CN108572165B - 一种pH平板光极荧光传感膜、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了pH平板光极荧光传感膜、制备方法及应用，属于监测二维pH值领域。所述的监测二维pH的荧光传感膜由荧光染料HPTS‑lipo制备，制备过程中将HPTS‑lipo采用水凝胶D4包埋。所述的荧光染料HPTS‑lipo通过在荧光染料HPTS的磺酸基团接入烷基胺制备。本发明的荧光传感膜，基于改性后的荧光染料HPTS‑lipo与荧光染料HPTS相比其pKa值得到显著的变化，因此荧光传感膜适用于不同的pH值监测，满足不同实验需求，且荧光染料HPTS‑lipo具有更好的疏水性，能在环境中保存更久时间，采用水凝胶D4包埋后进一步克服了染料泄露的问题。

Description

一种pH平板光极荧光传感膜、制备方法及应用

技术领域

本发明属于监测二维pH值的平板光极技术领域，更具体地说，涉及一种pH平板光极荧光传感膜、制备方法及应用。

背景技术

在环境领域，pH值是影响各类重金属、类金属元素地球化学循环的重要指标。以根际微区为例植物根系可通过分泌根系分泌物等行为影响到周边环境的pH值，引起根际酸化或碱化，因此根际效应对于研究重金属、类金属的地球化学循环来说至关重要。

目前传统方法对于pH的测量主要基于电极传感，一方面由于价格较为昂贵，且为单点测量，若在根际大面积布置成本较高，另一方面由于侵入性可能会破坏根际微界面并引起扰动影响根际活动。毋庸置疑，能对根际微环境或其它微区实现原位、实时、非侵入性检测，已经成为环境研究中的迫切需求。

自上世界90年代起，学者们对于二维荧光传感的研究进入了一个高速发展的时期，通过将荧光染料与包埋剂固定于一个平面内可实现对于待测物质的测量，目前已成功研发并施用于环境研究中的类似传感器包括：O₂、pH、CO₂及NH₃等。所制作成的荧光传感器灵敏度高、稳定性好且能适应环境的非均执性，十分适合用于相关待测物质的浓度检测及环境微界面的研究中。

近年来，光学传感器受到了越来越多的关注，尤其是对二维成像的平板光极技术的开发。由于具有原位、实时、非侵入性检测，已经成为环境研究中的迫切需求。

经检索，现有技术中对荧光传感膜的研究已公布了相关的申请案，如中国专利申请号 CN201410643390.4，公开日期为2015.02.18的申请案公开了一种pH荧光传感膜，包括薄膜基材，其将荧光染料CPIPA和荧光黄10-GN均匀混合，通过化学包埋法将两种荧光染料固定在薄膜基材表面。基于所述的pH荧光传感膜，本发明还公开了一种碱性沉积物pH二维动态分布检测方法，将pH荧光传感膜置于沉积物中，在激发光照射下通过成像装置获得两种染料光谱信息，通过R和B通道荧光比率定量方式获得到沉积物pH的分布特征。该申请案的传感膜将CPIPA与具有参比效应和增亮效应的荧光黄10-GN混合作为荧光指示剂，检测灵敏度、空间分辨率高，对pH变化响应灵敏。所述的方法采用平板电极技术，通过荧光比率定量减少光学干扰，实现对碱性沉积物pH二维、动态分布信息的实时、原位获取。然而该申请案中的荧光染料CPIPA仅仅适用于偏碱性的工作范围，限制了其在pH检测领域的应用。

中国专利申请号CN201110407804.X，公开日期为2013.04.03的申请案公开了一种用于检测pH的光学离子传感膜，它包括如下重量百分比的组分：ETH5418 0.38％-0.42％；四[3，5- 二-(三氟甲基)苯]硼酸钠0.44％-0.49％；上转换纳米棒2.09％-2.14％；聚氯乙烯33.13％-33.16％；癸二酸二(2-乙基己基)酯或邻硝基苯辛醚或邻苯二甲酸二辛酯补足至100％。本发明还公开了上述光学离子传感膜的制备方法及该传感膜在pH检测中的应用。该申请案的用于检测pH 的光学离子传感膜，用980nm波长的光激发，且发射也在近红外区，传感器不会受到背景吸收和背景荧光的干扰；且相对于传统有机体系本体系有更高的量子产率，可以产生高强度荧光。该申请案中的光学离子传感膜制备过程中需要耗费各种化学试剂，成本较高，不利于推广。

HPTS为8-羟基-1，3，6-三磺酸基芘，也是一种制备二维荧光传感膜的荧光染料。其是一类光谱性对pH变化有选择性的荧光材料，且兼具绿蓝色荧光发射等特点，而被广泛选做荧光染料应用于pH变化的荧光染料。不仅如此，HPTS还是一种极低毒性的水溶性荧光物质，其在水溶液中根据所处pH环境分别以质子化状态及去质子化状态的形式存在，HPTS具有很高的光量子产率及较大的斯托克斯位移，并且其pKa值决定HPTS是一种非常适合使用于自然环境及生物体内研究pH变化的荧光材料。但同时因为其极强的水溶性，限制了其在自然环境中的应用。

对于HPTS应用于荧光光纤传感器的研究现有技术也也公开了相关的申请案，如中国专利申请号CN201510171727.0，公开日期为2017.11.24的申请案提供一种监测pH值和氧分压的单点双参数荧光光纤传感器探头，包括光纤探针、固定在光纤探针上的聚氨酯水凝胶层及分散嵌入在聚氨酯水凝胶层中的pH敏感微粒和氧敏感微粒，所述pH敏感微粒通过将HPTS 共价固定于氨基改性的p-HEMA制备而成，所述氧敏感微粒通过溶剂三氯甲烷将Ru(dpp)₃ ²⁺包埋于有机改性硅酸盐制备而成。然而该申请案的方法制备萤光膜的过程较为繁琐。

因此，基于HPTS水溶性强，在自然环境中应用受限、用于监测pH的荧光传感膜产生的荧光染料容易泄漏、应用范围较窄的问题，亟需对HPTS进行改进以在监测二维pH领域获得更广泛的应用价值。

发明内容

1.要解决的问题

针对HPTS水溶性强，在自然环境中应用受限、制备成的pH的荧光传感膜的荧光染料容易泄漏、应用范围较窄的问题，本发明提供一种新的荧光染料及pH平板光极荧光传感膜、制备方法及应用。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种pH平板光极荧光传感膜，所述荧光传感膜由荧光染料HPTS-lipo制备，所述的荧光染料HPTS-lipo是在HPTS的磺酸基团引入二正丁胺或二甲胺制备而成。

作为本发明更进一步的改进，所述的荧光染料HPTS-lipo的制备方法包括以下步骤：

1)在NaOH溶液中，将HPTS与乙酸酐反应，无水乙醇提取产物并抽滤得羟基保护产品；

2)将羟基保护产品与氯化亚砜加热回流得到磺酰氯中间体；

3)以DCM为溶剂，将二正丁胺或二甲胺与磺酰氯中间体反应，反应结束后旋蒸、并用 NaOH脱保护，得到HPTS-lipo。

作为本发明更进一步的改进，所述的pH平板光极荧光传感膜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a)取水凝胶D4溶于含有无水乙醇的水溶液中，制备成水凝胶D4储备液；

b)配制所述的荧光染料HPTS-lipo储备液；

c)取水 凝胶D4储备液和荧光染料HPTS-lipo储备液混合，取混合液制膜。

作为本发明更进一步的改进，所述的混合液中水凝胶D4与荧光染料的质量比为100：1。

作为本发明更进一步的改进，所述的含有无水乙醇的水溶液中无水乙醇与水的体积比为 9：1。

作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种监测二维pH值的平板光极，所述平板光极采用pH平板光极荧光传感膜制备。

作为本发明更进一步的改进，所述的监测二维pH值的平板光极的应用方法，其特征在于：将所述的荧光传感膜固定在待测界面，在紫外激发光源下，利用图像捕捉系统动态获取待测界面pH的时空分布信息。

作为本发明更进一步的改进，所述的监测二维pH值的平板光极的应用方法，其特征在于：所述紫外激发光源的波长为405nm。

作为本发明更进一步的改进，所述的监测二维pH值的平板光极的应用方法，其特征在于：所述的图像捕捉系统包括CCD设备及存储终端设备。

作为本发明更进一步的改进，所述的监测二维pH值的平板光极的应用方法，包括以下步骤：

a)在10nm的Tris-HCl缓冲液中对所述的平板光极进行标定，分别用NaOH和HCl溶液调节pH；

b)在405nm LED灯的激发条件下逐点获取记录有荧光强度照片，并用ImageJ软件提取绿色通道的荧光强度，在Origin中利用Boltzmann方程进行拟合；

c)得到标线作为定量依据，将本发明的荧光传感膜应用于环境时，注意将荧光传感膜紧贴物体表面，在405nm的LED灯激发下，用相机记录照片，并用ImageJ软件提取绿色通道的荧光强度值，代入先前所拟合的曲线进行后续的数据处理得到pH的二维分布信息。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的pH平板光极荧光传感膜，其采用荧光染料HPTS-lipo制备，所述的荧光染料HPTS-lipo是在荧光染料HPTS极易溶于水的芳香磺酸盐结构接上烷基胺从而得到的衍生物，使荧光染料的疏水性得到大大增强，因此能够在环境中存在时间更久，进而使荧光传感膜满足长期实验的需求。

(2)本发明的pH平板光极荧光传感膜，其采用荧光染料HPTS-lipo制备，相比荧光染料HPTS具有小极性、疏水性强的特点，将荧光染料HPTS-lipo包埋于水凝胶D4中制备成荧光传感膜后，大大降低了荧光传感膜染料泄漏的可能性，拓展了荧光传感膜在pH监测领域的应用范围。而荧光染料HPTS由于具有极强的水溶性，如同样采用水凝胶D4进行包埋，在接触到水后即刻溶出，得到的荧光传感膜无法在自然环境中的应用，只能采用更为特殊的包埋剂或包埋方式进行处理，投入成本较高。

(3)本发明的监测二维pH值的荧光传感膜，由荧光染料HPTS-lipo制备而成，基于改性后的荧光染料HPTS-lipo与荧光染料HPTS相比其pKa值得到显著的变化，因此使制备而成的荧光传感膜适用于不同的pH值监测，满足不同实验需求。

(4)本发明的监测二维pH值的荧光传感膜，采用二甲胺-HPTS制得的荧光传感膜适用的pH范围为5～9，而二正丁胺-HPTS制得的荧光传感膜适用的pH范围为3～11，采用二正丁胺改性荧光染料HPTS的衍生物可适用于更广泛的pH范围，应用范围更广。

(5)本发明的监测二维pH值的荧光传感膜，由此荧光传感膜制备成的pH平板光极在实际应用过程中能够瞬间对信号做出响应，与现有技术中的pH平板光极相比响应时间大大缩短，利于推广。

(6)本发明的监测二维pH值的荧光传感膜，制备过程中将荧光染料HPTS-lipo采用水凝胶D4包埋，操作简单方便、成本低廉，相比采用复杂手段对染料分子进行包埋，降低了制膜难度，制备而成的荧光传感膜应用范围广，利于推广。

附图说明

图1是荧光染料HPTS-lipo制备的反应流程图；

图2是二甲胺-HPTS化学结构示意图；

图3是二正丁胺-HPTS化学结构示意图；

图4是实施例1的荧光传感膜应用时得到的拟合图谱；

图5是实施例2的荧光传感膜应用时得到的拟合图谱；

图6是二甲胺-HPTS紫外激发光谱图；

图7是二甲胺-HPTS在405nm激发下的发射光谱图；

图8是二正丁胺-HPTS紫外激发光谱图；

图9是二正丁胺-HPTS在405nm激发下的发射光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

本实施例的荧光染料HPTS-lipo制备过程包括以下步骤：

1)在2mol/L的NaOH溶液中，HPTS与乙酸酐按照1：3倍当量在室温条件下反应，无水乙醇提取产物并抽滤得羟基保护产品；

2)羟基保护的HPTS与氯化亚砜按照1：4倍当量于90℃条件下加热回流2h得到磺酰氯中间体，将氯化亚砜旋干后，得到HPTS-SO₂Cl；

3)将HPTS-SO₂Cl溶解于二氯甲烷中，在冰浴条件下按照1：3.1倍当量二甲胺逐滴加入，反应结束后旋蒸并用1mol/L的NaOH脱保护，得到终产物过柱分离得纯产品HPTS-lipo，即二甲胺-HPTS，图2是二甲胺-HPTS化学结构示意图。

图1是荧光染料HPTS-lipo制备的反应流程图。

将上述荧光染料HPTS-lipo制备成二维pH荧光传感膜，操作步骤如下：

1)取1g水凝胶D4溶于10mL 90％的无水乙醇：水溶液中(V/V＝90/10)，制备成水凝胶D4储备液；

2)配制浓度为1mg/mL的二甲胺-HPTS储备液；

3)取等体积凝胶D4储备液和二甲胺-HPTS储备液涡旋震荡至完全混合，所述的混合液中水凝胶D4与荧光染料的质量比为100：1。取适量混合液，利用100μm厚度的四面制备器及涂膜机均匀刮至PET基材的表面，待有机溶剂完全挥发后，获得厚度约10μm的荧光传感膜。

将上述荧光传感膜用于制作监测二维pH值的平板光极，本实施例还提供了一种监测二维 pH值的平板光极的应用方法，包括以下步骤：

a)在10nm的Tris-HCl缓冲液中进行pH平板光极的标定，分别用1mol/L的NaOH和HCl溶液调节pH；

b)在405nm LED灯的激发条件下逐点获取记录有荧光强度照片，并用ImageJ软件提取绿色通道的荧光强度，在Origin中利用Boltzmann方程进行拟合，

图4是实施例1的荧光传感膜应用时得到的拟合图谱，结果证明：荧光强度在pH范围 5～9的条件下具有良好的拟合关系。

c)得到标线作为定量依据，将本发明的荧光传感膜应用于环境时，注意将荧光传感膜紧贴物体表面，在405nm的LED灯激发下，用相机记录照片，并用ImageJ软件提取绿色通道的荧光强度值，代入先前所拟合的曲线进行后续的数据处理得到pH的二维分布信息。

在《High-resolution Imaging of pH in Alkaline Sediments and WaterBased on a New Rapid Response Fluorescent Planar Optode》的文献中，Han等人采用CPIPA做出的pH光极，响应时间在120s左右。而本发明的荧光传感膜制备的pH光极能够瞬间响应，大大缩短了现有技术中pH光极的响应时间。

分别进行紫外发射光谱及荧光发射光谱表征分析：

1)紫外发射光谱，狭缝宽度为1.0nm。待测液由0.01mg/mL二甲胺-HPTS甲醇溶液和不同梯度的pH缓冲液按照4：1混合。

图6是二甲胺-HPTS紫外激发光谱图，由图谱可知，光谱图中存在425nm及500nm双激发峰。改性后的二甲胺-HPTS具有极大的斯托克斯位移，避免了激发光对发射光的干扰，在应用中选择405nm的紫外LED作为激发光源。

2)荧光发射光谱：设置405nm的激发波长，狭缝宽度为1.0nm。待测液由0.01mg/mL二甲胺-HPTS甲醇溶液和不同梯度的pH缓冲液按照4：1混合。

图7是二甲胺-HPTS在405nm激发下的发射光谱图；由图谱可知，二甲胺-HPTS在550nm处存在最大发射波长。因此，在相机前设置550nm的高通滤光片来屏蔽其它光源的干扰。

进一步需要说明的是，本发明用于定量的信号捕捉系统及LED激发光源系统，对来源没有特殊的限制，在市场上购买、获取开源软件或自制均可。

实施例2

本实施例的荧光染料HPTS-lipo制备过程包括以下步骤：

1)在2mol/L的NaOH溶液中，HPTS及乙酸酐按照1：3倍当量在室温条件下反应，无水乙醇提取产物并抽滤得羟基保护产品；

2)羟基保护的HPTS与氯化亚砜按照1：4倍当量于90℃条件下加热回流2h得到磺酰氯中间体，将氯化亚砜旋干后，得到HPTS-SO₂Cl。

3)将HPTS-SO₂Cl溶解于二氯甲烷中，在冰浴条件下按照1：3.1倍当量将二正丁胺逐滴加入，反应结束后旋蒸并用1mol/L的NaOH脱保护，得到终产物过柱分离得纯产品HPTS-lipo，即二正丁胺-HPTS，图3是二正丁胺-HPTS化学结构示意图。

采用上述荧光染料HPTS-lipo制备二维pH荧光传感膜的步骤如下：

1)取1g水凝胶D4溶于10mL 90％的无水乙醇：水溶液中(V/V＝90/10)，制备成水凝胶D4储备液；

2)配制浓度为1mg/mL的二正丁胺-HPTS储备液；

3)取等体积凝胶D4储备液和二正丁胺-HPTS储备液涡旋震荡至完全混合，所述的混合液中水凝胶D4与荧光染料的质量比为100：1。取适量混合液，利用100μm厚度的四面制备器及涂膜机均匀刮至PET基材的表面，待有机溶剂完全挥发后，获得厚度为10μm左右的荧光传感膜。

在10nM的Tris-HCl缓冲液中进行pH平板光极的标定，分别用1M的NaOH和HCl溶液调节pH，在405LED灯的激发条件下逐点获取记录有荧光强度的照片，并用ImageJ软件提取荧光强度，在Origin中利用Boltzmann方程进行拟合。

图5是实施例2的荧光传感膜应用时得到的拟合图谱，结果证明荧光强度在pH范围3～11 的条件下具有良好的拟合关系。

因此可得，采用二正丁胺改性荧光染料HPTS的衍生物与二甲胺-HPTS衍生物相比，可适用于更广泛的pH范围，应用范围更广。

针对于本实施例分别进行紫外发射光谱及荧光发射光谱表征分析：

1)紫外发射光谱，狭缝宽度为1.0nm。待测液由0.01mg/mL二正丁胺-HPTS甲醇溶液和不同梯度的pH缓冲液按照4：1混合。图8是二正丁胺-HPTS紫外激发光谱图，由图谱可知，二正丁胺-HPTS光谱图中存在425nm及500nm双激发峰。改性后的二甲胺-HPTS具有极大的斯托克斯位移，避免了激发光对发射光的干扰，选择405nm的紫外LED作为激发光源。

2)荧光发射光谱，设置405nm的激发波长，狭缝宽度为1.0nm。待测液由0.01mg/mL二正丁胺-HPTS甲醇溶液和不同梯度的pH缓冲液按照4：1混合。图9是二正丁胺-HPTS在405nm激发下的发射光谱图。由图谱可知，二正丁胺-HPTS于550nm处存在最大发射波长，因此在相机前设置550nm的高通滤光片来屏蔽其它光源的干扰。

实施例3

本实施例的荧光染料HPTS-lipo制备过程包括以下步骤：

1)在2mol/L的NaOH溶液中，HPTS及乙酸酐按照1：3倍当量在室温条件下反应，无水乙醇提取产物并抽滤得羟基保护产品；

2)羟基保护的HPTS与氯化亚砜于90℃条件下加热回流2h得到磺酰氯中间体；在冰浴条件下以DCM做溶剂并将二正丁胺逐滴加入；

3)步骤2)反应结束后旋蒸干燥并用1mol/L的NaOH脱保护，得到终产物过柱分离得纯产品HPTS-lipo。

采用上述荧光染料HPTS-lipo制备二维pH荧光传感膜的步骤如下：

1)取1g水凝胶D4溶于10mL 90％的无水乙醇：水溶液中(V/V＝90/10)，制备成水凝胶D4储备液；

2)配制浓度为1mg/mL的二正丁胺-HPTS储备液；

3)取等体积凝胶D4储备液和二正丁胺-HPTS储备液涡旋震荡至完全混合，所述的混合液中水凝胶D4与荧光染料的质量比为100：1。取适量混合液，利用100μm厚度的四面制备器及涂膜机均匀刮至PET基材的表面，待有机溶剂完全挥发后，获得厚度约10μm的荧光传感膜。

以上对本发明所提供的二维pH荧光传感膜的制作方法进行了详细的介绍。本文中采用具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本方法原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种pH平板光极荧光传感膜，其特征在于：所述荧光传感膜由荧光染料HPTS-lipo制备，所述的荧光染料HPTS-lipo是在HPTS的磺酸基团引入二正丁胺或二甲胺制备而成。

2.根据权利要求1所述的pH平板光极荧光传感膜，其特征在于：所述的荧光染料HPTS-lipo的制备方法包括以下步骤：

1)在NaOH溶液中，将HPTS与乙酸酐反应，无水乙醇提取产物并抽滤得羟基保护产品；

2)将羟基保护产品与氯化亚砜加热回流得到磺酰氯中间体；

3)以DCM为溶剂，将二正丁胺或二甲胺与磺酰氯中间体反应，反应结束后旋蒸、并用NaOH脱保护，得到HPTS-lipo。

3.权利要求1或2所述的pH平板光极荧光传感膜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a)取水凝胶D4溶于含有无水乙醇的水溶液中，制备成水凝胶D4储备液；

b)配制所述的荧光染料HPTS-lipo储备液；

c)取水 凝胶D4储备液和荧光染料HPTS-lipo储备液混合，取混合液制膜。

4.根据权利要求3所述的pH平板光极荧光传感膜的制备方法，其特征在于：所述的混合液中水凝胶D4与荧光染料的质量比为100：1。

5.根据权利要求4所述的pH平板光极荧光传感膜的制备方法，其特征在于：所述的含有无水乙醇的水溶液中无水乙醇与水的体积比为9：1。

6.一种监测二维pH值的平板光极，其特征在于：所述平板光极采用权利要求1或2所述的pH平板光极荧光传感膜制备。

7.权利要求6所述的监测二维pH值的平板光极的应用方法，其特征在于：将所述的荧光传感膜固定在待测界面，在紫外激发光源下，利用图像捕捉系统动态获取待测界面pH的时空分布信息。

8.根据权利要求7所述的监测二维pH值的平板光极的应用方法，其特征在于：所述紫外激发光源的波长为405nm。

9.根据权利要求7或8所述的监测二维pH值的平板光极的应用方法，其特征在于：所述的图像捕捉系统包括CCD设备及存储终端设备。