CN101375150A - 用于定量分析物的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于测量样品中的多种分析物的量的装置和方法。所述装置这样设计，以致每个分析物传感元件被设置成测量预先确定的分析物的量，并且其中机器可执行指示被设置成选择与待测量的分析物相对应的适当的分析物传感元件。

Description

用于定量分析物的装置和方法

导言

对相关申请的交叉参考

[0001]本申请要求于2006年1月24日提交的美国临时申请号60/762,008和于2006年10月20日提交的美国临时申请号60/862,422的优先权，其内容通过引用如同在本文中完全描述而并入本申请。

发明领域

[0002]本发明涉及用于测量样品中的分析物的数量的装置和方法，该方法使用，例如，基于荧光的测定，基于吸光度的测定，或光散射测定。

发明背景

[0003]用于实施分析物读数的常规荧光计典型地设计为可以使用一些类型的激发和发射滤波器并可以装配有可调节的灵敏度的通用仪器，以致它们可以被设置用于许多不同类型的测定。Turner BioSystems TBS-380，和BioRad VersaFluor荧光计是典型的实验室荧光计的实例。这种设计的显著缺点在于，使用者必须选择要用的滤波器和/或光源，这需要使用者懂得荧光怎样工作，查阅它们的测定的激发和发射值，懂得怎样选择适当的滤波器设置，并且可能购买和安装新的滤波器设置。另外，使用者必须经常在开始测定之前通过反复的程序而确定所述仪器的适当的获得设置(gainsettings)(灵敏度)。随这些仪器提供的广泛性表格举例说明了使用者设置所述仪器实施他们的目的测定的潜在的困难。特别地，如果使用者意欲只使用一种类型的测定，这种选择过程对使用所述仪器形成令人畏惧的障碍。

[0004]另外，常规荧光计典型地测量从样品发射的光，并且以相对的荧光值显示读数。由于所述显示是以相对的荧光值，所以使用者通常必须使用标准物来生成标准曲线，绘制标准物的相对荧光值，将所述曲线拟合成直线，将样品的相对荧光值与标准曲线进行比较，并且最后二次计算(back-calculate)以确定所述样品的浓度。这些操作可以给未经训练的使用者并且甚至是有经验的使用者带来困难，这些操作是繁琐而费时的。通常，荧光计可以设置成下载数据到计算机，以使得这一操作更容易。不幸地是，这种省力的特点需要给兼容的计算机安装软件，这可能需要购买兼容的计算机，找到适当的通信端口以将数据从所述仪器传送到计算机，在实验室中找到可以是所述仪器永久性与计算机连接的适当的位置，然后希望所安装的软件与所述仪器仪器正确的操作。这些行为可能对想要成为的使用者带来令人畏惧的障碍。

[0005]存在至少一种荧光计，Turner BioSystems Modulus仪器，其具有一些内置的软件用于自动执行来自由使用者提供的标准物的计算，使得那些选择测定的执行对于使用者更容易。然而，Turner荧光计需要5个标准物以计算标准曲线，这需要使用者的显著的时间投入，如果使用者只是测量少数样品，其可以是特别繁琐的。最后，这种仪器又被设计成用于最大的适应性，提供用于每种测定的独立的模块，所述模块必须快速按入仪器中，并且足够得小，以致容易在典型的实验室环境中丢失。

[0006]典型的荧光计还使用专门的小杯来盛放样品。通常，所述小杯是具体的仪器专有的，对于小的样品大小需要适配器，通常不能从标准化实验室供应公司获得，并且可能是昂贵的。

[0007]本领域需要的是用于测量确定的测定设置的小装置。所述装置应该设计成用于与具体的测定设置的无缝整合，以致使用者-界面将允许使用者从确定的测定设置中进行选择，并且立即开始实施所述测定。当选择目的测定时，所述装置将自动选择用于所选择的测定的正确的光源、滤波器设置和灵敏性设置。另外，所述装置将被设计成具有用于适合所述具体测定的数据分析的精细的算法，以致使用者只需要测量少量的标准物(2或3个)。所述装置还将被设计成从这些标准物计算标准曲线，并且当测量样品时，所述装置将自动执行需要的分析，并且简单地为使用者显示样品的浓度。通过建立光源、滤波器设置、和获得设置的自动配置，并且通过将数据分析算法结合到所述装置中，使用者将不再遇到学习曲线而只是使用所述仪器。另外，使用者将不需要选择、购买和安装滤波器，或者确定仪器的获得设置或灵敏度。最后，使用者将节省使用大量的标准物用于曲线、绘制曲线、将所述曲线拟合成直线、比较样品值与所述曲线、并且从所述标准曲线方程二次计算样品浓度的繁琐。所述装置将具有小的底座，并且将不需要与计算机连接，以致所述仪器系统将不需要大的专门指定量的实验台空间。另外，由于所述装置将不需要与计算机连接而进行数据分析，所以消除了找到与软件兼容的计算机、将所述软件安装到计算机上、并且将所述装置与计算机连接的困难。最后，所述装置将使用易于获得的、廉价的、一次性的、实验室测试管，以将为所述仪器找到适当的替代小杯的压力和费用减到最小。

发明概述

[0008]本发明涉及用于测量样品中的多种分析物的量的装置和方法。在一个实施方案中，所述装置包括保持具有分析物和任选地报道分子的样品容器的容座(receptacle)、光检测器、一个或多个分析物传感元件和带有机器可执行指示的计算机处理部件。依次，所述分析物传感元件包括下列各项：用于激发样品的能源，其中该能源被设置成发射预先确定最大波长的光；激发滤波器，其分离来自能源的预先确定的波长范围的光；发射滤波器，其分离从被激发的样品发射的预先确定的波长范围的光。所述装置这样设计，以致每个分析物传感元件被设置成测量预先确定的分析物的量，并且所述机器可执行指示被设置成选择与待测量的分析物相对应的适当的分析物传感元件。

[0009]本发明还涉及用于测量样品中的分析物的量的装置，所述装置包括能源、光检测器、带有机器可执行指示的计算机处理部件和用于保持样品管的容座，其中所述容座被设置成与微量离心管相配。

[0010]本发明还涉及计算在样品容器中的分析物的量的方法，所述方法包括生成荧光标准曲线，所述曲线包括测量低端(low-end)或空白样品(g)的荧光强度，并且测量至少一个高端(high-end)标准物(v)的荧光强度，其中所述曲线使得荧光强度与分析物数量相关，并且其中所述曲线具有预先确定的S形(sigmoidicity)程度(n)和曲率(k)。在生成荧光标准曲线后，测量所述样品(y)的荧光强度，其中所述样品包括能够指示所述分析物在样品中的存在的荧光部分。然后，使用所述荧光标准曲线将样品(y)的荧光强度与数量相关。

[0011]本发明还涉及用于测量样品中一种分析物与另一种分析物的比例的装置，所述装置包括光谱不同的能源，一个或多个能够区分来自所述两种分析物的荧光发射的光检测器，带有机器可执行指示的计算机处理部件，和用于保持样品管的容座，其中所述容座被设置成与微量离心管相配。

[0012]本发明的一个方面提供用于测量多种分析物的量的装置，所述装置包括：

用于保持具有分析物的样品容器的容座，光检测器，一个或多个分析物传感元件，和带有机器可执行指示的计算机处理部件，所述分析物传感元件包括：

a)用于激发所述样品的能源，其中该能源被设置成发射预先确定最大波长的光；

b)激发滤波器，其中所述激发滤波器被设置成分离来自所述能源的预先确定的波长范围的光；

c)发射滤波器，其中所述发射滤波器被设置成分离从被激发的样品发射的预先确定的波长范围的光；并且

其中每个所述分析物传感元件被设置成测量预先确定的分析物的量，并且其中所述机器可执行指示被设置成选择与待测量的分析物相对应的适当的分析物传感元件。

[0013]在一个更具体的实施方案中，所述能源是发光二极管。更具体地，所述预先确定的分析物选自由下列各项组成的组：DNA、RNA、蛋白质、真核或原核细胞、碳水化合物、脂质和金属离子。更具体地，所述机器可执行指示还被进一步设置成基于来自被激发的样品的发射光而确定所述具体分析物的浓度。在另一个实施方案中，所述装置还包括使用者界面。在另一个实施方案中，所述使用者界面包括显示器和非数字键区。在另一个实施方案中，所述样品容器容座被设置成适合0.5微量离心管。在另一个实施方案中，所述装置还包括内部电源。另一个实施方案还包括至少一个通信端口。更具体地，所述通信端口选自由下列各项组成的组：通用串行总线(USB)端口、音频/视频串行总线(IEEE 1394)端口、红外(IR)端口和无线电频率(RF)端口。

[0014]在另一个实施方案中，所述装置包括第一和第二分析物传感元件。更具体地，所述第一分析物传感元件包括发射具有约470nm最大波长的光的二极管，滤除具有大于约490nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约520nm和大于约580nm的波长的光的发射滤波器。仍然更具体地，所述第二分析物传感元件包括发射具有约640nm的最大波长的光的二极管，滤除具有小于约570nm和大于约647nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约652nm的波长的光的发射滤波器。

[0015]在另一个实施方案中，所述使用者界面被设置成允许使用者选择用于测量的分析物。更具体的，所述机器可执行指示能够在没有使用者输入时选择所述用于测量的分析物。

[0016]在一个更具体的实施方案中，所述装置在终端使用者第一次使用所述装置之前进行校正。另一个实施方案还包括用于鉴定与所述样品容器相关的鉴定标记的工具。更具体地，所述鉴定标记是机器可读的。仍然更具体地，所述鉴定标记选自由下列各项组成的组：条形码、数据矩阵条形码和无线电频率识别(RFID)标记。

[0017]本发明的另一个实施方案提供检测样品中的分析物的方法，所述方法包括使用本文所述的装置。

[0018]本发明的另一个方面提供计算在样品容器中的分析物的量的方法，所述方法包括：

a)生成荧光标准曲线，包括测量空白样品(g)的荧光强度，并且测量至少一个高端标准物(v)的荧光强度，其中所述曲线使得荧光强度与分析物数量相关，并且其中所述曲线具有预先确定的S形程度(n)和曲率(k)；

b)测量所述样品(y)的荧光强度，其中所述样品包括能够指示所述分析物在所述样品中的存在的荧光部分；和

c)使用所述荧光标准曲线将所述样品(y)中的所述荧光强度与所述分析物的量相关。

[0019]在另一个实施方案中，所述分析物数量是所述分析物的浓度。更具体地，所述分析物选自由DNA、RNA和蛋白质组成的组。在另一个实施方案中，所述荧光标准曲线接近线性。在一个更具体的实施方案中，(n)约为1。

[0020]在另一个实施方案中，所述曲线由下述方程表征：

(I)y＝r(xⁿ/(xⁿ+k))+g；

其中r是通过下式确定的校正值：

(II)r＝(v-g)((sⁿ+k)/sⁿ)

其中(s)是在所述高端标准物中的分析物的量。

[0021]在另一个实施方案中，所述荧光部分是选自由花青和部花青染料组成的组的荧光化合物。更具体地，所述荧光部分选自由NanoOrange、OliGreen、PicoGreen、和RiboGreen组成的组。

[0022]在另一个实施方案中，所述高端标准物存在于所述样品容器中。更具体地，所述高端标准物被固定在固体表面上。

[0023]在另一个实施方案中，所述固体表面选自由所述样品容器的内表面、珠子、芯片和纤维组成的组。

[0024]本发明的另一个方面提供用于测量样品中的分析物的量的装置，所述装置包括带有机器可执行指示的计算机处理部件，其设置成实施上述方法。

[0025]在另一个更具体的实施方案中，所述装置还包括：

用于保持具有分析物的样品容器的容座，光检测器和一个或多个分析物传感元件，所述分析物传感元件包括：

i)用于激发所述样品的能源，其中该能源被设置成发射预先确定最大波长的光；

ii)激发滤波器，其中所述激发滤波器分离来自所述能源的预先确定的波长范围的光；

iii)发射滤波器，其中所述发射滤波器分离从所述被激发的样品发射的预先确定的波长范围的光；并且

其中每个所述分析物传感元件被设置成测量预先确定的分析物的量，并且其中所述机器可执行指示被进一步设置成选择与待测量的分析物相对应的适当的分析物传感元件。

[0026]在另一个实施方案中，所述能源是发光二极管。在另一个实施方案中，所述预先确定的分析物选自由下列各项组成的组：DNA、RNA、细胞和蛋白质。

[0027]在另一个实施方案中，所述装置还包括使用者界面。更具体地，所述使用者界面包括显示器和非数字键区。在另一个实施方案中，所述使用者界面被设置成允许使用者选择用于测量的所述分析物。在另一个实施方案中，所述机器可执行指示能够在没有使用者输入时选择用于测量的所述分析物。在另一个实施方案中，所述装置在终端使用者第一次使用所述装置前进行校正。在另一个实施方案中，所述样品容器容座被设置成适合0.5ml的微量离心管。

[0028]在另一个实施方案中，所述装置还包括内部电源。

[0029]在另一个实施方案中，所述装置包括第一和第二分析物传感元件。更具体地，所述第一分析物传感元件包括发射具有约470nm最大波长的光的二极管，滤除具有大于约490nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约520nm和大于约580nm的波长的光的发射滤波器。仍然更具体地，所述第二分析物传感元件包括发射具有约640nm最大波长的光的二极管，滤除具有小于约570nm和大于约647nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约652nm的波长的光的发射滤波器。

[0030]本发明的另一个方面提供用于测量在样品容器中的分析物的量的装置，所述装置包括能源、光检测器、带有机器可执行指示的计算机处理部件、和保持所述样品容器的容座，其中所述样品容器包括选自由聚丙烯和聚乙烯组成的组的聚合物。

[0031]在另一个实施方案中，所述能源是发光二极管。

[0032]在另一个实施方案中，所述分析物选自由DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、脂质和金属离子组成的组。在另一个实施方案中，所述装置还包括使用者界面。在另一个实施方案中，所述使用者界面包括显示器和非数字键区。更具体地，所述使用者界面被设置成允许使用者选择用于测量的所述分析物。

[0033]在另一个实施方案中，所述机器可执行指示能够在没有使用者输入时选择用于测量的所述分析物。在另一个实施方案中，所述装置还包括内部电源。

[0034]在另一个实施方案中，所述装置还包括至少一个通信端口。在另一个实施方案中，所述通信端口选自由通用串行总线(USB)端口，音频/视频串行总线(IEEE1394)端口，红外(IR)端口和无线电频率(RF)端口组成的组。在另一个实施方案中，所述装置在终端使用者第一次使用所述装置之前进行校正。

[0035]在另一个实施方案中，所述装置还包括用于鉴定与所述样品容器相关的鉴定标记的方法。在另一个实施方案中，所述鉴定标记是机器可读的。在另一个实施方案中，所述鉴定标记选自由条形码、数据矩阵条形码和无线电频率识别(RFID)标记组成的组。

[0036]本发明的另一个方面提供检测在样品中的分析物的方法，所述方法包括使用上述装置。

[0037]本发明的另一个方面提供计算在样品容器中的两种分析物的比例的方法，所述方法包括

a)生成关于所述两种分析物的荧光标准曲线，其包括：测量第一空白分析物样品(g1)和第二分析物样品(g2)的荧光强度，并且测量关于所述第一分析物的至少一个高端标准物(v1)和关于所述第二分析物的至少一个高端标准物(v2)的荧光强度，其中所述曲线使得荧光强度与每种分析物的量或相对量相关，并且其中所述曲线具有预先确定的S形程度(n)和曲率(k)；

b)测量所述样品(y1和y2)的荧光强度，其中所述样品包括能够指示所述分析物在所述样品中的存在的荧光部分；和

c)使用所述荧光标准曲线将所述样品(y1和y2)中的所述荧光强度与所述分析物的量相关。

附图简述

[0038]图1描述本发明的一个实施方案的侧视图图表。

[0039]图2描述以样品容器容座为中心的多个分析物传感部件的一个实施方案。

[0040]图3描述可以使用方程I生成的关于RNA作为分析物的理论荧光标准曲线。用于生成所述曲线的高端标准物包含100ng的RNA，当使用该100ng标准物时，测定的可靠性达到200ng。

[0041]图4描述测量报道子通过扩散或主动混合而从仪器光径外区域分解成光径内的区域的装置。

[0042]图5A描述随着活的：死的细胞比例下降的蓝色激发信号。

[0043]图5B描述随着活的：死的细胞比例下降而增加的红色激发信号。

[0044]图5C描述活的：死的细胞的比例确定。

[0045]图6描述在本文所述的装置上的真核细胞计数，其中对于所有检测的真核细胞系的荧光反应显示显著高于背景。

发明详述

[0046]导言

[0047]本发明的装置和方法允许所述仪器和使用者之间的连续的、直观的相互作用，以及所述方法在日常工作中对使用者的可及性。这里我们公开了包括分析物传感元件(ASE)的荧光计，所述分析物传感元件可操作性地连接，允许检测预先确定的分析物，以致选择所述预先确定的分析物就选择了适当的ASE。因此，在一个实施方案中，所述装置是这样设置，以致机器-可执行指示选择与所用的测定相对应的适当的分析物传感元件以进行具体分析物的检测。所述方法包括通过测量两种或多种标准物而生成标准曲线，所述两种或多种标准物中的一种可以是零或空白标准物。所述标准曲线可以这样生成：通过将所述标准物的值应用到具体算法，以产生表达由所述仪器读取的、由测定产生的信号与在样品中的分析物的浓度之间的关系的方程。所述装置可以这样设计，以致所述使用者界面提示使用者选择测定，插入标准物，和插入样品。从这种简单的输入，所述装置自动可以选择适当的分析物传感元件和算法，进行需要的计算，以确定标准曲线，并且将来自样品的信号与所述标准曲线比较，并且进行需要的计算，以便以使用者的读数显示样品中的分析物的量。另外，所述装置还可以设置成接受廉价的、一次性的塑料的、透光的微量离心形管，该微量离心形管容纳标准物或样品，并且易于获得。此外，所述装置可以用来监测和定量同一样品中的多种分析物，例如，通过用不同的染料标记分析物，然后在特定的波长激发和/或滤过发射光谱，以致目的染料/分析物可以在其它的染料/分析物的存在下被清楚地监测。

定义

[0048]在详细描述本发明之前，应该理解，本发明不限于具体的组合物或方法步骤，原因在于这些可以变化。必须注意，当用于本说明书和后附的权利要求中时，单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，提及“报道分子(a reporter molecule)”包括多种报道分子，和提及“荧光计”包括多种荧光计等等。

[0049]除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所涉及的领域中的普通技术人员通常所理解的相同的意思。为了本文所述的发明目的，定义下述术语。

[0050]术语“分析物”是指在本发明的测定中要被测量或检测的分子。术语“分析物”包括任何物质，对于其存在特异性结合分子，或者对于其可以制备特异性结合分子，或者对于其所述分析物与报道分子相互作用产生可检测的信号。代表性的分析物包括，但不限于，药物、抗原、半抗原、抗体、蛋白质、肽、氨基酸、激素、类固醇、癌细胞标记、组织细胞、病毒、维生素、核酸、金属离子、酶、脂质、放射活性同位素、病毒、细菌、病原体、化学污染物、和杀虫剂。

[0051]术语“分析物传感元件”或“ASE”当用于本文时是指下列各项的特定组合：1)能源，其自身可以发射限定范围内波长的电磁能，2)“激发滤波器”，其能够分离一定波长范围的电磁能，诸如但不限于光，和3)“发射滤波器”，其能够分离从所述样品发射的一定波长范围的电磁能，其中所述三个部分可操作地连接。所述ASE是可操作地连接的，以致可以测量预先确定的分析物，而无需由终端使用者人工选择波长和滤波器，或者需要进行额外的计算。

[0052]术语“水溶液”在用于本文时是指主要是水并且保持水的溶液特征的溶液。其中所述水溶液包含除了水以外的溶剂，水是典型的主要溶剂。

[0053]术语“缓冲液”在用于本文时是指针对加入或者消耗化学物质而起作用将所述溶液的酸度或碱度的改变减少到最低的系统。

[0054]术语“可检测的反应”在用于本文时是指通过观察或者通过使用仪器而直接或间接可检测到的信号的发生或改变。典型地，所述可检测的反应是这样的光学反应，即，其导致波长分布模式、或者吸收或荧光强度的改变、或光散射中的改变、荧光寿命、荧光极性、或这些参数的组合中改变。备选地，所述可检测的反应是信号的发生，其中所述染料是固有发荧光的，并且在与金属离子或磷酸化的靶分子结合时不产生信号的改变。备选地，所述可检测的反应是信号的结果，诸如所述可检测标记的颜色、荧光、放射活性或另一种物理性质，所述可检测的标记变得空间位于样品的子集中，诸如在凝胶中，在印迹上，或在阵列上，在小平板的孔中，在微流体室中，或在由于形成包括磷酸化的靶点分子的本发明的三重(ternary)复合物而导致的微粒上。

[0055]术语“能源”在用于本文时是指光或波长发射装置，优选地是LED，其能够激发在溶液中的颗粒。

[0056]术语“荧光团”在用于本文时是指固有荧光的或者当与生物化合物或金属离子结合时表现出荧光改变的，即荧光性的组合物。荧光团可以包含改变所述荧光团的溶解性、光谱特征或物理特征的取代基。许多荧光团是本领域的技术人员已知的，并且包括，但不限于，香豆素，花青，苯并呋喃，喹啉，喹唑啉酮，吲哚(indole)，氮茚(benzazole)，borapolyazaindacene和呫吨，其包括荧光素，罗丹明和对甲氨基酚以及半导体纳米晶体和在RICHARD P.HAUGLAND，MOLECULAR PROBES HANDBOOK OFFLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(荧光探针和研究化学品的分子探针手册)(第10版，2005)中描述的其它荧光团。

[0057]术语“试剂盒”在用于本文时是指相关成分，典型地一种或多种化合物或组合物的包装的套系。

[0058]术语“标记”在用于本文时是指当附着到标记的试剂上并且用于本方法中时保留其天然特征(例如，光谱特征，构象和活性)的化学部分或蛋白质。所述标记可以是直接可检测的(荧光团)或间接可检测的(半抗原或酶)。这样的标记包括，但不限于，可以使用放射性-计数装置测量的放射性标记；色素、染料或其它可以视觉观察到或使用分光光度计测量的生色团发色团；可以使用自旋标记分析仪测量的自旋标记；和荧光标记(荧光团)，在这种情形中，例如，输出信号通过激发适当的分子加合物而产生，并且其可以通过用被所述染料吸收的光激发而显现，或者可以使用标准荧光计或成像系统测量。所述标记可以是化学发光的物质，在这种情形中，输出信号通过对信号化合物的化学修饰而产生；含金属的物质；或酶，在这种情形中，发生信号的酶-依赖性二次发生，诸如从无色底物形成有色产物。术语标记还可以指这样的“标记”或半抗原，即，其可以选择性地与缀合的分子结合，以便当随后与底物一起加入时，所缀合的分子用来产生可检测的信号。例如，人们可以使用生物素作为标记，然后使用辣根过氧化物(HRP)的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合物来结合所述标记，并且然后使用比色底物(例如，N-四甲基联苯胺(TMB))或荧光底物如Amplex Red试剂(分子探针公司(Molecular Probes，Inc.))以检测HRP的存在。许多标记是本领域的技术人员已知的，并且包括但不限于，颗粒、荧光团、半抗原、酶和它们的比色的、荧光的和化学发光的底物、以及其它在RICHARD P.HAUGLAND，MOLECULAR PROBES HANDBOOK OFFLUORESCENT PROBES AND RESEARCH PRODUCTS(荧光探针和研究产物的分子探针手册)(第9版，CD-ROM，2002年9月)，同上所述中描述的标记。

[0059]术语“机器可执行指示”在用于本文时是指使得机器如CPU实施方法或测定的一系列指示。

[0060]术语“光检测器”在用于本文时是指能够接受光信号并且产生包含与在所述光信号中相同的信息的电信号的任何装置。

[0061]术语“预先确定的分析物”在用于本文时是指与分析物传感元件(ASE)配合的分析物，以致所述预先确定的分析物的选择指示特定的ASE在装置中的存在。

[0062]术语“蛋白质”和“多肽”以通用意义用于本文，包括任何长度的氨基酸残基的聚合物。术语“肽”用于本文是指具有小于100个氨基酸残基，典型地小于10个氨基酸残基的多肽。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。

[0063]术语“样品”在用于本文时是指可以包含用于检测或定量的分析物的任何物质。所述分析物可以包括反应基团，例如通过其本发明的化合物可以缀合到所述分析物上的基团。所述样品还可以包括稀释剂、缓冲剂、去污剂、和污染种类、碎片等，发现它们与目标物混合在一起。示例性的实例包括尿、血清、血浆、全血、唾液、泪水、脑脊液、从乳头分泌的流体等。还包括混悬或溶解在液体物质如缓冲液、提取剂、溶剂等中的固体、凝胶或半固体物质如粘液、机体组织、细胞等。典型地，所述样品是活细胞，包括内源宿主细胞蛋白、核酸聚合物、核苷酸、寡核苷酸、肽、环境物质、食品、工业物质和缓冲溶液的生物流体。所述样品可以在水溶液、存活细胞培养物中或固定在固体或半固体表面如玻璃或塑料管或小杯上。

荧光计及使用方法

[0064]本发明的一个方面提供一种装置，该装置包括保持具有分析物和任选地报道分子的样品容器的容座，光检测器，一个或多个分析物传感元件和带有机器可执行指示的计算机处理部件。依次，所述分析物传感元件包括用于激发样品的能源，其中所述能源被配置成发射预先确定最大波长的光；激发滤波器，其分离来自能源的预先确定的波长范围的光；发射滤波器，其分离从被激发的样品发射的预先确定的波长范围的光。所述装置这样设计，以致每个分析物传感元件被设置成测量预先确定的分析物的量，并且其中所述机器可执行指示被设置成选择与待测量的分析物相对应的适当的分析物传感元件。

[0065]图1是本发明的一个实施方案的侧视图。图1描述一个所述装置的元件结构的实施方案，和怎样实施备选结构来实现本发明的装置的功能，对于本领域的技术人员将是显而易见的。图1图示的系统包括保持样品容器的容座101，电源103，计算机处理部件105，分析物传感元件，所述分析物传感元件包括能源107、激发滤波器109、和发射滤波器111，以及光检测器113。

[0066]在一个实施方案中，所述装置不限于所述容座所设置成接受的样品容器。所述容座可以适合的样品容器的实例包括但不限于，培养皿、培养瓶、4孔板、8孔板、24孔板、96孔板、小杯、离心管、和微量离心管，仅举数例。当用于本文时，“容座被设置成适合或者接受”意指用于样品容器的容座这样设计，以致样品容器贴切地适合开口，允许样品容器在超过垂直轴外很少或不移动。另外，所述容座和所述计算机处理部件可以或者可以不彼此配合，以致除非所述样品容器正确地放置在容座中，否则所述计算机处理部件将不开始测量所述样品。所述容座可以只接受1个样品容器，或者它可以设置成接受2，3，4，5，6，7，8，910或更多个样品管。在一个实施方案中，所述容座被设置成适合或者接受微量离心管。微量离心管的实例在本领域是公知的，并且包括但不限于EppendorfTM管，透光微量离心管形管如在实时PCR实验中所用的那些(一个实例是可从VWR获得的Axygen PCR-05-C500μL PCR管)和通用的离心管。在一个更具体的实施方案中，所述容座可以设置成只适合一种大小的微量离心管，或者它可以设置成适合多于一种大小的微量离心管，其包括但不限于，小于0.5ml的管，0.5ml的管，1.5ml的管，2ml的管和大于2ml的管。

[0067]因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于测量在样品容器中的分析物的量的装置，其中所述装置包括能源，光检测器，带有机器可执行指示的计算机处理部件，和保持样品容器的容座，其中所述样品容器包括透光塑料。在一个具体的实施方案中，塑料包括聚丙烯和/或聚乙烯。实时PCR仪器，诸如BioRad DNA Engine和Opticon2实时PCR检测系统是使用这种类型的管用于需要荧光团进行检测的样品的仪器的实例。这种类型的仪器和相对应的管是通常所用的，并且因此所述管易于从许多来源获得。

[0068]本发明的装置还包括光检测器。所述光检测器可以是能够接受光信号并且产生含有与所述光信号相同的信息的电信号的任何装置。可以用于本发明的光检测器的实例包括，但不限于，光敏电阻、光电元件、光敏二极管、光电倍增管、光电管、光电晶体管和检测由于发光引起的温度变化的热电装置。

[0067]本发明的装置还包括一个或多个分析物传感元件。本发明的每个分析物传感元件包括下列各项的特定组合：1)能源，其自身可以发射限定波长范围内的电磁能，2)“激发滤波器”，其能够分离一定波长范围的电磁能，诸如但不限于光，和3)“发射滤波器”，其能够分离从所述样品发射的一定波长范围的电磁能。当受到来自所述能源的能量的激发时，一般来说，所述样品将发射某种形式的电磁能，诸如，但不限于，可以通过荧光、磷光或发光产生的光。在本发明的一个实施方案中，所述装置包括单个分析物传感元件(ASE)。在另一个实施方案中，所述装置包括超过一个ASE。在一个更具体的实施方案中，所述装置包括2，3，4，5，6，7，8，9，或10个或更多个ASEs。如果所述装置包括多于1个ASE，那么所述多个ASEs可以共用ASEs的一个或多个单个组件。因此，例如，当本发明的装置包括2个ASEs时，这些ASEs可以共用一个能源，并且具有独立的发射滤波器和激发滤波器。为了继续本实例，所述ASEs可以共用能源和发射滤波器，但具有独立的激发滤波器。当然，在一个实施方案中，本发明的装置可以包括多于1个不同的ASEs，其中所述不同的ASEs不共用能源，也不共用发射滤波器或激发滤波器。在一个更具体的实施方案中，所述装置包括多于1个ASE，其中所述ASEs的组件没有共用的，尽管它们可以整合或者连接到同一计算机处理部件上。

[0070]当用于本文时，能源是电磁能的来源，并且包括任何类型的能量与电磁光谱，其包括但不限于，无线电能、微波能、红外、可见光、紫外光、x-射线光和甚至是γ射线。在一个实施方案中，从所述能源发射的能量是可见光。在一个更具体的实施方案中，最大波长的可见光是从所述能源发射的。例如，最大波长的可见光可以是，但不限于，在400nm和450nm之间，或在425和475nm之间，或在450nm和500nm之间，或在475nm和525nm之间，或在500nm和550nm之间，或在525和575nm之间，或在550nm和600nm之间，或在575nm和625nm之间，或在600nm和650nm之间，或在625和675nm之间，或在650nm和700nm之间，或在675nm和725nm之间。这些最大波长理想地与为了检测预先确定的分析物而选择的报道分子的最佳激发波长相对应。在另一个实施方案中，所述最大波长与从所述预先确定的分析物产生自发荧光的最佳波长相对应。在另一个实施方案中，所述最大波长与用于测量来自所述预先确定的分析物的光散射的最佳波长相对应。

[0071]所述能源可以是能够发射电磁能的任何装置或组合物。能源的实例包括，但不限于，发光二极管(LED)，白炽灯泡，气充电灯(例如，氦气、氪气、氖气、氩气、钠蒸汽和氮气)，激光，微波激射器，游离带电颗粒如离子，加速颗粒，化学发光化学品，荧光物质，和磷光物质。在一个具体的实施方案中，所述能源是至少一个发光二极管。在另一个具体的实施方案中，所述能源是多于一个的发光二极管。在一个更具体的实施方案中，所述能源是发射可见光的单个发光二极管。在一个更具体的实施方案中，所述能源是发射具有预定最大波长的可见光的一个或多个发光二极管。

[0072]本发明的ASE的另一个组件包括至少一个发射滤波器和一个激发滤波器。当用于本文时，激发滤波器是放置在所述能源和所述样品之间的滤波器，以便从所述能源发射的能量在激发所述样品之前进行滤波。当用于本文时，所述发射滤波器是放置在所述样品和所述光检测器之间的滤波器，以便从所述样品发射的能量在激发所述光检测器之前进行滤波。通常，滤波器作用排除(滤除)特定波长的电磁能透过所述滤波器。滤波器可以排除低于或者高于特定波长的电磁能的波长。例如，滤波器可以排除低于650nm的所有波长的光或高于490nm的所有波长。滤波器还可以排除在特定的波长范围内的电磁能。例如，滤波器可以排除除了具有在约520nm和约580nm之间的波长的光之外的所有波长的光。选择适当的滤波器与所述能源一起使用应该是容易地显而易见的。在一个特别的实施方案中，所述ASE包括发光的能源，滤除具有大于约490nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约520nm和大于约580nm的波长的光的发射滤波器。在另一个特别的实施方案中，所述ASE包括发光的能源，滤除具有小于约570nm和大于约647nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约565nm的波长的光的发射滤波器。在另一个实施方案中，所述装置包括至少两个ASEs，其中第一个ASE包括发光的能源，滤除具有大于约490nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约520nm和大于约580nm的波长的光的发射滤波器，并且其中第二个ASE包括发光的能源，滤除具有小于570nm和大于约647nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约565nm的波长的光的发射滤波器。

[0073]在一个实施方案中，所述装置包括多于一个ASE，并且所述多个ASEs被设置成以这样的空间排列，以致ASEs的核心组件不移动。图2描述具有2个ASEs的装置的实例，其中ASEs的核心组件被置于样品容座的中心。参照图2，所述第一ASE包括组件201，203和207，并且所述第二ASE包括组件213，215和217。在这种空间构型的一个实例中，能量(例如，光)从能源201(例如，发光二极管)发射，并且在透过放置在容座205上的样品之前透过激发滤波器203。当所述光激发样品时，从被激发的样品发射的光透过发射滤波器207，并且通过镜子209反射到光检测器211内或其上。继续这一实例，能量(例如，光)从能源213(例如，发光二极管)发射，并且在透过放置在容座205上的样品之前透过激发滤波器215。当所述光激发样品时，从被激发的样品发射的光透过发射滤波器217，并且通过镜子219反射到光检测器211内或其上。从图2显而易见，对于将能量束引导到所述光检测器内或其上，镜子可以是或者可以不是必需的，这取决于从被激发的样品发射的能量和所述光检测器之间的空间关系。因此，一个或多个镜子是任选的，并且可以在一些特别的实施方案中存在。

[0074]本发明的装置还包括计算机处理部件。所述处理器控制所述装置的操作，并且还提供对所述装置的各种功能性的控制。所述处理器可以是通过总线(bus)结构或其它通信界面控制功能的中央处理器。所述处理器还可以通过将所述处理功能分布在用来实施本装置的功能性的一个或多个所述各种组件中而实施。

[0075]所述计算机处理部件的一个组件将包括存储器。存储器用来提供程序数据或在操作过程中计算机处理部件所用的其它数据的存储，并且可以使用各种RAM或ROM存储装置而实施。存储器可以用于，例如，存储操作指示，和提供操作和存储的存储器登记。

[0076]存储器还可以与存储装置诸如但不限于盘存储装置或闪存装置联合使用。存储装置还可以用来存储程序指示，对照和校正曲线，操作数据，历史日志，和其它可以需要存储在所述装置内的数据。备选地，所述存储装置，如果存在一个的话，不需要在所述装置内。在一个实施方案中，所述存储装置将不存储大量数据，但是他存储的数据或指示能够被经常而快速地访问。在另一个实施方案中，存在高速缓冲存储器，已将与从所述存储装置找回常用的数据或指示相关的反应时间最小化。在更具体的实施方案中，所述存储装置可以存储小于1个十亿字节(GB)，小于500兆字节(MB)，小于250MB，小于100MB，小于50MB，小于20MB，小于10MB，小于9MB，小于8MB，小于7MB，小于6MB，小于5MB，小于4MB，小于3MB，小于2MB或小于1MB的数据和/或指示。在另一个具体的实施方案中，所述存储装置可以存储大量数据，例如1GB或更多的数据。

[0077]所述装置的存储器将包括机器可执行指示。所述机器可执行指示控制在所述装置内的ASEs的操作。例如，所述机器可执行指示被设置成选择适当的ASE，这取决于被测量的具体的分析物。因此，在一个具体的实施方案中，所述装置包括多于一个ASE，并且包括机器可执行指示。终端使用者可以选择并且将待测量的具体分析物输入到所述装置中，反过来，所述机器可执行指示将选择并使用所述装置内的正确的ASE来测量所选择的分析物。在一个具体的实施方案中，所述ASE已被最优化与特异的报道分子一起使用，所述报道分子用来测量所选择的分析物。

[0078]例如，参照图2，终端使用者可以选择特定的分析物来通过所述装置进行测量，并且所述机器可执行指示将确定使用哪一个ASE。如果选择了一种具体的分析物，那么所述机器可执行指示将操作打开能源201和光检测器209的电源，而不是能源211或光检测器217的电源。来自能源201的能量将透过激发滤波器203，并且激发放置在容座205中的样品。然后，从所述样品发射的能量将在传播到光检测器209之前透过发射滤波器207。如果然后终端使用者选择不同的分析物进行测量，那么所述机器可执行指示将操作打开能源211和光检测器217的电源，而不是能源201或光检测器209的电源。来自能源211的能量将透过激发滤波器213，并且激发放置在容座205中的样品。然后，从所述样品发射的能量将在传播到217中的光检测器之前透过发射滤波器215。在这种意义中，所述机器可执行指示能够被设置成选择与被测量的分析物相对应的适当的ASE。

[0079]在另一个实施方案中，所述机器可执行指示这样设置，以便它们能够在没有终端使用者输入时选择待测量的分析物。在这一实施方案中，终端使用者将只是将样品容器放置在容座205中。一旦放置就位，所述机器可执行指示可以或可以不进行一个或一系列操作，以确定最适合的ASE用于分析所述样品。当所述机器可执行指示选择与所述样品内的分析物相对应的适当的ASE时，然后，所述机器可执行指示实施测定以确定分析物浓度。

[0080]在另一个实施方案中，所述机器可执行指示还可以包括校正数据，诸如但不限于，校正曲线数据，内部标准数据等。例如，所述校正数据可以被写入所述机器可执行指示中，以便对于终端使用者不需要获得空白和标准物测量数据。因此，所述机器可执行指示可以允许所述装置在终端使用者第一次使用之前进行校正。并且所述机器可执行指示还可以允许对于终端使用者所述装置是完全“免于校正”的。

[0081]在另一个实施方案中，所述装置监测并定量在同一份样品中的多种分析物，其通过，例如，用不同的染料标记分析物，然后激发和/或滤过在特定波长的发射光谱，以便目的染料/分析物可以在其它染料/分析物的存在下被清楚地监测。因此，本发明的一个具体的实施方案提供对多种分析物的同时监测，诸如通过同时检测在单一样品中的多种染料/分析物而进行。

[0082]本发明的装置被设计成测量在样品中的多种分析物的量。所述装置可以被设计成同时测量多种分析物，或者所述装置可以被设置成“一次测量一种”分析物。所述被定量的分析物可以是任何分析物，条件是所述装置被设置成测量所需要的具体的分析物。当用于本文时，分析物是待分析的样品中的分析物、组合物或生物体。待定量的分析物的实例包括，但不限于，核酸如DNA和RNA，蛋白质，碳水化合物，脂质，蛋白聚糖，糖蛋白，蛋白脂质，脂蛋白，金属离子，原核和真核细胞，和病毒颗粒。在一个具体的实施方案中，所述装置能够定量DNA，RNA，真核和原核细胞，以及蛋白质。

[0083]在一个实施方案中，所选择的分析物使用报道分子进行测量。术语“报道分子”在用于本文时是指当与分析物缔合时，能够产生可见信号的任何发光分子，不管其是直接地还是间接地发光。包括典型用于荧光计检测分析物如核酸和蛋白质的报道子。目前可商购的报道分子包括但不限于，Quant

试剂盒(Invitrogen)中的染料，

染料，

染料，深紫蛋白染料，

染料，

染料，染料，和

染料。典型地，发光分子，当用于本文时，包括染料，荧光蛋白，磷光染料，发色团，酶底物，半抗原和化学发光化合物颗粒，半抗原，酶及它们在适当激活时能够产生可检测信号的比色、荧光和化学发光底物。术语“染料”是指发射光以产生可观察的检测信号的化合物。“染料”包括荧光的和非荧光的化合物，其包括但不限于，色素，荧光团，化学发光化合物，发光化合物和发色团。术语“发色团”在用于本文时是指发射和/或反射在可以不用仪器辅助而观察到的可见光谱中的光的标记。术语“荧光团”在用于本文时是指固有荧光性的，或者当与生物化合物结合时表现出荧光改变，即，可以是荧光性的或者强度可以通过淬灭而减少的组合物。荧光团可以包含改变所述荧光团的溶解性、光谱特征或物理特征的取代基。许多荧光团是本领域的技术人员已知的，并且包括，但不限于，香豆素，花青，苯并呋喃，喹啉，喹唑啉酮，吲哚，氮茚(benzazole)，borapolyazaindacene和呫吨，其包括荧光素，罗丹明和对甲氨基酚和在RICHARD P.HAUGLAND，TheHandbook，A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies(手册，荧光探针和标记技术的指南)(第10版，2005年)中描述的其它荧光团。[0084]存在许多用于扩增信号的荧光性和比色的酶底物，以及用来直接检测分析物的功能的底物，例如，分解底物形成可检测的信号的酶。二者都包含在本发明中用于检测预先确定的分析物。在用于扩增信号的酶底物的情形中，所述分析物与酶缔合。在酶底物直接检测所述分析物的情形中，所述分析物是酶。比色的或荧光性的底物和酶组合包括，但不限于，使用氧化还原酶如辣根过氧化物酶和底物如3，3’-二氨基联苯胺(DAB)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，其产生有区别的颜色(分别为棕色和红色)。其它产生可检测的产物的比色的氧化还原酶底物包括，但不限于：2，2-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，邻-苯二胺(OPD)，3，3’，5，5’-四甲联苯胺(TMB)，邻-联茴香胺，5-氨基水杨酸，4-氯-1-萘酚。荧光底物包括，但不限于，高香草酸或4-羟基-3-甲氧基苯乙酸，还原的吩噁嗪和还原的苯并噻嗪，包括

和Amplex超红试剂及其变体(美国专利号4,384,042和美国系列号10/980,139)和还原的二氢呫吨，包括二氢荧光素(美国专利号6,162,931)和二氢罗丹明，其包括二氢罗丹明123。是酪酰胺(tyramides)的过氧化物酶底物(美国专利号5,196,306；5,583,001和5,731,158)代表独特种类的过氧化物酶底物，原因在于它们在酶作用之前可以是固有可检测的，而通过过氧化物酶在描述为酪酰胺信号扩增(TSA)的过程中的作用而“固定在适当位置”。这些底物广泛地用于标记样品中的目的物，其是细胞、组织或阵列，用于它们随后通过显微镜、流式细胞术、光学扫描和荧光计进行检测。

[0085]另一种优选的比色(并且在一些情形中是荧光性的)底物和酶组合使用磷酸酶诸如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶或这样的磷酸酶与比色底物如5-溴-6-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)，6-氯-3-吲哚磷酸，5-溴-6-氯-3-吲哚磷酸，对-硝基苯基磷酸，或邻-硝基苯基磷酸的组合形式，或者与荧光底物如4-甲基伞基磷酸(4-methylumbelliferyl phosphate)，6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素磷酸(DiFMUP，美国专利号5,830,912)荧光素二磷酸，3-邻-甲基荧光素磷酸，试卤灵磷酸，9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸(DDAO磷酸)，或ELF97，ELF39或相关的磷酸盐(酯)(美国专利号5,316,906和5,443,986)的组合形式。

[0086]糖苷酶，特别是β-半乳糖苷酶，β-葡糖醛酸糖苷酶和β-葡糖苷酶，是另外适合的酶类。适当的比色底物包括，但不限于，5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和类似的吲哚半乳糖苷，葡糖苷，和葡糖醛酸糖苷，邻-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)和对-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷。优选的荧光性底物包括试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷，荧光素二半乳糖苷(FDG)，荧光素二葡糖醛酸糖苷以及它们的结构变体(美国专利号5,208,148；5,242,805；5,362,628；5,576,424和5,773,236)，4-甲基伞基β-D-吡喃半乳糖苷，羧基伞基β-D-吡喃半乳糖苷和氟化的香豆素β-D-吡喃半乳糖苷(美国专利号5,830,912)。

[0087]在另一个实施方案中，用于检测与抗抗生素如β-内酰胺的微生物相关的酶的存在的酶底物包括β-内酰胺酶底物，其包括但不限于，在美国系列号11/040,924；和US20030003526中公开的任何底物和应用方法。

[0088]其它酶类包括，但不限于，水解酶诸如胆碱酯酶和肽酶，氧化酶诸如葡萄糖氧化酶和细胞色素氧化酶，和还原酶，对于它们适合的底物是已知的。

[0089]产生化学发光的酶和它们适当的底物对于一些测定是优选的。这些包括，但不限于，天然和重组的形式的萤光素酶和水母发光蛋白。用于磷酸酶、糖苷酶和氧化酶的产生化学发光的底物，诸如包含稳定的二氧杂环丁烷(dioxetane)、鲁米诺、异鲁米诺和吖啶酯(acridinium esters)的那些也是有用的。

[0090]除了酶类，半抗原如生物素也是优选的标记。生物素是有用的，原因在于它可以在酶系统中起作用，以进一步扩增可检测的信号，并且它可以作用为标记，以用于分离目的的亲和层析中。对于检测目的，使用对于生物素具有亲和性的酶缀合物，诸如抗生物素蛋白-HRP。随后，加入过氧化物酶底物，以产生可检测的信号。

[0091]半抗原还包括激素，天然存在的和合成的药物，污染物，过敏原，效应分子，生长因子，化学因子，细胞因子，淋巴因子，氨基酸，肽，化学中间物，核苷酸，等。

[0092]在一个独立的实施方案中，所述报道分子是与特异的结合配偶体缀合的染料或标记，其中所述特异的结合配偶体与所述分析物或共价附着到所述分析物上的分子结合。术语“标记”在用于本文时是指当附着到标记试剂上并且用于本方法中时保留其天然特征(例如，光谱特征，构象和活性)的化学部分或蛋白质。所述标记可以是直接可检测的(荧光团)或间接可检测的(半抗原或酶)。这样的标记包括，但不限于，可以使用放射性-计数装置测量的放射性标记；色素、染料或其它可以视觉观察到或使用分光光度计测量的生色团；可以使用自旋标记分析仪测量的自旋标记；和荧光标记(荧光团)，在这种情形中，例如，输出信号通过激发适当的分子加合物而产生，并且其可以通过用被所述染料吸收的光激发而显现，或者例如可以使用标准荧光计或成像系统测量。所述标记可以是化学发光的物质，在这种情形中，输出信号通过对信号化合物的化学修饰而产生；含金属的物质；或酶，在这种情形中，发生信号的酶-依赖性二次发生，诸如从无色底物形成有色产物。术语标记还可以指这样的“标记”或半抗原，即，其可以选择性地与缀合的分子结合，以便当随后与底物一起加入时，所缀合的分子用来产生可检测的信号。例如，人们可以使用生物素作为标记，然后使用辣根过氧化物(HRP)的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合物来结合所述标记，并且然后使用比色底物(例如，N-四甲基联苯胺(TMB))或荧光底物如Amplex Red试剂(分子探针公司(Molecular Probes，Inc.))以检测HRP的存在。许多标记是本领域的技术人员已知的，并且包括但不限于，颗粒、荧光团、半抗原、酶和它们的比色的、荧光的和化学发光的底物、以及其它在RICHARD P.HAUGLAND，MOLECULARPROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCHPRODUCTS(荧光探针和研究产物的分子探针手册)(第9版，CD-ROM，2002年9月)，同上所述中描述的标记。

[0093]典型地，所述标记将是抗体、抗原、生物素或链霉抗生物素蛋白、典型用于免疫测定中的所有的缀合物。然而，并不意欲限制可以缀合到标记上并且用于本方法中来检测目标分析物的具体的结合配偶体。

[0094]表2.代表性的具体的结合对

 

抗原	抗体-
		生物素	抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白或抗-生物素)
IgG*	蛋白质A或蛋白质G
		药物	药物受体
叶酸	叶酸结合蛋白
		毒素	毒素受体
碳水化合物	凝集素或碳水化合物受体
		肽	肽受体
蛋白质	蛋白质受体
		酶底物	酶
Fc区	抗-Fc抗体
		激素	激素受体
离子	螯合剂

[0095]在一个特别的方面，载体分子是抗体片段，诸如，但不限于，抗-Fc，抗-Fc同种型，抗-J链，抗-K轻链，抗-λ轻链，或单链片段可变蛋白；或非抗体肽或蛋白，诸如，例如但不限于，可溶的Fc受体，蛋白质G，蛋白质A，蛋白质L，凝集素，或其片段。在一个方面，所述载体分子是对靶-结合抗体的Fc部分或对靶-结合抗体的Fc部分的同种型特异的Fab片段(美国系列号10/118,204)。单价Fab片段典型地从鼠源单克隆抗体或在各种动物例如但不限于兔或山羊中产生的多克隆抗体而产生。这些片段可以从任何同种型诸如鼠源IgM，IgG₁，IgG_2a，IgG_2b或IgG₃而产生。

[0096]备选地，非抗体蛋白或肽如蛋白质G，或其它适当的蛋白质，可以单独使用或者与白蛋白偶联。优选的白蛋白包括人和牛血清白蛋白或卵清白蛋白。蛋白质A，G和L定义为包括本领域的技术人员已知的包括至少一个IgG的结合结构域的那些蛋白质或其衍生物，即，对IgG有亲和性的蛋白质。这些蛋白质可以进行修饰，但是不必要进行修饰，并且以与本发明其它载体分子相同的方式缀合到反应标记上。

[0097]在另一个方面，所述载体分子是完整无损的抗体。抗体是本领域的术语，表示由动物应答抗原而分泌或生产的可溶物质或分子，并且其具有与诱导其形成的抗原特异性结合的特别的性质。抗体本身也作为抗原或免疫原，因为它们是糖蛋白，并且因此用来产生抗-物种抗体。抗体，也称为免疫球蛋白，分成5个不同的种类----IgG，IgA，IgM，IgD，和IgE。基本的IgG免疫球蛋白结构由两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链(通过二硫键连接在一起)组成。

[0098]当用酶木瓜蛋白酶处理IgG时，可以分离单价抗原-结合片段，本文称为Fab片段。当将IgG用胃蛋白酶(另一种蛋白水解酶)处理时，产生更大的片段F(ab′)₂。通过用中等还原性缓冲液处理，这一片段可以分成两半，这导致单价Fab′片段。Fab′片段比Fab稍大一些，并且包含一个或多个来自铰链区的游离的巯基(在更小的Fab片段中没有发现巯基)。术语“抗体片段”用于本文是定义抗体的Fab′，F(ab’)₂和Fab部分。用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶处理抗体分子以产生抗体片段，在本领域内是公知的(Gorevic等.，Methods of Enzyol.(酶学方法)，116:3(1985))。

[0099]本发明的单价Fab片段是从鼠源单克隆抗体而产生，或从在已经用外来抗体或其片段免疫的各种动物中产生的多克隆抗体而产生的，美国专利号4,196,265公开了生产单克隆抗体的方法。典型地，二级抗体来自于已经在兔或山羊中产生的多克隆抗体，但是本领域技术人员已知产生多克隆抗体的任何动物都可以用来产生抗-物种抗体。术语“一级抗体”描述直接与所述抗原结合的抗体，其与“二级抗体”相反，二级抗体结合所述一级抗体的区域。单克隆抗体是相等的，并且在一些情形中，比多克隆抗体优选，条件是配体-结合抗体与所述单克隆抗体相容，所述单克隆抗体典型地使用本领域技术人员公知的方法从鼠源杂交瘤细胞系产生。

[0100]在一个方面中，所述抗体只针对外来抗体的Fc区域产生。本质上，动物只用外来抗体如鼠源的Fc区域片段进行免疫。所述多克隆抗体从随后的采血中收集，用酶胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，以产生单价片段。然后，将所述片段在柱上进行亲和纯化，所述柱上包括动物针对其免疫的完整的免疫球蛋白蛋白或只是Fc片段。

[0101]本发明的标记包括本领域技术人员已知的任何直接或间接可检测的标记，所述标记可以共价附着到特异的结合配偶体上。标记包括，但不限于，发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光染料、串联染料、颗粒、半抗原、酶和放射性同位素。优选的标记包括荧光团、荧光蛋白、半抗原和酶。

[0102]本发明的荧光团是在超过280nm表现出最大吸收的任何化学部分，并且当共价附着到标记试剂上时保留其光谱特征。本发明的荧光团包括，但不限于：芘(包括在美国专利5,132,432中公开的任何相对应的衍生化合物)，蒽，萘，吖啶，1，2-二苯乙烯，吲哚或苯并吲哚，噁唑或苯并噁唑，噻唑或苯并噻唑，4-氨基-7-硝基苯基-2-噁-1，3-二唑(NBD)，花青(包括美国系列号09/968,401和09/969,853中的任何相对应的化合物)，羰花青(包括在美国系列号09/557,275；09/969,853和09/968,401；美国专利号4,981,977；5,268,486；5,569,587；5,569,766；5,486,616；5,627,027；5,808,044；5,877,310；6,002,003；6,004,536；6,008,373；6,043,025；6,127,134；6,130,094；6,133,445；和公布WO 02/26891，WO 97/40104，WO 99/51702，WO 01/21624；EP 1 065250 A1中的任何相对应的化合物)，喹诺酮(carbostyryl)，卟啉，水杨酸酯，氨茴酸酯，薁，苝，吡啶，喹啉，a borapolyazaindacene(包括在美国专利号4,774,339；5,187,288；5,248,782；5,274,113；和5,433,896中公开的任何相对应的化合物)，呫吨(包括在美国专利号6,162,931；6,130,101；6,229,055；6,339,392；5,451,343和美国系列号09/922,333中公开的任何相对应的化合物)，噁嗪(包括在美国专利号4,714,763中公开的任何相对应的化合物)或苯并噁嗪，carbazine(包括在美国专利号4,810,636中公开的任何相对应的化合物)，phenalenone，香豆素(包括在美国专利号5,696,157；5,459,276；5,501,980和5,830,912中公开的相对应的化合物)，苯并呋喃(包括在美国专利号4,603,209和4,849,362中公开的相对应的化合物)和benzphenalenone(包括在美国专利号4,812,409中公开的任何相对应的化合物)以及它们的衍生物。当用于本文时，噁嗪包括试卤灵(包括在5,242,805中公开的任何相对应的化合物)、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪、以及它们的苯并-取代的类似物。

[01003]当所述荧光团是呫吨时，所述荧光团任选地是荧光素、对甲氨基酚(包括在美国专利号5,227,487和5,442,045中公开的任何相对应的化合物)或罗丹明(包括在美国专利号5,798,276；5,846,737；美国系列号09/129,015中公开的任何相对应的化合物)。当用于本文时，荧光素包括苯并-或二苯并荧光素、半萘荧光素、或萘荧光素。类似地，当用于本文时，对甲氨基酚包括seminaphthorhodafluors(包括在美国专利号4,945,171中公开的任何相对应的化合物)。备选地，所述荧光团是呫吨，其通过在呫吨的9-位置上的单一共价键连接而键合。优选的呫吨包括附着在9-位置上的3H-呫吨-6-醇-3-酮的衍生物，附着在9-位置上的6-氨基-3H-呫吨-3-酮的衍生物，或附着在9-位置上的6-氨基-3H-呫吨-3-亚胺的衍生物。

[0104]本发明优选的荧光团包括呫吨(对甲氨基酚，罗丹明，荧光素及其衍生物)香豆素，花青，芘，噁嗪和borapolyazaindacene。最优选的是磺化呫吨，氟化呫吨，磺化香豆素，氟化香豆素和磺化花青。附着到特异性结合配偶体上的荧光团的选择将决定报道分子的吸收和荧光发射特征以及随后的ASE选择。荧光团标记的物理特征包括光谱特征(吸收、发射和斯托克斯频移)、荧光强度、寿命、极性和光脱色速率，所有这些特征都可以用来区分一种荧光团和另一种荧光团。

[0105]典型地，所述荧光团包含一个或多个芳香族或杂芳香族环，其任选地由各种取代基取代一次或多次，所述取代基包括但不限于，卤素，硝基，氰基，烷基，全氟烷基，烷氧基，链烯基，炔基，环烷基，芳烷基，酰基，芳基或杂芳基环系统，苯并，或本领域已知的在荧光团上典型存在的其它取代基。

[0106]在本发明的一个方面中，所述荧光团具有超过480nm的最大吸收。在一个特别有用的实施方案中，所述荧光团在或者接近488nm到514nm(特别适用于通过氩离子激光激发源的输出激发)或接近546nm(特别适用于通过水银弧光灯激发)吸收。

[0107]许多荧光团还可以作用为发色团，并且因此所述荧光团也是本发明优选的发色团。

[0108]荧光蛋白还可以用作本发明的标记。荧光蛋白的实例包括绿色荧光蛋白(GFP)和藻胆蛋白以及它们的衍生物。所述荧光蛋白，特别是藻胆蛋白，特别用于生成被标记试剂标记的串联染料。这些串联染料包括用于获得更大的斯托克斯频移的目的的荧光蛋白和荧光团，其中发射光谱从所述荧光蛋白的吸收光谱的波长更远地频移。对于检测样品中的少量目标物，这是特别有利的，其中所发射的荧光被最大程度的最优化，换言之，所发射的光中很少至没有被所述荧光蛋白重吸收。为了使这起作用，所述荧光蛋白和荧光团作用为能量转移对，其中所述荧光蛋白在所述荧光团吸收的波长发射，然后所述荧光团在远离所述荧光蛋白的波长处发射，这只能使用所述荧光蛋白而获得。特别有用的组合是在美国专利4,520,110；4,859,582；5,055,556中公开的藻胆蛋白，和在5,798,276中公开的磺化罗丹明荧光团，或在美国系列号09/968/401和09/969/853中公开的磺化花青荧光团；或在6,130,101中公开的磺化呫吨衍生物，以及在美国专利4,542,104中公开的那些组合。备选地，所述荧光团作用为能量供体，并且所述荧光蛋白是能量受体。

[0109]在一个实施方案中，所述标记是选自由下列各项组成的组的荧光团：荧光素，香豆素，罗丹明，5-TMRIA(四甲基罗丹明-5-碘乙酰胺)，(9-(2(或4)-(N-(2-马来酰亚胺基乙基)-氨磺酰基)-4(或2)-磺基苯基)-2，3，6，7，12，13，16，17-八氢-(1H，5H，11H，15H-呫吨并(2，3，4-ij:5，6，7-i′j′)联喹嗪-18-鎓盐)(德克萨斯红

(Texas 

))，2-(5-(1-(6-(N-(2-马来酰亚胺基乙基)-氨基)-6-氧代己基)-1，3-二氢-3，3-二甲基-5-磺基-2H-吲哚-2-基亚基)-1，3-丙基二烯基)-1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-3H-吲哚鎓盐(Cy^TM3)，N，N′-二甲基-N-(碘乙酰基)-N′-(7-硝基苯基-2-氧杂-1，3-重氮-4-基)乙二胺(IANBD酰胺)，6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘(acrylodan)，芘，6-氨基-2，3-二氢-2-(2-((碘乙酰基)氨基)乙基)-1，3-二氧代-1H-苯基(de)异喹啉-5，8-二磺酸盐(荧光黄(lucifer yellow))，2-(5-(1-(6-(N-(2-马来酰亚胺基乙基)-氨基)-6-氧代己基)-1，3-二氢-3，3-二甲基-5-磺基-2H-吲哚-2-基亚基)-1，3-戊二烯基)-1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-3H-吲哚鎓盐(Cy^TM5)，4-(5-(4-二甲基氨基苯基)噁唑-2-基)苯基-N-(2-溴乙酰氨基乙基)磺酰胺

(2-溴乙酰氨基乙基)磺酰胺))，(N-(4，4-二氟-1，3，5，7-四甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-基)碘乙酰胺

 507/545IA)，N-(4，4-二氟-5，7-联苯基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙炔基)-N’-碘乙酰基乙二胺(BODIPY530/550IA)，5-((((2-碘乙酰基)氨基)乙基)氨基)萘-1-磺酸(1，5-IAEDANS)，和羧基-X-罗丹明，5/6-碘乙酰胺(XRIA5，6)。标记的另一种实例是BODIPY-FL-酰肼。其它发光标记包括镧系元素如铕(Eu3+)和铽(Tb3+)，以及钌[Ru(II)]，铼[Re(I)]，或锇[Os(II)]的金属-配体络合物，典型地在与二亚胺配体如菲咯啉的络合物中。

[0110]在另一个实施方案中，所述报道分子是荧光性的，其中它们在与所述分析物缔合时变成荧光性的。这样的报道分子包括与核酸(DNA和/或RNA)、蛋白(总蛋白和子集蛋白如翻译后修饰的蛋白)、pH、和金属离子相关的染料。用于检测核酸的报道分子典型地包括不对称的花青化合物，单体或二聚体，其包括但不限于，在美国专利号4,957,870；4,883,867；5,436,134；5,658,751，5,534,416；5,863,753；5,410,030；5,582,977；6,664,047；美国系列号10/911,423；11/005,860；11/005,861；60/680,243和WO 93106482中公开的化合物；溴化乙锭二聚体(美国专利号5,314,805)，吖啶二聚体和吖啶-溴化乙锭异二聚体(美国专利号6,428,667和Rye，等.Nucleic AcidsResearch(核酸研究)(1990)19(2)，327)。下述参考文献描述了DNA嵌入荧光二聚体和它们的物理特征：Gaugain等，Biochemistry(生物化学)(1978)17:5071-5078；Gaugain等，Biochemistry(生物化学)(1978)17:5078-5088；Markovits等，Anal.Biochemistry(生物化学年刊)(1979)94:259-269；Markovits等，Biochemistry(生物化学)(1983)22:3231-3237；和Markovits等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)(1985)13:3773-3788。商购的染料包括PicoGreen，RiboGreen和OliGreen(Invitrogen)。

[0111]在另一个实施方案中，所述报道分子将蛋白染色，直接染色或者通过形成包含金属离子的三重络合物。这样的报道分子包括，但不限于，在美国专利5,616,502；美国系列号11/241,323；11/199,641；11/063,707；10/966,536；10/703,816；和6,967,251中公开的那些。商购的染料包括NanoOrange，和Coomassie Fluor(Invitrogen)。

[0112]在另一个实施方案中，所述报道分子在与离子缔合后变成荧光性的。这样的报道分子包括，但不限于，在美国专利6,316,267；6,162,931；5,648,270；6,013,802；5,405,975；5,516,864；5,453,517；6,962,992；美国系列号10/634,336；和11/191,799中公开的那些。商购的染料包括氟-3，氟-4，Corona Red，Corona Green，LeadmuinGreen，Fura钙指示剂。

本发明的具体方面：

[0113]本发明的一个方面提供使用报道分子测量一种或多种预先确定的分析物的量的装置，其中所述装置是一个整合的部件，其包括：

用于保持具有分析物和报道分子的样品容器的容座，光检测器、一个或多个固定的并且不同的分析物传感元件(ASE)、和带有机器可执行指示的计算机处理部件，其中所述ASE包括：

a)用于激发所述样品的能源，其中该能源被设置成发射预先确定最大波长的光；

b)激发滤波器，其中所述激发滤波器被设置成分离来自所述能源的预先确定的波长范围的光；

c)发射滤波器，其中所述发射滤波器被设置成分离从被激发的样品发射的预先确定的波长范围的光；并且

其中每个ASE被设置成测量预先确定的分析物的量，并且所述机器可执行指示被设置成选择与待测量的分析物相对应的适当的ASE。

[0114]在一个优选的实施方案中，所述能源是发光二极管(LED)。

[0115]在另一个实施方案中，所述预先确定的分析物选自由下列各项组成的组：DNA，RNA，蛋白质，真核或原核细胞，碳水化合物，脂质，病毒，pH和金属离子。在另一个实施方案中，所述机器可执行指示进一步被设置成基于来自被激发的样品的发射光而确定具体分析物的浓度。在另一个实施方案中，所述装置还包括使用者界面。在另一个实施方案中，所述使用者界面包括显示器和非数字键区。

[0116]在另一个实施方案中，所述样品容器容座被设置成适合透光0.5微量离心管。在另一个实施方案中，所述装置还包括内部电源。在另一个实施方案中，所述装置还包括至少一个通信端口。更具体地，所述通信端口选自由下列各项组成的组：通用串行总线(USB)端口、音频/视频串行总线(IEEE1394)、红外(IR)端口和无线电频率(RF)端口。

[0117]在另一个实施方案中，所述装置包括第一和第二ASE。更具体地，所述第一ASE包括发射具有约470nm最大波长的光的LED，滤除具有大于约490nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约520nm和大于约580nm的波长的光的发射滤波器。仍然更具体地，所述第二ASE包括发射具有约640nm的最大波长的光的LED，滤除具有小于约570nm和大于约647nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约652nm的波长的光的发射滤波器。

[0118]在另一个实施方案中，所述使用者界面被设置成允许使用者选择用于测量的分析物。

[0119]在另一个实施方案中，所述机器可执行指示能够在没有使用者输入时选择所述用于测量的分析物。

[0120]权利要求1的装置，其中所述装置的尺寸在短轴上约30-300mm，在长轴上100-500mm，并且可变厚度约10到100mm；条件是长轴的尺寸大于短轴。

[0121]本发明的另一个方面提供计算在透光样品容器中的分析物的量的方法，所述方法包括：

a)生成荧光标准曲线，包括测量空白样品(g)的荧光强度，并且测量至少一个高端标准物(v)的荧光强度，其中所述曲线使得荧光强度与分析物数量相关，并且其中所述曲线具有预先确定的S形程度(n)和曲率(k)；

b)测量所述样品(y)的荧光强度，其中所述样品包括能够指示所述分析物在样品中的存在的荧光部分；和

c)使用所述荧光标准曲线使得所述样品(y)中的所述荧光强度与所述分析物的量相关。

[0122]在另一个实施方案中，所述曲线由下述方程表征：

(I)y＝r(xⁿ/(xⁿ+k))+g；

其中r是通过下式确定的校正值：

(II)r＝(v-g)((sⁿ+k)/sⁿ)

其中(s)是在所述高端标准物中的分析物的量。

[0123]另一个实施方案提供用于检测预先确定的分析物在样品中的存在的方法，其中所述样品是在透光样品容器中，所述方法包括：

a)使样品与报道分子接触，以形成接触的样品；

b)检测所述预先确定的分析物的存在，其中检测包括将所述透光容器放置在整合装置的保持所述样品容器的容座上，以测量预先确定的分析物，其中所述装置还包括：

i)光检测器，一个或多个固定的并且不同的分析物传感元件(ASE)、和带有机器可执行指示的计算机处理部件，其中所述ASE包括：

用于激发所述样品的能源，其中该能源被设置成发射预先确定最大波长的光；

激发滤波器，其中所述激发滤波器被设置成分离来自所述能源的预先确定的波长范围的光；

发射滤波器，其中所述发射滤波器被设置成分离从被激发的样品发射的预先确定的波长范围的光；并且

其中每个ASE被设置成测量预先确定的分析物的量，并且其中机器可执行指示被设置成选择与待测量的分析物相对应的适当的ASE。

[0124]本发明的另一个方面提供计算在样品容器中的两种分析物的比例的方法，所述方法包括：

a)生成关于所述两种分析物的荧光标准曲线，其包括：测量第一空白分析样品(g1)和第二分析样品(g2)的荧光强度，并且测量关于所述第一分析物的至少一个高端标准物(v1)和关于所述第二分析物的至少一个高端标准物(v2)的荧光强度，其中所述曲线使得荧光强度与每种分析物的量或相对量相关，并且其中所述曲线具有预先确定的S形程度(n)和曲率(k)；

b)测量所述样品(y1和y2)的荧光强度，其中所述样品包括能够指示所述分析物在所述样品中的存在的荧光部分；和

c)使用所述荧光标准曲线使得所述样品(y1和y2)中的所述荧光强度与所述分析物的量相关。

[0125]本发明的另一个实施方案提供检测在样品中的酶或分解底物的方法，所述方法包括：

提供如本文所述的装置，其包括包含与可裂解接头结合的标记的容座，其中所述可裂解接头通过所述酶或可裂解底物而裂解；

将怀疑含有所述酶或可裂解底物的样品加入到所述容座；

监测所述容座的目标部分，除了当与所述可裂解接头结合时被所述标记占据的位点；和

检测所述标记在所述容座的目标部分的存在。

[0126]在其一个优选实施方案中，所述酶或可裂解底物裂解所述可裂解接头，由此释放所述标记，其扩散到被监测所述标记存在的容座部分上。在另一个实施方案中，所述标记是荧光染料。

[0127]本发明的优选方面包括本发明的任何一个方面，更具体地由本发明所述的实施方案所定义。

[0128]在另一个实施方案中，所述装置被放置在具有短轴约30-300mm、长轴100-500mm、可变厚度约10到100mm尺寸的椭圆或卵形部件中；条件是长轴的长度大于短轴。在一个优选的实施方案中，所述部件具有接近使用者的减小的厚度，以致屏幕倾斜向使用者。更具体的，所述部件被放置在具有约2-3mm厚度的材料中，更具体地所述框架材料是塑料。

[0129]在一个具体的实施方案中，所述装置具有美国外观申请号29/251,820中所述的外观/结构特征，其内容通过引用如同在本文中充分描述那样并入。

[0130]AIDS诊断检测装置

[0131]在CD4诊断测定中的最近的进步允许2种简单的试剂用于鉴定和计数全血中的两种细胞群体，其与简单的2通道荧光计相容。使用简单的分离机制，诸如手摇曲柄离心机，简单的细胞滤器或磁珠，将待计数的细胞与所述试剂分离。这3种组件包括用于偏远地区的AIDS诊断平台(ADPURA)。[0132]用于这种应用的主要生物化学试剂是抗-CD4抗体和抗-CD45抗体。这两种抗体是PLG方法(Glencross等(2002)CD45assisted panleucogating foraccurate，cost effective dual platform CD4+T cell enumeration，CytometryClinical Cytometry，Special Issue:CD4:20years and counting(CD45辅助的panleucogating精确，成效双重平台CD4+T细胞计数：血细胞计数临床血细胞技术，特刊：CD4：20年和计数):50(2)69-77)的基础，该方法使用表达CD45的细胞(全是白血细胞)进行标准化测量CD4+细胞。一起使用这两种抗体(抗-CD4抗体和抗-CD45抗体)使得CD4计数变得如同计算表达CD4的细胞和表达CD45的细胞之间的比例那样简单。

[0133]在本发明的一个实施方案中，一起使用下述组件：

a)具有2个检测通道的荧光计，每个检测通道包括LED、发射滤波器和光电二极管检测器。所述荧光计具有使用者界面和在印刷的电路板上的CPU(中央处理器)上的数据分析。主体(body)是稳定的，并且可以经受存在风、沙和水的环境，不同的LEDs和发射滤波器，流线型的使用者界面和更少的按钮。另外，所述荧光计可以脱离电池、手摇曲柄或其它电源进行工作，不需要插头插入到电栅基础结构中。所述荧光计设计成只用于一个目的，在这种情形中，简化使用者界面，表达读数的结果，并且将只需要一个按钮来激活该仪器进行读数。备选地，可以进行多个诊断应用，使用具有USB连接的“闪盘(thumb drive)”，新的应用能够上载到该仪器上。

b)试剂试剂盒，其包括CD4抗体，其用荧光染料如AlexaFluor 488染料标记，和CD45抗体，其用光谱与CD4标记显著不同的荧光染料如AlexaFluor647染料标记。所述抗体将理想地在热或冷条件下稳定运输，可能是冻干的，或者可能是叠氮化物。存在一些可以应用的备选的抗体-稳定技术。所述抗体将以适当的浓度，并且在适当的容器中，以允许具有很少科技训练的人将其简单加入到样品中。

c)三个可能的细胞-分离平台中的一种：

a.CD45抗体-标记的Dynal珠和分离珠(DetachaBead)技术，以从全细胞群体分离白血细胞，然后使用简单的磁体从残留的珠子分离。

b.用于500μL管的手摇曲柄离心机，其可以用来沉淀细胞，与简单的塑料移液管组合，以去除上清，并且加入洗涤溶液。该离心机在原理上与目前市场上的手摇曲柄离心机类似，但是被修改成使用500-μL的塑料管，为了操作者安全操作进行包封，，以及样品完整性，大小与目前的桌面“分子离心机(picofuges)”类似，并且与野外条件相容。

c.滤器，以将细胞与标记的CD4和CD45抗体分开。

d)关于这一平台的任选的附件包括廉价的塑料移液管和水净化系统，诸如在出售露营供应品的商店中找到的那些。

e)本发明还包括包含上述组件的试剂盒，使用细胞-标记方法，细胞-分离方法和所述荧光计连续地一起工作。

[0134]本申请的工作流程如下：

a.第一，血液样品采自患者，并且使用公认的方法制备用于抗体染色。

b.第二，将所述样品与在试剂试剂盒中的抗体混合。荧光团-标记的CD4抗体将结合CD4+细胞，并且荧光团-标记的CD45抗体将结合CD45+细胞。如果抗体-标记的珠子用于所述分离方法，这些将在这一步骤中也结合细胞。

c.第三，分离方法将用来从所述标记的细胞中去除游离的标记抗体。i如果本方法使用磁珠，那么将使用磁体来从样品中去除CD4+和CD45+细胞。上清将被弃掉，并且将珠子重悬在缓冲液中。然后将珠子去除，例如，通过使用分离珠子技术进行，使用所述磁体吸出珠子，将被标记的细胞留在上清中。

ii如果所述方法使用离心机，那么将样品在离心机中旋转离心，以沉淀被标记的细胞。含有游离的标记抗体的上清将被弃掉，并且将所述细胞重悬在缓冲液中。

iii如果所述方法使用滤器，那么将所述样品用于所述滤器，其将截留被标记的细胞。流过液将被弃掉，并且将被标记的细胞重悬在缓冲液中。

d.第四，使用所述荧光计读取所述样品。将步骤c的被标记的细胞转移到500μL干净透明的PCR管中，并且在所述荧光计上读数。所述荧光计将自动在两个通道中进行读数，进行计算，并且使用关于本检测的标准术语，在LCD或类似的屏幕上显示该值作为CD4+的计数。

[0135]在另一个实施方案中，所述校正剂可以是已知浓度的分析物。例如，当用适当的分析物检测染料温育时，含有零分析物的空白代表所述测定的低端，和包含高浓度分析物的管代表所述测定的高端。

[0136]在另一个实施方案中，所述校正剂可以是液体或固体标准物，其产生与相对应的分析物/染料混合物相等的荧光信号。

[0137]在另一个实施方案中，所述标记可以是荧光或光散射纳米晶体[Yguerabide，J.和Yguerabide，EE，2001J.Cell Biochem Suppl.(细胞生物化学杂志增刊)37:71-81；美国专利号6,214,560；6,586,193和6,714,299]。这些荧光纳米晶体可以是半导体纳米晶体或掺杂的金属氧化物纳米晶体。纳米晶体典型地包括这样的核心，所述核心包括至少一种组II-VI半导体材料(其中，ZnS，和CdSe是示例性的实例)、或组III-V半导体材料(其中，GaAs是示例性的实例)、或组IV半导体材料、或它们的组合。所述核心可以用均匀沉淀在其上的半导体覆盖层(“外壳”)钝化。例如，组II-VI半导体核心可以用组II-VI半导体外壳钝化(例如，ZnS或CdSe核心可以用包括YZ的外壳钝化，其中Y是Cd或Zn，并且Z是S，或Se)。纳米晶体可以在水基环境中可溶。半导体纳米晶体的一个吸引人的特征是发射的光谱范围可以通过改变所述半导体核心的大小而改变。

[0138]使用原位裂解的实施方案：

[0139]在另一个实施方案中，所述仪器可以测量报道子通过扩散或者活性混合而从该仪器光径之外的区域到所述光径之内的区域的裂解。图4：描述了在该仪器内的管(306)。结合到可裂解底物(301)上的报道元件(302)结合在管的底部。当所述底物被裂解时，那么所述报道元件变成游离的(303)在管内移动到仪器(304)的光径(300)之内，在这里对它进行检测(305)。

[0140]所述报道元件可以是荧光或比色的。

[0141]所述可裂解底物可以是核酸、肽、或其它有机化学品。

[0142]所述可裂解的底物可以通过酶或化学反应而裂解。

[0143]所述可裂解底物可以附着到管上或某些其它物理固定剂如磁性或非磁性珠子上

[0144]所述报道元件可以从结合的粘合剂上而不是可裂解的底物上被置换下来，这也是可能的。这样的实例是荧光标记的脱硫生物素，其可以通过更高亲和力结合的生物素而从链霉抗生物素蛋白上置换下来。

[0145]使用多个参数装置的实施方案：

a.在另一个实施方案中，所述机器可执行指示可以由终端使用者在计算机上“脱机”发展。以便测定的名称、适当的ASEs、相关校正的值和数目、曲线拟合算法、和显示输出的格式由终端使用者确定和设定，然后通过连接电缆“上载”到该仪器上。

b.当“上载”到该仪器上时，新程序将变成该仪器上永久可选择的选择。

[0146]用于细胞测定的染料：

[0147]用于全细胞计数的染料：SYTO9，11-18，20-25，和59-64，BC，TOTO-3，TO-PRO-3，DRAQ-5，Dil，DiO，WGA-546，FM1-43，钙荧光素AM。

[0148]用于死细胞计数的染料：SYTOX Green，SYTOX Red，SYBR Gold，SYBR Green，PicoGreen。

[0149]液体标准物的制备：

a.将是液体标准物的高浓度校正点的样品混合，意欲用于模拟。例如在Quant-iT DNA高灵敏度测定中，所述高标准物是在终体积200μLTE中的100ngλ DNA加上PicoGreen染料(终浓度0.7uM)。

b.在仪器上(诸如本文所述的荧光计)读取相关的荧光值。例如在所述Quant-iT DNA高灵敏性测定中使用460nm激发能源读数。

c.将浓缩的稳定荧光化合物逐步加入到稀释溶液中。例如在Quant-iTDNA高灵敏性测定中，将浓缩的荧光素(10mM，在0.1M硼酸钠，pH9的缓冲液中)加入到0.1M硼酸钠，pH9的缓冲溶液中直到在所述装置中的荧光信号等于在步骤b中获得的信号(接近浓度100nM荧光素)。

d.对于所有实验，继续用荧光素溶液取代高标准物。例如在Quant-iTDNA高灵敏性测定中用100nM荧光素校正剂取代含有100ng DNA加PicoGreen的校正剂。

[0150]在本发明的一个实施方案中，本文所述的装置用于水和土壤检测。在本发明的一个更具体的实施方案中，所述装置监测选自由下列各项组成的组的分析物或参数：排泄物大肠菌，pH，重金属，硝酸盐，砷，朊病毒，挥发性的有机化合物(VOC)，氯，钙，钠，和葡萄糖。

[0151]在另一个实施方案中，本文所述的装置用于传染病检测和监测。在本发明的一个更具体的实施方案中，所述装置监测选自由下列各项组成的组的分析物或参数：AIDS(CD4测定)，疟疾，TB，SARS，BSE，炭疽热，流感，感冒，瘟疫，和朊病毒。

[0152]在另一个实施方案中，本文所述的装置用于生物标记的检测或鉴定。在本发明的在一个更具体的实施方案中，所述生物标记指示下列各项：癌症，支原体(Mycoplasma)，妊娠，端粒酶，抗体，和遗传病。

[0153]在另一个实施方案中，本文所述的装置用于酶底物的检测或鉴定。在本发明的一个更具体的实施方案中，所述酶底物选自由下列各项组成的组：核酸酶，磷酸酶，glycoases，激酶，蛋白酶，和过氧化物酶。

[0154]在另一个实施方案中，本文所述的装置用于细胞生物学试剂验证和质量控制(QC)。在本发明的在一个更具体的实施方案中，所述装置监测选自由下列各项组成的组的分析物或参数：钠，钙，葡萄糖，镁，钾，锌，铊，pH，氧，氧化氮，二氧化碳，氯化物和酶底物(核酸酶，磷酸酶，glycoeases，激酶，蛋白酶，和过氧化物酶)。

[0155]在另一个实施方案中，本文所述的装置用于细菌确定。在本发明的在一个更具体的实施方案中，所述装置监测与赤潮或大肠杆菌(E.Coli)相关的分析物。

[0156]在另一个实施方案中，本文所述的装置用于化妆品领域。在其一个更具体的实施方案中，所述装置监测活性氧种类(ROS)，细菌污染，活的/死的细胞，三聚氰胺确定，胆固醇。

[0157]在另一个实施方案中，所述装置监测GFP，叶绿素，或生物战争试剂。

[0158]在另一个实施方案中，本文所述的装置用于机动车目的。更具体地，泄漏检测、油检测、空气调节、冷冻剂检测。

[0159]在另一个实施方案中，本文所述的装置用于法医学；更具体地，用于样品确定，诸如血液、尿或精子的检测/定量。

[0160]在另一个实施方案中，本文所述的装置用于农业检测/定量。更具体地，用于酶底物的检测/定量，诸如植酸酶、纤维素酶和本文所述的其它酶底物的检测/定量。

[0161]在另一个实施方案中，本文所述的装置用于终点PCR。更具体地，所述装置监测/检测染料，其特别包括SYBR Green，PicoGreen，SYBR Gold。在另一个实施方案中，所述装置检测/监测分子信标。在另一个实施方案中，所述装置检测/监测等温扩增。

[0162]本发明涉及用于定量多种分析物的装置和方法。术语“定量”或“测量数量”在用于本文时是可互换的。定量测量可以是被设计成为终端使用者提供关于分析物在样品中的量的信息的任何测量。因此，所述测量可以是所述分析物的绝对测量，诸如质量，或所述测量可以是相对测量，诸如浓度或百万分率(parts per million)，等。当然，分析物的量可以等于零，表明不存在所寻找的分析物，或者所述分析物在由所述仪器测量的测定的可检测的水平之下。所述量可以简单地作为由光检测器检测到的测量的能量，无需任何额外的测量或操作。备选地，所述量可以表示为所述分析物的测量值与另一种化合物包括但不限于标准物的测量值的差异、百分数或比例。所述量甚至可以表示为分析物与在不同时间点测量的自身的差别或比例。

[0163]分析物的量可以直接从所检测的能量值确定，或者所检测的能量值可以用于算法中，所述算法设计成将所检测的能量值与分析物在样品中的数量相关。为了这一目的，所述机器可执行指示还可以被设置成基于所检测的能量值而确定所述分析物的量。

[0164]在一个具体的实施方案中，所述机器可执行指示实施计算分析物在样品中的数量的方法，其通过产生荧光标准曲线，并且使用这一荧光标准曲线将样品的荧光强度与分析物的数量相关。在一个更具体的实施方案中，所述荧光标准曲线可以通过测量“空白”样品，即已知不含所述分析物的样品(g)的荧光强度，并且测量含有已知量的分析物的唯一一个标准物(v)的荧光强度而产生。当然，所述荧光标准曲线可以使用多于一种含有已知量的分析物的标准物而产生。当已经测量了所述空白和标准物的荧光值时，那么所述机器可执行指示可以产生荧光标准曲线。在测量所述空白和标准物之前，所述荧光标准曲线可以具有预先确定的S形程度(n)和曲率(k)，并且所述机器可执行指示可以拥有这些(k)和(n)值作为产生所述荧光标准曲线的算法的一部分。在所述机器可执行指示产生所述荧光标准曲线时，可以测量样品(y)的荧光强度，并且可以使用所述荧光标准曲线使所述(y)值与分析物的数量相关。

[0165]在一个具体的实施方案中，所述荧光标准曲线可以通过下述方程表征：

(I)y＝r(xⁿ/(xⁿ+k))+g；

其中r是通过下式确定的校正值：

(II)r＝(v-g)((sⁿ+k)/sⁿ)

其中(s)是在所述高端标准物中的分析物的量。

[0166]在一个甚至更具体的实施方案中，方程I和II中的(n)值接近或大约等于1(1)。n的值包括但不限于，0≤n≤10，0≤n≤5，0.5≤n≤3，0.75≤n≤1.5，0.8≤n≤1.2，0.9≤n≤1.1和0.95≤n≤1.05。另外，所述曲线可以接近线性。由于k接近无穷大，故所述曲线接近线性。易于理解当曲线“接近线性”时是什么意思。

[0167]在另一个具体的实施方案中，使用3个标准物，其中一个标准物是空白，另一个标准物是中间范围的标准物，并且第三个标准物是高端标准物。在这个具体的实施方案中，(n)是预先确定的，但是(k)可以是变量，并且因此应该被确定。在这一实施方案中，k使用下述方程IV求解。

(IV)k＝[sⁿtⁿ(d-1)]/[sⁿ-(tⁿd)]

值d是校正值，其等于所述两种非空白背景-校正的非空白标准物的荧光值的比例，其使用下述方程V求解。

(V)d＝(v-g)/(w-g)

[0168]在方程V中，(w)是用于这一测定的中间范围标准物的荧光强度，值(v)是高端标准物的荧光强度，并且(g)是空白的荧光强度。在方程IV中，(t)是在中间范围标准物中的分析物的量。

[0169]另一个实施方案提供计算在样品容器中的两种分析物的比例的方法，所述方法包括：

a)生成关于所述两种分析物的荧光标准曲线，其包括：测量第一空白分析物样品(g1)和第二分析物样品(g2)的荧光强度，并且测量关于所述第一分析物的至少一个高端标准物(v1)和关于所述第二分析物的至少一个高端标准物(v2)的荧光强度，其中所述曲线使得荧光强度与每种分析物的量或相对量相关，并且其中所述曲线具有预先确定的S形程度(n)和曲率(k)；

b)测量所述样品(y1和y2)的荧光强度，其中所述样品包括能够指示所述分析物在所述样品中的存在的荧光部分；和

c)使用所述荧光标准曲线将所述样品(y1和y2)中的所述荧光强度与所述分析物的量相关。

[0170]因此，本发明涉及用于定量分析物的装置，所述装置包括使用上述荧光标准曲线方程I实施定量分析物方法的机器可执行指示。这一装置当然可以进一步包括本文列出的每种组件，诸如但不限于，保持样品容器的容座，光检测器，和一个或多个ASEs。

[0171]计算机处理部件还可以包括充分的存储器和用于使样品鉴定标记与具体的样品缔合的指示或操作。在这一实施方案中，所述装置可以包括识别与样品容器缔合的鉴定标记的工具。在一个具体的实施方案中，所述样品识别标记是机器可读的。识别标记的实例包括，但不限于，条形码、数据矩阵条形码、无线电频率识别标记、光学标记等。识别所述鉴定标记的工具当然应该适合所用的鉴定标记的类型。然后，所述机器可执行指示又可以能够基于所述样品识别标记，使所确定的所述分析物的数量值与具体的样品相匹配。

[0172]本发明的装置还可以包括使用者界面。可以提供多种使用者界面，以辅助使用者控制和提高所述装置的可操作性。输入界面包括，但不限于，数据输入装置，如键盘、键区、触摸屏显示器、鼠标、声音识别输入、或其它数据输入装置。在一个具体的实施方案中，所述使用者界面包括非数字键区。输出界面包括，但不限于，显示屏、监视器、打印机、扬声器或其它输出装置。在另一个具体的实施方案中，所述使用者界面包括显示屏。在另一个具体的实施方案中，所述使用者界面包括非数字键区和显示屏。在一个更具体的实施方案中，所述使用者界面被设置成允许终端使用者选择要被定量的分析物。当终端使用者选择了分析物时，那么所述机器可执行指示可以确定要用的ASE，如果需要的话，来定量所述分析物。

[0173]本发明的装置可以任选地包括内部电源，用来为所述装置的多个组件供电。在一个实施方案中，所述电源是可充电的。在另一个实施方案中，所述内部电源不是可充电的。

[0174]在另一个实施方案中，本发明的装置可以包括一个或多个通信端口。所述通信端口能够与另一个装置连接，所述另一个装置例如，但不限于，计算机、盘驱动、闪存驱动、监视器、打印机、另一种用于定量分析物的类似装置。例如，所述装置的功能可以更新或改变，并且所述装置可以使用通过所述通信端口来自计算机、CD或DVD的新机器可执行指示进行校正或重新校正。所述装置不受通信端口的类型的限制。通信端口的实例包括但不限于，通用串行总线(USB)、音频/视频串行总线(IEEE 1394)(“火线”)、和红外端口以及无线电频率端口。无线电端口包括Bluetooth

端口，Wi-Fi端口等。

[0175]在前述实施方案中的任何一个的具体实施方案中，所述分析物是真核或原核细胞。

[0176]在另一个实施方案中，本文所述的装置或方法用于定量在液体样品中的低水平的DNA。在另一个实施方案中，本文所述的装置或方法用于定量在液体样品中的宽范围的DNA。在另一个实施方案中，所述装置或方法用于定量在液体样品中的RNA。在另一个实施方案中，所述装置或方法用于定量在液体样品中的蛋白质。在另一个实施方案中，所述装置或方法用于定量在液体样品中的活：死细胞。在另一个实施方案中，所述装置或方法用于定量在液体样品中的GFP表达水平。在另一个实施方案中，所述装置或方法用于检测并定量细胞培养物和细胞培养试剂的支原体污染。这些实施方案的进一步描述在下述的实施例中描述。

实施例

[0177]实施例1-分析RNA浓度

[0178]使用方程I：y＝r(xⁿ/(xⁿ+k))+g；

其中(r)是通过下式确定的校正值：

(II)r＝(v-g)((sⁿ+k)/sⁿ)

确定样品中的RNA浓度。值(y)是具有未知浓度的分析物的样品的荧光强度。高端标准物，其是(s)值，具有500ng/ml的浓度。S形程度(n)设定为1.10的值，并且曲率(k)设定为2350。空白(g)的荧光强度是22.16个相对荧光单位(RFU)，并且所述高端标准物(v)的荧光强度是543.97RFU。这些值用于方程II以求解r，其为1839.20。

[0179]关于x的求解方程I，在本实施例中其是样品中RNA的浓度，导致方程III

(III)x＝|(k(y-g))/(r-(y-g)|^1/n

[0180]使用本发明的荧光计，含有400ng/ml RNA的样品的荧光强度测量为459.40RFU。将该值输入到方程III中，荧光计获得样品中的RNA浓度值402.34ng/ml。

[0181]实施例2-分析在低水平的DNA浓度

[0182]使用上述方程I、II和III，还可以估算低水平的DNA的浓度。在本实施例中，(n)设定为1.00，和(k)设定为9999999。空白具有7.61RFU的荧光值(g)，并且所述高端标准物具有3020.30RFU的荧光值(v)。所述高端标准物(s)具有500ng/ml的浓度。在方程II中使用这些值，校正值(r)确定为60256806.66。

[0183]所述样品含有400ng/ml的DNA，并且具有2401.60的荧光值(y)。使用方程III，DNA的浓度确定为397.31ng/ml。

[0184]实施例3-分析宽范围浓度的DNA

[0185]使用上述方程I、II和III，还可以估算DNA的浓度。在本实施例中，(n)设定为1.00，和(k)设定为22.5。空白具有25.36RFU的荧光值(g)，并且所述高端标准物具有2213.20RFU的荧光值(v)。所述高端标准物(s)具有5μg/ml的浓度。在方程II中使用这些值，校正值(r)确定为12033.12。

[0186]所述样品含有4.0μg/ml的DNA，并且具有1841.10的荧光值(y)。使用方程III，DNA的浓度确定为4.0μg/ml。

[0187]实施例4-分析蛋白质浓度

[0188]使用上述方程I、II和III，还可以估算蛋白质的浓度。当估算蛋白质浓度时，可以理想地使用3个标准物而不是如上述的2个标准物。

[0189]如果使用3个标准物，那么k可以是变量，并且如果k是变量，那么算法将首先使用这3个标准物来求解k。当k被求解时，所述算法在上述方程I、II和III中使用该值。当k是变量时，为了使用3个标准物求解K，使用下述方程：

(IV)k＝[sⁿtⁿ(d-1)]/[sⁿ-(tⁿ*d)]

其中d是校正值，其等于所述两种非空白背景-校正的标准物的荧光值的比例，其使用下述方程V求解。

(V)d＝(v-g)/(w-g)

[0190]在方程V中，w是用于这一测定的中间范围标准物的荧光值。当校正值d被确定后，将该值输入到方程IV中以求解(k)。值(s)是高端标准物的浓度，如在方程II中，并且(t)是中间范围标准物的浓度，并且(n)是预先确定的。当(k)被求解时，使用方程IV和V，检测未知物的荧光值(y)，并且使用上述方程III，确定所述未知物的浓度(x)。

[0191]在本实施例中，(n)设定为2.15。空白具有42RFU的荧光值(g)，并且所述高端标准物具有3230RFU的荧光值(v)。所述高端标准物(s)具有5.000μg/200μl的浓度。所述中间范围标准物具有1286的荧光值(w)，和2.000μg/200μl的浓度(t)。在方程IV和V中使用这些值，(k)等于10.79。在方程II中使用k＝10.79和n＝2.15，校正值(r)(基于高端标准物)等于4371.28。最后，含有3.000g/200μl蛋白质的样品的荧光值(y)测量为2334。所述荧光计，使用此处所述的算法，确定所述样品的浓度是3.2μg/200μl。

[0192]在下述实施例中，“Quant-it”测定固件选择是与分析物传感元件连接，所述分析物传感元件带有如上述用于各种类型的分析物的预先确定的算法、标准物、光源、滤波器等。这些调整的分析物传感元件使得技术人员非常容易地操作所述装置。

[0193]实施例5-在液体样品中低水平的DNA的定量

[0194]将PicoGreen染料稀释在特定的缓冲液中，以制备0.7μM的工作染料溶液。将180-199μL的所述工作染料溶液加入到本文所述的500μL透明的塑料PCR管中。将两个这样的管子用于标准物，以校正用于所述测定的仪器。将10μL的TE溶液(10mM Tris，1mM EDTA)加入到一个管中作为“零”。将10μL在TE中的10ng/μL的λDNA溶液加入到第二个管中，并且作为高标准物。对于其余的管子，加入1-20μL的未知样品，在每个管中终浓度200μL。将每个管使用涡旋振荡器或通过颠倒所述管混合，然后在室温下温育所述管2分钟。为了确定在测定管中的DNA的量，使用者使用构建在荧光计中的固件选择“Quant-iT DNA HS”测定，然后按照提示允许所述荧光计读取标准物1(上述零标准物)，标准物2(上述高标准物)，然后任何数目的样品。使用这两个标准物，所述仪器使用在实施例2中所述的方程确定样品管中的DNA浓度。在所述测定管中的溶液中的DNA的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。在所述固件中包含选项，通过询问使用者进行稀释计算，以选择将1，2，3，4，5，10，15或20μL的样品加入到所述样品管中。然后，将在初始样品管中的DNA的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。所有这些数据可以使用本文所述的兼容的端口和数据资料记录软件同时转移到计算机上。

[0195]实施例6-在液体样品中宽范围的DNA的定量

[0196]将HiQuant染料稀释在特定的缓冲液中，以制备2μM的工作染料溶液。将180-199μL的所述工作染料溶液加入到本文所述的500μL透明的塑料PCR管中。将两个这样的管子用于标准物，以校正用于所述测定的仪器。将10μL的TE溶液(10mM Tris，1mM EDTA)加入到一个管中作为“零”。将10μL在TE中的100ng/μL的λDNA溶液加入到第二个管中，以作为高标准物。对于其余的管子，加入1-20μL的未知样品，在每个管中终浓度200μL。将每个管使用涡旋振荡器或通过颠倒所述管混合，然后将所述管在室温下温育2分钟。为了确定在测定管中的DNA的量，使用者使用构建在荧光计中的固件选择“Quant-iT DNA BR”测定，然后按照提示允许所述荧光计读取标准物1(上述零标准物)，标准物2(上述高标准物)，然后任何数目的样品。使用这两个标准物，所述仪器使用在实施例3中所述的方程确定样品管中的DNA浓度。在所述测定管中的溶液中的DNA的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。在所述固件中包含选项，通过询问使用者进行稀释计算，以选择将1，2，3，4，5，10，15或20μL的样品加入到所述样品管中。然后，将在初始样品管中的DNA的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。所有这些数据可以使用本文所述的兼容的端口和数据资料记录软件同时转移到计算机上。

[0197]实施例7-在液体样品中的RNA的定量

[0198]将RiboRed染料稀释在特定的缓冲液中，以制备0.04μM的工作染料溶液。将180-199μL的所述工作染料溶液加入到本文所述的500μL透明的塑料PCR管中。将两个这样的管子用于标准物，以校正用于所述测定的仪器。将10μL的TE溶液(10mM Tris，1mM EDTA)加入到一个管中作为“零”。将10μL在TE中的10ng/μL的核糖体RNA溶液加入到第二个管中，并且将作为高标准物。对于其余的管子，加入1-20μL的未知样品，在每个管中终浓度200μL。将每个管使用涡旋振荡器或通过颠倒所述管混合，然后将其在室温下温育2分钟。为了确定在测定管中的RNA的量，使用者使用构建在荧光计中的固件选择“Quant-iT RNA”测定，然后按照提示允许所述荧光计读取标准物1(上述零标准物)，标准物2(上述高标准物)，然后任何数目的样品。使用这两个标准物，所述仪器使用在实施例2中所述的方程确定样品管中的RNA浓度。在所述测定管中的溶液中的RNA的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。在所述固件中包含选项，通过询问使用者进行稀释计算，以选择将1，2，3，4，5，10，15或20μL的样品加入到所述样品管中。然后，将在初始样品管中的RNA的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。所有这些数据可以使用本文所述的兼容的端口和数据资料记录软件同时转移到计算机上。

[0199]实施例8-在液体样品中的蛋白质的定量

[0200]将NanoOrange染料稀释在特定的缓冲液中，以制备4μM的工作染料溶液。将180-199μL的所述工作染料溶液加入到本文所述的500μL透明的塑料PCR管中。将3个这样的管子用于标准物，以校正用于所述测定的仪器。将10μL的TE溶液(10mM Tris，1mM EDTA)加入到一个管中作为“零”。将10μL在TE中的200ng/μL的BSA溶液加入到第二个管中，并且将作为中间标准物。将10μL在TE中的400ng/μL的BSA溶液加入到第三个管中，并且将作为高标准物。对于其余的管子，加入1-20μL的未知样品，在每个管中终浓度200μL。将每个管使用涡旋振荡器或通过颠倒所述管混合，然后在室温下温育15分钟。为了确定在测定管中的蛋白质的量，使用者使用构建在荧光计中的固件选择“Quant-iT蛋白质”测定，然后按照提示允许所述荧光计读取标准物1(上述零标准物)，标准物2(上述中间标准物)，标准物3(上述高标准物)，然后任何数目的样品。使用这3个标准物，所述仪器使用在实施例4中所述的方程确定样品管中的蛋白质浓度。在所述测定管中的溶液中的蛋白质的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。在所述固件中包含选项，通过询问使用者进行稀释计算，以选择将1，2，3，4，5，10，15或20μL的样品加入到所述样品管中。然后，将在初始样品管中的蛋白质的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。所有这些数据可以使用本文所述的兼容的端口和数据资料记录软件同时转移到计算机上。

[02001]实施例9-在液体样品中的细胞(真核或原核)的定量

[0202]将SYTO9染料稀释在特定的缓冲液中，以制备0.02mM的工作染料溶液。将180-199μL的所述工作染料溶液加入到本文所述的500μL透明的塑料PCR管中。将两个这样的管子用于标准物，以校正用于所述测定的仪器。将200μL的水溶液加入到一个管中作为“零”。将200μL在0.1M硼酸钠pH9的缓冲液中的100nM的荧光素溶液加入到第二个管中，并且将作为高标准物。对于其余的管子，加入1-20μL的未知样品，在每个管中终浓度200μL。将每个管使用涡旋振荡器或通过颠倒所述管进行混合，然后将所述管在室温下温育5分钟。为了确定在测定管中的细胞的量，使用者使用构建在荧光计中的固件选择“Quant-iT细胞计数”测定，然后按照提示允许所述荧光计读取标准物1(上述零标准物)，标准物2(上述高标准物)，然后任何数目的样品。使用这两个标准物，所述仪器使用本文所述的方程(参见方程I-V)确定样品管中的蛋白质浓度。在所述测定管中的溶液中的细胞的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。在所述固件中包含选项，通过询问使用者进行稀释计算，以选择将1，2，3，4，5，10，15或20μL的样品加入到所述样品管中。然后，将在初始样品管中的细胞的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。所有这些数据可以使用本文所述的兼容的端口和数据资料记录软件同时转移到计算机上。

[0203]实施例10-在液体样品中的细胞(真核或原核)的活：死比例的定量

[0204]将SYTO 9染料和SYTOX Red染料稀释在特定的缓冲液中，以制备每种染料0.02mM的工作染料溶液。将180-199μL的所述工作染料溶液加入到本文所述的500μL透明的塑料PCR管中。将两个这样的管子用于标准物，以校正用于所述测定的仪器。将200μL的水溶液加入到一个管中作为“零”。将200μL在0.1M硼酸钠pH 9的缓冲液中的100nM荧光素染料和100nM的Alexa Fluor 647染料溶液加入到第二个管中，并且将作为高标准物。对于其余的管子，加入1-20μL的未知样品，在每个管中终浓度200μL。将每个管使用涡旋振荡器或通过颠倒所述管进行混合，然后在室温下温育5分钟。为了确定在测定管中的活和死细胞的量，使用者使用构建在荧光计中的固件选择“Quant-iT活/死”测定，然后使用如在[0031]中所述的“蓝色”波道(Ex/Em:460nm/520nm)和深红波道(Ex/Em:630nm/650nm)，按照提示允许所述荧光计读取标准物1(上述零标准物)，标准物2(上述高标准物)，然后任何数目的样品。使用这两个标准物，所述仪器使用在本文所述的方程确定样品管中的总细胞和死细胞的相对浓度。这二者的比例显示在所述荧光计的屏幕上。所有这些数据可以使用本文所述的兼容的端口和数据资料记录软件同时转移到计算机上。

[0205]实施例11-在液体样品中的细胞中的GFP表达水平的定量

[0206]将SYTO 61染料稀释在特定的缓冲液中，以制备0.02mM的工作染料溶液。将180-199μL的所述工作染料溶液加入到[0016]中所述的500μL透明的塑料PCR管中。将两个这样的管子用于标准物，以校正用于所述测定的仪器。将200μL的水溶液加入到一个管中作为“零”。将200μL在0.1M硼酸钠pH9的缓冲液中的100nM荧光素染料和100nM的Alexa Fluor647染料溶液加入到第二个管中，以作为高标准物。对于其余的管子，加入1-20μL的未知样品，在每个管中终浓度200μL。将每个管使用涡旋振荡器或通过颠倒所述管混合，然后在室温下温育5分钟。为了确定在测定管中的细胞的量，使用者使用构建在荧光计中的固件选择“Quant-iTGFP”测定，然后使用如在[0031]中所述的“蓝色”波道(Ex/Em:460nm/520nm)和深红波道(Ex/Em:630nm/650nm)，按照提示允许所述荧光计读取标准物1(上述零标准物)，标准物2(上述高标准物)，然后任何数目的样品。使用这两个标准物和来自SYTO 61的信号，所述仪器使用在[0066]中所述的方程确定样品管中细胞的浓度。使用这两个标准物和来自所述“蓝色”波道的信号，所述仪器使用在[0066]中所述的方程确定样品管中GFP的浓度。在所述测定管中的溶液中的GFP与细胞浓度的比例显示在所述荧光计的屏幕上。所有这些数据可以使用本文所述的兼容的端口和数据资料记录软件同时转移到计算机上。

[0207]实施例12-在细胞培养物和细胞培养试剂中的支原体污染的检测和定量

[0208]GFP共价附着到结合在500μL透明塑料管底部的肽的一端。将180-199μL的这种工作溶液加入到本文所述的500μL透明的塑料PCR管中。将两个这样的管子用于标准物，以校正用于所述测定的仪器。将200μL的水溶液加入到一个管中作为“零”。将200μL在0.1M硼酸钠pH9的缓冲液中的100nM荧光素溶液加入到第二个管中，并且将作为高标准物。对于其余的管子，加入1-20μL的未知样品，在每个管中终浓度200μL。将每个管使用涡旋振荡器或通过颠倒所述管进行混合，然后在室温下温育5分钟。为了确定支原体污染的存在，使用者使用构建在荧光计中的固件选择“Quant-iT支原体”测定，然后按照提示允许所述荧光计读取标准物1(上述零标准物)，标准物2(上述高标准物)，然后任何数目的样品。使用这两个标准物，所述仪器使用本文所述的方程确定样品管中的支原体的浓度。在所述测定管中的溶液中的支原体的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。在所述固件中包含选项，通过询问使用者进行稀释计算，以选择将1，2，3，4，5，10，15或20μL的样品加入到所述样品管中。然后，将在初始样品管中的支原体的浓度显示在所述荧光计的屏幕上。所有这些数据可以使用本文所述的兼容的端口和数据资料记录软件同时转移到计算机上。

[0209]实施例13-原核活：死细胞确定

[0210]将2mL金黄色葡萄球菌(S.aureus)收集到微量离心管中并且沉淀。一个管用70％IPA(异丙醇)在RT处理～30min以杀死细胞，然后洗涤/旋转沉淀2次。将沉淀物重悬并且转移到10mL0.85％ NaCl中。使用在表1所示的比例制备检测溶液，并且加入适当的染料：0.3μL的3.35mM SYTO 9和/或1μL的1mM SYTOX Red。将所述溶液在RT温育15分钟，将200μL转移到PCR管中并且进行分析。

表1

 

活:死细胞比例	1	2	3	4
					A	100:0	100:0	100:0	100:0
B	50:50	50:50	50:50	50:50
					C	0:100	0:100	0:100	0:100
染料→	无染料	SYTO 9	SYTOXRed	SYTO 9和SYTOXRed

[0211]结果：

[0212]蓝色激发-SYTO9随着活：死细胞比例的下降在信号中表现出很少的改变。SYTOX Red不是通过460nm激发而最佳激发(参见图5A)。

[0213]红色激发-SYTOX Red信号随着活：死细胞比例的下降而增加。SYTO 9不是通过460nm激发而最佳激发(参见图5B)。

[0214]比例确定-随着活：死细胞比例的下降，SYTO 9信号稍微下降，而SYTOX Red信号在其染色死细胞时显著增加。在来自460nm源(只激发SYTO 9)的信号和来自630nm源(只激发SYTOX Red)的信号之间的比例与所述细胞的活：死比例成比例地减小(参见图5C)。

[0215]实施例14-真核细胞计数

[0216]收集真核细胞系(Jurkat，MRC5，U2OS，3T3，BPAE，COS，HeLa，CHO-K1)，并且使用Coulter计数仪计数细胞浓度，并设为相等(1 x 10⁶细胞/mL)。将1mL的细胞与SYTO 9(终浓度1μM)在RT混合15分钟。将200μL所述溶液转移到PCR管中，并且使用460nm激发读取。

[0217]结果：460nm激发-对于检测的所有真核细胞系，SYTO 9表现出显著高于背景的荧光反应(参见图6)。

[0218]前述参考文献中的每一篇通过引用如同其在本文中完全描述一样并入本文中。

Claims (20)

1.一种用于测量一种或多种预先确定的分析物的量的装置，其中所述装置是一个整合部件，其包括

用于保持具有分析物的样品容器的容座，光检测器，一个或多个不同的和可操作性连接的分析物传感元件(ASE)，和带有机器可执行指示的计算机处理部件，其中所述ASE包括：

a)用于激发所述样品的能源，其中该能源被设置成发射预先确定最大波长的光；

b)激发滤波器，其中所述激发滤波器被设置成分离来自所述能源的预先确定的波长范围的光；

c)发射滤波器，其中所述发射滤波器被设置成分离从被激发的样品发射的预先确定的波长范围的光；并且

其中每个ASE被设置成测量预先确定的分析物的量，并且其中所述机器可执行指示被设置成选择与待测量的分析物相对应的适当的ASE。

2.权利要求1的装置，其中所述能源是发光二极管(LED)。

3.权利要求1的装置，其中所述预先确定的分析物选自由下列各项组成的组：DNA、RNA、蛋白质、真核或原核细胞、碳水化合物、脂质、病毒、pH和金属离子。

4.权利要求1的装置，其中所述机器可执行指示还设置成基于来自被激发的样品的发射光而确定所述具体的分析物的浓度。

5.权利要求1的装置，其中所述装置还包括使用者界面。

6.权利要求5的装置，其中所述使用者界面包括显示器和非数字键区。

7.权利要求1的装置，其中所述样品容器容座被设置成与透光的0.5微量离心管相匹配。

8.权利要求1的装置，其中所述装置还包括内部电源。

9.权利要求1的装置，其还包括至少一个通信端口。

10.权利要求9的装置，其中所述通信端口选自由通用串行总线(USB)端口，音频/视频串行总线(IEEE 1394)，红外(IR)端口和无线电频率(RF)端口组成的组。

11.权利要求1的装置，其中所述装置包括第一和第二ASE。

12.权利要求11的装置，其中所述第一ASE包括发射具有约470nm最大波长的光的LED，滤除具有大于约490nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约520nm和大于约580nm的波长的光的发射滤波器。

13.权利要求11的装置，其中所述第二ASE包括发射具有约640nm最大波长的光的LED，滤除具有小于约570nm和大于约647nm的波长的光的激发滤波器，和滤除具有小于约652nm的波长的光的发射滤波器。

14.权利要求5的装置，其中所述使用者界面被设置成允许使用者选择用于测量的分析物。

15.权利要求1的装置，其中所述机器可执行指示能够在没有使用者输入时选择用于测量的分析物。

16.权利要求1的装置，其中所述装置的尺寸在短轴上约30-300mm，在长轴上100-500mm，并且可变厚度约10到100mm；条件是长轴的尺寸大于短轴的尺寸。

17.一种计算在透光样品容器中的分析物的量的方法，所述方法包括：

a)生成荧光标准曲线，包括测量空白样品(g)的荧光强度，并且测量至少一个高端标准物(v)的荧光强度，其中所述曲线使得荧光强度与分析物数量相关，并且其中所述曲线具有预先确定的S形程度(n)和曲率(k)；

b)测量所述样品(y)的荧光强度，其中所述样品包括能够指示所述分析物在样品中的存在的荧光部分；和

c)使用所述荧光标准曲线将所述样品(y)中的所述荧光强度与所述分析物的量相关。

18.权利要求17的方法，其中所述曲线由下述方程表征：

(I)y＝r(xⁿ/(xⁿ+k))+g；

其中r是通过下式确定的校正值：

(II)r＝(v-g)((sⁿ+k)/sⁿ)

其中(s)是在所述高端标准物中的分析物的量。

19.一种用于检测预先确定的分析物在样品中的存在的方法，其中所述样品是在透光样品容器中，所述方法包括：

a)使样品与报道分子接触，以形成接触的样品；

b)检测所述预先确定的分析物的存在，其中检测包括将所述透光容器放置在整合装置的保持所述样品容器的容座上，以测量所述预先确定的分析物，其中所述装置还包括：

i)光检测器，一个或多个不同的并且可操作连接的分析物传感元件(ASE)、和带有机器可执行指示的计算机处理部件，其中所述ASE包括：

用于激发所述样品的能源，其中该能源被设置成发射预先确定最大波长的光；

激发滤波器，其中所述激发滤波器被设置成分离来自所述能源的预先确定的波长范围的光；

发射滤波器，其中所述发射滤波器被设置成分离从被激发的样品发射的预先确定的波长范围的光；并且

其中每个ASE被设置成测量预先确定的分析物的量，并且其中所述机器可执行指示被设置成选择与待测量的分析物相对应的适当的ASE。

20.一种计算在样品容器中的两种分析物的比例的方法，所述方法包括：

a)生成关于所述两种分析物的荧光标准曲线，其包括：测量第一空白分析物样品(g1)和第二分析物样品(g2)的荧光强度，并且测量关于所述第一分析物的至少一个高端标准物(v1)和关于所述第二分析物的至少一个高端标准物(v2)的荧光强度，其中所述曲线使得荧光强度与每种分析物的量或相对量相关，并且其中所述曲线具有预先确定的S形程度(n)和曲率(k)；

b)测量所述样品(y1和y2)的荧光强度，其中所述样品包括能够指示所述分析物在所述样品中的存在的荧光部分；和

c)使用所述荧光标准曲线使得所述样品(y1和y2)中的所述荧光强度与所述分析物的量相关。

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