CN102692400A - 一种用于激活微生物体内光敏蛋白的装置及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，旨在提供一种用于激活微生物体内光敏蛋白的装置及应用。该装置的主体结构是一张印刷电路板，印刷电路板上布设若干个完全相同的紫外发光二极管，各二极管和辅助电子元件通过印刷电路板实现连接；每个二极管的发射波长为395～415nm，波峰为405nm，正向导通电压为3.5V，功率为10～40mW，辐射角度为30度，直径小于6mm。本发明可以直接用于96孔细胞培养板或者圆形平皿中细菌的光激发，仅需要1min光激发时间，即可通过普通的荧光显微镜对培养板或者平板上的细菌是否具有光敏特性进行判定。该装置适用于表达光敏蛋白的所有微生物，只要光敏蛋白对405 nm紫外光敏感，均可以使用该装置；具有高效、简捷、快速、方便、适用广等特点。

Description

一种用于激活微生物体内光敏蛋白的装置及应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用于激活微生物体内光敏蛋白的装置及应用。

背景技术

基于光敏蛋白的超分辨率显微成像技术是最近几年才发现的一种分辨率可以达到纳米级别、且优于激光共聚焦的单分子成像技术。该技术的原理是通过激光将原本不呈现荧光（或不释放光子）的蛋白进行激活，激活后的蛋白可以释放光子信号，然后采用光激活定位显微技术：PALM (Photoactivatable localization microscopy)或STORM(Stochastic optical reconstruction microscopy) 捕捉光子信号。这些光敏蛋白其实是对普通的荧光蛋白进行突变修饰，修饰后的蛋白不产生荧光或者不释放光子，只有用405 nm激光激发后才能产生荧光（即释放光子）或者发生光转换（即从一种颜色的荧光转变成另外一种颜色）。目前已经报道的可以被405 nm激光激活的光敏特征的蛋白有：PAGFP、 PATag-RFP、PAmCherry、mKO、YPet、mEos2(G)、Emerald、Cerulean等。

Zeiss和Nikon目前已有商业化的光激活定位显微镜出售，价格是激光共聚焦显微镜的数倍，目前在国内还没有普及，但是作为新一代超分辨率三维成像技术，必定代表将来显微成像技术的发展方向。由于光激活定位显微镜采用的是对光子信号进行捕捉，只有对光子捕捉到一定数量之后，才能实现三维成像，因此从样品上机到完成图像采集，通常需要2-3个小时甚至更长。因此，对于含有光敏蛋白基因的重组细菌，这些蛋白在细菌内能否正确表达、能否呈现荧光、能否释放光子等，在进行PALM分析之前实验者是不清楚的。从实验者的角度考虑，其更关心的是样品被405 nm激光激发之后必须呈现荧光。对于虽经过激光激发也不呈现任何荧光、或者激发后不发生荧光转换的样品都是无效样品。这提示光敏蛋白在微生物内没有表达；或者虽然表达，但是蛋白结构已经发生变化，不再具有光敏蛋白的特性，也无法进行PALM分析。对于这些无效的样品，如果直接用PALM分析，从时间和资源的角度考虑是一种巨大浪费，也大大减少了激光器的寿命。因此，研究者希望能够通过一个简单的装置，在PALM分析之前，借助普通的荧光显微镜对样品是否具有光敏特征做出初步判断。由于光敏蛋白必须经过405 nm激光激发后才能呈现荧光，对于生长于96孔细胞培养板或者平皿的细菌，直接用激光器发射的激光激发是不可能的，也是不现实的。因为激光器是非常精密的高价值仪器，开机时间具有使用寿命限制，不允许反复多次开启；而且激光器发射的激光束为不足1mm²的聚焦点，显然对于96孔培养板（87x126 mm）和圆形培养皿（d=86 mm）是不合适的。激光器发射的激光只能聚焦于显微镜镜头下方的微小视野。因此，如何研发一种可以替代激光器，且能发射405 nm光谱的辅助装置尤为必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于激活微生物体内光敏蛋白的装置及应用。是将特殊的微型紫外发光二极管（波峰为405 nm）通过印刷电路板（即PCB板）焊接在一起，制作成与实验室96孔细胞培养板（或者96孔酶标板、方形培养皿）或圆形培养皿形状一致的装置。该装置通过紫外光对培养的细菌菌液或者菌落表达的蛋白进行激发，进而使细菌表达的蛋白发出光子信号，呈现荧光或者发生荧光转换。细菌发出的光子信号可以被特殊的光激活定位显微镜捕捉，从而实现分辨率为纳米级别的单分子成像和特定蛋白精确定位。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种用于激活微生物体内光敏蛋白的装置，包括外接的电源转换器；该装置的主体结构是一张印刷电路板，印刷电路板上布设若干个完全相同的紫外发光二极管，各发光二极管和辅助电子元件通过印刷电路板实现连接；每个发光二极管的发射波长为395～415 nm，波峰为405 nm，正向导通电压为3.5V，功率为10-40 mW，辐射角度为30度，二极管直径小于6 mm。

本发明中，所述印刷电路板呈正方形，紫外发光二极管的数量为96个，发光二极管布局为8×12的方形矩阵形式，且每个紫外灯泡的位置均与96孔酶标板上的孔的位置相互对应。

本发明中，所述印刷电路板呈圆形，紫外发光二极管的数量为49～64个，发光二极管布局为圆形矩阵形式，且最外圈的二极管所构成的圆的直径小于圆形培养皿的直径。

本发明中，所述外接的电源转换器是提供5～24V电压、660 mA电源的电源转换器。

作为进一步的发明目的，本发明还提供了前述装置在进行PALM分析之前检验含有光敏蛋白基因的重组细菌是否具有光敏特征的应用，以及所述的装置在细胞生物学领域关于光敏蛋白激发和荧光蛋白颜色转换中的应用。

本发明中装置的应用包括以下步骤：在进行PALM分析之前，将含有光敏蛋白基因的重组细菌置于96孔酶标板或圆形培养皿中，然后将所述装置对应地搁置于96孔酶标板或圆形培养皿上，接通电源1分钟，对重组细菌进行光激活；通过荧光显微镜观察重组细菌是否呈现荧光或者荧光转换，确定其是否具有光敏特性。

本发明的有益效果是：

本发明可以直接用于96孔细胞培养板或者圆形平皿中细菌的光激发，仅需要1 min光激发时间，即可通过普通的荧光显微镜对培养板或者平板上的细菌是否具有光敏特性进行判定。对于生长于试管和三角瓶等容器中液体培养基的细菌，待生长结束后根据需要直接转移入96孔细胞培养板（或者酶标板）即可。

该装置适用于表达光敏蛋白的所有微生物，只要光敏蛋白对405 nm紫外光敏感，均可以使用该装置，如：PAGFP、 PATag-RFP、PAmCherry、mKO、YPet、mEos2(G)、Emerald、Cerulean等。

相对于背景技术，本发明具有高效、简捷、快速、方便、适用广等特点。

附图说明

图1为本发明所述方形（96孔）光激活装置示意图。

尺寸说明是为了帮助设计印刷线路板中各个发光二极管的排列和间距，其中外周长x外周宽=126x87 mm；内周长x内周宽=108x72 mm，发光二极管将以12x8方阵的形式排列在内周框内。每个孔直径为9 mm并与图3中的发光二极管位置完全对应。

图2为本发明所述圆形（49-64孔）光激活装置示意图。

尺寸说明是为了帮助设计印刷线路板中各个发光二极管的排列和间距，其中外周直径=100 mm；内周直径86 mm，发光二极管排列在内周圆内。

图3为本发明所述的方形装置PCB图（96孔）。其中R1-R18代表电阻接口；D1-D96代表紫外发光二极管接口。

图4为本发明所述的方形装置Schematic图（96孔）。

其中R1-R18代表电阻元件；D1-D96代表紫外发光二极管元件。

图5为光激活装置对光敏蛋白mEos2和PAmCherry的激活结果，图片由荧光体视显微镜拍摄。

图中，E.coli代表大肠杆菌；Mycobacterium代表分枝杆菌；BeforePA代表405 nm光激活之前；After PA代表405 nm光激活之后；Phase light代表普通相位光。drop代表菌液（一滴）；colony代表单菌落；streak代表划线菌落。含有mEos2蛋白的细菌在光激活之前为绿色荧光，光激活之后为红色荧光；含有PAmCherry蛋白的细菌在光激活之前无荧光，光激活之后为红色荧光。所有细菌在普通相位光下均可以成像。

具体实施方式

发明原理介绍：

本发明中的微生物光敏蛋白激发装置，具有方形和圆形两种形式（图1、2）。其中方形外观如图1所示，含有96个微型紫外发光二极管。二极管发射波长为395 nm-415nm，波峰为405 nm。每个二极管的正向导通电压为3.5V，功率为40mW，辐射角度为30度，二极管直径小于6 mm；圆形外观如图2所示，含有49-64个微型紫外发光二极管。

采用计算机软件，设计连接电子元件的PCB线路板外观（lay out），以方形PCB为例（如图3）。该PCB与图1尺寸完全一致，其中R1-R18指示电阻位置；D1-D96指示二极管所在位置，D1-D96内的两个孔，分别连接紫外发光二极管的正负极。PCB设计的原则是：在保证整体布局与图1一致的前提下，将96个微型紫外发光二极管正负极依次连接在一起，因此可以内部线路搭配可以有若干种不同的连接方式。图3只是代表其中的一种。

用计算机软件，设计与PCB线路板（图3）相对应的内部线路Schematic方案（如图4），然后将图2和图4通过软件将内部信息连接在一起，这样才能形成一个完整的线路图。将链接有Schematic方案的PCB原始文件发给可以制作PCB板的工厂（文件后缀名分别.sch和.pcb）。目前中国深圳等多家工厂提供PCB代加工业务，只要提供图纸（即链接图3和图4的原始文件），厂家可以直接通过计算机阅读PCB信息，通过机器数分钟之内即可根据图纸合成PCB主板。

拿到PCB主板后，将紫外发光二极管和电阻焊接在主板上，然后外接5-24V电压，660 mA的电源转换器。此时，该装置即可实现正常工作，为了美观需要，可以在方形主板上加上外壳。

以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例

1. 激活微生物体内光敏蛋白的装置制作（光激活装置）

参照图3和图4，将原始文件发给PCB板代加工厂，加工PCB主板。将96只紫外发光二极管（规格如下：发射波长为395 nm-415 nm，波峰为405 nm；正向导通电压为3.5V，功率为40 mW，辐射角度为30度，二极管直径小于6 mm）和电阻焊接在主板上，外接外接24V电压，660mA的电源转换器。圆形装置制作与此类似，二极管数量为61个，只需将PCB板设计成圆形（d=100 mm）即可。

2. 应用

用光激活装置照射含有光敏蛋白mEos2的大肠杆菌（E.coli）、含有光敏蛋白mEos2的分枝杆菌（Mycobacterium）、含有光敏蛋白PAmCherry的分枝杆菌。照射时间为1 min，然后利用体视荧光显微镜进行观察。其中mEos2在光激活前（before PA）呈现绿色荧光，利用光激活装置照射后（after PA），mEos2被激活，呈现红色荧光（图5）。PAmCherry在光激活前不呈现任何荧光，利用光激活装置照射后将被激活，呈现红色荧光（图5）。各种光敏蛋白蛋白的荧光变化与预期完全一致，说明该光激活装置可以正常使用。

以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。无论在线路连接上如何变化，方形装置紫外发光二极管的数量为96个，而圆形装置紫外发光二极管数量为49-64个，二极管的发射光谱范围为395-415 nm，其中波峰为405 nm。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种用于激活微生物体内光敏蛋白的装置，包括外接的电源转换器，其特征在于，该装置的主体结构是一张印刷电路板，印刷电路板上布设若干个完全相同的紫外发光二极管，各二极管和辅助电子元件通过印刷电路板实现连接；每个二极管的发射波长为395～415 nm，波峰为405 nm，正向导通电压为3.5V，功率为10～40 mW，辐射角度为30度，二极管直径小于6 mm。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述印刷电路板呈正方形，二极管的数量为96个，二极管布局为8×12的方形矩阵形式，且每个二极管的位置均与96孔酶标板上的孔的位置相互对应。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述印刷电路板呈圆形，二极管的数量为49～64个，二极管布局为圆形矩阵形式，且最外圈的二极管所构成的圆的直径小于圆形培养皿的直径。

4.根据权利要求1至3任意一项中所述的装置，其特征在于，所述外接的电源转换器是提供5～24V电压、660 mA电源的电源转换器。

5.权利要求1至3任意一项中所述的装置在进行PALM分析之前检验含有光敏蛋白基因的重组细菌是否具有光敏特征的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将含有光敏蛋白基因的重组细菌置于96孔酶标板或圆形培养皿中，然后将所述装置对应地搁置于96孔酶标板或圆形培养皿上，接通电源1分钟，对重组细菌进行光激活；通过荧光显微镜观察重组细菌是否呈现荧光或者荧光转换，确定其是否具有光敏特性。

7.权利要求1至3任意一项中所述的装置在细胞生物学领域关于光敏蛋白激发和荧光蛋白颜色转换中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将含有光敏蛋白基因的重组细菌置于96孔酶标板或圆形培养皿中，然后将所述装置对应地搁置于96孔酶标板或圆形培养皿上，接通电源1分钟，对重组细菌进行光激活；通过荧光显微镜观察重组细菌是否呈现荧光或者荧光转换，确定其是否具有光敏特性。

Images