CN114989972A - 用于细胞光损伤测量的装置及其用途 - Google Patents

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BEIJING INSTITUTE OF OPHTHALMOLOGY
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Abstract

本发明提供用于细胞光损伤测量的装置及其用途。该装置包括箱体，箱体具有可开合的门且内部设有：包括二氧化碳浓度稳定模块、温度稳定模块和湿度稳定模块的条件稳定模块，包括照明模组和控制模组的集成光源组件，以及细胞放置层，其中，条件稳定模块用于稳定箱体内部环境的二氧化碳浓度、温度和湿度，集成光源组件用于提供至少一种光照均匀且亮度可调的损伤照射光，损伤照射光选自290nm‑1000nm。该装置可以用于视网膜细胞、皮肤细胞、视网膜类器官中的细胞、类玻璃体中的细胞的光损伤测量，以及用于挽救上述细胞或组织光损伤的有效保护蛋白、保护成分化合物的开发。

Description

用于细胞光损伤测量的装置及其用途
技术领域
本发明涉及生物化学检测领域，特别地涉及一种用于细胞光损伤测量的装置及其用途。
背景技术
研究表明，过强光照会造成人视力降低。随着环境中人工光源的增加以及人夜间用眼时间的延长，人眼正接受强度更大以及时长更长的光照。而过长的电子显示设备的暴露，也会增加青少年近视的人群比例。因此目前对于人视网膜光损伤的机制的研究逐渐增多。
通常研究者较多使用偏主观的反馈式调查或活动性较强的动物，以上方式均存在明显的弊端。主观式的调查需要依赖受试者的招募，且实验结果受受试者的主观影响大。实验动物则由于是活体，具有不可控性，会主观回避引起生理不适的光源，因此导致结果的稳定性以及可重复性不高，即不同实验室做同一实验，实验数据差异极大，无法统一和共享，造成极大的资源浪费。另外动物伦理及动物实验规范逐渐加强，使得在体研究遇到挑战。相反地，在更加易于获得的细胞系上进行的光损伤实验，可获得更加稳定、可重复性强、便于量化的数据。基于以上背景，开发出一款适用于细胞系的光损伤仪器是迫切之需。
现有的视网膜光损伤装置通常是独立于细胞培养箱外的装置，内设温度及湿度检测及调节装置，可维持较为恒定的温度和湿度。但对于光照过程中细胞正常代谢最重要的CO2浓度无法控制。该项参数对于光损伤细胞机制的研究极为重要，是需要排除的代谢方面的无关变量，如果CO2浓度无法与正常培养时保持一致，则无法模拟其正常状态，即无法控制变量仅为光照这一个可控参数。另外，现在技术中多使用单一点光源或多个灯管进行光损伤，在光源波长的精度、照射面下方光强均一性以及仪器散热方面存在诸多问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种能够稳定控制CO2浓度并且光源质量更匹配实验需求的用于细胞光损伤测量的装置及其用途。
本发明第一方面提出用于细胞光损伤测量的装置，包括箱体，所述箱体具有可开合的门且内部设有：包括二氧化碳浓度稳定模块、温度稳定模块和湿度稳定模块的条件稳定模块，包括照明模组和控制模组的集成光源组件，以及细胞放置层，其中，所述条件稳定模块用于稳定所述箱体内部环境的二氧化碳浓度、温度和湿度，所述集成光源组件用于提供至少一种光照均匀且亮度可调的损伤照射光，所述损伤照射光选自290nm-1000nm。
可选地，所述细胞选自视网膜细胞、皮肤细胞、视网膜类器官中的细胞和类玻璃体中的细胞中的一种或多种。
可选地，所述照明模组包括PCB电路板、灯体、在所述灯体的第一表面上均匀排布的多个灯珠，每个灯珠内部包括N个各自发射不同波长的单色LED；所述控制模组包括N个调节单元和显示单元，所述N个调节单元与N个不同波长一一对应，所述显示单元用于显示亮度级数，其中N是正整数。
可选地，所述多个灯珠呈同心圆周向等距分布。
可选地，所述灯珠内部采用纯金导线和铜支架，以多波段集成式5050方式封装。
可选地，所述照明模组还包括铝散热板，所述铝散热板与所述PCB电路板相连。
可选地，所述细胞是视网膜细胞，并且其中所述损伤照射光选自400nm-1000nm。
可选地，所述细胞是皮肤细胞，并且其中所述损伤照射光选自290nm-400nm。
可选地，所述集成光源组件还包括电源模组，其中所述控制模组和电源模组设置在所述箱体的外部，并且所述照明模组可拆卸地固定在所述箱体的内部。
可选地，所述细胞放置层与集成光源组件之间的间距D可调，其中D选自10至25cm。
可选地，所述多个灯珠中相距最远的两个具有间距L，L≤D×tan(60°)。
可选地，所述照明模组的最大照度为20000Lux。
本发明第二方面提出用于细胞光损伤测量的装置的用途，将本发明第一方面提出的装置用于视网膜细胞、皮肤细胞、视网膜类器官中的细胞、类玻璃体中的细胞的光损伤测量，以及用于挽救上述细胞或组织光损伤的有效保护蛋白、保护成分化合物的开发。
本发明提供的技术方案，通过在密封箱体内部设置二氧化碳浓度稳定模块和集成光源组件，能够有效地稳定实验细胞环境的CO2浓度，并且能够根据提供多波长、高精度的光损伤照射，更符合光损伤实验的需求。
附图说明
附图用于更好地理解本发明，不构成对本发明的不当限定。其中：
图1是本发明实施方式提供的视网膜光损伤测量装置中集成光源组件的结构示意图；
图2是图1中单个灯珠的放大示意图；
图3是图1中照明模组的正视图；
图4是图1中照明模组的后视图；
图5是图4中塑料螺栓的立体示意图；
图6是集成光源组件的照明模组在密封箱体内部的结构示意图；
图7是图6对应的正视图；
图8是图1中控制模组的结构示意图；
图9是光源开启20小时后的感光细胞活力变化的实验数据图；
图10是三次独立重复实验感光细胞活力的实验数据图；
图11是照明模组的照明范围内的A、B、C三个位置的示意图；
图12是400nm光照下不同位置感光细胞活力的实验数据对比图；
图13是440nm光照下不同位置感光细胞活力的实验数据对比图；
图14是480nm光照下不同位置感光细胞活力的实验数据对比图。
图中：1-照明模组、2-控制模组、3-电源模组、4-灯珠、5-单色LED、6-灯体、7-PCB电路板、8-固定螺丝、9-塑料螺栓、10-数码显示管、11-调节旋钮、12-控制模组外壳、13-连接电线、14-插头。
具体实施方式
本发明实施方式的视网膜光损伤测量装置，包括箱体，箱体具有可开合的门且内部设有：包括二氧化碳浓度稳定模块、温度稳定模块和湿度稳定模块的条件稳定模块、包括照明模组和控制模组的集成光源组件，以及细胞放置层。其中，条件稳定模块用于稳定箱体内部环境的二氧化碳浓度、温度和湿度，集成光源组件用于提供至少一种光照均匀且亮度可调的损伤照射光。
本发明实施方式的视网膜光损伤测量装置中，二氧化碳浓度稳定模块、温度稳定模块、湿度稳定模块这三大稳定模块通常包括传感单元(例如温度计)、调节单元(例如加热丝或者压缩制冷部件)和控制单元(例如控制面板和计算芯片)，其中控制单元用于设定相关阈值，将预设阈值与从传感单元接受的信号进行比较，并向调节单元发出指令，从而对二氧化碳浓度、温度和/或湿度进行调节从而使其稳定在预设阈值附近(通常为±10％)。
由于可以商购的高端型号的细胞培养箱通常已经预先集成了二氧化碳浓度稳定模块、温度稳定模块、湿度稳定模块，所以在本发明的优选实施方式中，可以使用市售细胞培养箱充当本发明的视网膜光损伤测量装置的密封箱体、二氧化碳浓度稳定模块、温度稳定模块、湿度稳定模块四个部分的总和。适用于本发明的细胞培养箱为国产或进口的常氧培养箱、低氧培养箱、高氧培养箱，例如Thermo Scientific品牌满足各类细胞生长所需的CO2培养箱。-
如图1所示，集成光源组件主要包括照明模组1和控制模组2。照明模组1主要包括PCB电路板7、灯体6、在灯体6的第一表面上均匀排布的多个灯珠4，每个灯珠4内部包括N个各自发射不同波长的单色LED 5。控制模组2主要包括N个调节单元(例如调节旋钮11)和显示单元(例如数码显示管10)，这N个调节单元与N种不同波长光一一对应，显示单元用于显示亮度级数。其中N是正整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10；优选地，N不大于15。
集成光源组件与箱体可以是一体的，在这种情况下，控制模组2集成在条件稳定模块的控制单元中。在其他实施方式中，集成光源组件与箱体是可分离的，在这种情况下，集成光源组件还可以包括电源模组3，控制模组2和电源模组3设置在箱体的外部，并且照明模组1可拆卸地固定在箱体的内部。
灯珠4内单个的单色LED 5能够发射高纯度的指定波长的光，每个单色LED 5的峰值波长公差在±3nm之内，光谱纯净、波段精准。以视网膜细胞为例，优选使用最易造成视网膜细胞光损伤的区间(400nm-500nm)内的N个波长，更优选地，其中两两相邻的波长间的差值相等。例如，图2示出了灯珠4内集成有五个单色LED 5，这五个LED可以分别发射400nm、420nm、440nm、460nm、480nm的波长。当然，本领域技术人员知道，其他波长的组合也是可以的，例如400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500中任意N种的组合。
光损伤实验有可能需要长时间使用较高光强，为了更好地散热，本发明的装置还配备高效散热系统，将PCB电路板7通过固定螺丝8固定在铝散热板上。这样能够进一步降低光源发热对细胞培养环境温度的影响，同时延长产品寿命。在优选实施方式中，照明模组的灯珠内部采用纯金导线和铜支架，以多波段集成式5050方式封装，从而提高产品的耐高温性能和稳定性。
将封装好的灯珠均匀排布在灯体6的第一表面(即朝向细胞放置层的一面)上。在本发明的实施方式中，灯珠排布间距需要在兼顾平衡灯珠封装大小、限流电阻、均匀度等因素的同时，采用数量最大化的设计，从而在保证装置稳定输出的情况下，增加装置的可输出光照强度，同时满足慢性光损伤以及急性光损伤的实验要求。图3示出了灯珠的一种排布方式。其中，共220枚灯珠以同心圆形式排列在PCB电路板7上，从内到外总共排列了七个同心圆，各同心圆之间等距，每个同心圆的圆周上等距离地分布多个灯珠，可发出从几十勒克斯至几万勒克斯不同强度的光照。
本领域技术人员能够理解，在本发明的装置中，灯体的尺寸受箱体尺寸、下方照度均匀度以及与测试细胞之间的距离的限制。如果灯体过小，则容易造成下方光照区域浪费；如果过大，则灯体一侧边缘灯珠的光无法照射到另一侧，造成下方光强不均。因此，在本发明的实施方式中，灯体上多个灯珠中相距最远的两个之间的间距L需要小于等于D×tan(60°)，其中D是测试细胞与灯体之间的距离，选自10至25cm。作为示例，在D为20cm的情况下，灯体的直径为30cm，光源的发光面积为70650mm2。
灯体的背面如图4所示，具有四个塑料螺栓5，图5为塑料螺栓的立体图。照明模组1可以通过灯体背后的四个塑料螺栓9固定在箱体中，固定后如图6和图7所示。该实施例照明模组1安装于细胞培养箱内，针对细胞培养箱隔板设计，拆卸简单。
照明模组1下方可以放置多个细胞培养板进行光损伤实验，光损伤照射时培养箱门关闭，保证细胞所需的恒定二氧化碳浓度、温度和湿度(例如：5％CO2浓度、37℃温度以及50％湿度)。
如图8所示为控制模组2的放大示意图，控制模组2可以包括数码显示管10、调节旋钮11以及控制模组外壳12。每种波段光源芯片采用了255级高精度PWM独立调光，调光等级采用数码显示管10直观显示，调光曲线采用线性调光，配合附带高品质24V/10A大功率开关电源使用，支持5通道任意通道独立调光输出，每通道最大输出功率100W，可获得最大20000Lx的照度需求，产品符合CE、EMC、LVD、RED等相关安全及无线电设备标准。
本发明的装置可用于视网膜细胞(例如视感受细胞(视杆细胞和视锥细胞)、水平细胞、双极细胞、无足细胞和神经节细胞)、皮肤细胞(例如皮肤上皮细胞、皮肤成纤维细胞)、视网膜类器官中的细胞、类玻璃体中的细胞的光损伤测量，还可用于挽救上述细胞或组织光损伤的有效保护蛋白、保护成分化合物的开发。本领域技术人员根据需要，可以选择适用的波长范围，例如用于皮肤细胞的UVB(290-320nm)和UVA(320-400nm)，用于视网膜细胞的可见光部分400-1000nm(优选400-500nm)。
下面介绍对照明模组的光强稳定性测试和光强重复性测试。
1、细胞培养
使用永生化的视网膜感光细胞(661W细胞)作为光损伤的细胞系。将细胞接种于96孔板中的9个孔，每孔中含100μL培养基(10％FBS的DMEM)，每孔细胞数为1万/孔。放在培养箱中过夜，使其贴壁生长。
2、光损伤实验
分别对集成光源组件的光强稳定性和光强重复性进行了测试。
在光强稳定性测试中，申请人测试了光源长时间工作(20小时)过程中的光强稳定性，即对比起始时段(即0-2时)光照和结尾时段(即18-20时)光照所对应的光损伤后细胞活力的差别。具体地，准备三块接种了细胞的细胞培养板。其中两块分别在起始时段和结尾时段接受波长420nm、光强为10000Lux的照射，另外一块则使用锡箔纸包裹避光作为对照组放在实验组附近。
在光强重复性测试中，申请人重复进行了三次独立的开关电源光照，测试光损伤细胞活力的差别。具体为使用420nm、10000Lux光强分别进行2h光损伤，此外提供对照组(锡箔纸包裹，无光照)放在实验组培养板附近。
3、细胞活力测试
采用CCK-8试剂盒进行细胞活力测试。CCK-8试剂盒基于水溶性四唑盐WST-8，其化学名为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物(formazan)。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活细胞的数量成正比。
细胞活力计算公式：细胞活力(％)＝[A(处理组)-A(空白)]/[A(对照组)-A(空白)]×100％
A(处理组)是指：进行光损伤后的细胞，用CCK-8溶液孵育后测出的OD值；
A(对照组)是指：避光处理后的细胞，具有细胞、用CCK-8溶液孵育后测出的OD值；
A(空白)是指：没有细胞的孔的OD值；
细胞活力是指：细胞增殖活力或细胞毒性活力。
4、实验结果
图9示出了光强稳定性测试的结果所示，测试了照明模组常开(例如持续工作20小时)的光强稳定性，即对比了在起始时段(即0-2小时)和结尾时段(即18-20小时)分别进行2小时的光损伤后，细胞活力的差别。起始时段和结尾时段两组实验组细胞与对照组细胞相比，光损伤组的细胞活力明显下降，相当于对照组细胞活力的一半，说明该装置能对细胞进行显著的急性光损伤，光损伤效果明显。且两组实验组的细胞活力值之间并没有统计学差异，说明持续工作20小时的起始时段和结尾时段中，设定参数不变的情况下，光源并未出现明显的衰减，证明了照明模组可进行较大强度，长时间的稳定输出。
如图10所示，测试三次独立开关电源后，光损伤细胞活力的重复性。与对照组相比，三次重复的实验组细胞活力值均明显下降，约为对照组的一半，表明三次重复光损伤效果明显。三次重复的实验组OD值之间相互没有统计学差异，表明三次独立重复实验中，设定参数不变的情况下，仪器光源强度输出稳定，实验的结果可重复性高。其中，“****”表示有显著性差异，“n.s”表示没有显著性差异。
申请人还测试了400nm、440nm、480nm三种不同波长光照下，A、B、C三个随机位置(参考图11)的细胞光损伤后细胞活力差别，以用来测试光照区域内的照度空间均一性。实验结果如图12至图14所示。从图中可以看出，与对照组相比，不同位置的细胞活力下降明显，表明光损伤效果明显，不同位置细胞活力无统计学差异，表明各个位置光损伤效果无差别，具有空间均一性。
综上，本发明的视网膜光损伤测量装置主要具有如下优点：
(1)对于需要较长时间来照射细胞系进行的光损伤实验，密封箱体和三大稳定模块能够满足长期培养细胞所需的稳定环境的要求，排除酸碱度等不利干扰和影响，利于提高实验精确度。
(2)光源模块设计采用多灯珠阵列排布的设计，避免了点光源和线光源光损伤区域光强不均匀的弊端，达到了在光源模块下方区域范围内光照强度一致，同时大幅提升培养箱照度均匀度和灯具照射面积；并且灯珠数量大，因此需要较大光强进行光损伤时，平均到每个灯珠的输出光强较小，可以较长时间维持稳定的较大光强输出。相比较现有技术，提高了光照条件的稳定性与重复性，可以让不同实验室更精确的对实验结果进行重复验证。
(3)光源模块使用五个芯片，集成了光损伤实验中常用到的五种波长，使得切换不同波长光损伤时不用移动光源，节省科研效率，还可进行复合光源的光损伤实验。
(4)光源光谱更加纯净、波段更加精准，有助于提升实验准确性。
(5)控制模块采用255级精度的线性调光，可以更加精确的控制光强。
(6)光源模块可直接固定于密封容器内部(例如固定在商用培养箱隔板上)，避免了额外的支撑及固定装置，拆卸方便。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

Claims (13)

1.一种用于细胞光损伤测量的装置，其特征在于，包括箱体，所述箱体具有可开合的门且内部设有：包括二氧化碳浓度稳定模块、温度稳定模块和湿度稳定模块的条件稳定模块，包括照明模组和控制模组的集成光源组件，以及细胞放置层，
其中，所述条件稳定模块用于稳定所述箱体内部环境的二氧化碳浓度、温度和湿度，所述集成光源组件用于提供至少一种光照均匀且亮度可调的损伤照射光，所述损伤照射光选自290nm-1000nm。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述细胞选自视网膜细胞、皮肤细胞、视网膜类器官中的细胞和类玻璃体中的细胞中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述照明模组包括PCB电路板、灯体、在所述灯体的第一表面上均匀排布的多个灯珠，每个灯珠内部包括N个各自发射不同波长的单色LED；
所述控制模组包括N个调节单元和显示单元，所述N个调节单元与N个不同波长一一对应，所述显示单元用于显示亮度级数，其中N是正整数。
4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述多个灯珠呈同心圆周向等距分布。
5.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述灯珠内部采用纯金导线和铜支架，以多波段集成式5050方式封装。
6.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述照明模组还包括铝散热板，所述铝散热板与所述PCB电路板相连。
7.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述细胞是视网膜细胞，并且其中所述损伤照射光选自400nm-1000nm。
8.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述细胞是皮肤细胞，并且其中所述损伤照射光选自290nm-400nm。
9.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述集成光源组件还包括电源模组，其中所述控制模组和电源模组设置在所述箱体的外部，并且所述照明模组可拆卸地固定在所述箱体的内部。
10.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述细胞放置层与集成光源组件之间的间距D可调，其中D选自10至25cm。
11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述多个灯珠中相距最远的两个具有间距L，L≤D×tan(60°)。
12.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述照明模组的最大照度为20000Lux。
13.一种用于细胞光损伤测量的装置的用途，其特征在于，将如权利要求1至12中任一项所述的装置用于视网膜细胞、皮肤细胞、视网膜类器官中的细胞、类玻璃体中的细胞的光损伤测量，以及用于挽救上述细胞或组织光损伤的有效保护蛋白、保护成分化合物的开发。
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