CN101189520A - 荧光检测系统和供其使用的染料组 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种系统，其可包含：至少两个激发源，其每一者适于提供与至少一个其他激发源所提供的激发波长不同的激发波长；至少一个检测器；和多个光谱可分辨染料。也提供一组染料并且所述染料组可包含一种或一种以上的能量传递染料，并且每一种能量传递染料可包括两个或两个以上连接在一起的荧光共振能量传递染料部分。也提供一组能量传递染料，其中所述组的每一种能量传递染料包含与所述组的其他能量传递染料所提供的供体染料部分不同的供体染料部分，和与所述组的其他能量传递染料所提供的受体染料部分相同的受体染料部分。也提供使用所述系统的检测方法。

Description

荧光检测系统和供其使用的染料组
交叉引用的有关申请案
本申请案主张来自较早申请，即2005年5月3日申请的第60/677,233号美国临时申请案的利益，所述申请案是以引用的方式全部并入本文。
技术领域
本教示案涉及用于检测来自荧光染料的荧光的检测系统，和用于检测荧光染料的方法。
背景技术
为识别生物学和化学样品组合物，例如荧光染料和能量传递荧光染料的各种标记物可添加到样品中。许多荧光染料具有大的斯托克斯频移(Stokes shift)，也就是说，最大吸光率的波长与最大荧光发射的波长之间的大的差异。大的斯托克斯频移可使检测系统能在荧光染料的荧光发射的波长与用以激发荧光染料的激发源发射的波长之间进行区别。
发明内容
根据各种实施例，本教示案提供包含两个或两个以上的激发源、至少一个检测器和一组染料的检测系统。激发源可适于发射多个不同的个别激发束波长范围，其中各个激发源发射至少一种波长，所述波长在激发源之至少一个其他激发源的激发束波长范围内不发射。各个激发源可包含各自的个别辐射源或两个或两个以上的激发源可包含相同辐射源。举例而言，各个激发源可包含分离的发光二极管(LED)或激光源，或两个或两个以上的激发源可包含共同的广谱光源和适当的光学器件、滤光器、光栅等等。在一个示范性实施例中，可提供第一个激发源，其适于发射约460nm到约475nm的第一激发束波长范围，且可提供第二激发源，其适于发射约480nm到约495nm的第二激发束波长范围。第二激发束波长范围可在与第一激发束波长范围相比不同的时间或不同的方向上发射。在一些实施例中，提供一组激发源，其适于发射2、3、4个或4个以上不同的并且非重叠的激发束波长范围。
在一些实施例中，检测系统可包含一组染料和序列检测系统、电泳检测系统、毛细管电泳系统、凝胶或平板电泳系统、聚合酶链反应(PCR)检测系统、实时PCR检测系统、其组合等等的一种或一种以上的系统。
根据各种实施例，提供供按本文中描述的检测系统使用的一组染料，其中所述组的至少2种染料具有不同的吸收波长范围但相同或大体上重叠的发射波长范围。在一些实施例中，本教示案提供一组染料，其中所述染料组的至少一种染料为能量传递染料。在一些实施例中，染料组的至少一种染料可包含供体染料部分、受体染料部分和视需要连接子部分。在一些实施例中，本教示案提供一组包含两种或两种以上的能量传递染料的染料，其中染料组的各种能量传递染料包括不同于所述组中的其他种能量传递染料的供体染料部分，并且染料组的各种能量传递染料包括具有与所述组的其他种能量传递染料的受体染料部分相同的类型或结构和/或具有与其相同的光谱性质和/或发射波长范围的受体染料部分。在一些实施例中，本教示案提供一组能量传递染料，其中所述组的各种能量传递染料包括不同于所述组中的其他种染料的供体染料部分，并且所述组的各种能量传递染料包括具有与所述组的其他种染料的受体染料部分相同的类型或结构和/或具有与其相同的光谱性质和/或发射波长的受体染料部分。
在一些实施例中，提供一组染料，其中染料的至少一种染料包含通过连接部分(在本文中也称为连接子或连接子部分)彼此共价连接的供体染料部分和受体染料部分。在一些实施例中，通过供体染料部分发射的激发能可通过可依次发荧光的受体染料部分吸收。在一些实施例中，连接子部分可用以促进能量在至少一种能量传递染料的供体染料部分与受体染料部分之间的有效转移。在一些实施例中，供体染料部分与受体染料部分之间的能量传递可称为荧光共振能量传递，其为供体染料部分与受体染料部分的电子激发态之间的距离依赖性相互作用，其中激发是从供体染料部分转移到受体染料部分，而不从供体染料部分发射光子。
在一些实施例中，通过在相应能量传递染料中包括不同的供体染料部分，可提供一系列具有光谱可分辨激发吸收的能量传递荧光染料，并且通过在所述组的各个相应能量传递染料中包括相同类型的受体染料部分，能量传递染料可在共同的波长范围内发射，同时在不同的、光谱可分辨波长范围内吸收。同样地，所述组可连同按本文中描述的检测系统一起为有效的。在一些实施例中，本教示案的检测系统和染料组可适用于(诸如)在核酸序列定序分析中检测样品中的多标靶物质。
在一些实施例中，本教示案提供一组染料，其中染料组的至少一种染料为能量传递染料并且其中染料组的两种或两种以上的染料具有大体上重叠的发射波长。在一些实施例中，本教示案提供一组染料，其中染料组的至少一种染料为能量传递染料并且其中染料组的至少2个子集包含具有大体上重叠的发射波长的染料的两种或两种以上的染料。在一些实施例中，至少一种不为能量传递染料的荧光染料包括在一组染料中，所述染料组也包括至少一种能量传递染料。
在一些实施例中，检测系统可用以检测从一个或一个以上的样品保留区域，例如从一个或一个以上的容器发射的荧光，其中各个容器适于保留相应样品或样品的相应等分试样或部分。在一些实施例中，各个样品保留区域可包括安置于其中的样品并且各个样品可包括根据本教示案的一组染料。在一些实施例中，所述组的各种染料和/或所述组的各种相应能量传递染料的各个供体染料部分可在不同于所述组的其他种染料和/或其他供体染料部分的波长下吸收辐射，并且所述组的各种染料和/或所述组的各种相应能量传递染料的各个受体染料部分可在与所述组的至少一种其他染料和/或至少一个其他受体染料部分相同波长或与其大体上重叠的波长范围下发射辐射。
在一些实施例中，提供试剂盒，其包括根据本教示案的一组染料。所述组的至少2种染料可在与所述组的至少一种其他染料相同的波长下或大体上重叠的波长范围内发射辐射。
在一些实施例中，提供用于检测样品中的分析物的方法，其包括提供具有至少2种可检测染料的样品，其中各种可检测染料在通过可激发染料的适当辐射源的激发后，在与所述组的另一种染料的波长相同的波长下或在大体上重叠的波长范围内发射辐射。在一些实施例中，方法可包含检测包括至少一种能量传递染料的染料。在一些实施例中，方法包含用两种或两种以上的不同激发束照射样品，其中各个激发束包括落在所述组的至少一种相应染料的峰值吸收波长范围内的波长。方法可包括检测从染料由于其激发而发射的辐射。在一些实施例中，从染料发射的辐射可具有相同的发射波长或在大体上重叠的发射波长范围内。在一些实施例中，样品可用两种或两种以上的不同激发波长范围来顺序地照射。
附图说明
图1为根据各种实施例的系统的透视图，其用于检测在多个空间分离的样品容器中的不同分析物并且包括具有4种不同激发源和对应于各个样品容器的一个检测器的相应群组；
图2说明用于使用毛细管电泳的核酸定序并且包括根据各种实施例的检测系统的示范性系统；
图3为显示展示于图4A-4D中的4种不同荧光能量转移染料的正规化荧光发射光谱的图；并且
图4A-4D说明4种不同能量传递染料的分子结构，其可个别地用于4个不同的染料组中，并且包括染料5-CFB-DR110-2(图4A)、5-CFB-DR6G-2(图4B)、6-CFB-DTMR-2(图4C)和6-CFB-DROX-2(图4D)的结构。
应了解，上述一般描述和以下详细描述都仅是示范性和解释性的，并且欲提供本教示案的各种实施例的解释。
具体实施方式
根据各种实施例，则检测系统包含两个或两个以上的激发源、至少一个检测器和一组染料。两个或两个以上的激发源可适于发射多个不同的个别激发束波长范围，其中各个激发源发射至少一种波长，所述波长在激发源之至少一个其他激发源的激发束波长范围内不发射。各个激发源可包含各自的个别辐射源或两个或两个以上的激发源可一起通过相同辐射源来提供。举例而言，各个激发源可包含分离的发光二极管(LED)或激光源，或两个或两个以上的激发源可包含共同的广谱光源，例如卤素灯或其他光源，和适当的光学器件、滤光器、光栅等等。层化OLED或LED阵列可提供两个或两个以上的激发源。在一个示范性实施例中，可提供第一个激发源，其适于发射约460nm到约475nm的第一激发束波长范围，且可提供第二激发源，其适于发射约480nm到约495nm的第二激发束波长范围。第二激发束波长范围可在与第一激发束波长范围相比不同的时间或不同的方向上发射。在一些实施例中，提供一组激发源，其适于发射2、3、4个或4个以上不同的并且非重叠的激发束波长范围。
在一些实施例中，检测系统可包含一组染料和序列检测系统、电泳检测系统、毛细管电泳系统、凝胶或平板电泳系统、聚合酶链反应(PCR)检测系统、实时PCR检测系统、其组合等等的一种或一种以上的系统。
按本文中所使用，关于非能量传递染料和能量传递染料的供体染料部分的术语“光谱可分辨”可指具有足够相异的，也就是说，大体上非重叠的吸光率的不同染料，以便相应染料的吸收光谱可使用例如UV-可见光分光光度计的普通检测手段来分辨。
按本文中所使用，关于激发和发射的术语“峰值波长”可指在激发情况下提供能量的最大吸收，或在发射情况下，提供随从染料发射的辐射的最大能量释放的峰值波长或峰值波长范围。关于激发和发射的术语“相同的波长”可指处于精确相同或大约相同的峰值波长或具有大体上重叠的峰值波长范围。关于激发和发射的术语“不同波长”可指不精确相同或不处于大约相同的峰值波长或不具有大体上重叠的峰值波长范围的波长。具有不同激发波长和发射波长的染料之实例为光谱可分辨染料。不同波长之实例可包括相对于用于组中的其他供体染料部分的每个供体染料部分来说，重叠不超过大约50％的对应供体染料部分的激发波长。如果完全存在任何重叠，那么不同波长的重叠可不超过大约10％，不超过大约5％，或不超过大约1％。在一些实施例中，组中的非(能量传递)染料可吸收在不同于其他染料，例如不用于所述组内的能量传递染料的波长下的光。然而应了解，组的所有非(能量传递)染料和/或所有能量传递染料在不同波长范围中吸收光并非必要的。
按本文中所使用，术语“发射滤光器”可指适于提供来自组的一种或一种以上的染料的发射束的分离的任何装置。发射滤光器可包含滤光器、带通滤光器、光栅、分束器等等。
关于图示，图1说明用于使用呈经热循环的固定体积的PCR的核酸序列检测的示范性系统。激发源10、20、30和40可各自提供具有不同峰值波长和/或不同峰值波长范围的辐射。举例而言，激发源10可在约540nm的第一波长下发射描述为光束592的辐射，激发源20可在约560nm的第二波长下发射描述为光束594的辐射，激发源30可在约580nm的第三波长下发射描述为光束596的辐射，并且激发源40可在约600nm的第四波长下发射描述为光束598的辐射。从激发源10、20、30和40发射的激发束可被引导到安置在相应小瓶中的液体样品部分70。液体样品部分70可各自包含欲检测的核酸和一组染料，其中染料组包含可分别通过从激发源10、20、30和40发射的相应激发波长激发的染料。举例而言，可选择4种能量传递染料，其中每一种包含可通过4种不同激发源10、20、30和40的每一个激发源激发的不同的相应供体染料部分。4种能量传递染料的每种染料的受体染料部分可经选择以对各种能量传递染料来说为相同的，(例如)以便各种染料在激发后，在相同波长下发射辐射。(例如)在约620nm的发射波长下，从样品发射的发射束600可通过检测器50来检测。在一些实施例中，使用一组染料，其中所述组的各种染料发射例如620nm的相同峰值发射波长，其可为有益的。在这种情况下，可调整检测器以用于在620nm处，或在通过所述组的两种或两种以上的染料共享的任何发射波长处的最佳检测。
在一些实施例中，展示于图1中的系统可包括聚焦通过激发源所照射的激发束的一个或一个以上的透镜(未图示)，和/或引导激发束的一个或一个以上的镜子(未图示)。在按图1中所示的包含多辐射源作为多激发源的系统中，激发波长和发射波长可经选择以便其为全部不同的并且彼此光谱间隔或分离的，产生不需要滤光器以降低或消除重叠辐射的系统。
在一些实施例中，说明于图1中的激发源10、20、30和40可包含4个个别的LED。在一些实施例中，激发源可集成在一起，例如呈2层OLED形式，其包含分别具有不同OLED的2个层，其可提供2种不同的并且光谱间隔的相应激发波长。在一些实施例中，本文中描述的各种辐射源的任何辐射源可用作激发源10、20、30和40。
在一些实施例中，说明于图1中的系统可提供用于激发源10、20、30和40的每一个激发源的独立控制，例如，通过CPU、另一个处理器或通过逻辑来控制。处理器可包含(例如)经编程以每次启动一个激发源的计算机。处理器可包含在其中的仪器仪表控制电路。处理器可连接于检测器以使经启动激发源与通过检测器来检测的发射波长、发射波长范围或发射光谱协调和/或关联。经启动的激发源可与用于系统中的染料关联以检测核酸序列。
图2说明根据各种实施例的用于使用毛细管电泳的核酸定序的示范性系统。展示于图2中的激发源10、20、30和40可各自提供具有不同峰值激发波长和/或不同峰值激发波长范围的激发束798。激发束798可通过聚集透镜120瞄准并且通过透镜110聚焦于毛细管60上。毛细管60包括欲检测的核酸和经选择以可通过由激发源10、20、30和40提供的波长激发的能量传递染料。举例而言，可选择4种能量传递染料，每一种具有可分别通过激发源10、20、30和40的不同激发源激发的相应供体染料部分。受体染料部分可经选择以对4种转移染料的每一种染料来说为相同的，(例如)以便染料的每一种染料在相同波长下发射发射束。按所说明的，发射束800可通过聚集透镜80来瞄准并且通过成象透镜130成象于检测器50上。在一些实施例中，系统可包含(例如)作为激发源10、20、30和40的分离LED或层化OLED。
在一些实施例中，说明于图2中的系统可提供用于激发源20、20、30和40的每一个激发源的独立控制，例如，通过CPU或另一个处理器来控制。处理器可包含(例如)经编程以每次启动一个激发源的计算机。处理器可包含在其中的仪器仪表控制电路。处理器可连接于检测器以使经启动激发源与通过检测器检测的发射波长、发射波长范围或发射光谱协调和/或关联。处理器可控制激发源10、20、30和40的交替或时序操作或循环。经启动的激发源可与组的特定染料关联并且用以测定核酸的序列。
在一些实施例中，本教示案提供一组染料，其中所述组的至少2种染料具有不同的相应吸收波长和相同或大体上重叠的发射波长。按本文中所使用，术语“染料组”可指2、3、4种或4种以上的包含非(能量传递)和/或能量传递染料的染料的任何组合。在一些实施例中，本教示案提供一组染料，其中所述染料组的至少一种染料为能量传递染料。在一些实施例中，用于染料组的至少一种染料的发射的波长范围将与用于所述组的至少一种其他其他染料的发射的波长范围相同，或将大体上与其重叠。在一些实施例中，用于染料组的每一种染料的吸收的波长范围将相对于用于所述组的其他染料的吸收的波长范围来说，为光谱可分辨的。
连同本教示案一起使用的适合染料可为所属领域中已知的各种染料的任何染料，其包括(但不限于)若丹明(rhodamine)，荧光素，对甲氨基酚，派若宁(pyronine)，碳派若宁，香豆素，包括(但不限于)酞菁、金属卟啉和镧系元素复合物的卟啉，花青，半花青，方形酸，部花青、氟硼荧(bodipy)，包括(但不限于)氧络宁(oxonine)、resorufamine和试卤灵(resorufin)的吩噁嗪，吖啶，氨吖啶，卡巴嗪(carbazine)，啡噻嗪铵(phenothiazium)、吡喃洋(pyrylium)等等。
连同本教示案一起使用的适合染料的实例包括描述于(例如)以下专利中的所述染料的任何染料：Menchen等人，第5,188,934号美国专利；Benson等人，第6,020,481号的美国专利；Lee等人，第5,847,162号的美国专利；Benson等人，第6,008,379号的美国专利；Benson等人，第5,936,087号美国专利；Upadhya等人，第6,221,604号美国专利；Lee等人，第6,191,278号美国专利；Yan等人，第6,140,500号美国专利；Mao等人，第6,130,101号美国专利；Glazer等人，第5,853,992号美国专利；Brush等人，第5,986,086号美国专利；Hamilton等人，第6,140,494号美国专利；和Hermann等人，第5,750,409号美国专利，其各自关于荧光染料结构、荧光染料合成、结合于生物聚合物的荧光染料、荧光染料在能量传递染料中的应用和荧光染料光谱性质而以引用的方式全部并入。连同本教示案一起使用的适合染料的实例包括(但不限于)，5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、若丹明绿(R110)、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、N，N′-二乙基-2′，7′-二甲基-5-羧基-若丹明(5-R6G)、N，N′-二乙基-2′，7′-二甲基-6-羧基若丹明(6-R6G)、N，N，N′，N′-四甲基-5-羧基若丹明(5-TAMRA)、N，N，N′，N′-四甲基-5-羧基若丹明(6-TAMRA)、5-羧基-X-若丹明(5-ROX)、6-羧基-X-若丹明(6-ROX)、5-羧基-2′，4′，5′，7′，-4，7-六氯荧光素、6-羧基-2′，4′，5′，7′，4，7-六氯-荧光素、5-羧基-2′，7′-二羧基-4′，5′-二氯荧光素、6-羧基-2′，7′-二羧基-4′，5′-二氯荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、1′，2′-苯并-4′-氟-7′，4，7-三氯-5-羧基荧光素、1′，2′-苯并-4′-氟-7′，4，7-三氯-6-羧基-荧光素、1′，2′，7′，8′-二苯并-4，7-二氯-5-羧基荧光素，以及按下文表1中所展示的其他市售染料。
表1
荧光染料 吸光率(nm) 发射(nm) 消光系数
5-荧光素 495  520  73000
5-羧基荧光素(5-FAM) 495  520  83000
6-羧基荧光素(6-FAM) 495  520  83000
荧光染料 吸光率(nm) 发射(nm) 消光系数
6-羧基六氯荧光素(6-HEX) 535  556  73000
6-羧基四氯荧光素(6-TET) 521  536  73000
JOE 625  548  73000
LightCycler红640 625  640
LightCycler红705 685  705
Oregon绿488 496  516  76000
Oregon绿500 499  519  84000
Oregon绿514 506  526  85000
BODIPY FL-X 504  510  70000
BODIPY FL 504  510  70000
BODIPY-TMR-X 544  570  56000
BODIPY R6G 528  547  70000
BODIPY 650/665 650  665  101000
BODIPY 564/570 563  569  142000
BODIPY 581/591 581  591  136000
BODIPY TR-X 588  616  68000
BODIPY 630/650 625  640  101000
BODIPY 493/503 500  509  79000
5-羧基若丹明6G 524  557  102000
5(6)-羧基四甲基若丹明(TAMRA) 546  576  90000
6-羧基四甲基若丹明(TAMRA) 544  576  90000
5(6)-羧基-X-若丹明(ROX) 576  601  82000
6-羧基-X-若丹明(ROX) 575  602  82000
AMCA-X(香豆素) 353  442  19000
德州红(Texas Red)-X 583  603  116000
若丹明红-X 560  580  129000
马里纳蓝(Marina Blue) 362  459  19000
太平洋蓝(Pacifc Blue) 416  451  37000
若丹明绿-X 503  528  74000
7-二乙基氨基香豆素-3-甲酸 432  472  56000
7-甲氧基香豆素-3-甲酸 358  410  26000
Cy3 552  570  150000
Cy3B 558  573  130000
Cy5 643  667  250000
Cy5.5 675  694  250000
DY-505 505  530  85000
DY-550 553  578  122000
DY-555 555  580  100000
DY-610 606  636  140000
DY-630 630  655  120000
DY-633 630  659  120000
DY-636 645  671  120000
DY-650 653  674  77000
DY-675 674  699  110000
DY-676 674  699  84000
荧光染料 吸光率(nm) 发射(nm) 消光系数
DY-681 691 708 125000
DY-700 702 723 96000
DY-701 706 731 115000
DY-730 734 750 113000
DY-750 747 776 45700
DY-751 751 779 220000
DY-782 782 800 102000
Cy3.5 581 596 150000
EDANS 336 490 5700
WellRED D2-PA 750 770 176000
WellRED D3-PA 685 706 224000
WellRED D4-PA 650 670 203000
芘 341 377 43000
Cascade蓝 399 423 30000
Cascade黄 409 558 24000
PyMPO 415 570 26000
Lucifer黄 428 532 11000
NBD-X 466 535 22000
羧基萘基荧光素 598 668 42000
Alexa Fluor 350 346 442 19000
Alexa Fluor 405 401 421 35000
Alexa Fluor 430 434 541 16000
Alexa Fluor 488 495 519 71000
Alexa Fluor 532 532 554 81000
Alexa Fluor 546 556 573 104000
Alexa Fluor 555 555 565 150060
Alexa Fluor 568 578 603 91300
Alexa Fluor 594 590 617 73000
Alexa Fluor 633 632 647 100000
Alexa Fluor 647 650 665 239000
Alexa Fluor 660 663 690 132000
Alexa Fluor 680 679 702 184000
Alexa Fluor 700 702 723 192000
Alexa Fluor 750 749 775 240000
Oyster 556 556 570 155000
Oyster 645 645 666 250000
Oyster 656 656 674 220000
5(6)-羧基曙红 521 544 95000
赤藓红 529 544 90000
连同本教示案一起使用的适合染料也包括能量传递染料。按本文中所使用，“能量传递染料”包括任何染料，其包含经由连接子部分共价连接于受体染料的供体染料，以便供体染料能够在第一波长或波长范围吸收光并且以发射激发能量作为响应；和能够吸收通过供体染料发射的激发能量并且以在第二波长或波长范围发荧光作为响应的受体染料。
连同本教示案一起使用的适合能量传递染料可包括包含上文所列的具有与上文定义一致的光谱性质的任何染料对的能量传递染料。适于连同本教示案一起使用的能量传递染料的实例包括(但不限于)描述于(例如)以下专利中的所述能量传递染料：Mathies等人，第5,728,528号美国专利，Lee等人，第5,863,727号美国专利，Glazer等人，第5,853,992号美国专利，Waggoner等人，第6,008,373号美国专利，Nampalli等人，第20040126763 A1号美国专利申请公开案，Kumar等人，第WO 00/13026A1号的PCT公开案和第WO 01/19841A1号PCT公开案，其各自关于能量传递染料结构、能量传递染料合成、能量传递染料连接子、替代性供体染料、替代性受体染料和能量传递染料光谱性质而以引用的方式将其所揭示之全部并入本文。
能量传递染料通常可提供比非能量传递荧光染料更大的有效斯托克斯频移，因为能量传递染料的斯托克斯频移是由供体染料最大限度吸收光所处的波长与受体染料最大限度发射激发能量所处的波长之间的差异决定。所属领域的技术人员应了解，通过了解各种可能的供体染料和受体染料的斯托克斯频移，可能制备具有所要求的最大吸收波长、所要求的最大发射波长和所要求的斯托克斯频移的能量传递染料。
尽管荧光染料描述为用于检测分析物的标记，但是应了解，代替所述染料或除所述染料之外，可使用Qdot生物结合物。因此，应了解，在本文中描述荧光染料的使用时，可因此用Qdot生物结合物取代。Qdot生物结合物为可用以描述偶合于可用以直接将量子点结合于所关注的标靶的蛋白质、寡核苷酸、小分子等等的Qdot纳米晶体的术语。Qdot生物结合物的实例可包括抗生蛋白链菌素、蛋白质A和结合物的生物素家族。关于Qdot生物结合物的其他信息可见于M.P.Bruchez等人，Semiconductor nanocrystals asfluorescent biological labels，Science 1998，281，2013和第2005/0141843号美国专利申请公开案中，所述专利是以引用的方式全部并入本文。Qdot生物结合物可从InvitrogenCorporation，1600 Faraday Avenue，Carlsbad，California 92008获得。
所属领域的技术人员应了解，荧光染料和荧光能量转移染料与包括多核苷酸的生物分子的共价连接(也就是说，结合)在所属领域中是熟知的。举例而言，染料或能量传递染料与生物分子的结合或一种染料或染料部分与另一种染料或染料部分的结合，可通过染料或能量传递染料的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)的形成，接着NHS酯与共价连接于生物分子的连接子或共价连接于另一种染料的连接子上的胺基的后续反应来达到。用于将染料和能量传递染料或其部分结合于连接子和生物分子的许多实例和方法在上文引用的参考文献中给出。
在一些实施例中，包括至少一种能量传递染料的多种染料可包括在染料组中。所述组的一种或一种以上的能量传递染料的每一种能量传递染料可包括供体染料部分、受体染料部分和连接子。供体染料部分可能够在第一波长处或在第一波长范围内吸收辐射，并且在第二、不同波长处或在第二波长范围内发射激发能量，而受体染料部分可能够吸收从供体染料部分发射的激发能量并且发荧光以响应激发。
在一些实施例中，可提供一组包含两种或两种以上的能量传递染料的染料。所述组的各种能量传递染料可包括相对于所述组的其他染料来说，光谱可分辨的供体染料部分，和受体染料部分，其与所述组的其他受体染料部分相同或具有与所述组的其他受体染料部分的发射波长或发射波长范围相同的，或大体上与其重叠的发射波长或发射波长范围。应了解，通过在所述组的各种能量传递染料中包括相同受体染料部分或具有相同或大体上重叠的发射波长的受体染料部分，能量传递染料可在共同波长范围发射但在光谱可分辨的波长范围中吸收。按本文中所使用，当用以描述荧光染料的重叠发射和/或吸收波长时，术语“大体上重叠”意思是波长范围重叠至少约50％。
在一些实施例中，一组染料可包括一种或一种以上的能量传递染料和一种或一种以上的非能量传递染料。一种或一种以上的非能量传递染料可包含(例如)选自以下染料的一种或一种以上的染料：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、若丹明绿(R110)、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、N，N′-二乙基-2′，7′-二甲基-5-羧基若丹明(5-R6G)、N，N′-二乙基-2′，7′-二甲基-6-羧基若丹明(6-R6G)、N，N，N，N′-四甲基-5-羧基若丹明(5-TAMRA)、N，N，N′，N′-四甲基-5-羧基若丹明(6-TAMRA)、5-羧基-X-若丹明(5-ROX)、6-羧基-X-若丹明(6-ROX)、5-羧基-2′，4′，5′，7′，-4，7-六氯-荧光素、6-羧基-2′，4′，5′，7′，4，7-六氯荧光素、5-羧基-2′，7′-二羧基-4′，5′-二氯荧光素、6-羧基-2′，7′-二羧基-4′，5′-二氯荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、1′，2′-苯并-4′-氟-7′，4，7-三氯-5-羧基-荧光素、1′，2′-苯并-4′-氟-7′，4，7-三氯-6-羧基荧光素，1′，2′，7′，8′-二苯并-4，7-二氯-5-羧基荧光素，以及按上文表1中展示的其他市售染料。适合能量传递染料可包括(但不限于)展示于图4A-4D中的所述能量传递染料以及包含一些组合的能量传递染料，所述组合包括选自以下者的一种或一种以上的供体染料部分：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、若丹明绿(R110)、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明和Cy3，与受体染料N，N′-二乙基-2′，7′-二甲基-5-羧基若丹明(5-R6G)、N，N′-二乙基-2′，7′-二甲基-6-羧基若丹明(6-R6G)、N，N，N′，N′-四甲基-5-羧基若丹明(5-TAMRA)、N，N，N′，N′-四甲基-5-羧基若丹明(6-TAMRA)、5-羧基-X-若丹明(5-ROX)、6-羧基-X-若丹明(6-ROX)、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。应了解，基于所要求的光谱性质，通过从(例如)表1选择供体染料部分和受体染料部分，以便染料组的供体染料部分的发射波长范围与染料组的其他相应受体染料部分的发射波长范围相同或大体上与其重叠，其他能量传递染料组合是可能的。
在一些实施例中，一组染料可包括根据本教示案的染料的两个或两个以上的不同子集。所述染料组可一起使用以检测样品中的甚至更大数量的不同分析物。举例而言，可提供2种染料的2个组，其中2种染料的各个组包含2种非能量传递染料、2种能量传递染料，或1种能量传递染料加1种非能量传递染料。在各组中，所述组的2种染料，无论其包含非能量传递染料、能量传递染料还是两种均包含，其可具有相同或大体上重叠的发射波长范围，并且各组的2种染料可具有光谱可分辨的吸收波长范围。
使用表1中说明的染料作为实例，可产生一组染料，其包含3种能量传递染料和1种非能量传递染料。在所述组中，3种能量传递染料的每一种可具有ROX部分作为受体染料部分，并且每一种能量传递染料可分别具有FAM部分、TET部分或TAMRA部分之一作为供体染料部分。所述配置可提供3种能量传递染料的一个组，其具有光谱可分辨的吸收波长和相同的发射波长。除3种能量传递染料外，所述组也可包括ROX作为非能量传递染料，在所述情况下，所述组的全部4种染料将具有光谱可分辨的吸收波长和相同的发射波长。
在另一实例中，可产生一组染料，其包含在子集内具有相同发射波长的染料的子集。举例而言，在一个子集中，Cy5部分可用作能量传递染料中的受体染料部分，其中FAM部分为供体染料部分，并且Cy5可用作非能量传递染料以提供2种染料的一个组，2种染料各自具有Cy5发射波长但各自具有相对于所述组的另一种染料的光谱可分辨的吸收波长。所述组也可包括子集，其中ROX部分用作分别包含TET部分或TAMRA部分作为供体染料部分的能量传递染料的受体染料部分，并且ROX可用作所述组的非能量传递染料。因此，可预见5种染料的一个组，其具有2组光谱可分辨的发射波长(例如ROX和Cy5)和5种光谱可分辨的吸收波长的一个组。
应了解，除先前实例中的染料的每一种染料外或代替先前实例中的染料的每一种染料，可使用许多其它的染料和能量传递染料。此外，具有先前实例中描述的类型的能量传递染料可根据Lee等人，第5,800,996、5,863,727和5,945,526号美国专利的教示来制得，所述专利以引用的方式全部并入。
在一些实施例中，多种能量传递染料可提供于一组能量传递染料中，其中多种能量传递染料的供体染料部分的每一个供体染料部分在当与所述组的其它染料相比时，在不同波长处或在不同波长范围内吸收辐射。所述组的相应能量传递染料的受体染料部分可全部具有与所述组的其它受体染料部分相同的结构或具有大体上重叠的峰值发射波长范围。
在一些实施例中，所述组的多种能量传递染料的各个受体染料部分不同于至少一个其他受体染料部分，但多种能量传递染料的各个受体染料部分在相同峰值发射波长范围内或在重叠用于所述组中的其它受体染料部分的至少一个部分的发射波长范围的至少约50％的发射波长范围内发射辐射。
在一些实施例中，所述组的相应能量传递染料的受体染料部分可在相同发射波长范围发射辐射，例如，各个受体染料部分可在第一发射波长范围内发射辐射并且所有峰值发射波长范围重叠检测器的一个可检测的波长范围，(例如)以便各自发射落在同一20nm宽的带或10nm宽的带波长中的峰值波长。尽管例证20nm宽的带和10nm宽的带，但是可选择其它宽度的波长带。相应发射可发生以响应能量传递染料的相应供体染料部分的相应激发。
根据本教示案的试剂盒或一组染料可适用于许多应用，并且提供(例如)为：经标记的核苷酸或经标记的核酸序列；共价连接于DNA定序反应中的终止基因核苷酸的标记；共价连接于PCR引物的标记；共价连接于PCR探针的标记；其组合；等等。在一些实施例中，染料可提供为所述标记。在一些实施例中，试剂盒可包含所述标记一起在单一管、小瓶或另一容器中的混合物。如果用作连接于核苷酸的标记，那么标记可(例如)与样品中的互补核酸序列，例如与DNA分子反应和键合。举例而言，在一些实施例中，本教示案提供视需要包含至少一种能量传递染料的一组染料，其中所述组的各种染料共价连接于多核苷酸探针并且多核苷酸探针共价连接于至少一种中止剂部分。各种染料的荧光可大体上通过中止剂部分来中止，而探针为完整的。在一些实施例中，探针可(例如)通过具有5′-核酸外切酶活性的聚合酶来分裂，因此引起中止剂部分从染料的剩余染料结构的分离并且产生从先前所中止的染料的剩余染料结构的增强荧光发射。在一些实施例中，中止剂部分可包含可具有低背景值荧光的非荧光中止剂染料的部分。可用于根据各种实施例的各种染料组的示范性中止剂染料、能量传递染料、供体染料、受体染料和其部分描述于(例如)Livak等人的第5,876,930号美国专利和Lee等人的第5,863,727号美国专利中，所述专利以引用的方式全部并入本文。可使用其它中止剂部分，例如杂交中止剂，诸如描述于以引用的方式全部并入本文的第6,750,024号美国专利中的所述中止剂。
在一些实施例中，提供至少一种辐射源，其可提供至少2种激发源并且在至少2种不同的相应波长下，例如在至少2种不同的、间隔分离和非重叠波长范围发射辐射。可使用1、2个或2个以上的激发源。至少2种不同的波长或波长范围可分离地照射于样品以先检测第一分析物并且然后第二次检测第二分析物。在一些实施例中，2种激发源可包含单一光源，例如包括具有不同的可见光颜色的波长的白色光源。如果使用单一光源，那么一个或一个以上的滤光器、棱镜、衍射光栅、其它光谱分离装置或其组合可用以独立地提供第一峰值波长范围的辐射和不同的、第二峰值波长范围的辐射。
根据各种实施例，(例如)当2种欲检测的分析物连接于2种相应染料，并且染料之一在当用处于第一峰值波长范围的辐射照射时显示相对增加，而另一种染料在当用处于第二峰值波长范围的辐射照射时显示相对增加，就可完成检测。在所述系统中，单一检测器可用以检测来自各种染料的发射并且2种分析物可基于用以引起可检测发射的激发源而彼此区别。可检测单个样品中的多个不同分析物，其取决于所述组的不同染料的数量，并且检测不限于确定仅1种或2种分析物在样品中的存在。
在一些实施例中，检测可使用光检测系统、组件和/或技术来完成，例如使用激发和/或检测系统和/或基于按核酸序列分析领域中所已知的PCR的序列检测或定序的组件。
在一些实施例中，提供系统，其包括多个各自能够提供特定波长下的辐射束的激发源，和一组染料，其中所述组的至少一种染料可在通过多个激发源的第一个激发源提供的相同波长下吸收或被激发。在一些实施例中，多个激发源的第二个激发源提供第二特定波长和/或峰值波长范围，以便第二种染料可通过第二激发源而不是从第一激发源来激发，并且不是从由于第一种染料的激发，通过第一种染料发射的辐射来激发。此外，另外的激发源的至少一个激发源可提供第三激发波长，(例如)同时提供在第一激发源或第二激发源的特定波长中的少量辐射或无辐射。
在一些实施例中，能量传递染料在样品中的存在可用以识别存在于样品中的各种组分或分析物。所述组的能量传递染料可经设计或选择以便各种能量传递染料产生(a)在第一波长下的离散吸收，和(b)在第二波长下的离散发射。
在一些实施例中，所使用的各种能量传递染料可包含能够在第一波长下吸收光和在第二波长下发射激发能量的供体染料部分，和能够在第二波长下吸收通过供体染料部分发射的激发能量和在第三波长下发射辐射的受体染料部分。各种能量传递染料可视需要也包含连接子部分，其将供体染料部分和受体染料部分连接在一起。在一些实施例中，多种能量传递染料的各个供体染料部分在不同于用于系统中的，例如与样品混合的其它能量传递染料的波长下吸收最高辐射。相应能量传递染料的各个受体染料部分可在与样品中的其它能量传递染料相同的波长下发射最高辐射。
在一些实施例中，多种能量传递染料的各个相应供体染料部分可包括不同的染料部分，并且多种能量传递染料的各个相应受体染料部分可包括相同的染料部分或在与所述组的其它受体染料部分相同或大约相同的波长下发射最高辐射的相应染料部分。
在一些实施例中，提供系统，其包括两个或两个以上的激发源、一个或一个以上的检测器和染料的一个适当组。染料组可包含一种或一种以上的能量传递染料。
在一些实施例中，系统可包括一个或一个以上的激发或辐射源，例如，一个或一个以上的激光器，一个或一个以上固态激光器，一个或一个以上激光二极管，一个或一个以上的纳米管场发射极光源，一个或一个以上发光二极管(“LED”)，一个或一个以上的有机发光二极管(“OLED”)，一个或一个以上的薄膜电荧发光装置(“TFELD”)，一个或一个以上的量子点LED和/或一个或一个以上的磷光OLED(“PHOLED”)。呈各种配置的适合LED、OLED、量子点LED和固态激光器在荧光测定术领域中为已知的。在一些实施例中，激发源可包括多个可发射具有不同的相应峰值波长和/或峰值波长范围的最高辐射的激发源。
在一些实施例中，系统可包括一个或一个以上的检测器，例如，单波长检测器、多波长检测器、多路检测器、光电二极管阵列、电荷耦合二极管阵列、照相机、CMOS检测器和/或其任何组合。一个或一个以上的检测器可被可操作地排列以接受在不同染料的相应激发后，从所述组的不同染料发射的辐射。
在一些实施例中，提供试剂盒，其可包含封装在一起的包括至少一种按本文中描述的能量传递染料的多种染料。试剂盒的各种能量传递染料可包括按本文中描述的供体染料部分，按本文中描述的受体染料部分和视需要按本文中描述的连接子部分。在一些实施例中，试剂盒的能量传递染料的供体染料部分的每一个供体染料部分可在当与试剂盒的至少一种其他染料的吸光率相比时，在不同峰值波长和/或在不同峰值波长范围吸收最高辐射。在一些实施例中，试剂盒的能量传递染料的受体染料部分的每一个受体染料部分可在当与试剂盒的至少一种其他染料的发射相比时，在相同或大约相同的峰值波长或峰值波长范围发射最高辐射。在一些实施例中，所述组的各种染料的发射波长范围大体上与试剂盒中的至少一种其他染料的发射波长范围重叠。
试剂盒可封装于盒子或另一容器中和/或可被热密封、热包装、收缩包装或另外包裹或囊封。试剂盒可包括用于保留多种染料或多个例如小瓶的染料容器的系统。举例而言，试剂盒可包括小瓶架。试剂盒可包括两种或两种以上的染料，其包括至少一种能量传递染料，其各自含在相同或不同的相应分离容器中。试剂盒可包括3种或3种以上的染料，其各自含在相同或不同的相应分离容器中。试剂盒可含有4种或4种以上的染料，其各自含在相同或不同的相应分离容器中。在一些实施例中，试剂盒的染料的至少一种染料可为按本文中描述的能量传递染料。在一些实施例中，试剂盒的染料的至少两种染料可为按本文中描述的能量传递染料。
在一些实施例中，试剂盒的多种染料，包括至少一种能量传递染料，或试剂盒的所有染料可一起含在单一容器中，例如，含在单管或小瓶中。单管或小瓶可(例如)用标签来标记。标签可包含条型码、二维条型码或射频识别标签。在一些实施例中，标签可包括在外部封装中，例如，安置于盒子中或盒子上。
在一些实施例中，试剂盒也可包括一个或一个以上的激发源，例如，上文所述的辐射源的一个或一个以上的辐射源，或激发源的阵列。在一些实施例中，试剂盒可包括一个或一个以上的检测器，例如一个或一个以上的单色或单波长检测器，一个或一个以上的多波长检测器，一个或一个以上的多路检测器，一个或一个以上的光电二极管，一个或一个以上的光电二极管阵列，一个或一个以上的电荷耦合二极管阵列，一个或一个以上的照相机，一个或一个以上的CMOS检测器或其一个或一个以上的组合。一个或一个以上的检测器可包括一个或一个以上的雪崩光电二极管。试剂盒可包括光学器件组件，例如、镜子、聚焦透镜、菲涅耳透镜(Fresnel lens)等等。试剂盒可用以改进适于与不同于本文中揭示的组的一组染料一起使用的现有系统。
在一些实施例中，提供在采样器中检测分析物的方法并且所述方法包括：提供含有至少2种可检测染料的样品；用第一激发束照射样品；检测通过样品中的染料响应用第一激发束照射样品所发射的第一发射束；用不同于第一激发束的第二激发束照射样品；和检测从样品中的染料响应用第二激发束照射样品所发射的第二发射束。至少2种可检测的染料可包含至少2种相应荧光染料的一个组，(例如)其包括按本文中描述的至少一种能量传递染料。各种可检测的染料可适于在当通过包括具有适用于激发相应染料的相应峰值波长的辐射的激发束照射时，发射相应可检测的发射束。举例而言，各种染料可在当用落在相应染料的最大吸收波长范围内的相应峰值波长照射时，发射可检测的辐射。在一些实施例中，所检测的第一发射束和所检测的第二发射束可具有相同波长或大体上相同的或大体上重叠的波长范围。
在一些实施例中，方法可包括用一个或一个以上的按本文中描述的激发源照射样品，例如，用一个或一个以上的激光器，一个或一个以上的固态激光器，一个或一个以上的激光二极管，一个或一个以上的纳米管场发射极光源，或一个或一个以上的LED，一个或一个以上的OLED，一个或一个以上的TFELD，一个或一个以上的基于量子点的LED或一个或一个以上的PHOLED来照射样品。
在一些实施例中，方法可包括用一个或一个以上的检测器来检测所发射的辐射，例如，用一个或一个以上的单波长检测器，一个或一个以上的多波长检测器，一个或一个以上的多路检测器，一个或一个以上的光电二极管阵列，一个或一个以上的电荷耦合二极管阵列，一个或一个以上的照相机，一个或一个以上的CMOS检测器或其一个或一个以上的组合来检测。
实例
本教示案现将进一步在以下预言性实例中解释。以下实例决不意味着限制本教示案，并且所属领域的技术人员应了解，除下文例证的所述实施例外，许多实施例为可能的。
实例1-在一些实施例中，示范性染料组可包括一种或一种以上的能量传递染料，并且可(例如)包含具有展示于图4A-4D中的结构的4种能量传递染料之一。用在5′末端处的氨基己基键联将各种示范性能量传递染料连接于21碱基长度引物序列，并且用激发束照射所得复合物。假定消光系数为180,000cm-1 M-1，基于其在260nm处的相应吸光率将寡核苷酸定量。在0.4uM在8M尿素、1 X Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲液中的引物浓度下，使用488nm激发源获得光谱。说明于图4A-4D中的4种能量传递染料的相应结构分别相应于产生图3中从左到右展示的4个峰值的结构。
图3展示分别包括图4A-4D中展示的4种能量传递染料的寡核苷酸之正规化荧光发射光谱。展示于图3中的能量传递染料荧光值包括对5-CFB-DR110-2(图4A)、5-CFB-DR6G-2(图4B)、6-CFB-DTMR-2(图4C)和6-CFB-DROX-2(图4D)来说，表示为分别从左到右所展示的峰值的值。关于所述能量传递染料的更多细节可见于Lee等人的第5,945,526号美国专利中，所述专利以引用的方式全部并入本文。按可从图3中所见，全部4种能量传递染料具有光谱不同于其它能量传递染料的峰值荧光范围的个别峰值荧光发射范围。根据各种实施例，4种染料将不一起用于一组染料中。取而代之，展示于图4A-4D中的能量传递染料的任何一种能量传递染料可与一种或一种以上的具有相同或具有大体上重叠的发射波长范围的其它染料一起使用。
实例2-以下实例比较可用作可在根据一些实施例的组中一起使用的3种相应能量传递染料的供体染料部分的供体染料的吸收和发射频率。在0.4μM在8M尿素、1 X Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲液中的引物浓度下，使用分别在500nm、560nm和590nm下发射的3种激发源从各种供体染料获得发射光谱。
3种供体染料的吸收和发射特征呈现于表2中。按表2中所示，3种供体染料的吸收性质为彼此光谱可分辨的。包含所述3种供体染料的相应部分的一组能量传递染料提供具有光谱不同和可分辨吸收特征的染料。根据一些实施例的一组染料可包含至少一种染料，其是从表2中所列的供体染料的任何一种染料的部分形成并且结合或连接于从第一种染料制得的受体染料部分。所述组也可包含第一种染料和/或至少一种也包括从第一种染料制得的受体染料部分的其它能量传递染料。
表2
染料 吸收(nm) 发射(nm)
FAM 492 515
若丹明红-X 560 580
ROX 590 610
在一些实施例中，表2中列出的所说明的供体染料的至少2种供体染料可各自个别地形成部分并且(例如)通过相应连接子部分或通过相应氨基己基键联连接于相应受体染料部分。用于至少2种所说明的染料的每一种染料的受体染料部分可与连接于至少2种所说明的供体染料的另一种供体染料的受体染料部分相同或不同。在一个示范性组中，FAM和若丹明红-X供体染料部分的各者可经连接子部分连接于相应ROX受体染料部分。所述组也可包括单独的ROX染料(不连接于供体染料部分)。所例证的染料组中的染料将具有光谱不同的相应峰值吸收波长范围，和相同的峰值发射波长范围，也就是说，以在大约610nm处为中心的峰值发射波长范围。单色检测器可连同所述组一起使用以在610nm处检测发射。将FAM和若丹明红-X染料连接于相应ROX受体染料部分可通过许多连接子部分的任何连接子部分来完成。连接子部分可包括(例如)氨基己基连接子或描述于全部属于Lee等人的第5,800,996、5,863,727和5,945,526号美国专利中的连接子，所述专利以引用的方式全部并入本文。
所属领域的技术人员可从上述描述了解，本教示案可以各种形式实施。因此，虽然所述教示已经连同特定实施例和其实例一起描述，但是本教示案将不会因此受限制。可在不脱离本教示案时进行各种改变和修改。

Claims (40)

1.一种系统，其包含：
至少两个激发源，每一个激发源适于提供与所述激发源中的至少一个其他激发源所提供的激发波长范围不同的激发波长范围；
至少一个检测器；和
多种染料，其中所述多种染料中的每一种染料在与所述多种染料的其它染料相比，大体上非重叠的峰值吸收范围吸收辐射，所述多种染料中的每一种染料在与所述多种染料中的至少一种其他染料的峰值发射波长范围大体上重叠的峰值发射波长范围内发射辐射，至少所述多种染料中的第一种染料具有与所述至少两个激发源中的第一个激发源的所述激发波长范围重叠的第一峰值吸收波长范围，并且至少所述多种染料中的第二种染料具有与所述至少两个激发源中的第二个激发源的所述激发波长范围重叠的第二峰值吸收波长范围。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述多种染料包含至少一种能量传递染料，其包含：
供体染料部分，其可在与所述多种染料中的至少一种其他染料的激发波长不同的激发波长下激发；和
受体染料部分，其在激发后，在与通过所述多种染料中的至少一种其他染料在激发后所发射的波长相同的波长下发射辐射。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述多种染料包含至少两种能量传递染料，其中每一种能量传递染料包含：
供体染料部分，其可在与其它至少两种能量传递染料中至少一种能量传递染料的至少一个其他供体染料部分的激发波长不同的激发波长下激发；和
受体染料部分，其在激发后，在与其它至少两种能量传递染料中至少一种能量传递染料的至少一个其他受体染料部分在激发后的波长相同的波长下发射辐射。
4.根据权利要求3所述的系统，其中所述至少两种能量传递染料中的至少一种能量传递染料的所述供体染料部分包含ROX部分和TAMRA部分中的至少一个部分。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统包含相邻于所述至少一个检测器的单一高通滤光器。
6.根据权利要求1所述的系统，其另外包含用于独立启动所述至少两个激发源的控制器。
7.根据权利要求1所述的系统，其中所述至少两个激发源包含发光二极管、固态激光器、基于量子点的辐射发射二极管、纳米管场发射极辐射源、有机LED和其组合中的一个或一个以上激发源。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述至少一个检测器包含单波长检测器、多波长检测器、多路检测器、光电二极管、光电二极管阵列、电荷耦合装置、互补金属氧化物半导体、光电倍增管、雪崩光电二极管和其组合中的一个或一个以上检测器。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一峰值吸收波长范围为20纳米(nm)宽，所述第二峰值吸收波长范围为20nm宽，并且所述第一峰值吸收波长范围与所述第二峰值吸收波长范围重叠不超过约10％。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一峰值吸收波长范围为20纳米(nm)宽，所述第二峰值吸收波长范围为20nm宽，并且所述第一峰值吸收波长范围与所述第二峰值吸收波长范围重叠不超过约2％。
11.根据权利要求1所述的系统，其中所述多种染料中的至少一种染料的所述峰值发射波长范围为20nm宽的第一范围，所述多种染料中的至少一种其他染料的所述峰值发射波长范围为20nm宽的第二范围，并且所述第一范围与所述第二范围重叠至少约50％。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述多种染料中的至少一种染料的所述峰值发射波长范围为20nm宽的第一范围，所述多种染料中的至少一种其他染料的所述峰值发射波长范围为20nm宽的第二范围，并且所述第一范围与所述第二范围重叠至少约70％。
13.根据权利要求1所述的系统，其中所述多种染料中的至少一种染料为能量传递染料，并且所述能量传递染料包含连接于供体染料部分、受体染料部分和连接子部分中的至少一个部分的中止剂染料部分。
14.一种包含多种荧光染料的试剂盒，其中所述多种荧光染料中的每一种染料在与所述多种染料中的其它染料相比，大体上非重叠的峰值吸收波长范围内吸收辐射，并且所述多种荧光染料中的每一种染料在与所述多种荧光染料中的至少一种其他染料的峰值发射波长范围大体上重叠的峰值发射波长范围内发射辐射。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料包含一种或一种以上能量传递染料，所述一种或一种以上能量传递染料中的每一种能量传递染料包含：供体染料部分，其适于在第一峰值吸收波长范围内吸收辐射并且发射激发能量；和
受体染料部分，其适于吸收通过所述供体染料部分发射的激发能量并且在第一峰值发射波长范围内发射辐射。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述一种或一种以上能量传递染料中的至少一种能量传递染料另外包含连接子部分，其将所述相应供体染料部分连接于所述相应受体染料部分。
17.根据权利要求14所述的试剂盒，其另外包含单一容器，并且其中所述多种荧光染料安置于所述单一容器内部。
18.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料中的每一种染料包含在与所述多种荧光染料中的至少一种其他染料分离的相应容器中。
19.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述多种染料包含两种或两种以上能量传递染料，所述两种或两种以上能量传递染料中的每一种能量传递染料包含相应供体染料部分，其具有与所述两种或两种以上能量传递染料中的至少一种其他能量传递染料的所述供体染料部分的峰值吸收波长范围不同的峰值吸收波长范围，并且所述两种或两种以上能量传递染料中的每一种能量传递染料包含具有受体染料部分，其与所述两种或两种以上能量传递染料中的至少一种其他能量传递染料的所述受体染料部分的所述峰值发射波长范围重叠的相应峰值发射波长范围的。
20.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料中的每一种染料在20nm的相应峰值吸收波长范围吸收辐射，并且每一个20nm的相应峰值吸收波长范围其它相应峰值吸收波长范围中的每一个范围重叠达到在0％到约10％的范围内的量。
21.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料中的每一种染料在20nm的相应峰值吸收波长范围吸收辐射，并且每一个20nm的相应峰值吸收波长范围与其它相应峰值吸收波长范围中的每一个范围重叠达到在0％到约2％的范围内的量。
22.根据权利要求14所述的试剂盒，其中每一个相应峰值吸收波长范围包含20nm的范围并且不含与所述其它相应峰值吸收波长范围中的任何范围的任何重叠。
23.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料中的每一种染料在激发后，在20nm的相应峰值发射波长范围发射辐射，并且每一个20nm的相应峰值发射波长范围与所述多种荧光染料中的至少一种其他染料的至少一个其他20nm的峰值发射波长范围重叠至少约50％。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料中的每一种染料在激发后，在20nm的峰值发射波长范围发射辐射，所述20nm的峰值发射波长范围与所述多种荧光染料中的至少一种其他染料的所述20nm的峰值发射波长范围重叠至少约70％。
25.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料中的每一种染料在激发后，在20nm的峰值发射波长范围发射辐射，所述20nm的峰值发射波长范围与所述多种荧光染料中的至少一种其他染料的所述20nm的峰值发射波长范围重叠至少约95％。
26.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述一种或一种以上能量传递染料中的至少一种能量传递染料另外包含连接于所述相应供体染料部分、所述相应受体染料部分和所述相应连接子部分中的至少一个部分的中止剂染料部分。
27.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料中的至少一种荧光染料为非(能量传递)染料。
28.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料中的每一种染料包含经标记核苷酸或经标记核酸序列。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述多种荧光染料中的所述染料以混合物形式安置在一起。
30.一种方法，其包含：
提供包含至少两种染料与含有核酸序列的样品的混合物，其中所述多种染料中的每一种染料在与所述多种染料中的其它染料相比，大体上非重叠的峰值吸收波长范围内吸收辐射，并且所述多种染料中的每一种染料在大体上与所述多种染料中的至少一种其他染料的峰值发射波长范围重叠的峰值发射波长范围内发射辐射；用第一激发波长范围照射所述样品；
检测在用所述第一激发波长范围照射所述样品后从所述至少两种染料发射的辐射；
用不同于所述第一激发波长范围的第二激发波长范围照射所述样品；和检测在用所述第二激发波长范围照射所述样品后从所述至少两种染料发射的辐射。
31.根据权利要求30所述的方法，其另外包含：
独立启动至少两个激发源以在两个不同的相应时间提供所述至少两种不同的激发波长。
32.根据权利要求31所述的方法，其另外包含将所述经检测的所发射的辐射与所述独立启动的激发源关联。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述独立启动包含独立启动至少两个发光二极管。
34.根据权利要求30所述的方法，其另外包含：
启动辐射源；和
将来自所述辐射源的发射束光谱分离以形成具有至少两个不同的相应激发波长范围的至少两个激发源。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述光谱分离包含在两个不同的相应时间，形成具有至少两个不同的相应激发波长范围的至少两激发源。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述光谱分离包含在相同时间，形成具有至少两个不同的相应激发波长范围的至少两个激发源。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述光谱分离包含过滤来自所述辐射源的发射束。
38.根据权利要求30所述的方法，其中所述多种染料包含至少一种能量传递染料，其中每一种能量传递染料包含相应供体染料部分和相应受体染料部分，所述供体染料部分在与所述至少两种染料中的至少一种其他染料的峰值吸收波长范围相比，不同的相应峰值吸收波长范围吸收辐射，并且所述受体染料部分在与所述至少两种染料中的至少一种其他染料的峰值发射波长范围重叠的峰值发射波长范围内发射辐射。
39.根据权利要求30所述的方法，其中所述含核酸序列的样品包含与所述多种染料中的至少一种染料反应的至少一种核酸序列。
40.根据权利要求30所述的方法，其中所述含核酸序列的样品包含与所述多种染料中的至少一种染料反应的至少一种DNA分子。
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