CN106092994B - 一种大功率led的微阵列芯片荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大功率LED的微阵列芯片荧光检测方法，包括自上而下依次设置的冷却型CCD相机、窄带镀膜荧光滤波片、成像微距镜头、LED照明阵列以及被测荧光微阵列生物芯片；冷却型CCD相机连接至计算机系统；LED照明阵列中的LED灯经驱动电路连接至计算机系统；通过计算机系统，经驱动电路输出预设驱动电流，以驱动LED照明阵列发光；被测荧光微阵列生物芯片上已经标记荧光染料的微点阵受激产生荧光分子，通过冷却型CCD相机对荧光分子进行多像素并行积分的方式曝光成像，并将采集到的图像传送到计算机系统中进行储存以及去噪处理，最终获取被测荧光微阵列生物芯片的荧光图像。本发明所提出的方法，扫描速度快，装置结构简单。

Description

一种大功率LED的微阵列芯片荧光检测方法

技术领域

本发明涉及一种大功率LED的微阵列芯片荧光检测方法。

背景技术

专利(申请号：CN200410009044.7)提出一种具有光强实时检测的生物芯片检测方法以及检测系统，使得生物芯片检测系统在检测过程中出现光源光强变动情况时，能够及时被检测出并处理使得检测数据准确。专利(公开号：CN03112771.1)提出一种低密度生物芯片检测系统，结合激发光系统、荧光信号收集系统和信号检测系统，主要关键技术是用光导纤维束将芯片上产生的荧光信号收集到光电倍增管表面并转化成电信号，得出一种成本低、适用于检测低密度生物芯片荧光信号的方法。专利(申请号：CN201110398112.3)提出一种生物芯片检测装置及生物芯片检测方法，藉由判断辨识信息来确定生物芯片是否可进行检测，并透过控制器自动调整检测模块的设定减少错误。

目前广泛应用的激光共聚焦扫描的生物芯片检测仪具有很高的灵敏度和分辨率，但由于激光聚焦到几微米级别并对芯片的探针阵列进行逐点逐线扫描，检测速度较慢，耗时较多。使用冷却型CCD成像技术，并结合均匀的面照明激发光系统，由于多像素并行采集，大大提高了检测速度。冷却型CCD的生物芯片扫描仪需要一般采用高压汞灯或氙灯作为芯片的激发光源。由于高压汞灯和氙灯工作启停时间长，发热量大，工作寿命短，存在较大的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大功率LED的微阵列芯片荧光检测方法，以克服现有技术中存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种大功率LED的微阵列芯片荧光检测方法，包括自上而下依次设置的冷却型CCD相机、窄带镀膜荧光滤波片、成像微距镜头、LED照明阵列以及被测荧光微阵列生物芯片；所述冷却型CCD相机连接至一计算机系统；所述LED照明阵列中的LED灯经驱动电路连接至所述计算机系统；通过所述计算机系统，经所述驱动电路输出预设驱动电流，以驱动所述LED照明阵列发光；所述被测荧光微阵列生物芯片上已经标记荧光染料的微点阵受激产生荧光分子，通过所述冷却型CCD相机对所述荧光分子进行多像素并行积分的方式曝光成像，并将采集到的图像传送到所述计算机系统中进行储存以及去噪处理，最终获取所述被测荧光微阵列生物芯片的荧光图像。

在本发明一实施例中，所述LED照明阵列为一环形阵列，且包括设置于同一水平面上的一内圆环LED阵列以及一外圆环LED阵列；所述内圆环LED阵列以及所述外圆环LED阵列上均匀分布有若干个在发光面上设置有滤光片的LED灯。

在本发明一实施例中，通过Tracepro软件分别构建所述内圆环LED阵列以及所述外圆环LED阵列的面光源模型，获取LED的总辐射通量和有效照明通量，并确定所述内圆环LED阵列以及所述外圆环LED阵列的位置；所述面光源模型参数通过如下方式获取：

设LED灯分布在xy平面上，则坐标系中待观测的一点P(x，y，z)处的照度为：

式中，(x₀，y₀)为LED在xy平面上的坐标，I₀为LED发光面法线上的光照强度，m为LED光辐射模式，z为LED照明阵列至照明目标面的距离；

对于LED照明阵列的环形阵列排列，由上式可得照明目标面任意点的线性叠加的照度，N≥3：

其中，N为内圆环LED阵列或外圆环LED阵列上的LED灯的总数，n为内圆环LED阵列或外圆环LED阵列不同位置上的LED灯的序列号，ρ为内圆环LED阵列或外圆环LED阵列的半径；

对该式进行求二次导，并依据斯派罗法则最大平坦条件，在x＝0，y＝0处令得到：

根据预设的LED光辐射模式m，N以及ρ，进而获取z。

在本发明一实施例中，所述内圆环LED阵列上的LED灯采用绿色单芯大功率LEDPT54-G，所述外圆环LED阵列上的LED灯采用红色单芯大功率LED PT54-R。

在本发明一实施例中，计算所述LED照明光源对荧光染料激发所产生的荧光分子数，再结合所述冷却型CCD相机探测到的最小的荧光光强系数，计算检测灵敏度值，并通过对所述冷却型CCD相机的拍摄曝光时间进行预设置，进而获取已经标记荧光染料的微点阵图像。

在本发明一实施例中，记照射到所述被测荧光微阵列生物芯片表面的激发光功率密度为I_exc，则每个荧光分子的激发速率为：

式中，hv为吸收光子的能量，σ为荧光染料截面，σ与消光系数ε的关系式：

σ＝3.8×10^-21ε(cm²)；

记τ为荧光寿命，1/τ为荧光分子由激发态迁跃回基态的弛豫速率，记N₀为探针表面激发光照明的荧光分子总数，N₁为受激发的荧光分子数，则荧光染料在受激照射并稳定发射荧光时，存在以下的激发速率和消激速率的平衡：

可得荧光染料激发比率：

记φ为的量子效率，受激产生的荧光速率为：

对应所述冷却型CCD相机中CCD传感器的每个像素，生物芯片上面积为A_s荧光染料受激产生的荧光光子数q_em为：

q_em＝p_f·A_s·C_s·t_s

式中，t_s为所述CCD传感器的积分时间，C_s为荧光染料浓度；

荧光光子通过所述成像微距镜头成像光路到达所述CCD传感器所形成响应电子数q_s为：

式中，Ф_ccd为所述CCD传感器的量子效率，K_em为成像镜片和荧光窄带滤光片的总透光率，NA为物镜的数值孔径。

在本发明一实施例中，所述荧光染料包括Cy3以及Cy5。

相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明所提出的一种大功率LED的微阵列芯片荧光检测方法，通过使用大功率LED阵列与科研级冷却型CCD采集对生物芯片进行检测，可以使得检测的灵敏度优于0.1flour/um²，单通道扫描22mm*22mm的检测时间不超过10秒，相比于主流应用的激光共聚焦扫描检测方式来说结构简单，扫描速度快。该产品可以广泛应用于疾病诊断、药物筛选、预防医学等方面，能够达到传统检测方式所做不到的效果。

附图说明

图1为本发明中的大功率LED的微阵列芯片荧光检测装置的结构示意图。

图2为本发明中的面光源模型的模型图。

图3为本发明中的内圆环LED阵列与外圆环LED阵列的位置示意图。

图4为本发明中的面光源模型的仿真数据图。

图5为本发明中大功率红色LED PT54-R环形阵列辐射照度分布图。

图6为本发明中大功率绿色LED PT54-G环形阵列辐射照度分布图。

图7为本发明中的大功率LED阵列与CCD采集的生物芯片检测方法的工作流程图。

图8为本发明中的内圆环LED阵列与外圆环LED阵列的驱动参数图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的技术方案进行具体说明。

本发明提出一种大功率LED的微阵列芯片荧光检测方法，如图1所示，包括自上而下依次设置的冷却型CCD相机、窄带镀膜荧光滤波片、成像微距镜头、LED照明阵列以及被测荧光微阵列生物芯片；所述冷却型CCD相机连接至一计算机系统；所述LED照明阵列中的LED灯经驱动电路连接至所述计算机系统；通过所述计算机系统，经所述驱动电路输出预设驱动电流，以驱动所述LED照明阵列发光；所述被测荧光微阵列生物芯片上已经标记荧光染料的微点阵受激产生荧光分子，其中，荧光染料包括Cy3以及Cy5，通过所述冷却型CCD相机对所述荧光分子进行多像素并行积分的方式曝光成像，并将采集到的图像传送到所述计算机系统中进行储存以及去噪处理，最终获取所述被测荧光微阵列生物芯片的荧光图像。进而解决了由于高压汞灯和氙灯工作启停时间长、发热量大、工作寿命短的缺陷。

在本实施例中，由于在芯片的荧光采集上信号是非常微弱的，而且相机本身的暗电流噪声也是会造成整个采集的信号信噪比不高的原因，因此降低温度可以大大减少相机的暗电流噪声，所以选用冷却型的CCD相机是十分必要的。

为了保障照明系统的出射光通量和光照均匀度，提高生物荧光微阵列芯片测量区域内的标记染料的受激荧光响应的强度和一致性，最有效的方法就是采用大功率LED阵列进行叠加照明。

在本实施例中，采用LED环形阵列来实现该检测装置的激发光源对荧光微阵列芯片的整个视场的光照达到均匀，使得荧光的激发响应达到一致。LED环形阵列具有聚光作用，并且均匀照明时其圆环上的LED个数与半径无关，这对于采用单芯大功率LED芯片是十分有利的，环形阵列既保证照明中心的强度，又可以减少LED芯片及其激发光滤光片的数量。由于LED所发出的激发光光谱宽度比较大，因此必须在LED的发光面上加上相对应的滤光片，使得它的激发光波段更靠近荧光染料的激发波段。

进一步的，所述LED照明阵列为一环形阵列，且包括设置于同一水平面上的一内圆环LED阵列以及一外圆环LED阵列；所述内圆环LED阵列以及所述外圆环LED阵列上均匀分布有若干个在发光面上设置有滤光片的LED灯。所述内圆环LED阵列上的LED灯采用绿色单芯大功率LED PT54-G，所述外圆环LED阵列上的LED灯采用红色单芯大功率LED PT54-R。该PT54-G以及PT54-R为采用先进的PhlatLight技术生产的单芯大功率LED芯片，光强分布成近朗伯型，发散角较大。

进一步的，在本实施例中，通过Tracepro软件分别构建所述内圆环LED阵列以及所述外圆环LED阵列的面光源模型，获取LED的总辐射通量和有效照明通量，并确定所述内圆环LED阵列以及所述外圆环LED阵列的位置；所述面光源模型参数通过如下方式获取：

设LED灯分布在xy平面上，则坐标系中待观测的一点P(x，y，z)处的照度为：

式中，(x₀，y₀)为LED在xy平面上的坐标，I₀为LED发光面法线上的光照强度，m为LED光辐射模式，z为LED照明阵列至照明目标面的距离；根据PT54数据手册，辐射场角分布曲线接近余弦函数，半发光角度θ_1/2约为60度，也即发光强度值为轴向强度值一半时的发光角度。根据m＝-ln2/ln(cosθ_1/2)，可得红色PT54-R的m≈1.0，绿色PT54-G的m≈3。

对于LED照明阵列的环形阵列排列，接受面上某一点的光照度为单个LED照度的线性叠加，即由圆环上多个LED共同作用的结果，由于LED光强分布为发光角余弦多次方的函数的类朗伯，如图2所示，由上式可得照明目标面P点的线性叠加的照度，N≥3：

其中，N为内圆环LED阵列或外圆环LED阵列上的LED灯的总数，n为内圆环LED阵列或外圆环LED阵列不同位置上的LED灯的序列号，ρ为内圆环LED阵列或外圆环LED阵列的半径；

对该式进行求二次导：

并依据斯派罗法则最大平坦条件，在x＝0，y＝0处令得到：

根据预设的LED光辐射模式m，N以及ρ，进而获取z。

进一步的，在本实施例中，设计环形阵列的圆环上各有4颗PT54-R和4颗PT54-G大功率LED，如图2以及3所示排布，PT54是美国Lumlnus Devices公司的单色大功率单芯LED芯片，发光面积5.4mm²，可产生4.1W光辐射输出，输出光通量超过750流明，这使得采用大功率LED的照明设计大为简单。DNA芯片常用CY3和CY5作为荧光染料，用以标记对照组mRNA和样品组mRNA。荧光激发照明系统设计采用4片绿色PT54-G作为CY3照明光源，采用4片红色PT54-R作为CY5照明光源。

按机械尺寸设计取红色LED芯片PT54-R的半径ρ₁为30mm，在图2所示的阵列设计，当N＝4，m＝1，由上式可得z为36.74mm。对绿色照明通道，z取值36.74mm，由N＝4，m＝3，由MATLAB工具求解上式可得ρ₂为23.24mm，即PT54-G绿色大功率LED的圆环半径为23.24mm。

根据数据手册，使用Tracepro软件分别构建PT54-R和PT54-G的面光源模型，并按图3的阵列结构排布LED，对红绿照明通道分别追迹2×10⁶条光线，仿真数据分析见图4。使用Tracepro软件，对该环形阵列模型的红色LEDPT54-R的照明阵列进行仿真，在座标中心位置30mm×30mm区域内，照明均匀度大于94％，其辐射照度分布如下图5；对绿色LEDPT54-G的照明阵列进行仿真，在座标中心位置30mm×30mm区域内，照明均匀度大于92％。其辐射照度分布如下图6所示。照明阵列的4片红色PT54-R采用串联供电，设置恒流供电电流10A，对应供电电压9.6V；4片绿色色PT54-R也采用串联恒流供电，设计电流8.1A，电压17.6V。

进一步的，在本实施例中，由于DNA扫描仪采用分时检测CY3和CY5的荧光出射强度，所以红绿通道的LED电源通过使用与计算机系统匹配的STM32中的2路GPIO通道分时切换供电继电器，执行PT54-R和PT54-G阵列的单独照明。

进一步的，在本实施例中，在荧光分子采集方面，采集系统由微距镜头、窄带镀膜滤光片还有冷却型CCD相机构成，计算所述LED照明光源对荧光染料激发所产生的荧光分子数，再结合所述冷却型CCD相机探测到的最小的荧光光强系数，计算检测灵敏度值，并通过对所述冷却型CCD相机的拍摄曝光时间进行预设置，进而获取已经标记荧光染料的微点阵图像。

进一步的，在本实施例中，冷却型CCD的量子效率远高于光电倍增管PMT，得益于检测面成像的优势，其并行多像素同时检测，大大提高采集系统的工作速度。如图1所示，基于CCD的生物芯片扫描仪的荧光采集系统包括冷却型CCD相机、光学成像镜头、荧光滤光片切换系统和照明系统。记照射到所述被测荧光微阵列生物芯片表面的激发光功率密度为I_exc，则每个荧光分子的激发速率为：

式中，hv为吸收光子的能量，σ为荧光染料截面，σ与消光系数ε的关系式：

σ＝3.8×10^-21ε(cm²)；

记τ为荧光寿命，1/τ为荧光分子由激发态迁跃回基态的弛豫速率，记N₀为探针表面激发光照明的荧光分子总数，N₁为受激发的荧光分子数，则荧光染料在受激照射并稳定发射荧光时，存在以下的激发速率和消激速率的平衡：

可得荧光染料激发比率：

记φ为的量子效率，受激产生的荧光速率为：

在本实施例中，CCD传感器SONY ICX694AL，像素单元4.54um×4.54um，有效像素2750×2200，设计光学扫描的物理分辨率A_s为10um×10um，则成像镜头倍率为1/2.2，一次扫描生物芯片面积22mm×22mm。对应所述冷却型CCD相机中CCD传感器的每个像素，生物芯片上面积为A_s荧光染料受激产生的荧光光子数q_em为：

q_em＝p_f·A_s·C_s·t_s

式中，t_s为所述CCD传感器的积分时间，C_s为荧光染料浓度；

荧光光子通过所述成像微距镜头成像光路到达所述CCD传感器所形成响应电子数q_s为：

式中，Ф_ccd为所述CCD传感器的量子效率，K_em为成像镜片和荧光窄带滤光片的总透光率，NA为物镜的数值孔径。CCD的响应电子数q_s与生物芯片的荧光染料浓度C_s的关系是检测装置的设计基础。

进一步的，为了让本领域技术人员进一步了解本发明所提出的技术方案，下面结合具体实例进行说明。大功率LED阵列与CCD采集的生物芯片检测方法的分析仪的工作流程图如图7所示。放置好待检测的生物芯片后，控制大功率LED阵列进行照明，根据图8所示的驱动控制参数，利用预先设定的驱动电流值对LED进行驱动，以满足所需参数值标准；LED照明开始时，同时打开CCD相机的快门进行曝光积分，采集到图像后立即将数据传送到计算机中进行储存，然后到计算机系统中进行图像的去噪处理最终获取生物荧光微阵列芯片的荧光图像。

以上是本发明的较佳实施例，凡依本发明技术方案所作的改变，所产生的功能作用未超出本发明技术方案的范围时，均属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种大功率LED的微阵列芯片荧光检测方法，其特征在于，包括自上而下依次设置的冷却型CCD相机、窄带镀膜荧光滤波片、成像微距镜头、LED照明阵列以及被测荧光微阵列生物芯片；所述冷却型CCD相机连接至一计算机系统；所述LED照明阵列中的LED灯经驱动电路连接至所述计算机系统；通过所述计算机系统，经所述驱动电路输出预设驱动电流，以驱动所述LED照明阵列发光；所述被测荧光微阵列生物芯片上已经标记荧光染料的微点阵受激产生荧光分子，通过所述冷却型CCD相机对所述荧光分子进行多像素并行积分的方式曝光成像，并将采集到的图像传送到所述计算机系统中进行储存以及去噪处理，最终获取所述被测荧光微阵列生物芯片的荧光图像；

所述LED照明阵列为一环形阵列，且包括设置于同一水平面上的一内圆环LED阵列以及一外圆环LED阵列；所述内圆环LED阵列以及所述外圆环LED阵列上均匀分布有若干个在发光面上设置有滤光片的LED灯；

通过Tracepro软件分别构建所述内圆环LED阵列以及所述外圆环LED阵列的面光源模型，获取LED的总辐射通量和有效照明通量，并确定所述内圆环LED阵列以及所述外圆环LED阵列的位置；所述面光源模型参数通过如下方式获取：

设LED灯分布在xy平面上，则坐标系中待观测的一点P(x，y，z)处的照度为：

式中，(x₀，y₀)为LED在xy平面上的坐标，I₀为LED发光面法线上的光照强度，m为LED光辐射模式，z为LED照明阵列至照明目标面的距离；

对于LED照明阵列的环形阵列排列，由上式可得照明目标面任意点的线性叠加的照度，N≥3：

其中，N为内圆环LED阵列或外圆环LED阵列上的LED灯的总数，n为内圆环LED阵列或外圆环LED阵列不同位置上的LED灯的序列号，ρ为内圆环LED阵列或外圆环LED阵列的半径；

对该式进行求二次导，并依据斯派罗法则最大平坦条件，在x＝0，y＝0处令得到：

根据预设的LED光辐射模式m，N以及ρ，进而获取z；

所述内圆环LED阵列上的LED灯采用绿色单芯大功率LED PT54-G，所述外圆环LED阵列上的LED灯采用红色单芯大功率LED PT54-R；

计算所述LED照明光源对荧光染料激发所产生的荧光分子数，再结合所述冷却型CCD相机探测到的最小的荧光光强系数，计算检测灵敏度值，并通过对所述冷却型CCD相机的拍摄曝光时间进行预设置，进而获取已经标记荧光染料的微点阵图像；

记照射到所述被测荧光微阵列生物芯片表面的激发光功率密度为I_exc，则每个荧光分子的激发速率为：

式中，hv为吸收光子的能量，σ为荧光染料截面，σ与消光系数ε的关系式：

σ＝3.8×10^-21ε(cm²)；

记τ为荧光寿命，1/τ为荧光分子由激发态迁跃回基态的弛豫速率，记N₀为探针表面激发光照明的荧光分子总数，N₁为受激发的荧光分子数，则荧光染料在受激照射并稳定发射荧光时，存在以下的激发速率和消激速率的平衡：

可得荧光染料激发比率：

记φ为的量子效率，受激产生的荧光速率为：

对应所述冷却型CCD相机中CCD传感器的每个像素，生物芯片上面积为A_s荧光染料受激产生的荧光光子数q_em为：

q_em＝p_f·A_s·C_s·t_s

式中，t_s为所述CCD传感器的积分时间，C_s为荧光染料浓度；

荧光光子通过所述成像微距镜头成像光路到达所述CCD传感器所形成响应电子数q_s为：

式中，Ф_ccd为所述CCD传感器的量子效率，K_em为成像镜片和荧光窄带滤光片的总透光率，NA为物镜的数值孔径；

所述荧光染料包括Cy3以及Cy5。