苷酸序列或第二多肽序列的多肽序列。靶向部分可以是小分子或结构基序，其结合蛋白质受体，另一小分子基序或络合剂，但不限于此。选择性结合可以是特异性结合事件。
“结合伴侣”是靶向部分所结合的分子或颗粒。其可以是细胞、病毒、细胞的片段、抗体、抗体的片段、肽、蛋白质、多核苷酸序列、抗原、小分子或它们的组合。结合剂可以选择性或特异性结合它。
就多肽-抗体复合物而言，本文的术语荧光“信噪比”指(复合体的荧光信号，其中所述复合体包含的多肽与一抗结合，进而与本发明化合物标记的结合剂结合)/(多肽、同种型对照一抗和标记结合剂的混合物的荧光信号)之比。
“标记程度”或“DOL”指每个靶分子(包括但不限于多肽和多核苷酸)连接的染料分子数量。例如，每个多肽，例如抗体一个染料分子表示标记程度(DOL)为1.0。如果平均多于一个染料分子与多肽，例如多肽，如抗体反应并与之交联，标记程度大于1，还可以是除整数以外的数值。DOL的数值越高，标记程度越高。
本文所用的“胞内”指给定分子存在于细胞中。胞内分子可存在于细胞的胞质中，连接于细胞膜，细胞器上，或在细胞器内。
用于反应表面的“基材”或“固体基材”指检验某些相互作用的材料。例如，就此而言，基材可以是阵列表面或微孔表面。还可以是固体，例如不形成具体形状但在其表面有连接点的聚合物。在一些情况中，“基材”可指酶底物，其是酶能化学转化的分子或生物分子。
术语“最大激发波长”和“最大荧光激发波长”在本文可互换使用。这些术语指荧光化合物发出最强荧光的波长。应用于染料的术语“最大吸收波长”指荧光染料或非荧光染料具有最大吸收的波长。荧光染料具有“最大荧光发射波长”，其是染料发出最强荧光的波长。当提到任何染料的一种波长时，根据该术语的语境，其指激发、吸收或发射的最大波长，例如，吸收波长指化合物具有最大吸收的波长，发射波长指染料发出最强荧光的波长。
本发明的化合物
在一些实施方式中，本文提供式Ia和Ib所示化合物：
式中：
X是O、S或-C(CH3)2-；
A是-OR1或-NR1R1a；
B是＝O或＝N+R4R4a；
C是-OR4或-NR4R4a；
R1、R1a、R4和R4a各自独立为H或烷基，其是未取代的或用-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物或用-L-Rx取代；或者一对或多对R1和R1a或R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中的任一个取代；或者R1、R1a、R4或R4a中至少一个是酶底物或保护基团；
R2、R3、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、或反应活性磺酰胺；或者一对或多对R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、或反应活性磺酰胺取代；
R7’是H、OH、CN或C1-C6烷氧基；或者R7’与R7组合形成5-或6-元螺内酯或螺磺内酯环；
Rx是反应活性基团；
L是键或(Q)n；
各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、(C＝X’)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd是毗连的，没有两个O毗连；
各X’独立为NRd、S或O；
n是1-20；
各Rd是H、取代或未取代的烷基；
只要该化合物包含至少一个反应活性磺酰胺。
在一些实施方式中，X是O。在其它实施方式中，A是-NR1R1a，B是＝N+R4R4a。在还有其它实施方式中，一对或多对的R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、-L-SO3 -、-L-Rx或反应活性磺酰胺取代。
在式Ia或Ib的一些实施方式中，反应活性磺酰胺部分具有式IIa所示结构：
式中：
R10是H或取代或未取代的C1-C12烷基；或
R10和L与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和的环。
在一些实施方式中，R10是H、磺基丙基或磺基丁基。在其它实施方式中，Rx是异硫氰酸酯、异氰酸酯、一氯三嗪、二氯三嗪、卤素-取代的吡啶、卤素-取代的二嗪、亚磷酰胺、马来酰亚胺、氮丙啶、磺酰卤、酰卤、羟基琥珀酰亚胺酯、羟基磺基琥珀酰亚胺酯、吡咯-2，5-二酮、四氟苯酚酯、亚胺酯、肼、叠氮基硝基苯基、叠氮化物、炔烃、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺、乙二醛或醛。例如，Rx与氨基、巯基或羟基亲核试剂形成共价键。在一些实施方式中，Rx是活化的羧酸酯基团。在其它实施方式中，活化的羧酸酯基团是N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
在其它实施方式中，R2、R3、R5和R9独立选自：H、卤素、-PO3 2-、-SO3 -或无反应活性磺酰胺、或
在一些实施方式中，R7是H、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的芳基。在一些实施方式中，R7是被-CO2 -、羧酰胺、-SO3 -、氯、氟或Rx取代的苯基。
在一些实施方式中，本发明化合物具有式IIIa所示结构：
式中：
R3是H、-SO3 -、或无反应活性的磺酰胺；
R11是-CO2 -或-SO3 -；和
R11a是H、-SO3 -或无反应活性的磺酰胺。
在一些实施方式中，本发明化合物具有式IV所示结构：
式中：
R3是H、-SO3 -、或无反应活性的磺酰胺；
R10是H、磺基丙基或磺基丁基；
R11是-CO2 -或-SO3 -；
R11a是H、-SO3 -、或无反应活性磺酰胺；和
R12、R13、R14、R15、R16和R17各自独立为H或甲基。
在其它实施方式中，本发明化合物具有式V所示结构：
式中：
R3是H、-SO3 -、或无反应活性的磺酰胺；
R10是H、磺基丙基或磺基丁基；
R11是-CO2 -或-SO3 -；
R11a是H、-SO3 -、或无反应活性磺酰胺；
R12、R13、R14、R15、R16和R17各自独立为H或甲基，和
在其它实施方式中，本发明化合物具有式VI所示结构：
式中：
R11和R11a各自独立为H、-SO3 -、或无反应活性磺酰胺；
R10是H、磺基丙基或磺基丁基；
L是键或Qn；其中至少1个Q是-(CH2CH2O)-；和
Rx是反应活性基团。
本发明还提供式Ia或Ib所示化合物；
式中：
X是O、S或-C(CH3)2-；
A是-OR1或-NR1R1a；
B是＝O或＝N+R4R4a；
C是-OR4或-NR4R4a；
R1、R1a、R4和R4a各自独立为H或烷基，其是未取代的或用-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物或用-L-Rx取代；或者一对或多对R1和R1a或R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中的任一个取代；或者R1、R1a、R4或R4a中至少一个是酶底物或保护基团；
R2、R3、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺、或中性或带正电荷的无反应活性磺酰胺；或者一对或多对R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺、或中性或带正电荷的无反应活性磺酰胺取代；
R7’是H、OH、CN或C1-C6烷氧基；或者R7’与R7组合形成5-或6-元螺内酯或螺磺内酯环；
Rx是反应活性基团；
L是键或(Q)n；
各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、(C＝X’)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd是毗连的，没有两个O毗连；
各X’独立为NRd、S或O；
n是1-20；
各Rd是H、取代或未取代的烷基；
只要该化合物包含至少一个中性或带正电荷的无反应活性磺酰胺。
在一个实施方式中，无反应活性磺酰胺的分子量小于约350。在另一实施方式中，所述无反应活性磺酰胺部分具有式IIb所示结构：
式中Rm和Rn各自独立为H、烷基或杂烷基；其中无反应活性磺酰胺部分不带电荷或携带正电荷。
在一些实施方式中，Rm和Rn各自独立为H或C1-C12烷基。在其它实施方式中，本发明的化合物具有式IIIb所示结构：
式中：
R3是-SO3 -；
Rm和Rn各自独立为H、烷基或杂烷基；
R11是-CO2 -或-SO3 -；和
R11a是H、-CO2-、-SO3 -或-L-Rx。
本文还提供制备标记生物分子的方法，包括将生物分子与具有式VIIIa或VIIIb所示结构的化合物反应：
式中：
X是O、S或-C(CH3)2-；
A是-OR1或-NR1R1a；
B是＝O或＝N+R4R4a；
C是-OR4或-NR4R4a；
R1、R1a、R4和R4a各自独立为H或烷基，其是未取代的或用-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物或用-L-Rx取代；或者一对或多对R1和R1a或R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中的任一个取代；或者R1、R1a、R4或R4a中至少一个是酶底物或保护基团；
R2、R3、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺或无反应活性磺酰胺；或者一对或多对R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺或无反应活性磺酰胺取代；
R7’是H、OH、CN或C1-C6烷氧基；或者R7’与R7组合形成5-或6-元螺内酯或螺磺内酯环；
Rx是反应活性基团；
L是键或(Q)n；
各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、(C＝X’)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd是毗连的，没有两个O毗连；
各X’独立为NRd、S或O；
n是1-20；
各Rd是H、取代或未取代的烷基；
只要该化合物包含至少一个反应活性基团。
在本发明化合物的一些实施方式中，X是O。在其它实施方式中，X是S。在还有其它实施方式中，X是-C(CH3)2-。
在本发明化合物的一些实施方式中，A是-OR1。在其它实施方式中，A是-NR1R1a。
R1和R1a包括，例如H和-L-烷基，其是未取代或用-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物或用-L-Rx取代。在一个实施方式中，A是-OH。在另一实施方式中，A是-OR1，R1是(C＝O)C1-C10烷基。
在另一实施方式中，R1和R1a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中任一个取代。
在一个实施方式中，R1和R1a中至少一个是酶底物或保护基团。例如，R1或R1a是作为酶底物的肽。或者，R1或R1a是作为酶底物的碳水化合物。在另一实施方式中，R1或R1a是包含酯连接键的化合物，其是酶底物。
在本发明化合物的一些实施方式中，B是＝O。在其它实施方式中，B是＝N+R4R4a。
R4和R4a包括，例如H和-L-烷基，其是未取代或用-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物或用-L-Rx取代。在一个实施方式中，B是＝NH2 +。在另一实施方式中，R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中任一个取代。例如，R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和的6-元环。
在一些实施方式中，R2、R3、R5、R6、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、烷基、烯基、烷氧基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、-L-SO3 -、或-L-Rx；或者一对或多对R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的饱和或不饱和环，该环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、氨基磺酰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -或-L-Rx。
在一些实施方式中，R1和R9与和它们相连的原子一起形成一个或稠合的环。例如，R1和R9一起形成以下环之一：
在一些实施方式中，R4和R5与和它们相连的原子一起形成一个或稠合的环。例如，R4和R5一起形成以下环之一：
当本发明化合物是式1b所示时，R′7是H或基团R7的取代基，其中R′7与R7及呫吨环中和它们相连的碳原子一起形成5-或6-元螺内酯或螺磺内酯环。
在式VI的一些实施方式中，所述化合物的最大荧光激发波长约633nm。
本发明在其它方面提供试剂盒，其包含：i)本发明的化合物；ii)缓冲液；iii)纯化偶联产物的材料或装置；和iv)指导使用该化合物的使用说明书。
本发明在另一方面提供包含具有本发明结构的标记物的生物分子，所述标记物经历将该标记物连接于该生物分子的反应。在一些实施方式中，所述生物分子包含多核苷酸。在一些实施方式中，所述生物分子包含多肽。在一些实施方式中，所述多肽还包含抗原结合位点。在一些实施方式中，所述多肽是完整的免疫球蛋白。在一些实施方式中，所述多肽是Fab片段。
本发明在另一方面提供包含具有本发明结构的标记物的免疫球蛋白，其中该化合物的至少一个反应活性部分经历将该标记物连接于该免疫球蛋白的反应，其中该免疫球蛋白是特异性结合癌细胞上抗原的抗体。在一些实施方式中，所述抗体结合erb2。
在一些实施方式中，待标记的底物生物分子是多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质或它们的组合。在其它实施方式中，所述底物生物分子是多核苷酸。
本发明在还有另一方面提供标记细胞群内某细胞的方法，藉此该细胞相对于该群内的邻近细胞作差异性标记，该方法包括将该细胞与按照本发明方法标记的生物分子接触，其中所述生物分子包含与结合伴侣相结合的靶向部分，而所述结合伴侣指示该细胞，藉此相对于该群内的邻近细胞差异性标记该细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括使该细胞成像的步骤，所述成像步骤包括：i)将激发波长引向该细胞；和ii)检测该细胞发射的荧光。在一些实施方式中，标记在体外进行。在一些实施方式中，标记在体内进行。
在一些实施方式中，L是键或具有式(Q)n，其中各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、(C＝X’)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd毗连，没有两个O毗连。在此类实施方式中，n是1-20，各Rd是H或取代或未取代的烷基。
在一些情况中，-L-Rx基团的L是聚亚甲基-(CH2)n-，其中n是1到约6。在其它情况中，-L-Rx基团的L可包含水溶性部分，例如聚乙二醇(或PEG)单位，其中乙二醇单位的数量可以是，例如1到约30。更常见的乙二醇单位的数量是1到约24。在一些情况中，-L-Rx基团的L包含8个乙二醇单位的PEG部分。在其它情况中，PEG部分包含12个亚甲基单位。当偶联于聚合物，例如蛋白质或聚核酸(polynucleic acid)时，PEG部分可用于增加染料的水溶性，在一些情况中，可增加染料的荧光强度。
一些但并非全部本发明化合物可包含至少一个反应活性基团Rx。反应活性基团是能与基材或底物分子上的反应伴侣反应以形成共价键的化学部分。本发明化合物可用于标记含有合适反应伴侣或经衍生含有合适反应伴侣的各种分子或底物。“反应活性基团”和“反应伴侣”可指本发明化合物上的基团，或待标记分子上的基团。在本文中，为方便起见(但不限于)，化合物上的成键基团通常称为反应活性基团，底物分子上的成键基团通常称为反应伴侣。
在本文所示任何结构式中，“Rx”可以是赋予本发明化合物所需功能特性的任何反应活性基团。反应活性基团及其反应伴侣可以分别是亲电试剂和亲核试剂，其可用或不用偶联剂或催化剂形成共价键。按照一个实施方式，反应活性基团是在紫外线光活化或光解后能与烃分子反应的光可活化基团。按照另一实施方式，反应活性基团是能通过狄尔斯-阿德耳反应与共轭二烯反应的亲二烯体。按照还有另一实施方式，反应基团是能与亲二烯体反应的1，3-二烯。按照还有另一实施方式，反应活性基团是能与叠氮基官能团反应以形成1，2，3-三唑连接键的炔烃。按照还有另一实施方式，反应活性基团是能通过所谓的施陶丁格(Staudinger)反应与叠氮基官能团反应以形成酰胺连接键的2-(二苯基膦基)苯甲酸甲酯。下表1列出了按照本发明有用的反应基团、官能团和相应的连接键的例子(只是举例)。
表1：反应活性基团、官能团和共价键的例子
  反应活性基团   反应伴侣/底物   得到的共价键
  活化的酯*   胺/苯胺   羧酰胺
  丙烯酰胺   硫醇   硫醚
  酰基叠氮化物**   胺/苯胺   羧酰胺
  酰基卤   胺/苯胺   羧酰胺
  酰基卤   醇/苯酚   酯
  酰基腈   醇/苯酚   酯
  酰基腈   胺/苯胺   羧酰胺
  醛   胺/苯胺   亚胺
  醛或酮   肼   腙
  醛或酮   羟胺   肟
  烷基卤   胺/苯胺   烷基胺
  烷基卤   硫醇   硫醚
  烷基卤   醇/苯酚   酯
  磺酸烷基酯   硫醇   硫醚
  磺酸烷基酯   羧酸   酯
  磺酸烷基酯   醇/苯酚   酯
  酸酐   醇/苯酚   酯
  酸酐   胺/苯胺   羧酰胺
  芳基卤   硫醇   硫代苯酚
  芳基卤   胺   芳基胺
  氮丙啶   硫醇   硫醚
  硼酸盐(boronate)   乙二醇   硼酸酯
  环氧化物   硫醇   硫醚
  卤代乙酰胺   硫醇   硫醚
  卤代三嗪   胺/苯胺   氨基三嗪
  卤代三嗪   醇/苯酚   三嗪基醚
  亚氨酸酯   胺/苯胺   脒
  异氰酸酯   胺/苯胺   脲
  异氰酸酯   醇/苯酚   氨酯(urethane)
  异硫氰酸酯   胺/苯胺   硫脲
  马来酰亚胺   硫醇   硫醚
  亚磷酰胺   醇   亚磷酸酯
  甲硅烷基卤化物   醇   甲硅烷基醚
  磺酸酯   胺/苯胺   烷基胺
  磺酸酯   硫醇   硫醚
  磺酸酯   醇   醚
  磺酰卤   胺/苯胺   磺胺
  磺酰卤   苯酚/醇   磺酸酯
  叠氮化物   炔烃   1，2.3-三唑
  顺铂   鸟苷   铂-鸟苷复合物
*如本领域所知，活化的酯通常如式-COΩ所示，其中Ω是良好的离去基团，例如琥珀酰亚胺氧基(succinimidyloxy)(-OC4H4O2)、磺基琥珀酰亚胺氧基(sulfosuccinimidyloxy)(-OC4H3O2-SO3H)或-1-氧基苯并三唑基(-OC6H4N3)；或用于形成活化的芳酯的芳氧基或用吸电子取代基，例如硝基、氟、氯、氰基、三氟甲基或其组合取代一次或多次的芳氧基；或由碳二亚胺活化的羧酸，从而形成酸酐或混合酸酐-OCORa或-OCNRaNHRb，其中Ra和Rb可以相同或不同，二者独立为C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或C1-C6烷氧基；或环己基、3-二甲基氨基丙基或N-吗啉基乙基。
**酰基叠氮化物也可重排成异氰酸酯。
反应活性基团可以是能与胺、硫醇、羟基或醛反应的基团。反应活性基团可以是胺反应活性基团，例如琥珀酰亚胺基酯(SE)；或硫醇反应活性基团，例如马来酰亚胺、卤代乙酰胺或磺酸甲硫醇酯(MTS)；或醛反应活性基团，例如胺、氨氧基(aminooxy)或酰肼。
在本发明的一些实施方式中，提供包含一个或多个反应活性磺酰胺基团的取代呫吨染料，其中所述呫吨染料具有等于或大于约488nm的最大吸收波长。在一些实施方式中，所述呫吨染料具有等于或大于约532nm的最大吸收波长。在本发明的一些实施方式中，提供包含一个或多个反应活性磺酰胺基团的取代罗丹明染料，其中所述罗丹明染料具有等于或大于约514nm的最大吸收波长。
本发明还提供式VII所示化合物：
式中：
Z是金属螯合剂；
X是O、S或-C(CH3)2-；
A是-OR1或-NR1R1a；
B是＝O或＝N+R4R4a；
C是-OR4或-NR4R4a；
R1、R1a、R4和R4a各自独立为H或烷基，其是未取代的或被-L-SO3 -、-L-PO3 2-、水溶性聚合物、或被-L-Rx取代；或者一对或多对R1和R1a或R4和R4a与和它们相连的氮一起形成饱和或不饱和的环，该环任选被-L-SO3 -、-L-PO3 2-和-L-Rx中任一个取代；或者R1、R1a、R4或R4a中至少一个是酶底物或保护基团；
R3、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺或中性或带正电荷的无反应活性磺酰胺；或者一对或多对R3和R4a、R4和R5、R5和R6、R8和R9、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成一个或多个稠合的环，所述环任选被至少一个卤素、CN、烷基、杂烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、-L-PO3 2-、L-SO3 -、-L-Rx、反应活性磺酰胺或中性或带正电荷的无反应活性磺酰胺取代；
Rx是反应活性基团；
L是键或(Q)n；
各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、(C＝X’)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、或取代或未取代的杂环烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd毗连，没有两个O毗连；
各X’独立为NRd、S或O；
n是1-20；和
各Rd是H、取代或未取代的烷基。
在一些实施方式中，Z是选自以下靶离子的螯合剂：Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Na+、K+、Hg2+、Pb2+、Cd2+和As3+。例如，Z是基于BAPTA的Ca2+螯合剂。
在本发明的其它实施方式中，待检测的靶离子选自：Li+、Na+、K+、Cs+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Rb+、Tb3+或Eu3+。在本发明的另一实施方式中，所述靶离子选自：Li+、Na+、K+、Ca2+、Zn2+、和Mg2+。本发明指示剂的所选实施方式的其它靶离子还包括Mn2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Cu+、Zn2+、Al3+、Cd2+、Ag+、Au+、Tl+、Pd2+、Hg+、Sn2+、Pb2+、Sr2+、Ba2+、Mo3+、Ga3+、In3+、La3+、Eu3+、Tb3+、Dy3+、Ru3+、Sc3+、As3+、Sb3+、Cr3+、Bi3+、Ce3+、Ce4+、Pd2+、Pt2+和Pt4+离子。在本发明的还有另一实施方式中，本发明指示剂的靶离子是Fe2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Cu+、Zn2+、Al3+、Cd2+、Hg2+、Pd2+、Ba2+、La3+、Tb3+和Cr3+离子。在还有另一实施方式中，所述靶离子选自Fe3+、Ni2+、Cu2+、Cu+、Hg2+、或Pb2+。例如，待检测的靶离子是钙。钙起到胞内信使和调节剂的作用，对胞内游离钙(Ca2+)浓度的检测和测量是非常有用的。例如，可利用本发明化合物测量水性溶液，如生物学液体中的钙浓度。例如，可利用本发明化合物测量活细胞内的钙浓度。在一些实施方式中，相对于其它金属离子，例如Mg2+，本发明化合物显示明显的选择性。
结合感兴趣离子并导致荧光特性改变的任何螯合剂是合适的。例如，Z可以是冠醚，例如二芳基二氮杂冠醚(美国专利号5,405,975)；1，2-双-(2-氨基苯氧基乙烷)-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)的衍生物(美国专利号5,453,517；美国专利号5,049,673)；2-羧基甲氧基-苯胺-N，N-二乙酸(APTRA)的衍生物(Ragu等.AM.J.PHYSIOL.256，C540(1989))；或基于吡啶基的或菲咯啉靶离子螯合剂(美国专利号5,648,270)(通过引用纳入)。其它螯合剂化合物描述于美国专利号4,849,362；美国专利号5,501,980；美国专利号5,459,276；和美国专利号5,501,980。还知道对水性或有机溶剂中的Li+、Na+和K+有选择性的，依据化学修饰冠醚的一些荧光指示剂(美国专利号5,134,232；和5,405,975；Gromov等.Russian Chemical Bulletin(1999)48：6第1190-1192页；Lockhart等，J.C.S.Perkin I(1977)第202-204页)。
本发明化合物的示范性结构示于表3。
本发明化合物的应用
本发明化合物可用于各种不同应用。感兴趣的应用之一是将本发明化合物用作能赋予特定物质组合物的荧光特性的标记试剂。
本文提供制备标记的生物分子的方法，包括将生物分子与具有式VIIIa后VIIIb所示结构的化合物反应：
式中：
A是OH或NR1R1a；其中R1和R1a各自独立为H、C1-C12烷基，或者R1和R1a与和它们相连的氮一起形成取代或未取代的饱和或不饱和环；
B是＝O或＝N+R4R4a或NR1R1a；其中R4和R4a各自独立为H、C1-C12烷基，或者R4和R4a与和它们相连的氮一起形成取代或未取代的饱和或不饱和环；和
R2、R3、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，选自磺酰氯或反应活性磺酰胺的反应活性基团、用选自磺酰氯或反应活性磺酰胺的反应活性基团取代的甲基、无反应活性磺酰胺、-PO3 2-或-SO3 -；或
或者一个或多个R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成5或6-元环，该环任选被反应活性磺酰胺或用选自磺酰氯或反应活性磺酰胺的反应活性基团取代的甲基取代；
只要式VIIIa或VIIIb所示化合物包含至少一个反应活性基团。
在式VIIIa或VIIIb的一些实施方式中，R2和R1a、R3和R4a、R4和R5、R5和R6、或R9和R1与和它们相连的原子一起形成的5或6-元环是取代或未取代的或饱和或不饱和的环。
在一些实施方式中，反应活性磺酰胺具有以下结构式：
式中R10、L和Rx如本文定义。
标记底物生物分子的方法包括以下步骤：
1)提供：本发明的反应活性染料；2)在有或没有偶联剂或催化剂存在下，将所述染料与所述底物生物分子在合适的溶剂或缓冲液中温育足以在染料和底物生物分子之间形成共价连接键的时间。
在一些实例中，底物生物分子还包含伴侣反应活性基团，其中所述底物生物分子选自：蛋白质、肽、氨基酸、DNA、RNA、寡核苷酸、核苷酸、核苷、碳水化合物、聚合物、脂质、药物、生物学配体、荧光染料和金属螯合剂。
标记反应对偶联剂或催化剂的需求取决于反应物的性质，这通常是本领域技术人员熟知的。例如，对于羧酸和脂族胺之间的偶联反应，通常利用碳二亚胺，例如DCC或EDAC。在一些情况中，催化剂可有助于促进标记反应。例如，DMAP(4-二甲基氨基吡啶)可用于催化具有琥珀酰亚胺酯的染料和具有芳族胺的底物分子之间的反应。
可利用本发明化合物与各种分子反应，包括但不限于生物分子，例如多肽、基于多肽的毒素、氨基酸、核苷酸、包括DNA和RNA的多核苷酸、脂质和碳水化合物以及它们的任何组合。此外，可利用本发明化合物与半抗原、药物、离子络合剂，如金属螯合剂，微粒、合成或天然聚合物、细胞、病毒、包括本发明染料分子在内的其它荧光分子、或表面反应。底物分子通常包含一个或多个官能团，这些官能团与本发明化合物的反应活性基团反应形成共价或非共价键。在一方面，本发明化合物的反应活性基团是活化酯(例如琥珀酰亚胺酯或SE)、马来酰亚胺、酰肼或氨基氧基。因此，在一些方面，底物分子(或反应底物)的官能团是胺、巯基、醛或酮。得到的荧光标记底物分子可称为偶联物或标记的底物分子。本领域实施的制备荧光基团-底物偶联物的任何方法(例如，通过引用纳入本文的Brinkley，Bioconjugate Chem.3，2(1992))适用于实施本发明。
生物分子和本发明化合物的偶联物通常具有高荧光量子产率，但通常保留未标记生物分子的关键参数，例如溶解度、与受体或核酸的选择性结合、特定酶的活化或抑制或掺入生物膜的能力。然而，标记程度最高的偶联物仍能非特异性地沉淀或结合。为保留功能或结合特异性，如果需要，低于最高的标记程度是可接受的。制备本发明偶联物可涉及实验以优化特性。偶联后，可通过本领域已知的技术，例如凝胶过滤、透析、偶联物沉淀和再溶解、HPLC或这些技术的组合来除去未偶联的标记试剂。存在游离染料可能使得生物偶联物的后续实验复杂化。
核酸
在另一实施方式中，可利用本发明化合物偶联核苷、核苷酸或多核苷酸，其中任何此类分子可以是天然或合成的、修饰或未修饰的。用于标记的本发明化合物可包含反应活性基团，其是亚磷酰胺、活化的酯(例如，琥珀酰亚胺酯)、烷基化基团或反应活性铂络合物。此类分子可含有或经衍生而含有本发明化合物上的反应活性基团的一个或多个反应活性伴侣。本发明化合物的反应活性基团可与所述分子上的合适反应伴侣反应以形成共价连接键。例如，脱保护后，亚磷酰胺基团可与羟基反应以形成磷酸酯连接键；琥珀酰亚胺酯等可与胺基团反应以形成酰胺连接键；反应活性铂络合物可与鸟苷碱基反应以形成铂络合物连接键。在一个实施方式中，包含活化酯的本发明反应活性化合物与包含碱基的核苷酸三磷酸反应以形成荧光标记的核苷酸三磷酸，所述碱基包含氨基炔基、氨基烯丙基或氨基烷基。此类标记的核苷酸三磷酸常通过酶促掺入而用于制备荧光标记的核酸聚合物。
在一些实施方式中，本发明的荧光化合物与连接于尿苷或胞苷残基C-5位的基团或接头反应。该位置不参与Watson-Crick碱基配对，对互补序列杂交影响甚微。可将氨基炔基接头引入荧光部分和核苷酸之间以便减少荧光团与酶或靶结合位点的相互作用。除了该4-原子桥，可引入7-到10-原子的间隔臂以便进一步隔开荧光团与碱基。利用较长间隔臂可产生较亮的偶联物，并增加二级检测试剂对半抗原的可接近性。
或者，可利用2-氨基乙氧基乙基(OBEA)接头制备在胞苷的N-4位修饰的脱氧胞苷三磷酸。利用额外的间隔臂可减少荧光团存在而导致可能的空间干扰。
可通过PCR反应、末端转移酶-催化添加或缺口平移从荧光标记的核苷酸三磷酸制备荧光标记的DNA。此类反应可利用各种聚合酶。此类聚合酶包括Taq聚合酶(可用于，例如聚合酶链式反应(PCR)试验)、DNA聚合酶I(可用于，例如缺口-平移和引物-延伸试验)、Klenow聚合酶(可用于，例如随机-引物标记)、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)(可用于，例如3′-端标记)、逆转录酶(例如，从RNA模板合成DNA)或其它聚合酶，例如SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶以便体外转录。
或者，可首先将胺标记的核苷酸酶促掺入核酸聚合物以产生胺标记的核酸聚合物，然后用本发明化合物标记所述胺标记的聚合物，从而制备荧光标记的核酸聚合物。制备和利用荧光标记的核苷酸三磷酸的更多信息可见美国专利号4,711,955和5,047,519。还可利用包含反应活性铂络合物作为反应活性基团的本发明化合物直接标记核酸聚合物，例如DNA，其中所述铂络合物与鸟苷碱基的氮原子形成配位键，如美国专利号5,714,327中所述。
氨基酸和多肽
在另一实施方式中，本发明化合物可用于偶联氨基酸、氨基酸类似物或多肽。可将本发明化合物与包含所述化合物上反应活性基团的反应伴侣的氨基酸、氨基酸类似物和多肽反应来标记氨基酸、氨基酸类似物和多肽。此类反应伴侣可以是所述多肽中存在的天然或非天然基团。例如，反应伴侣可以是天然残基，例如作为天然赖氨酸残基的一部分的氨基，或作为天然半胱氨酸基团的一部分的巯基。
为获得可能的最大荧光，可用尽可能多的同一荧光基团的分子标记蛋白质，其程度应是标记对该蛋白质的生物学活性的影响最低。在其它情况中，优选避免蛋白质上多个荧光基团分子相互作用导致的荧光淬灭。染料间相互作用可以是物理作用，例如染料聚集，或是光谱作用，例如FRET能量转移，或二者的组合。任一类型的相互作用可导致荧光淬灭，其特征在于标记蛋白质的总荧光随着标记程度增加而缓慢升高，然后快速降低。图2显示本发明荧光基团，与现有技术的相似荧光基团相比，其不大可能在抗体上淬灭其荧光。据信，蛋白质上标记荧光基团的荧光淬灭的主要原因是形成染料聚集体，例如染料二聚体。当染料二聚体形成时，荧光基团-蛋白质偶联物的吸收光谱通常显示双峰。如图1所示，吸收光谱中没有双峰证明本发明荧光基团未在蛋白质上形成二聚体。因此，在很大DOL范围上用本发明荧光基团标记的抗体在胞内染色过程中均产生极佳的信号(图2)。与其它荧光标记的抗体相比，用本发明荧光基团标记的抗体的另一优点是它们在很大DOL范围上有一致的极佳染色特异性(图4和6)，例如，用本发明荧光基团标记的抗体保留与它们抗原的高度结合特异性。与FITC(常用的488nm-可激发绿色荧光染料)标记抗体相比，用本发明染料标记的抗体的还有另一优点是它们的光稳定性显著提高(图5)。
(2)本发明标记生物分子的应用
本发明化合物为标记生物分子用于各种领域提供有效工具。作标记能分辨涉及生物分子，例如蛋白质、糖蛋白、核酸和脂质以及无机化学物质或它们的任何组合的相互作用。相互作用可以在核酸分子之间、核酸与蛋白质之间、蛋白质与小分子之间。可分辨无细胞生物学系统、细胞系统(包括胞内和胞外系统)中或体内的相互作用，包括组织或器官或对象中细胞内的活性。描绘各种相互作用常是科学研究和开发、药物设计、筛选和优化、系统发生分类、个体基因分型、亲本和法医鉴定、环境研究、诊断、预后和/或疾病治疗中的重要步骤。
按照本发明方法标记的生物分子可用作结合剂来检测它们的结合伴侣，它们生物学相互作用的靶标，如上所述。例如，本发明染料可用于标记蛋白质和用于结合细胞表面受体。如此标记的结合剂与其结合伴侣接触并检测荧光。在其它实施方式中，结合剂在本发明结构的化合物足够与结合剂交联的条件下与该化合物反应。
本发明的标记分子可在各种生物学试验和方法中用作FRET对的一部分，作为供者或受者分子。本领域技术人员知道根据特定应用选择合适的FRET伴侣。此类应用包括但不限于：涉及分子信标的试验、FRET蛋白酶试验、流式细胞术、核酸杂交和任何其它应用，其中必须探查两个或更多个部分的相对空间定位。FRET通常可以10到的范围使用。在一个实施方式中，FRET对的供者和受者是本发明的标记分子。在另一实施方式中，FRET对的一个成员是本发明的标记寡核苷酸，其能与该FRET对的第二成员标记的互补寡核苷酸退火，从而退火导致能量转移的效率提高。在该实例中，FRET对的第二成员可以是本发明的荧光团或不同的荧光团。
在一些应用中，需要淬灭本发明标记分子。可利用本领域已知的各种淬灭剂。非限制性例子包括Black Hole QuencherTM部分、DABCYL、反应红(Reactive Red)4(Cibacron Brilliant Red 3B-A)、孔雀绿(Malachite Green)、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4′-异氰酸酯(DABITC)和4，4′-二异硫氰酸酯基(isothiocyanaito)二氢-芪-2，2′-二磺酸。例如，可用本发明化合物以及合适的淬灭剂标记分子信标。在该信标的闭合构象时，荧光团被淬灭。当识别或结合事件打开该信标时，荧光团的荧光显著增加。
在还有另一实施方式中，本发明提供包含第一供者荧光基团和第二受者荧光基团的能量转移荧光基团，其中：供者荧光基团和受者荧光基团共价相连以形成FRET对；所述供者荧光基团和受者荧光基团中至少一个是本发明的荧光基团；且所述能量转移荧光基团任选包含反应活性基团。制备能量转移荧光基团的方法及其使用方法早已见诸描述。参见美国专利号6,479,303和WO 00/13026。
在一个实施方式中，本发明的荧光基团用于标记荧光蛋白以形成所谓的串联染料，其中本发明的荧光基团和荧光蛋白的荧光团形成能量转移对(即，FRET对)。在此类FRET对中，本发明的荧光基团是供者荧光基团或受者荧光基团，同样，蛋白质的荧光团是受者荧光基团或供者荧光基团，从而可在供者荧光基团的最大吸收(波长)或附近激发FRET对，在受者荧光基团的最大发射(波长)收集荧光，从而导致大的斯托克司频移(Stokes shift)。制备串联染料的合适荧光蛋白包括但不限于各种藻胆蛋白，例如别藻蓝蛋白B、别藻蓝蛋白(APC)、C-藻青蛋白、R-藻青蛋白、藻红菁(Phycoerythrocyanin)、C-藻红蛋白、b-藻红蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白(R-PE)等。藻胆蛋白是包含后胆色素作为辅基的蛋白质，其还是蛋白质的荧光团。藻胆蛋白优选R-PE或APC。为实现合适的FRET效率，可选择合适波长的荧光基团，从而供者荧光基团的发射(光谱)和受者荧光基团的吸收(光谱)具有足够的光谱重叠。荧光基团选择和制备串联染料的详细方法见美国专利号4,520,110和5,714,386。由于斯托克司频移较大，本发明的串联染料可用于仅有限数量的激发光可用的多色检测。具体地说，本发明的串联染料可用于荧光激活细胞分选(FACS)或流式细胞术研究。商品化流式细胞仪通常配有1-3个激发光源，更常见的是1-2个激发光源。例如，有些商品化流式细胞仪配有488nm氩激光和633nm He-Ne激光或635nm红色二极管激光，大量的流式细胞仪仅有488nm氩激光。因此，为检测多种靶标，可用具有不同发射的不同荧光基团染色各靶标，所述不同荧光基团均需要被共同激发源有效激发。本发明的串联染料满足此需求，因为不难制备具有相同最大激发但不同最大发射的不同串联染料。在一个实施方式中，在促进共价标记所述多肽的条件下将本发明化合物应用于含多种多肽和任选的其它生物学分子的生物学样品。在一些实施方式中，化合物的反应活性基团是活化的酯、马来酰亚胺、碘乙酰胺、溴乙酰胺、酰肼、胺或氨基氧基。生物学样品可以是细胞裂解物或组织裂解物。可通过各种已知的工具或技术，包括但不限于蛋白质微阵列、色谱和凝胶电泳分析和/或纯化得到的标记多肽或细胞组分。
本发明还提供包含本发明化合物和/或本发明荧光基团-底物偶联物的试剂盒以便用于以上选择性描述的各种试验。本发明的试剂盒可装有一种或多种本发明化合物和指导利用所述化合物的使用说明书。例如，试剂盒可装有用于标记底物的一种或多种本发明化合物，用于标记反应和产物纯化的一种或多种缓冲液、用于纯化得到的荧光基团-底物偶联物的色谱柱、实施该流程的说明书，任选的任何其它试剂和任选的任何参比标准品。在另一实施方式中，试剂盒装有一种或多种本发明的荧光基团-底物偶联物，一种或多种缓冲液，利用所述偶联物的说明书，任选的任何其它试验试剂和任选的任何校正标准品。试剂盒还可装有用于纯化偶联产物的其它材料或装置。
可采用各种方法检测本发明荧光基团产生的信号。一般可通过本领域已知的任何方法检测信号强度的改变，该改变通常依赖于所选用的荧光基团。光学系统有助于实施该检测。此类系统通常包括至少两个元件，即，激发源和光子检测器。本领域有这些元件的许多实例可用。示范性激发源是激光，例如极化激光。激光的选择依赖于探针所连接的荧光基团。对于大多数荧光基团，所需激发光在约300nm到约800nm范围内，更常见是约350nm到约650nm。或者，可利用约300到约350nm、350到400nm、450到500nm、500到550nm、550到600nm、600到650nm的激发波长激发本发明化合物，这些仅是举例。本领域技术人员不难通过常规实验确定合适的激发波长来激发给定荧光团(参见，例如《荧光探针和标记技术指导手册》(The Handbook-‘A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies)，第10版(2005)(可从英杰公司(Invitrogen，Inc.)/分子探针公司(Molecular Probes)获得)前面通过引用纳入本文)。如果需要，可利用其它光学系统。这些光学系统可包含元件，例如光学读数仪、高效光子检测系统、光电倍增管、栅敏场效晶体管(gate sensitive FET)、纳米管场效晶体管、光电二极管(例如雪崩二极管(APD))、照相机、电荷耦合装置(CCD)、电子倍增电荷耦合装置(EMCCD)、增强型电荷耦合装置(ICCD)和共焦显微镜。这些光学系统还可包含光学传播元件，例如光纤、光学开关、镜、透镜(包括微型透镜和纳米透镜)、准直仪。其它例子包括光衰减器、极化滤波片(例如，二色性滤波片)、波长滤光器(低通、带通、或高通)、波片(wave-plate)和延迟线(delay line)。在一些实施方式中，光学传播元件可以是与阵列化光学限制元件成光学通讯的平面波导。参见，例如美国专利号7,292,742；7,181,122；7,013,054；6,917,726；7,267,673和7,170,050。可以各种方式组合和组装本领域已知的这些和其它光学组件以检测可区分信号。
本发明的荧光标记多核苷酸可用于各种应用。此类应用可涉及核酸之间的相互作用，例如DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA，或任何其它非天然产生的核酸PNA、LNA和/或TNA之间的相互作用。各种应用还可涉及核酸和蛋白质、脂质或它们的组合之间的相互作用。特异性核酸试验的非限制性例子包括核酸扩增、定量或终点扩增、溶液中或基片上的杂交(例如，阵列杂交)、凝胶迁移和核酸测序。荧光标记的多核苷酸可用于液相或固定在基片上。
在一个实施方式中，标记的多核苷酸用作杂交探针。杂交探针的应用之一是荧光原位杂交(FISH)。在该技术中，感兴趣序列的互补标记多核苷酸与固定的染色体制品退火，通过显微镜检测感兴趣序列存在与否以及染色体定位。可将感兴趣核酸固定于基片上来进行FISH，所述基片包括但不限于玻璃、硅或纤维。还可定量采用FISH(Q-FISH)来检测重复序列，例如端粒酶的存在和长度。这可通过定量测定所发出荧光的强度来进行，例如通过显微术检测。可实施利用本发明荧光化合物的FISH试验来检测DNA分子或染色体的特定区段。这些特征可用于遗传咨询(例如，产前筛检)、医药和物种鉴定。
在一些实施方式中，标记的多核苷酸可在扩增反应，例如PCR中用作引物。在还有另一实施方式中，可利用本发明化合物标记多核苷酸，然后将其用作探针，可以是杂交探针或实时PCR探针。可用第二荧光基团标记此类探针以便与本发明的第一荧光基团形成FRET对。本领域技术人员熟知制备和利用PCR探针的方法。
在本发明的一个实施方式中，提供检测或定量测定靶核酸的方法，该方法包括以下步骤：a)提供本发明的标记多核苷酸(“探针”)；b)使所述标记的多核苷酸与核酸靶标接触以便探针与该核酸靶标杂交；和c)通过测量核酸探针与核酸靶标杂交后探针荧光的改变来检测或定量测定所述核酸靶标。
当探针与靶核酸形成复合物时产生本文所用的杂交。复合物通常至少部分因为核苷酸残基的碱基之间的氢键而稳定。氢键可通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或任何其它序列特异性模式而产生。杂交可构成更宽泛过程中的一步，例如启动PCR反应，或通过核酶酶促切割多核苷酸。
探针和靶标之间发生杂交后，可检测探针荧光强度的改变。杂交前后此类改变可导致所检测信号强度的正增益或负衰减。依据所运行的特异性杂交试验，杂交后多于一个事件可导致信号强度产生改变。例如，报道信号的增加可能是报道荧光基团与淬灭基团空间扩展或分离所致，但二者仍连接于该探针。此外，可通过酶(例如，具有5’到3’外切核酸酶的聚合酶)切割来分离探针的报道部分或淬灭部分，藉此产生检测的报道信号。如上所述，报道部分和淬灭部分都根据功能来定义的，从而这些基团可以是相同的，但用于杂交反应时，它们可相对于彼此起到不同的作用。例如，连接于探针的基团是淬灭基团，因为其在探针未与靶核酸杂交时(通常是探针采取随机状态时)减少光学信号的发出。与靶核酸杂交后，同一基团可在酶切割后变成报道荧光基团，因为目前是在试验期间检测荧光基团的信号。
以前描述的信号检测方法可应用于靶核酸拷贝数增加的核酸扩增。此类增加可以线性或指数方式发生。可利用以下天然或重组DNA聚合酶进行扩增，例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶、T7 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、Tma DNA聚合酶、exo-Tli DNA聚合酶、exo-KOD DNA聚合酶、exo-JDF-3 DNA聚合酶、exo-PGB-D DNA聚合酶、U1Tma(N-截短的)海栖热孢菌(Thermatoga martima)DNA聚合酶、测序酶和/或RNA聚合酶，例如逆转录酶。
优选的扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)。PCR的通用过程见美国专利号4,683195(Mullis)和4,683,202(Mullis等)。简言之，通过PCR扩增核酸包括以下重复循环：DNA的热变性、两个引物与侧接待扩增靶核酸区段的序列退火和用聚合酶延伸该退火的引物。引物与靶核酸的相对链杂交，定向以便聚合酶合成通过引物之间的区段进行，从而有效倍增靶区段量。此外，由于延伸产物还与引物互补并能与之结合，每后一轮基本上倍增上一轮中合成的靶核酸量。如此导致特异性靶核酸以2n的速度发生指数累积，其中n是循环数。
典型的常规PCR热循环方案包括以下30轮：(a)在90℃-95℃变性0.5-1分钟，(b)在50℃-65℃退火1-2分钟，和(c)在68℃-75℃延伸至少1分钟。其它方案包括但不限于通用方案以及快速循环方案，这些方案也可用本发明探针进行。
常规PCR的改变形式是称为“热启动PCR(Hot Start PCR)”的反应。热启动PCR技术关注反应准备期间聚合酶活性的抑制。通过在PCR循环之前限制聚合酶活性，非特异性扩增减少，靶标产率增加。热启动PCR的常规方法包括化学修饰聚合酶(参见，例如美国专利号5,773,258)、通过聚合酶特异性抗体抑制聚合酶(参见，例如美国专利号5,338,671)和在反应位点引入物理屏障从而在热循环开始前隔离聚合酶(例如，蜡屏障方法)。实施热启动PCR所需的试剂可方便地包装在市售可得的试剂盒中(参见，例如西格玛公司(Sigma)的JumpStart试剂盒)。
可用本发明探针进行的常规PCR的另一改变形式是利用巢式引物的“巢式PCR”。当样品中靶核酸的量极其有限，例如利用档案样品或法医样品时，优选该方法。实施巢床PCR时，首先用能与侧接靶核酸的较大区段的序列杂交的外组(outer set)引物扩增核酸。该扩增反应后利用能与大区段内的靶序列杂交的内组引物进行第二轮扩增循环。
本发明探针可用于逆转录PCR反应(RT-PCR)，其中逆转录酶首先将RNA分子转化成双链cDNA分子，然后将其用作聚合酶链式反应中后续扩增的模板。实施RT-PCR时，通常在靶核酸经热变性后将逆转录酶加入反应样品。然后将反应维持在合适温度(例如，30℃-45℃)足够的时间(例如，5-60分钟)以产生cDNA模板，然后进行预定的扩增循环。此类反应尤其可用于检测其遗传学信息保存在RNA分子内的生物学实体。该类生物学实体的非限制性例子包括RNA病毒，例如HIV和导致肝炎的病毒。本发明所体现的RT-PCR的另一重要应用是基于在测试样品中检测的mRNA水平同时定量测定生物学实体。
还可利用本发明探针进行连接酶链式聚合酶链式反应(LCR-PCR)。该方法包括将靶核酸连接于一组引物对，所述引物各自具有靶标特异性部分和靶序列无关的短锚定序列。然后利用第二组含有锚定序列的引物扩增与第一组引物相连的靶序列。本领域技术人员熟知进行LCR-PCR的过程，因此本文不作详述(参见，例如美国专利号5,494,810)。
本发明探针尤其适合用于均相试验。在此类试验中，检测和/或定量测定靶核酸而无需试验后加工以记录试验结果。例如，可在封闭样品容器(例如，试管、样品毛细管或热芯片(thermalchip))中进行均相PCR反应，一旦试验开始无需进一步添加或除去试剂以记录结果。均相试验能实时记录试验结果。如果需要，实施本发明方法时，可随试验进展及时连续记录试验结果或在试验期间的一个或多个点或试验完成后立即记录。
如果需要，均相试验可为多元的，即，可在一次试验中检测一种以上靶核酸。在多元试验中，将两种或更多种核酸探针加入待检验的混合物，这些探针所共价相连的荧光基团的性质不同。选择荧光基团以从各特异性核酸探针产生可区分的荧光信号。可同时记录核酸探针的不同荧光基团组合的信号以检测和/或定量测定相应的靶核酸。多元化极大降低分析成本，以高体量的模式极大增加通量。
本发明探针可用于检测单突变。因此，提供的方法利用本发明探针检测探针序列和靶序列之间最少一个错配。PCR检测核酸中的此类高特异性在临床诊断和遗传学研究中具有极高价值。例如，许多疾病与人基因组中不同位点的单突变有关。虽然在理论上，可通过测序检测该类型的遗传学改变，也称为单核苷酸多态性或SNP，但预计此类测序方法因成本高和效率低而不能实际用于大规模。利用本发明探针，通过扩增反应检测SNP是可行的。
本发明探针还尤其适用于监测核酸扩增反应。在相关实施方式中，本发明提供监测所述靶标扩增期间靶核酸增加的方法。所述方法通常包括(a)提供包含所述靶核酸、至少一种引物和本发明的标记寡核苷酸探针的扩增反应混合物，所述引物与所述靶核酸杂交，而所述探针提供可检测信号，其强度与扩增中靶核酸的增加成比例；(b)在扩增所述靶核酸的条件下处理所述混合物；和(c)测量所述处理步骤(c)期间所述混合物产生的所述信号量。如果需要，在扩增反应期间连续测定或在扩增反应期间间歇测定信号量。利用引物对的扩增可以是指数性的，利用引物对中一条引物的扩增是线性的。
扩增反应期间信号强度的增加可能是探针与靶核酸杂交的步骤所致，还可能是扩增反应中所用聚合酶作用的切割步骤所致。
在一方面，与PCR联用时，本发明方法利用聚合酶的5’到3’核酸酶活性。如果本发明探针在PCR启动时与引物一起加入，探针的标记核苷酸水解产生的信号为在其扩增期间检测靶序列提供手段。大量聚合酶适于催化引物和模板依赖性核酸合成并具有5’到3’核酸酶活性。非限制性例子包括DNA聚合酶，例如大肠杆菌DNA聚合酶I、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶、海滨超嗜热菌(Thermococcus littoralis)DNA聚合酶和水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶。如果需要，核酸扩增反应中可利用温度稳定的聚合酶。参见，例如美国专利号4,889,818公开了从水生栖热菌分离的代表性热稳定酶。其它代表性的温度稳定性聚合酶包括但不限于，例如从热稳定细菌黄色栖热菌(Thermusflavus)、红色栖热菌(Thermus ruber)、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽胞杆菌(其最优温度比所列的其它细菌略低)、乳糖栖热菌(Thermus lacteus)、鲁宾斯栖热菌(Thermus rubens)、海栖热孢菌(Thermotoga maritima)、海滨超嗜热菌(Thermococcus littoralis)、和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)提取的聚合酶。
在另一实施方式中，可用显示链置换活性的聚合酶进行核酸扩增(也称为滚环聚合)。标准置换可合成环状DNA模板的串联拷贝，尤其可用于等温PCR反应。适合本发明的滚环聚合酶的非限制性例子包括但不限于：T5DNA聚合酶(Chatterjee等.，Gene 97：13-19(1991))、和T4 DNA聚合酶全酶(Kaboord和Benkovic，Curr.Biol.5：149-157(1995))、噬菌体M2 DNA聚合酶(Matsumoto等.，Gene 84：247(1989))、噬菌体PRD1 DNA聚合酶(Jung等.，Proc.Natl.Aced.Sci.USA 84：8287(1987)，Zhu和Ito，Biochim.Biophys.Acta.1219：267-276(1994))、DNA聚合酶I的Klenow片段(Jacobsen等.，Eur.J.Biochem.45：623-627(1974))。
优选的一类滚环聚合酶利用蛋白质引发作为启动复制的方法。示范性的该类聚合酶是选自或衍生自以下的修饰和未修饰的DNA聚合酶：噬菌体Φ29、PRD1、Cp-1、Cp-5、Cp-7、Φ15、Φ1、Φ21、Φ25、BS 32 L17、PZE、PZA、Nf、M2Y(或M2)、PR4、PR5、PR722、B103、SF5、GA-1、和短尾病毒科(Podoviridae)的相关成员。具体地说，野生型噬菌体Φ29基因组由19,285个碱基对的线形双链DNA(dsDNA)组成，其具有共价连接于各5’端的末端蛋白(TP)。为启动复制，组蛋白样病毒蛋白形成含复制起点的核蛋白复合物，其可能促使双螺旋在DNA两端解旋(Serrano等.，The EMBOJournal 16(9)：2519-2527(1997))。DNA聚合酶催化第一dAMP与TP提供的羟基的加合。该蛋白质引发事件对着模板的第二3’核苷酸发生，起始产物(TP-dAMP)后退一个DNA位置以覆盖末端核苷酸。启动后，同一DNA聚合酶复制DNA链之一，同时置换另一个。Φ29 DNA聚合酶的高持续性(processivity)和链置换能力使其能在没有任何解螺旋酶或辅助维持因素的存在下完成含Φ29TP基因组(TP-DNA)的复制(综述参见Serrano等.，TheEMBO Journal 16(9)：2519-2527(1997))。
可利用各种辅助蛋白质增强链置换。它们包括但不限于解螺旋酶(Siegel等.，J.BioL Chem.267：13629-13635(1992))、单纯疱疹病毒蛋白ICP8(Skaliter和Lehman，Proc.Natl，Acad.Sci.USA 91(22)：10665-10669(1994))、单链DNA结合蛋白(Rigler和Romano，J.Biol.Chem.270：8910-8919(1995))、腺病毒DNA-结合蛋白(Zijderveld和van der Vliet，J.Virology68(2)：1158-1164(1994))和BMRF1聚合酶辅助亚基(Tsurumi等.，J.Virology67(12)：7648-7653(1993))。
本发明探针可用于等温扩增反应。此类扩增反应不单依赖于热循环。该过程可应用于各种环境温度。特别是，双链模板序列的变性不单通过将温度提高到双链序列的解链温度以上来实现。变性过程包括物理或机械作用力将链分开以便进行引物退火和延伸。包括等温PCR在内的进行等温扩增反应的各种机制描述于美国专利公布号20060019274和美国专利号5,824,477及6,033,850，其通过引用纳入本文。
通常利用扩增试剂进行核酸扩增。扩增试剂通常包括酶、水性缓冲液、盐、引物、靶核酸和核苷三磷酸。扩增试剂可视具体情况是完全或不完全的扩增反应混合物。
用于核酸扩增的引物的选择取决于靶核酸序列。用于本发明的引物通常是寡核苷酸，例如长度为10-100或10-25个碱基，其可通过聚合酶的作用以模板特异性方式延伸。引物设计中通常考虑以下因素：a)引物对中的各独立引物优选不在扩增反应中自我杂交；b)各独立引物对优选不在扩增反应中交叉杂交；和c)选择的引物对必须具有适当长度和序列同源性以便与侧接待扩增核酸区段的两个不同区域退火。然而，为进行延伸，不必引物的每个核苷酸与模板退火。引物序列无需反映靶核酸的精确序列。例如，非互补核苷酸片段可连接于引物的5’端，引物的其余部分与靶标互补。或者，可将非互补碱基间插入引物，只要该引物序列与靶标有足够互补性以便进行退火并合成互补核酸链。
核酸扩增反应通常在扩增靶标所用酶的相容性缓冲液中包含靶核酸。缓冲液通常含有能掺入模板序列的复制链的核苷酸或核苷类似物(ATP、TTP、CTP、GTP或其类似物，包括但不限于具有各碱基单元的五磷酸酯)。
如果需要，可自动进行扩增反应。本领域有许多能容纳48、96或更多样品的热循环仪可用。合适的光学系统将激发光从光源移动至反应位点，并检测各样品的发射光。例如，多根光纤引线同时读取经历热循环的所有PCR试管。然而，仅需要一台荧光计来读取反应位点的荧光。类似检测方案适用于96-孔微量滴定形式。在临床实验室中该类型对于大规模样品筛选常是理想的，例如遗传学分析，如在血库筛选过程中筛查AIDS病毒。
因此，本发明还提供检测本发明探针所产生信号的设备，其可用于检测、测量和定量测定扩增之前、期间和之后的信号。该设备包括能容纳包含本发明探针的扩增反应混合物并实现靶序列扩增的热元件(例如，热循环仪)和检测本发明探针所产生信号的检测器。
在本发明的另一实施方式中，本发明探针用于在核酸微阵列上进行的试验以检测或定量测定核酸靶标。在此类试验，存在互补的靶核酸导致核酸微阵列上产生荧光信号。
包括基因芯片在内的核酸微阵列包含核酸的有序阵列，所述核酸共价连接于固体表面，参见，例如美国专利号5,871,928、6,040,193、6,262,776、6,403,320和6,576,424。可用光学检测器监测和定量测定试验产生的荧光信号，所述检测器包括但不限于荧光成像仪，例如加利福尼亚州圣布鲁诺日立公司(Hitachi Corp.，San Bruno，Calif.)供应的商品化仪器或共焦激光显微镜(共焦荧光扫描仪)，例如马萨诸塞州沃特敦的通用扫描公司(GeneralScanning，Inc.，Watertown，Mass)的商品化仪器。
在利用核酸微阵列进行的试验中，提供的靶核酸可以是衍生自任何合适的生物学来源的核酸序列混合物。它们可以衍生自体液，实质组织样品、组织培养物或其衍生的细胞及其后代，从任何这些来源制备的切片或涂片，或含有核酸的任何其它样品。
检验表达模式时，一般首先通过逆转录PCR，利用通用引物扩增mRNA序列，然后它们在试验中用作靶序列。在一个实施方式中，测试样品中存在的所有核酸序列同时施加于微阵列以供分析，因而所有靶核酸序列能与阵列上的所有核酸相互作用。在另一实施方式中，施加于阵列的靶核酸经预选择产生亚组以便利用微阵列作精细杂交分析。例如，数量有限的靶序列可含有待分析的特异性核苷酸序列的多个延伸，例如一个以上单核苷酸多态性。可利用特异性引物，通过PCR扩增该类型的核酸序列，然后用微阵列分析它们。
检验对象的多个基因表达时，杂交反应中靶多核苷酸能与探针在上述阵列上形成稳定复合物。本领域技术人员应该知道如果反义RNA用作靶核酸，固定在阵列上的序列要选择与该反义核酸的序列互补。相反，如果靶核酸库是有义核酸库，固定在阵列上的序列要选择与该有义核酸的序列互补。最后，如果核酸库是双链核酸，探针可以是有义和/或反义，因为靶核酸同时包括有义和反义链。
在一个实施方式中，利用标记的探针在微阵列上进行竞争性杂交。在该试验方式中，测试样品的靶核酸与本发明探针竞争结合固定在微阵列上的已知序列。会与固定的已知序列结合的标记探针量与测试样品中相应靶核酸的浓度成反比。
改变的杂交试验包括在微阵列上利用聚合酶，通过切割报道部分以增强探针的信号。例如，靶序列的混合物首先与固定在阵列上的已知序列杂交。然后洗去未杂交的序列。随后对应于靶序列的探针与靶标上不同区域杂交。洗去过量的未结合探针后，通过聚合酶作用切割杂交探针上的报道荧光基团，藉此产生表明初始存在于测试样品中的靶序列存在与否和/或含量的可检测信号。
利用本发明标记探针的合适杂交条件是使得阵列上序列与靶标之间的识别相互作用的特异性和稳定性足够的条件。如上所述，可在不同“严格性”条件下进行杂交反应。相关条件包括温度、离子强度、温育时间、反应混合物中是否存在如甲酰胺等其它溶质和洗涤过程。极高严格性的条件是那些条件，例如温度较高和钠离子浓度较低，从而要求杂交元素之间的最低互补性较高以便形成稳定的杂交复合物。增加杂交反应严格性的条件是本领域熟知且公开的。参见，例如(Sambrook等.，(1989)，同上)。
通常需要平衡杂交特异性(严格性)和信号强度。在优选的实施方式中，先洗涤杂交阵列再检测靶标-探针复合物以增强信噪比。通常利用较高严格性的溶液连续洗涤杂交阵列并读取每次洗涤之间的信号。分析如此产生的数据集会知晓某种洗涤严格性，在其之上不会改变杂交模式并能提供感兴趣的特定多核苷酸探针的充分信号。调节洗涤严格性的参数通常与杂交严格性的那些相同。其它手段，例如在杂交期间包含封闭试剂(例如，精子DNA、洗涤剂或其它有机或无机物)也能降低非特异性结合。
通常利用光学系统在微阵列上进行成像特异性杂交事件。合适系统的非限制性例子包括照相机、电荷耦合装置(CCD)、电子倍增电荷耦合装置(EMCCD)、增强型电荷耦合装置(ICCD)和共焦显微镜。
微阵列提供序列中发生杂交的位置定位。杂交区域的位置与特异性序列以及由此的测试样品中所表达靶标的身份相关。检测方法还获得各杂交区域的杂交强度水平的定量测定值，因此能直接检测给定基因转录物的表达水平。表明阵列上存在的杂交区域和它们各自强度的数据集合构成的杂交模式表示对象所表达的基因转录物的多样性。在衍生自不同对象的靶多核苷酸杂交产生的杂交模式中检测到的任何差异表明这些对象的基因转录物的多样性中的差异性表达。
一方面，可在同一阵列上产生待比较的杂交模式。在此类情况中，由不同类型的可检测标记物区分不同模式。在另一方面，在不同阵列上产生用于比较的杂交模式，其中差异表明所比较对象中特定基因的差异性表达。
用于比较性杂交分析的测试核酸可衍生自(a)同一物种不同生物体的细胞(例如，衍生自不同人的细胞)；(b)衍生自同一生物体但不同组织类型，包括正常或患病组织、胚胎或成人组织的细胞；(c)细胞周期中不同点的细胞；(d)用或不用外部或内部刺激处理的细胞。因此，利用本发明阵列的比较性杂交分析可用于监测各种环境中的基因表达。此类分析可拓展至检测患病和正常组织之间，不同类型的组织和细胞之间，不同细胞周期点或不同发育阶段的细胞之间和经历各种环境刺激或先导药物的细胞之间的基因差异表达。因此，本发明检测表达的方法可用于各种领域，包括检测疾病、鉴定和定量测定之上两份样品之间的差异基因表达、将差异表达的基因与特异性染色体位置相联系和/或筛选上调或下调特定基因表达或改变其表达模式的组合物。
可采用本发明的扩增试验或本文所述的任何其它杂交试验检测怀疑含有靶标的任何来源中的任何靶核酸。不打算限定样品的来源或其制备方式。测试样品通常可以是生物学和/或环境样品。生物学样品可衍生自人或其它动物，体液、实质组织样品、组织培养物或其所衍生的细胞及其后代、从任何这些来源制备的切片或涂片、或含有核酸的任何其它样品。优选的生物学样品是体液，包括但不限于尿液、血液、脑脊液、脊髓液、滑膜液、精液、羊水、脑脊液(CSF)和唾液。其它类型的生物学样品可包括食品和成分，例如乳制品、蔬菜、肉和肉副产品及废料。环境样品源自环境材料，包括但不限于：土壤、水、污水、化妆品、农业和工业样品以及从食品和乳制品加工仪器、设备、一次性及非一次性用品获得的样品。
根据本发明标记的多核苷酸还可用于凝胶迁移试验。此类试验也称为电泳迁移率变动分析(EMSA)、凝胶迁移率变动分析、条带迁移试验或凝胶迟滞试验，是研究蛋白质-DNA或蛋白质-RNA相互作用的常用技术。该方法可测定蛋白质或蛋白质混合物是否能结合给定DNA或RNA序列，有时能表明多于一种的蛋白质分子是否参与结合复合物。标记的寡核苷酸可用于凝胶迁移试验，先进行电泳，再通过显现荧光标记物的发射光来测定标记寡核苷酸在凝胶中的迁移程度。研究转录启动、DNA复制、DNA修复或RNA加工和成熟时，凝胶迁移试验可在体外与以下试验同时进行：DNA酶足迹法、引物延伸和启动子-探针实验。已知进行凝胶迁移试验的方法。参见，例如Garner，M.M.和Revzin，A.(1981)″定量测定蛋白质与特异性DNA区域结合的凝胶电泳方法：应用于大肠杆菌乳糖操纵子调控系统的诸组分(A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins tospecific DNA regions：application to components of the Escherichia colilactose operon regulatory system).″Nucleic Acids Res.9：3047-3060或Fried，M.和Crothers，D.M.(1981)″聚丙烯酰胺凝胶电泳的lac阻遏子-操纵子相互作用的平衡与动力学(Equilibria and kinetics of lac repressor-operatorinteractions by polyacrylamide gel electrophoresis).″Nucleic Acids Res.，9：6505-6525。
荧光标记的本发明多肽可用于各种试验。可进行此类试验与分辨蛋白质间特异性相互作用、蛋白质-核酸相互作用、感兴趣蛋白质和候选抑制剂或激活剂之间的相互作用。候选抑制剂或激活剂包括但不限于反义寡核苷酸、双链RNA、核酶、核酶衍生物、抗体、脂质体、小分子、无机或有机化合物。还可实施本发明试验以研究酶促动力学，以便进行，例如药物设计、筛选和/或优化，可利用溶液中或固定在固体基材上的荧光标记多肽进行该试验。
尤其感兴趣的是细胞表面受体及其相应配体之间的特异性相互作用。细胞表面受体是锚定在细胞质膜上或插入其中的分子。它们构成蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质的大家族，其不仅用作质膜的结构组分，还用作控制各种生物学功能的调控元件。在另一方面，蛋白质间的特异性相互作用包括细胞表面受体和免疫脂质体或免疫毒素。在还有另一方面，蛋白质间的特异性相互作用可包括胞质溶胶蛋白、核蛋白、伴侣蛋白或锚定在其它细胞内膜结构上的蛋白质。在还有另一方面，蛋白质间的特异性相互作用是靶蛋白(例如，抗原)和该抗原的特异性抗体之间。
通过在怀疑会发生相互作用的条件下混合两种实体来检验标记多肽和相互作用实体之间的特异性相互作用。通常利用光学装置显现相互作用。如果需要，这些实体可置于光学限制装置内(参见，例如美国专利号7,267,673和7,170,050)。如果要检测单分子，各光学限制装置仅含有一种所研究的靶标。这可通过将最少量的靶标稀释在大体积溶液中实现，从而在限制装置阵列上的沉积产生基础分布，或者大多数限制装置沉积有一种靶分子。可通过本领域可用的任何方法将标记多肽和相互作用实体固定在光学限制装置的内表面上。此类方法包括利用各种结合部分实现的共价和非共价连接。结合部分的选择取决于标记多肽和/或相互作用实体的性质。固定标记多肽或蛋白质性探针的一种方法包括利用链霉亲和素或亲和素/生物素结合配对。
在一个实施方式中，要与本发明化合物反应的多肽包含3到约80个氨基酸。此类多肽的例子包括但不限于：神经肽、细胞因子、毒素和肽酶或蛋白酶底物。荧光标记的神经肽、细胞因子和毒素可用于绘制图谱或显现各肽特异性受体的分布。例如，用本发明化合物标记时，可利用鬼笔毒环肽(环状肽结构的毒素)染色细胞中的F-肌动蛋白丝。再例如，用本发明荧光基团标记时，α-银环蛇毒素(基于肽的蛇毒)可用于检测乙酰胆碱受体。用本发明荧光基团标记的肽酶或蛋白酶底物可用于检验肽酶或蛋白酶活性，用于筛选设计为肽酶或蛋白酶抑制剂的药物。例如，可用选自本发明荧光基团的第一荧光基团(荧光供者荧光基团)标记包含可用肽酶切割的肽序列的肽中该肽序列的一端，用第二荧光基团(荧光受者荧光基团)(例如，本发明的另一荧光基团或淬灭部分)标记该肽序列的另一端，其中第一染料和第二染料形成荧光共振能量转移(FRET)配对。通过在所述肽酶切割该肽的前后检测FRET配对的供者荧光基团或受者荧光基团的荧光差异，可评估酶活性水平。
本发明制备的其它多肽偶联物包括抗体、凝集素、酶、脂蛋白、白蛋白、亲和素、链霉亲和素、膜联蛋白、A蛋白、G蛋白、运铁蛋白、脱铁运铁蛋白、藻胆蛋白和其它荧光蛋白、毒素、生长因子、微管蛋白、激素、各种受体和离子通道的那些偶联物。
在一个实施方式中，本发明化合物可与抗体反应。根据所需的应用，此类抗体可以是一抗或二抗。如果待检测抗原存在量极少，可利用二抗以放大信号。可标记各种二抗同种型。二抗同种型的非限制性例子是抗-小鼠IgG、抗-小鼠IgM、抗-家兔IgG、抗-大鼠IgG、抗-大鼠IgM、抗-豚鼠IgG、抗-鸡IgG、抗-仓鼠IgG、抗-人IgG、抗-人IgM、抗-山羊IgG、抗-小鼠IgG、抗-家兔IgG、抗-大鼠IgG、抗-绵羊IgG、抗-山羊IgG、抗-小鼠IgG、抗-人IgG、抗-大鼠IgG、抗-小鼠IgG、抗-人IgG、抗-大鼠IgG、抗-山羊IgG、和抗-家兔IgG。
或者，可用本发明化合物标记Fab片段。此类片段可优于完整的抗体偶联物，因为它们缺乏Fc区，其会降低与携带Fc受体细胞膜的非特异性相互作用和更好地透入组织。
本发明的标记二抗可用于信号放大试剂盒，例如由分子探针公司(Molecular Probes，Inc)商品化的那些。此类试剂盒各自能提供特异性针对一抗的两种标记抗体，所述一抗例如小鼠抗体。在一个实施方式中，本发明的家兔抗-小鼠IgG抗体偶联物首先用于结合小鼠来源的一抗。然后通过加入山羊抗-家兔IgG抗体的第二偶联物急剧增强荧光。
在还有另一实施方式中，可利用本发明化合物标记A蛋白和/或G蛋白。A蛋白和G蛋白是细菌蛋白，其以高亲和力结合各种物种的各类和亚类免疫球蛋白的Fc部分，例如牛、猫、鸡、狗、山羊、豚鼠、马、人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、人IgM、IgA、IgE、人IgD、小鼠IgG1等、猪、家兔、大鼠或绵羊，其可用于检测免疫球蛋白。或者，可用具有式I、III、IV、V或VI所示结构的本发明化合物标记免疫球蛋白，并在此类标记后保留对其靶标的结合特异性。这些标记的免疫球蛋白可用于体外或体内检测靶抗原。在本发明的各种实施方式中，此类标记的免疫球蛋白结合癌细胞上的抗原。在一些实施方式中，标记的免疫球蛋白结合erb2。
按照本发明制备的标记抗体可以是用于各种应用的一抗。虽然二级检测方法可提供显著的信号扩增，直接标记的一抗常产生较低的背景荧光和较低的非特异性结合。利用一抗还使得相同同种型的或衍生自同一物种的多种一抗在直接标记时可用于同一实验。
此类一抗的例子包括报道基因产物的特异性多克隆抗体。这些抗体包括抗-绿色荧光蛋白抗体、抗-谷胱甘肽S-转移酶抗体、抗-β-葡糖醛酸糖苷酶抗体、抗-β-半乳糖苷酶抗体、表位标签的特异性单克隆抗体、五His抗体、抗-HA抗体和抗-c-myc抗体。
还可制备细胞器特异性抗体以标记各种亚细胞细胞器和组分，例如内质网、过氧化物酶体、线粒体、或细胞色素c。标记的抗体还对氧化磷酸化系统中的蛋白质具有特异性，例如抗细胞色素氧化酶(复合物IV)的抗体或抗复合物I、II、III和V或其它线粒体蛋白质的抗体，例如抗-线粒体蛋白质抗体或抗-丙酮酸脱氢酶抗体。
在其它实施方式中，可制备增殖标记和细胞周期调控蛋白的特异性标记抗体。此类抗体包括，例如可用于TUNEL试验的抗-溴脱氧尿苷抗体(抗-BrdU抗体)、抗-人mRNA-结合蛋白HuR抗体(抗-HuR抗体)、抗-人神经元蛋白HuC/HuD抗体(抗-Hu抗体)、抗-cdc6肽抗体、抗-CD抗体、抗细胞周期蛋白D/细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的抗体和抗-磷酸肌醇抗体。
一些标记的抗体可以是结构细胞蛋白特异性的。此类抗体的例子是抗-α-微管蛋白单克隆抗体、抗-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、抗-结蛋白抗体或抗-纤连蛋白抗体。适用于本发明的其它抗体包括神经元蛋白的特异性抗体，例如抗-突触蛋白I抗体或抗-NMDA受体抗体。可按照本发明标记的其它多克隆和单克隆抗体包括抗-人Golgin-97抗体、抗-人运铁蛋白受体抗体、抗基质金属蛋白酶的抗体和抗-牛血清白蛋白抗体。
在采用本发明荧光化合物的免疫测定中，利用抗原和抗体之间的特异性相互作用。免疫测定允许单分子检测或总体检测。可进行本发明免疫测定以表征生物学实体，筛选抗体疗法并测定靶抗原的结构构象。例如，涉及抗体的免疫测定通过形成抗体-实体复合物而常规用于鉴定实体，所述抗体是生物学实体的特异性抗体或该生物学实体产生的副产物的特异性抗体。免疫测定还用于筛选能激活或下调有治疗潜力的靶抗原的生物学活性的抗体。免疫测定还利用能区分折叠成不同构象的靶蛋白的抗独特型抗体而可用于测定结构构象。
按照本发明的一个实施方式中，用本发明荧光基团标记的生物分子，例如蛋白质适用于体内成像，包括但不限于使生物分子在细胞、细胞、组织、器官或整个对象内成像。如果需要，可利用标记的生物分子进行染色和成像胞内给定分子(例如，特定细胞蛋白质)的“胞内蛋白质印迹”。
可将本发明荧光基团和/或本发明标记的生物分子以适合于所选给药途径的各种形式给予对象，即，口服或胃肠外。就此而言，胃肠外给药包括但不限于通过以下途径给药：静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、眼内、滑膜内、包括经皮在内的经上皮、眼科、舌下和口腔含化；局部途径，包括眼科、真皮、眼部、直肠和通过吹入和气溶胶的鼻吸入及直肠全身性给药。体内成像可为各种疾病的早期检测、筛选、诊断、图像引导的外科手术介入和治疗提供方法。例如，近红外荧光基团标记的毒素(Veiseh等，Cancer Res.67(14)，6882(2007))和抗体(Kulbersh等，Arch Otolaryngol HeadNeck Surg.133(5)，511(2007))已用于检测和指导外科手术除去肿瘤。在体内成像中，将荧光探针，例如用荧光基团标记的抗体首先给予动物(例如，哺乳动物)。然后通过施加波长适合荧光基团吸收的激发光并收集适合该荧光基团发射的另一波长的荧光信号使该动物成像。为使激发和发射光均有效穿透组织，荧光基团的吸收和发射波长通常可大于470nm、大于550nm、大于600nm或大于640nm。
在本发明的其它实施方式中，提供的对象体内成像方法包括以下步骤：给予有此需要的对象包含标记物的生物分子，所述标记物具有式I、III、IV、V、VI或VII所示结构，其中标记物的至少一个反应活性部分经历将该标记物连接于该生物分子的反应，其中所述生物分子还包含结合该对象细胞上指示该细胞的结合伴侣的靶向部分；该细胞上的结合伴侣与该生物分子的靶向部分结合，藉此相对于毗邻细胞差异性标记该细胞；将激发波长引向该细胞；和检测该对象细胞发射的荧光，藉此检测该对象的差异性标记细胞。所述生物分子可以是抗体、抗体片段、蛋白质、肽、脂质或碳水化合物。
还可利用本发明化合物产生标记的生物分子以便用于免疫组化和免疫细胞化学实验。在免疫组化(IHC)实验中，通过采用抗体特异性结合生物组织中存在的抗原这一原理测定组织切片中蛋白质的存在和定位。此类实验可用于，例如癌症的诊断和治疗。特定分子标记是特定癌症类型的特征，其是本领域技术人员已知的。IHC还可用于基础研究以便测定生物标记在组织的不同部分中的分布和定位。通过抗体与本发明的反应活性荧光化合物反应和利用标记抗体染色组织切片可显现抗体-抗原相互作用。在免疫细胞化学实验中，利用标记的抗体染色培养的细胞群。这些技术可与共焦扫描显微镜联用，其高度灵敏，还可用于显现多种蛋白质之间的相互作用。利用共焦显微镜还可能进行蛋白质的亚细胞定位。
尤其感兴趣的是利用标记的多肽进行免疫细胞化学实验。与荧光显微镜联用的荧光免疫细胞化学方法可显现细胞内的生物分子，例如蛋白质和核酸。一种方法利用一抗杂交所选靶标。然后利用偶联于本发明荧光染料并靶向一抗的二抗标记该复合物。用波长匹配染料的激发光谱的光激发来显现该复合物。
免疫细胞化学实验还可用于区分给定蛋白质或核酸的亚细胞定位。例如，利用各细胞靶标的不同抗体组共同定位细胞中的生物分子。例如，可用小鼠单克隆抗体标记一种细胞组分，而用家兔多克隆抗体标记另一组分。这些(抗体)称为一抗。然后利用二抗显现细胞靶标，该二抗是所述小鼠抗体或家兔抗体的二抗并偶联物本发明的不同荧光染料。
还可利用本发明化合物或本发明标记生物分子为各种应用标记细胞或颗粒。因此，本发明提供个别标记细胞群内细胞的方法，藉此该细胞相对于该群内的毗邻细胞作差异性标记。该方法通常包括使细胞与本发明的标记生物分子接触，其中所述生物分子包含结合指示所述细胞的结合伴侣的靶向部分，藉此相对于该群内的毗邻细胞差异性标记该细胞。靶向部分可以是识别待检测细胞上的结合伴侣的任何生物分子。可根据待标记的细胞对靶向部分作不同选择。例如，为检测癌细胞，靶向部分的选择应使其结合伴侣在癌细胞上差异表达。本领域已知大量癌症标记。它们包括但不限于：细胞表面受体，例如erb2、PDGF受体、VEGF受体、大量胞内蛋白质，例如磷脂酰肌醇3-激酶、c-abl、raf、ras以及包括转录因子和其它核酸结合分子在内的大量核蛋白。在一些其它实施方式中，癌症标记是免疫球蛋白εFc受体II、Alk-1，CD20、EGF受体、FGF受体、NGF受体、EpCam、CD3、CD4、CD11a、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CTLA-4、粘蛋白1、粘蛋白16、内皮素(Endoglin)、间皮素(Mesothelin)受体、Nogo受体、叶酸受体、CXCR4、胰岛素-样生长因子受体、神经节苷脂GD3、和α或β整联蛋白。为差异性标记各种细胞类型，可利用识别细胞特异性结合伴侣的靶向部分。例如，相对于B细胞或不同谱系的其它细胞，有大量蛋白质标记在T细胞上差异性表达。本领域还知道神经元标记、肌肉细胞标记以及指示外胚层、中胚层或内胚层起源细胞的标记，所有这些均可根据所需应用而使用。靶向部分可以是待标记细胞上的结合伴侣所识别的抗体、受体、细胞因子、生长因子和任何其它部分或它们的组合。标记的细胞可以胞内标记。
可采用许多体外方式(溶液中或固定在基材上)，通过将激发波长(光)引导至细胞并检测细胞发出的荧光使差异标记的细胞成像。
可进行流式细胞术来检测或定量测定标记的细胞和/或荧光强度。还可采用荧光激活细胞分选(FACS)，根据标记物的具体特性制备和分离用本发明化合物标记或用本发明标记生物分子染色的细胞或颗粒。本领域已知此类技术。简言之，用本发明荧光染料标记细胞，然后使之在悬浮介质中通过狭窄的滴嘴以使各细胞通常在小液滴中。激光检测器系统用于激发荧光，含阳性荧光细胞的液滴带有电荷。带电荷和不带电荷的液滴随着它们落在带电荷平板之间而分开，因此用不同试管收集。该仪器可用作分析工具，计数群体中的标记细胞数或分离细胞以供随后培养所选的群体。可利用第二激光系统进一步完善该系统，以正确角度首先观察第二荧光标记物或根据光散射衡量细胞大小。
进行荧光细胞分选的其它指导可见以下出版物：Darzynkiewicz，Z.，Crissman，H.A.和Robinson，J.P编.，“细胞计量术(Cytometry)”，第三版部分A和B(“分子生物学方法(Methods in Cell Biology)”，第63和64卷)，学术出版社(Academic Press)(2001)；Davey，H.M.和Kell，D.B.，″异质微生物群体的流式细胞术和细胞分选：单细胞分析的重要性(Flow cytometry and cellsorting of heterogeneous microbial populations：the importance of single-cellanalyses)″Microbiological Rev 60，641-696(1996)；Givan，A.L.，“流式细胞术：首要原理”(Flow Cytometry：First Principles)，第二版，约翰韦利父子公司(John Wiley and Sons)(2001)；Herzenberg，L.A.，Parks，D.，Sahaf，B.，Perez，O.，Roederer，M.和Herzenberg，L.A.，″荧光激活的细胞分选和流式细胞术的历史与未来：来自斯坦福的观点(The history and future of the fluorescenceactivated cell sorter and flow cytometry：a view from Stanford)″Clin Chem 48，1819-1827(2002)；Jaroszeski，M.J.和Heller，R编.，“流式细胞术方案(FlowCytometry Protocols)”(“分子生物学方法”(Methods in Molecular Biology)，第91卷)，休玛娜出版社(Humana Press)(1997)；Ormerod，M.G编.，《流式细胞术：实用方法》(Flow Cytometry：A Practical Approach)，第三版，牛津大学出版社(Oxford University Press)(2000)；Robinson，J.P编.，《最新细胞生物学方案》(Current Protocols in Cytometry)，约翰韦利父子公司(1997)；Shapiro，H.M.，″细胞计量术中的光学检测：光散射、消光、吸收和荧光(Optical measurement in cytometry：light scattering，extinction，absorption andfluorescence)″Meth Cell Biol 63，107-129(2001)；Shapiro，H.M.，《实用流式细胞术》(Practical Flow Cytometry)，第四版，WL公司(Wiley-Liss)(2003)；Weaver，J.L.，″流式细胞术指导(Introduction to flow cytometry)″Methods 21，199-201(2000)。
本发明的荧光化合物还可用于荧光寿命成像(FLIM)。FLIM是根据荧光样品的荧光衰减特征中的差异来产生图像的有用技术。其可用作共焦显微术和其它显微镜系统中的成像技术。FLIM中采用荧光团信号的寿命而非其强度来产生图像，其优点是最大程度降低厚的样品层中光子散射的影响。FLIM可用于生物医学组织成像，从而能探查的组织深度大于常规荧光显微术。
本发明化合物可用于单分子应用。通过观察荧光基团的各分子除去总体平均化可测定生物学和化学过程的机制。此类过程可包括运动蛋白，例如驱动蛋白或肌球蛋白的易位、形成、溶解和细胞蛋白复合物的易位及DNA或RNA聚合酶的作用机制。在此类实验中，本发明化合物可用于，例如标记连接于表面，例如显微镜载玻片或流动室的生物分子。随后可采用全内反射荧光显微术观察各荧光团。
本发明化合物还可用于标记脂质。脂质参与许多生物学过程，标记脂质和脂质筏常是研究它们的特性的有价值方法。可标记活细胞或人工系统，例如脂质体和胶束中的各种脂质单层和双层。例如，可用本发明化合物与霍乱毒素亚基B反应制备的荧光偶联物标记活细胞群，该偶联物与脂质筏特异性相互作用。然后可利用抗-霍乱毒素抗体将此类脂质筏交联入不同膜片，该抗体可用本发明化合物之一标记。
本发明的标记多肽可在原核和真核细胞中用作生物传感器，例如钙离子指示剂、pH指示剂、磷酸化指示剂、其它离子，包括但不限于镁、钠、钾、氯和卤离子的指示剂。例如，为检测钙离子，已知含有EF-手基序的蛋白质在结合钙离子后从胞质易位至膜。这些蛋白质含有通过与蛋白质的其它区域的疏水相互作用而包埋在分子内的肉豆蔻酰基。钙离子的结合诱导构象改变，从而暴露肉豆蔻酰基，然后其可用于插入脂双层。通过监测从胞质向质膜的易位，用本发明荧光染料标记此类含有EF-手的蛋白质使其成为胞内钙离子浓度的指示剂。可利用光学检测器，例如共焦显微镜进行此类监测。适用于该系统的EF-手蛋白质包括但不限于：恢复蛋白(1-3)、神经钙蛋白B、肌钙蛋白C、视椎蛋白、神经钙蛋白、钙调蛋白、小白蛋白等。
为用作pH指示剂，可利用依据富组亲动蛋白的系统。富组亲动蛋白是已知存在于网柄菌(Dictyostelium)中的富含肉豆蔻酰化组氨酸的蛋白质。它们与肌动蛋白和酸性脂质的结合极其依赖于细胞质pH范围内的pH。在活细胞中，膜结合看来超过富组亲动蛋白与肌动蛋白丝的相互作用。pH约6.5时，它们通常定位于质膜和核。相反，pH 7.5时，它们平均分布在胞质空间。该分布改变是可逆的，归因于分子表面上环中暴露的组氨酸簇。胞质pH改变范围中的胞内分布的逆转与组氨酸残基的pK为6.5一致。细胞分布不依赖蛋白质肉豆蔻酰化。将本发明荧光染料偶联于富组亲动蛋白，标记富组亲动蛋白的胞内分布后进行激光扫描、共焦显微术或标准荧光显微术。可通过细胞的线性扫描(激光扫描共焦显微术)或其它电子数据分析(例如，利用metamorph软件(通用成像公司(Universal Imaging Corp)))并求取在细胞群中收集数据的平均值来进行定量荧光分析。
本发明荧光蛋白还可用于涉及采用显微成像和电子分析自动筛选细胞阵列的应用。筛选可用于药物发现和功能基因组学领域：例如，本发明蛋白质用作全细胞的标记来检测多细胞重组和迁移中的改变，如通过内皮细胞形成多细胞微管蛋白(血管形成)，细胞经BD公司弗氏插入系统(Fluoroblok Insert System，Becton Dickinson Co.)的迁移，伤口愈合，神经突长出；蛋白质用作与肽融合(例如，靶向序列)的标记和检测胞内定位改变的蛋白质作为细胞活性指示剂，例如：信号转导，如激酶和刺激后的转录因子易位，如蛋白激酶C、蛋白激酶A、转录因子NFkB、和NFAT；细胞周期蛋白，例如细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白E；蛋白酶切割以及随后移动切割的底物，磷脂，胞内结构的标记，例如内质网、高尔基体、线粒体、过氧化物酶体、核、核仁、质膜、组蛋白、核内体、溶酶体、微管、肌动蛋白。
本发明荧光蛋白还可用于高通量筛选试验。本发明荧光蛋白通常比缺乏本发明荧光染料的蛋白质稳定。在一些方面，荧光蛋白可显示血清半衰期大于1小时、2小时、5小时或24小时或更高。
本发明荧光蛋白可用作第二信使检测器，例如将本发明荧光染料偶联于特异性信号传导结构域，如钙结合SH2-、SH3-、PH-、PDZ-结构域等。
检测靶离子
在一些实施方式中，本发明化合物用于检测靶离子存在与否或其浓度。通过吸收或荧光的改变测定化合物的光学应答。在一些实施方式中，包含螯合剂的本发明化合物显示净荧光发射强度改变至少两倍(升高或降低)，或荧光寿命改变1纳秒(缩短或增长)。在其它实施方式中，所述化合物对靶离子起反应而显示净荧光发射强度改变五倍或更高或荧光寿命改变100％。或者，显示激发或发射波长改变至少10nm(波长减小或增加)的化合物也是有用的，例如显示改变25nm或更大。当本发明化合物与靶离子接触后显示波长改变时，可在绝对度量内检测靶离子。在其它实施方式中，在生物液中作检测时，待检测靶离子的水平是，例如接近或低于典型的休眠值(restingvalue)。靶离子是Ca2+时，典型的休眠值约为10-7M。
为检测靶离子，本发明化合物与样品的混合方式将促进检测样品中该靶离子的浓度。样品是，例如已知或怀疑含有靶离子的细胞群、液体或液体悬液。其它样品包括，例如血细胞、培养的细胞、肌肉细胞、神经元等中的胞内液体；紧挨细胞外区域的胞外液体；囊泡中的；植物和动物的脉管组织中的；例如血液、唾液和尿液等生物学液体中的；生物发酵培养基中的；例如水、土壤、废水和海水等环境样品中的；工业样品，例如药物、食品和饮料中的；和化学反应器中的。检测和定量测定样品中的靶离子可有助于表征未知样品的身份，或有助于来源已知样品的质量控制。
通常在本领域已知的方法中利用本发明化合物检测样品中的靶离子水平。例如，将荧光数据处理成两种波长下的激发或荧光强度之比，而非一种波长下的绝对强度，进行离子浓度的比例检测(ratiometric measurement)。采用该方法，消除了可干扰离子浓度检测的许多变量。具体地说，比例检测中消除了影响信号强度的离子依赖性因素，例如胞内染料浓度不均、探针泄漏、染料漂白和细胞厚度，因为在两种波长下这些参数对强度的影响相似。该方法可通过观察指示剂的激发光谱，指示剂的发射光谱或二者而用于测定浓度。采用校正来弥补离子强度、粘度或样品内的其它条件导致的指示剂解离常数差异。例如，可利用离子载体，如A-23187、短杆菌肽、缬氨霉素或伊屋诺霉素实现校正。还可用样品中存在的第二荧光染料校正来实现非比例分析。
本领域已知和本文公开的任何装置可用于进行靶离子的光学检测和/或定量测定，例如利用仪器目测或利用荧光传感装置观察吸收或荧光改变。荧光传感装置包括荧光计、荧光显微镜、激光扫描仪、流式细胞仪和微流体装置以及照相机和其它成像设备。
以下实施例是为了说明本发明的实施方式。它们不应理解成对本发明或权利要求范围的限制。
实施例
实施例1.制备1号化合物
室温下搅拌CH3CN(200mL)中的6-氨基己酸甲酯盐酸盐(10g)、1，3-丙磺内酯(propanesulftone)(7.4g)和碳酸钾(11.4g)的混合物2天，然后在60℃加热1天。冷却至室温后，抽滤该混合物，将滤液真空浓缩至干。向残留物中加入EtOAc(200mL)，室温下搅拌悬液3小时。抽滤收集沉淀物。通过硅胶短柱纯化粗产物，用H2O/CH3(20g)洗脱。
实施例2.制备2号化合物
向H2O(20mL)配制的1号化合物(5g)中加入NaOH(3.8g)的H2O(20mL)溶液。室温下搅拌该混合物2小时，用HCl(6N)溶液将该溶液中和至pH＝7。真空浓缩溶液至干。粗产物经硅胶短柱脱盐，利用H2O/CH3CN作为洗脱剂。高真空下干燥收集的产物至恒重(3.5g)。
实施例3.制备3a-6a号化合物
3a-6a号化合物
3a：R＝-Cl
4a：R＝-HN(CH2CH2O)8CH2CH2CO2H
5a：R＝-HNCH(CH2SO3 -)CO2 -
6a：R＝-N(CH2CH2CH2SO3 -)(CH2CH2CH2CH2CH2CO2 -)2[Et3NH]+
40℃加热罗丹明110(0.2g)(Biotium目录号80103)在氯磺酸(3mL)中的混合物2小时，然后冷却至室温。将该溶液缓慢滴加到剧烈搅拌的碎冰上(80g)。抽滤除去沉淀物，用冷水(2x 5mL)洗涤得到粗制的3a号化合物，其对于大多数后续偶联反应足够纯，但为立即冻干保存可以制成更稳定。以上沉淀物冷却至0℃，加入含有Et3N(1mL)的CH3CN(5mL)和H2O(5mL)混合物配制的相应氨基烷酸(1当量H2N(CH2CH2O)8CH2CH2CO2H，磺基丙氨酸，或2号化合物)溶液。0℃搅拌该混合物30分钟，然后在室温搅拌2小时。真空浓缩溶液至干，利用C18反相柱通过制备型HPLC纯化粗产物得到4a、5a或6a号化合物。
实施例4.制备6b号化合物
0℃，向30％发烟硫酸(0.5mL)中一次性加入6a号化合物(10mg)。0℃搅拌该混合物1小时，倒入冰-冷却的Et2O(20mL)与Et3N(2mL)中。真空浓缩该溶液至干，利用反相C18柱通过制备型HPLC纯化残留物得到6b号化合物(6mg)。
实施例5.制备4b号化合物
利用4a号化合物作为起始材料，按照制备实施例4中6b号化合物的流程合成4b号化合物。
实施例6.制备4c号化合物
0℃，向4b号化合物(34mg)的DMF(500μL)溶液中加入Et3N(26μL)和TSTU(11mg)。0℃，搅拌该混合物30分钟，然后真空浓缩至干。向残留物中加入Et2O(1mL)，室温下搅拌该混合物1小时。离心收集沉淀物(30mg)，真空干燥至恒重。
实施例7.制备6c号化合物
按照4c号化合物的合成，从6b号化合物(8mg)制备6c号化合物(5mg)。
实施例8.制备7号化合物
将如实施例3所述从0.2g罗丹明110制备的3a号化合物冷却至0℃，加入含Et3N(1mL)的CH3CN(10mL)混合物配制的6-氨基己酸甲酯(1当量)溶液。0℃，搅拌该混合物30分钟，然后在室温下搅拌2小时。真空浓缩溶液至干，硅胶柱层析纯化粗产物得到7号化合物。
实施例9.制备8号化合物
向7号化合物(100mg)的CH3OH(2mL)溶液中加入1N NaOH(2mL)。室温下搅拌该混合物过夜，然后真空浓缩至干。将1N HCl(3mL)加入残留物，室温下搅拌得到的悬液3小时。抽滤收集8号化合物的沉淀物(60mg)。
实施例10.制备9号化合物
按照4c号化合物的合成，从8号化合物(22mg)制备9号化合物(20mg)。
实施例11.制备10号化合物
首先将3a号化合物与亚氨基二乙酸二-叔丁酯(1当量)反应以形成甲酯中间体(参见实施例8)来制备10号化合物。5℃，向该中间体(45mg)的CH2Cl2(1mL)悬液中加入三氟乙酸(0.5mL)。5℃，搅拌该混合物1小时，然后在室温下搅拌过夜。真空浓缩溶液至干，将Et2O(2mL)加入残留物。室温下搅拌该悬液3小时，通过离心收集沉淀物(20mg)。
实施例12.制备11和12号化合物
11号化合物：R＝-NH(CH2)5CO2CH3
12号化合物：R＝-N(CH2CO2-t-But)2
80℃，加热罗丹明110(0.2g)在氯磺酸(3mL)中的混合物1小时20分钟，然后冷却至室温。将该溶液缓慢滴加到剧烈搅拌的碎冰上(80g)。抽滤所得双磺酰氯染料中间体的沉淀物，用冷水(2x 5mL)洗涤。将粗产物冷却至0℃，加入含有Et3N(1mL)的CH3CN(10mL)混合物配制的6-氨基己酸甲酯或亚氨基二乙酸二-叔丁酯(1当量)溶液。0℃搅拌该混合物30分钟，然后在室温搅拌2小时。真空浓缩溶液至干，通过硅胶柱层析纯化粗产物得到11或12号化合物。
实施例13.制备13号化合物
按照实施例11中10号化合物的合成，利用TFA脱保护，从12号化合物(100mg)制备13号化合物(25mg)。
实施例14.制备14a号化合物和14b号化合物
80℃加热罗丹明110(0.2g)(Biotium目录号80103)在氯磺酸(3mL)中的混合物1小时，然后在室温下搅拌1小时。将该溶液缓慢滴加到剧烈搅拌的碎冰上(80g)。抽滤除去沉淀物，用冷水(2x 5mL)洗涤。将该沉淀物冷却至0℃，加入含有Et3N(1mL)的CH3CN(9mL)和H2O(1mL)混合物配制的5-氨基BAPTA甲酯(1当量)溶液。0℃搅拌该混合物30分钟，然后在室温搅拌2小时。真空浓缩溶液至干，通过硅胶柱层析纯化粗产物得到14a号化合物和14b号化合物。
实施例15.制备15号化合物
按照实施例9中8号化合物的合成，通过碱催化水解从14b号化合物(13mg)制备15号化合物(4mg)。
实施例16.制备16号化合物
向搅拌的7-羟基-2，2，4-三甲基-1，2，3，4-四氢喹啉(510mg)和邻苯二甲酸酐(198mg)的丙酸(5mL)混合物中加入对甲苯磺酸(100mg)。将该混合物小心回流24小时。冷却至室温后，真空蒸馏除去溶剂。通过硅胶柱层析纯化残留物得到橙色固体状的16号化合物(100mg)。
实施例17.制备17a号化合物和17b号化合物
80℃加热16号化合物(0.1g)在氯磺酸(2mL)中的混合物1小时，然后在室温下搅拌1小时。将该溶液缓慢滴加到剧烈搅拌的碎冰上(50g)。抽滤除去沉淀物，用冷水(2x 3mL)洗涤。将该沉淀物冷却至0℃，加入含有Et3N(0.5mL)的CH3CN(95mL)和H2O(0.5mL)混合物配制的氨基dPEG8酸(1当量)溶液。0℃搅拌该混合物30分钟，然后在室温搅拌2小时。真空浓缩溶液至干，利用C18反相柱，通过制备型HPLC纯化粗产物得到17a号化合物和17b号化合物。
实施例18.制备18号化合物
按照4c号化合物的合成，从17a号化合物(7mg)制备18号化合物(4mg)。
实施例19.制备19号化合物
室温下搅拌N-t-BOC-尸胺(0.5g)、6-溴己酸乙酯(0.46mL)和碳酸钾(0.7g)在CH3CN中的混合物2天。抽滤该混合物，真空浓缩滤液至干。硅胶柱层析纯化残留物得到无色油状的19号化合物(540mg)。
实施例20.制备20号化合物
室温下搅拌19号化合物(500mg)和NaOH(300mg)在H2O(10mL)中的混合物3小时。用1N HCl酸化溶液至pH＝5，真空浓缩至干得到无色固体(300mg)。
实施例21.制备21a号化合物和21b号化合物
80℃加热罗丹明110(0.2g)(Biotium目录号80103)在氯磺酸(5mL)中的混合物1小时，然后在室温下搅拌1小时。将该溶液缓慢滴加到剧烈搅拌的碎冰上(80g)。抽滤除去沉淀物，用冷水(2x 5mL)洗涤。将该沉淀物冷却至0℃，加入含有Et3N(1mL)的CH3CN(5mL)和H2O(5mL)混合物配制的20号化合物(1当量)溶液。0℃搅拌该混合物30分钟，然后在室温搅拌2小时。真空浓缩溶液至干，利用C18反相柱，通过制备型HPLC纯化粗产物得到21a号化合物和21b号化合物。
实施例22.制备22号化合物
0℃，向21b号化合物(15mg)在CH2Cl2(1mL)中的悬液中加入CF3CO2H(0.5mL)。0℃搅拌该混合物1小时，然后真空浓缩至干。将Et2O(2mL)加入残留物，室温下搅拌悬液2小时。离心收集沉淀物(7mg)。
实施例23.制备23号化合物
向DMF(100μL)配制的CF647 SE(1μmol)(Biotium目录号92135)和Et3N(10μL)中加入22号化合物(1μM)的DMF(100μL)溶液。室温下搅拌该混合物30分钟，然后真空浓缩至干。利用C18反相柱，通过制备型HPLC纯化残留物得到蓝色固体状23号化合物(2mg)。
实施例24.制备24号化合物
按照4c号化合物的合成，从23号化合物(2mg)制备24号化合物(2mg)。
实施例25.制备25a、26a、25b和26b号化合物
25a和26a号化合物        25b和26b号化合物
25a，26a：X＝CH
25b，26b：X＝N
80℃加热罗丹明110(0.2g)(Biotium目录号80103)在氯磺酸(3mL)中的混合物1小时，然后在室温下搅拌1小时。将该溶液缓慢滴加到剧烈搅拌的碎冰上(80g)。抽滤除去沉淀物，用冷水(2x 5mL)洗涤。将该沉淀物冷却至0℃，加入含有Et3N(1mL)的CH3CN(10mL)混合物配制的二-(2-吡啶甲基)胺(Aldrich，目录号385638)或(2-吡啶甲基)(吡嗪-2-基甲基)胺(J.Amer.Chem.Soc.，2008，130，15788)(1当量)溶液。0℃搅拌该混合物30分钟，然后在室温搅拌2小时。真空浓缩溶液至干，通过硅胶柱层析纯化粗产物得到25a、26a、25b或26b号化合物。
实施例26：制备蛋白质染料-偶联物
从各蛋白质和反应活性染料制备山羊抗-小鼠IgG(GAM)、山羊抗-家兔IgG(GAR)、链霉亲和素和膜联蛋白V的荧光偶联物。简言之，将1mg/mL的抗体或链霉亲和素在0.1mM pH 8.5碳酸氢钠缓冲液中以各种染料分子/蛋白质分子比例与反应活性染料之一混合。室温下温育约1小时后，利用PBS(pH 7.4)平衡的Sephadex G-25，通过凝胶过滤分离反应混合物。标记反应中所用的各种染料分子/蛋白质比例产生染料标记程度(DOL)不同的蛋白质偶联物，下表2列出了各染料/蛋白质配对。
表2.本发明制备的所选抗体和链霉亲和素偶联物的列表
利用JACSO荧光分光光度计检测抗体偶联物的荧光，然后对DOL作图得到图2。
实施例27：制备鬼笔毒环肽染料-偶联物
向DMF(200μL)中的氨基鬼笔毒环肽(1mg)和18号化合物(1.5当量)中加入N，N-二异丙基乙胺(3当量)，室温下搅拌混合物过夜。真空浓缩该溶液至干，通过LH-20柱的柱层析纯化残留物(1.5mg)。产物是固定的细胞制品中F-肌动蛋白丝的有效染色剂。
实施例28：荧光α-银环蛇毒素染料-偶联物的制备和使用
向α-银环蛇毒素(1mg)的0.1M碳酸氢钠(25μL)溶液中一次性加入18号化合物(1.5当量)，室温下搅拌该混合物2小时。依次通过G-25尺寸排阻柱和反相HPLC纯化产物。
实施例29：制备核苷酸-染料偶联物
向5-(3-氨基烯丙基)-2-脱氧尿苷5’-三磷酸(2mg，西格玛化学品公司(Sigma Chemical))的H2O(100μL)溶液中加入DMF和三乙胺(5μL)配制的4c号化合物。室温下搅拌该混合物3小时，然后真空浓缩至干。通过制备型HPLC纯化残留物。冻干诸产物部分得到黄色橙色核苷酸偶联物。
实施例30：制备寡核苷酸染料-偶联物
向H2O(4μL)配制的5’-胺-修饰的，18-碱基M13引物序列(100μg)中加入0.1M硼酸钠pH＝8.5缓冲液(200μL)配制的7号化合物(500μg)溶液。室温下搅拌该混合物过夜，加入3体积的冷乙醇。将该混合物冷却至-20℃，离心，轻轻倒出上清液，用乙醇洗涤沉淀物，然后溶解于H2O(100μL)中。通过制备型HPLC纯化标记的寡核苷酸。收集所需的峰，蒸发得到荧光寡核苷酸。
实施例31：用染料-抗体偶联物胞内染色的细胞的流式细胞术分析
固定一百万个Jurkat细胞，透化处理，与0.25μg小鼠抗-人CD3抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences))温育。然后将CD3抗体与用4c号化合物、Alexa Fluor488或DyLightTM 488以所示DOL(实施例26)标记的1μg山羊抗-小鼠IgG温育。利用BD FACS Calibur流式细胞仪分析各份样品约10,000个细胞，在FL1通道中检测荧光。为比较标记二抗的背景染色，还用同种型一抗代替该一抗进行染色实验。数据见图3A和3B。
实施例32：4c化合物和FITC之间的光稳定性比较
用1uM星孢素处理Jurkat细胞4小时以诱导凋亡。用4c号化合物或FITC标记的膜联蛋白V染色活细胞。用4c号化合物标记的膜联蛋白V的DOL为1.7，其按照实施例26制备。FITC-标记的膜联蛋白V是拜提公司(Biotium)的商业产品。将细胞装载到载玻片上，选择两个随机视野以供光稳定性研究。细胞连续暴露于奥林巴斯汞弧光灯显微镜(Olympus mercuryarc lamp microscope)，以30秒间隔捕捉图像，共2分钟。按照设置为100％的第一图像进行荧光标准化。
实施例33.用4c号化合物标记的山羊抗-小鼠IgG胞内染色Jurkat细 胞
图像：固定Hela细胞，透化处理，依次用小鼠α-微管蛋白抗体、5ug/mL4c号化合物标记的山羊抗-小鼠IgG(DOL 4.8)染色。用奥林巴斯汞弧光灯显微镜捕捉图像，放大率为60X，利用CCD照相机和ImagePro Express软件。

Claims (15)

1.式Ia所示化合物：
式中：
X是O；
A是-OH或-NR1R1a；
B是＝O或＝N+R4R4a；
R1、R1a、R4和R4a各自独立为H或C1-C12烷基；
R2、R3、R5、R6、R8和R9各自独立为H、卤素、CN、反应活性磺酰胺、-PO3 2-或-SO3 -；
R7是被-CO2 -、羧酰胺、-SO3 -、氯、氟或Rx取代的苯基；
Rx是异硫氰酸酯、异氰酸酯、一氯三嗪、二氯三嗪、卤素-取代的吡啶、卤素-取代的二嗪、亚磷酰胺、马来酰亚胺、氮丙啶、磺酰卤、酰卤、羟基琥珀酰亚胺酯、羟基磺基琥珀酰亚胺酯、吡咯-2,5-二酮、四氟苯酚酯、肼、叠氮基硝基苯基、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺、或乙二醛；
L是键或(Q)n；
各Q独立为NRd、S(O)t、O、C(＝X’)、未取代的烷基、或未取代的杂烷基，其中t是0-2，不超过两个NRd是毗连的，没有两个O毗连；
各X’独立为NRd、S或O；
n是1-20；
各Rd是H、未取代的烷基；以及
其中所述反应活性磺酰胺如式IIa所示：
式中：
R10是H或未取代的C1-C12烷基，
只要至少R2是反应活性磺酰胺。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，A是-NR1R1a，B是＝N+R4R4a。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，Rx与氨基、巯基或羟基亲核试剂形成共价键。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R2、R3、R5和R9独立选自：H、卤素、-PO3 2-、-SO3 -或
5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，Rx是N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
6.如权利要求1所述的化合物，其具有式IIIa所示结构：
式中：
R3是H、-SO3 -、或磺酰胺；
R11是-CO2 -或-SO3 -；和
R11a是H、-SO3 -或磺酰胺；
其中所述磺酰胺具有式IIb所示结构：
其中Rm和Rn各自独立地为H或C1-C12烷基。
7.如权利要求6所述的化合物，其特征在于，
R3是H或-SO3 -；和
L是Qn，其中至少1个Q是-(CH2CH2O)-。
8.如权利要求1所述的化合物，其具有式IV所示结构：
式中：
R3是H、-SO3 -、或磺酰胺；
R10是H、磺基丙基或磺基丁基；
R11是-CO2 -或-SO3 -；
R11a是H、-SO3 -、或磺酰胺；和
R12、R13、R14、R15、R16和R17各自独立为H或甲基；
其中所述磺酰胺具有式IIb所示结构：
其中Rm和Rn各自独立地为H或C1-C12烷基。
9.如权利要求3所述的化合物，其具有式V所示结构：
式中：
R3是H、-SO3 -、或磺酰胺；
R11是-CO2 -或-SO3 -；
R11a是H、-SO3 -、或磺酰胺；和
R12、R13、R14、R15、R16和R17各自独立为H或甲基。
10.一种制备标记生物分子的方法，包括将生物分子与如权利要求1所述的化合物反应。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述生物分子是蛋白质、多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质、或它们的组合。
12.一种试剂盒，其装有：
i)权利要求1至9中任一项所述的化合物；ii)缓冲液；iii)纯化偶联产物的材料或装置；和iv)指导所述化合物使用的使用说明书。
13.一种包含标记物的生物分子，所述标记物具有权利要求1至9中任一项所述化合物的结构，其中所述化合物的至少一个反应活性部分经历将所述标记物连接于所述生物分子的反应。
14.如权利要求13所述的生物分子，其特征在于，所述生物分子包含多核苷酸或多肽。
15.一种包含标记物的免疫球蛋白，所述标记物具有权利要求1至9中任一项所定义的结构，其中所述结构的至少一个反应活性部分经历将所述标记物连接于所述免疫球蛋白的反应，其中所述免疫球蛋白是特异性结合癌细胞上抗原的抗体。
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