CN104359884A - 一种pH荧光传感膜及碱性沉积物pH二维动态分布检测方法 - Google Patents

Abstract

一种pH荧光传感膜，包括薄膜基材，其特征在于，将荧光染料CPIPA和荧光黄10-GN均匀混合，通过化学包埋法将两种荧光染料固定在薄膜基材表面。基于所述的pH荧光传感膜，本发明还公开了一种碱性沉积物pH二维动态分布检测方法，将pH荧光传感膜置于沉积物中，在激发光照射下通过成像装置获得两种染料光谱信息，通过R和B通道荧光比率定量方式获得到沉积物pH的分布特征。本发明的传感膜将CPIPA与具有参比效应和增亮效应的荧光黄10-GN混合作为荧光指示剂，检测灵敏度、空间分辨率高，对pH变化响应灵敏。所述的方法采用平板电极技术，通过荧光比率定量减少光学干扰，实现对碱性沉积物pH二维、动态分布信息的实时、原位获取。

Description

一种pH荧光传感膜及碱性沉积物pH二维动态分布检测方法

技术领域

本发明涉及一种平板电极pH测定技术，具体涉及一种pH荧光传感膜及碱性沉积物pH二维动态分布检测方法，通过荧光分析方法，实现对湖泊或海洋碱性沉积物pH的二维、动态分布信息实时在线获取，同时适合水体及土壤中碱性范围pH的检测。

背景技术

沉积物作为湖泊营养物质重要的储蓄库，是水体营养物质的重要来源。沉积物中污染物或营养盐的迁移转化过程是环境微观领域中研究最活跃的研究方向之一，研究沉积物-水界面营养盐及污染物环境行为一直受到研究者的重视。

pH是评估湖泊、海洋沉积物中各种生物地球化学过程的主要参数，不仅控制沉积物微生物生命代谢过程，而且影响沉积物中营养盐和污染物的迁移转化，对维持生物地球化学循环和生态系统平衡发挥了极其重要作用。沉积物-水界面过程的发生大都以微尺度体现沉积物微环境下的物理、化学和生物效应。沉积物中的生物化学反应以及矿物溶解-沉淀反应会导致沉积物-水界面强烈的pH梯度变化。采用高分辨的技术准确反映pH分布信息及动力学变化是了解沉积物生物地球化学循环的关键。

电化学或化学测量技术是目前使用最广泛、最成熟的pH测量方法，这一方法简单、易操作，但是测量对象仅限于溶液等均匀性流体基质，不适用于沉积物和土壤的测量。微电极法和光纤传感器是近年来新发展的pH检测手段，具有高分辨率，高精确度和原位测量的特点，虽适合于沉积物以及上覆水pH检测，但仅能实现单点测量，且微电极价格昂贵、操作繁琐，无法实时获取沉积物pH二维分布信息。因此，现有的pH测量技术已不能适应现代环境分析检测的要求。

随着科技的发展，基于荧光分析原理的平板电极技术应运而生。平板电极技术突破了光谱技术和电化学分析的传统模式，将新型有机功能材料通过溶胀吸附、物理包埋、化学键合或者共聚结合等方式固定在薄膜基材上，结合光学数字成像技术对目标物和干扰物进行识别，实现对环境样本的原位、无损和在线监测。由于荧光响应时间极短(毫秒-秒级)，线性范围宽，使用平板型传感膜可以获得二维空间的实时动态信息。另外，平板电极设备简单，操作简便，重现性及精准性高，因此该技术具有传统技术无法比拟的巨大优势。尽管如此，当前大多数荧光pH指示剂多集中于酸性(如FITC：pH 4～6)或接近中性区域(如HTPS：pH 5.5～8.6)，严重制约了平板电极技术的应用。碱性沉积物pH监测技术难题体现在两个方面：1)缺乏良好的碱性pH荧光传感膜，且对pH变化响应灵敏；2)如何消减沉积物背景、光源衰减、薄膜漂白等因素干扰，因而针对碱性沉积物pH测量的平板电极技术尚未见报道。

发明内容

本发明针对碱性沉积物pH平板电极测定技术存在的上述问题，旨在提供一种pH荧光传感膜，所述的传感膜pH检测灵敏度、空间分辨率高，对pH变化响应灵敏，适用于检测pH在碱性区间的变化，扩宽了pH平板光电极的适用范围。

本发明的另一目的还在于提供一种碱性沉积物pH二维动态分布检测方法，采用基于荧光分析原理的平板电极技术，通过荧光比率定量减少光学干扰，如光源衰减、沉积物背景值干扰、染料流失或者漂白带来的数据误差，基于所述的碱性pH平板电极，实现对湖泊或海洋碱性沉积物pH的二维、动态分布信息实时、原位获取，该方法也适用于水体及土壤中碱性范围pH的检测。

概括地说，本发明首先合成具有共轭结构的希夫碱化合物4-((1E，3E)-3-((4-氯苯基)亚氨基)-1-丙烯基)-N，N-二甲氨基苯胺(C₁₇H₁₇ClN₂，CPIPA)，然后利用该化合物光致变色效应，对pH为6.0～10.5碱性区间响应进行荧光光谱学分析检测；其次，将CPIPA染料，与具有参比效应和增亮效应的另一种荧光染料-荧光黄10-GN，按照优化比例进行充分混合，然后通过化学包埋法将两种染料固定在薄膜基材上制得pH荧光传感膜。将pH荧光传感膜置于沉积物中，通过成像装置，在特定激发光照射下获得两种染料光谱信息，通过计算和转化可以获得到沉积物pH的分布特征。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种pH荧光传感膜，包括薄膜基材，其特征在于，将荧光染料CPIPA和荧光黄10-GN均匀混合，通过化学包埋法将两种荧光染料固定在薄膜基材表面。

所述的CPIPA和荧光黄10-GN的重量比为1∶1～4，优选1∶2。本发明将不同比例的CPIPA染料与具有参比效应和增亮效应的另一种荧光染料-荧光黄10-GN混合作为荧光指示剂，通过化学包埋法固定在基材表面后，得到适中的信号强度来表征pH值的高低。

所述的pH荧光传感膜采用以下方法制备：

(1)取120mg聚氯乙烯粒料，加入240μL塑化剂，振荡摇匀，再加入1mL四氢呋喃，按照质量百分浓度0.5％～1％和0.5％～4％分别添加两种荧光染料CPIPA和荧光黄10-GN，再加入3.0mg四(4-氯苯基)硼酸钾，超声溶解，获得pH荧光染料混合液。

(2)在涂膜前，充分混匀步骤(1)中得到的pH荧光染料混合液，用刮膜的方法将该混合液均匀涂覆在透明的薄膜基材上，室温干燥后得到所述的pH荧光传感膜，放在去离子水中备用。

所述的CPIPA的合成可参见Derinkuyu S，Ertekin K，Oter O等公开的方法(Fiber optic pHsensing with long wavelength excitable Schiff bases in the pH range of 7.0-12.0[J].Analyticachimica acta，2007，588(1)：42-49.)。

所述的薄膜基材优选PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)。

基于所述的pH荧光传感膜，本发明还涉及一种碱性沉积物pH二维动态分布检测方法，包括如下步骤：

(1)配制一组不同pH值的缓冲液，将所述的pH荧光传感膜置于缓冲液中，采用389nm的UV光源激发，并获取不同pH条件下pH荧光传感膜的荧光图像。

(2)对步骤(1)中获得的荧光图像，采用图像处理软件(如ImageJ)进行RGB三通道拆分，得到两种染料C₁₇H₁₇ClN₂和荧光黄10-GN分别对应的R和B通道的两种荧光强度图像，计算两个通道荧光强度比值I(R/B)，并将其与对应pH值进行曲线拟合，得到所述的pH荧光传感膜对pH响应曲线，pH荧光传感膜荧光释放特征可根据Hendersson-Hassebach修订方程(式1)描述：

$I=\frac{M_1-M_2}{1+e^{(\mathrm{pH}-\mathrm{pKa})/B}}+M_2---\left(1\right)$

式中I为不同pH值时荧光强度比值(R/B)，M₁为起始经验常数，M₂为最终经验常数，pKa为测量范围中心系数，B为Sigmoidal函数宽度。

(3)沉积物pH测试：将所述的pH荧光传感膜插入沉积物中，将清洗后的pH荧光传感膜按照与步骤(1)相同的方法获取荧光图像，再按照与步骤(2)相同的方法，由荧光图像上各点的荧光强度比值I根据pH响应曲线计算得到该点对应的pH值。

本发明的优点及有益效果：本发明采用新型pH混合荧光染料指示剂，通过荧光比率定量减少光学干扰，成功研制出碱性pH平板电极。该方法进一步扩宽了pH平板电极的适用范围，并首次用于检测pH在碱性区间的变化。

基于基于所述的pH荧光传感膜，根据本发明的碱性沉积物pH二维动态分布快速检测方法，同其它检测方法相比，具有以下优点：

(1)使用新型的碱性荧光材料制备pH荧光传感膜，并应用于pH为6.0～10.5范围碱性沉积物监测，国内外未见报道。在膜的配方上，并非仅仅依托一种指示剂染料，而是配合荧光黄10-GN染料的使用，在389nm激发光激发下，荧光黄10-GN具有很高的荧光亮度，不仅可以增强传感膜的亮度，而且还可以做为碱性荧光染料的参比染料，提高分析结果的准确度。

(2)荧光比率定量方式，有利于获得准确的pH分布特征。传统的定量方式多基于荧光强度，本发明方法采用CPIPA和荧光黄10-GN两种指示剂染料，二者释放的荧光分别位于获取图片的R和B两个通道，可以有效避免光学干扰，便于使用强度比值进行定量，该定量方法将进一步减少外界因素如光源衰减、沉积物背景值干扰、染料流失或者漂白带来的误差。

(3)灵敏度高，该方法可对pH值范围6.00-10.5呈S曲线响应，在7.5-10.0区间呈极佳的线性响应，检测灵敏度比传统方法提高1～2个数量级。

(4)分辨率高，可以获得50μm空间分辨率、秒级别时间分辨率的沉积物pH二维分布信息。该方法采用的传感膜的响应时间约为30s，可以快速获取剖面pH变化信息。

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。

附图说明

图1荧光染料(CPIPA)质谱鉴定图。

图2.CPIPA光谱特征。

图3平板电极系统工作原理图。

图4传感膜性能测试-均匀性。

图5传感膜性能测试-标准曲线。

图6传感膜性能测试-响应时间。

图7碱性沉积物pH二维分布图；其中(a)沉积物-水体剖面；(b)沉积物-水界面pH的二维分布图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1pH荧光传感膜及其制备

(1)荧光染料CPIPA的合成

对氯苯胺，对二氨基肉桂醛按照1∶1摩尔质量比例溶解在甲醇/二氯甲烷(5∶2v/v)混合溶剂中，室温条件下充分反应，过滤并重结晶后获得CPIPA，通过薄层硅胶板跑板或者质谱对得到化合物鉴定(图1)，结果表明获得物质中CPIPA纯度99.99％以上。

荧光染料CPIPA的光谱特征见图2。

(2)取120mg聚氯乙烯粒料，加入240μl塑化剂，振荡摇匀，再加入1mL四氢呋喃，分别添加两种荧光染料CPIPA和荧光黄10-GN(按照所得混合液浓度1％和2％，wt/wt)，以及3.0mg四(4-氯苯基)硼酸钾，超声溶解，获得pH荧光染料混合液。

(3)在涂膜前，采用涡轮搅拌器充分混匀(2)中得到的pH荧光染料混合液，并通过配有100微米厚度的刮刀的全自动刮膜机将该混合液均匀涂覆在透明的薄膜基材上，用100μm厚度刮刀进行刮膜的方法将该混合液均匀涂覆在透明的PET薄膜基材上，室温干燥2h后，得到干膜厚度约为6微米厚度的传感膜，放在去离子水中备用。

实施例2标准曲线绘制

(1)用0.1M的磷酸钠和磷酸二氢钠配成混合缓冲液，再使用氢氧化钠和稀盐酸调节pH值，使溶液pH值以变化幅度约0.5个单位在6-11之间变化，每调至稳定pH值时，采用389nm的UV-LED光源激发，并利用荧光比率图像获取系统(图3)获得不同pH条件下的荧光图像。

(2)对(1)中获得荧光图片，采用图像处理软件ImageJ 1.46，进行RGB三通道拆分，拆分成不同荧光强度图像，得到两种染料CPIPA和荧光黄10-GN分别对应的R和B通道荧光强度图像，计算两个通道荧光强度比值I(R/B)，并将其与对应pH值进行曲线拟合，得到该膜对pH响应曲线，pH平板电极传感膜荧光释放特征可根据Hendersson-Hassebach修订方程(1)描述：

$I=\frac{M_1-M_2}{1+e^{(\mathrm{pH}-\mathrm{pKa})/B}}+M_2---\left(1\right)$

式中I为不同pH值时荧光强度比值，M₁为起始经验常数，M₂为最终经验常数，pKa为测量范围中心系数，B为Sigmoidal函数宽度。

所述的pH荧光传感膜对pH响应曲线(标准曲线)如图5，最终拟合得到方程(2)为：

$\mathrm{pH}=0.918\×\ln (\frac{2.455}{I-0.976}-1)+8.082---\left(2\right)$

其中，在pH值范围为6.00-10.50呈S曲线响应，在7.5-9.5区间呈极佳的线性响应。

实施例3pH荧光传感膜均匀性和响应时间测试

(1)均匀性测试

将传感膜贴在pH值为7的溶液中，待稳定以后，拍摄图片。得到的图片先用ImageJ软件算出R通道和B通道的比值，再用Matlab软件进行作图。得到传感膜在5cm×5cm的范围内的RSD为1.55％(图4)。

(2)响应时间测试

将传感膜贴在pH值为7的溶液中，每隔10秒钟拍摄一张图片，至130秒时，立即把传感膜取出放入pH值为9的溶液中，每隔10秒拍摄一张图片。将图片用ImageJ软件分析后得到图片的R通道和B通道的比值，以该比值为纵坐标，拍摄时间为横坐标，得到传感膜的响应时间图(图6)。

实施例4碱性沉积物-水界面pH二维动态分布的测定

(1)采集太湖夏季蓝藻爆发时呈碱性水域的沉积物样和水样，带回实验室备用。按照上述流程制备好的pH传感膜(50mm×50mm)采用防水降到紧紧粘贴在两端开口的PMMA有机玻璃箱中(50mm×100mm×150mm)。

(2)进行测试时，将贴有传感膜的有机玻璃箱直接垂直插入沉积物中，用清水将有机玻璃箱周边的沉积物清洗掉，并用方塞底座固定好沉积物移至暗室采用荧光图像获取系统进行测试，计算方法参照实施例2。

(3)根据前述方法，计算或绘图后可以得到沉积物-水界面的pH二维动态分布(图7)。结果表明，该沉积物-水界面pH以及引灌结构洞穴清晰可见，其周围pH变化呈现明显的梯度变化，上腹水中最高pH值为9.08，最低值为7.64，平均值为8.73。图6中图片尺寸为1.24cm×3.78cm(292×895pixels)，即pH空间分辨率为42μm×42μm，可以满足沉积物微界面，如沉积物-水界面，沉积物-根际界面以及微生物群落等微环境中pH动态检测。

Claims (6)

1.一种pH荧光传感膜，包括薄膜基材，其特征在于，将荧光染料CPIPA和荧光黄10-GN均匀混合，通过化学包埋法将两种荧光染料固定在薄膜基材表面。

2.根据权利要求1所述的pH荧光传感膜，其特征在于，所述的CPIPA和荧光黄10-GN的重量比为1∶1～4。

3.根据权利要求1所述的pH荧光传感膜，其特征在于，所述的薄膜基材选自聚对苯二甲酸乙二醇酯。

4.根据权利要求1、2或3所述的pH荧光传感膜，其特征在于，所述的pH荧光传感膜采用以下方法制备：

(1)取120mg聚氯乙烯粒料，加入240μL塑化剂，振荡摇匀，再加入1mL四氢呋喃，按照质量百分浓度0.5％～1％和0.5％～4％分别添加两种荧光染料CPIPA和荧光黄10-GN，再加入3.0mg四(4-氯苯基)硼酸钾，超声溶解，获得pH荧光染料混合液；

(2)在涂膜前，充分混匀步骤(1)中得到的pH荧光染料混合液，用刮膜的方法将该混合液均匀涂覆在透明的薄膜基材上，室温干燥后得到所述的pH荧光传感膜。

5.一种碱性沉积物pH二维动态分布检测方法，包括如下步骤：

(1)制备权利要求1所述的pH荧光传感膜；

(2)配制一组不同pH值的缓冲液，将所述的pH荧光传感膜置于缓冲液中，采用389nm的UV光源激发，并获取不同pH条件下pH荧光传感膜的荧光图像；

(3)对步骤(2)中获得的荧光图像，采用图像处理软件将所得图像进行RGB三通道拆分，得到两种染料CPIPA和荧光黄10-GN分别对应的R和B通道的两种荧光强度图像，计算两个通道荧光强度比值I，并将其与对应pH值进行曲线拟合，得到所述的pH荧光传感膜对pH响应曲线，pH荧光传感膜荧光释放特征根据Hendersson-Hassebach修订方程(式1)描述：

$I=\frac{M_1-M_2}{1+e^{(\mathrm{pH}-\mathrm{pKa})/B}}+M_2---\left(1\right)$

式中I为不同pH值时荧光强度比值，M₁为起始经验常数，M₂为最终经验常数，pKa为测量范围中心系数，B为Sigmoidal函数宽度；

(4)沉积物pH测试：将所述的pH荧光传感膜插入沉积物中，将清洗后的pH荧光传感膜按照与步骤(2)相同的方法获取荧光图像，再按照与步骤(3)相同的方法，由荧光图像上各点的荧光强度比值I根据pH响应曲线计算得到该点对应的pH值。

6.根据权利要求5所述的碱性沉积物pH二维动态分布检测方法，其特征在于，所述的方法检测的pH范围为6.0～10.5。