TWI622650B - 微生物之檢查方法 - Google Patents
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Abstract
本發明旨在提供一種微生物之檢查方法，包含試樣調製程序，該試樣調製程序包含：螢光染色程序，將一定量之試樣及該螢光染色試藥加以攪拌、混合；靜置程序，將該螢光染色程序後之溶液靜置一定時間；及稀釋程序，以不螢光發光之液體稀釋該靜置程序後之溶液。
Description
本發明，係關於一種微生物之檢查方法，特別是關於適於偵測壓艙水等所含有且活著的浮游生物等微生物之微生物之檢查方法。
未搭載貨物之船舶，為使該船舶穩定而搭載壓艙水航行，於搭載貨物之海域將該壓艙水排出。 壓艙水，通常於與搭載之海域不同之海域排出，故有將該壓艙水所含有之浮游生物或細菌等微生物送至原來的棲息地以外之海域，引起破壞生態系等問題之虞。
為解決如此之問題，制定有關於壓艙水之限制之國際規則，通過了「用來限制並管理船舶之壓艙水及沉殿物之國際條約（壓艙水管理條約）」。
與上述壓艙水管理條約相關之「關於壓艙水採樣之方針(G2)」中，於「壓艙水排出基準(D-2)」，將自船舶排出之壓艙水所含有之活著的微生物之允許個體數，依該微生物之最小尺寸區分、限定之，例如，就最小尺寸50μm以上之微生物（以下，稱為「L尺寸生物」。），限定在10個／m3
以下，就最小尺寸在10μm以上未滿50μm之微生物（以下，稱「S尺寸生物」。），限定在10個／mL以下。
至現在止，作為排出上述壓艙水之際用來確認是否滿足上述排出基準之手法，已知專利文獻1所記載之，使以送水泵抽取之海水通過流量槽而量測影像者，或專利文獻2所記載之，使以送水泵抽取之海水通過網眼不同之濾器單元，使濾器上的微生物發光，計算微生物者等微生物檢查裝置。
上述專利文獻1所記載之微生物檢查裝置，包含： 染色部，使液體之檢體流動，同時使存在於該檢體中，具有生細胞之生物染色； 濃縮部，使該經施行染色之檢體流動，同時濃縮，以提高該生物之濃度； 個體量測部，取得該經濃縮之檢體中包含該生物之個體之影像資訊；及 控制機構，依由該個體量測部輸出之該個體之影像資訊，測定該生物。 藉此，可以流動方式進行檢體之液體中生物之染色程序、液體中生物之濃縮程序，液體中生物之資訊取得之程序等，故相較於以批次方式進行各方式之手法，可大幅縮短一程序結束之檢體之一部分進展至下一程序止之待命時間，或使其為0，就防止於待命時間染色之狀態劣化之意義而言，有可穩定取得生物生死之資訊之優點。
然而，上述專利文獻1所記載之微生物檢查裝置，依序使以送水泵抽取之海水通過各種程序，有裝置龐大，且製造成本高之問題。又，雖依序通過各種程序而縮短待命時間，但有至測定結束至少需耗費數小時之問題。
且上述專利文獻2所記載之微生物檢查裝置，可進行下列程序： 使海水通過串聯配置網眼不同之3種濾器而構成之濾器單元； 產生由濾器補集且活著的微生物造成的發色、發光及螢光中任一者；及 偵測發色、發光及螢光中任一者，藉由影像分析計算壓艙水或海水中之微生物數。 藉此，可實現階段性地捕捉每一尺寸之微生物，其結果，有可迅速測定是否滿足依每一尺寸之基準限制之允許殘存基準之優點。
然而，依專利文獻2所記載之微生物檢查裝置，亦與專利文獻1相同，依序使以送水泵抽取之海水通過各種程序，有裝置龐大，製造成本高之問題點。
在此，鑒於上述問題點，本申請人以專利文獻3提倡一種微生物之檢查方法，藉由利用批次式之測定胞，可簡便地且在短時間內，並以高精度測定壓艙水中微生物之量。
本申請人提倡之微生物之檢查方法，包含下列者： 攪拌混合程序，將在批次式之試樣容器內於試樣添加有螢光染色試藥之試樣溶液加以攪拌、混合； 激發程序，攪拌該試樣溶液，同時對該試樣容器之被照射面照射激發光； 受光程序，計算因該激發光而螢光發光之微生物之螢光；及 微生物數推定程序，自以該受光程序偵測之發光數，計算試樣容器中試樣所含有之微生物量。 藉此，有下列作用效果：可於極短時間內使微生物明亮地發光，簡便地且在短時間內量測壓艙水中微生物之量，且螢光發光之厚度部分薄，故背景與微生物之螢光發光之光量差極明確，可提升微生物螢光發光之偵測精度。
關於上述微生物之偵測原理，例如圖6所示，藉由光電子增倍管，以電氣信號偵測螢光染色之浮游生物等微生物，比較連續偵測到的例如約0.9V之電壓之背景成分，與活著的浮游生物通過之螢光強度，藉由浮游生物通過時螢光強度之峰的高度，亦即電壓的高度，可與背景成分區別。在此，所謂背景成分，係樣本水本身之螢光，亦即自身之螢光或染色劑於樣本水中自然分解而發出螢光。
然而，上述提案中，隨著背景成分增大，雜訊成分亦傾向增大，其結果，背景成分增大後S／N比降低，有對偵測精度造成影響之問題。
【先前技術文獻】 【專利文獻】 【專利文獻1】日本特開2009－85898號公報 【專利文獻2】日本特開2007－135582號公報 【專利文獻3】日本特開2014－042463號公報
【發明所欲解決之課題】
鑒於上述問題點，本發明之技術課題在於提供一種微生物之偵測方法，可減少背景成分之螢光發光，提升偵測精度。 【解決課題之手段】
依本發明之微生物之檢查方法，用來測定試樣中之微生物量，其特徵在於： 該試樣中之微生物量之測定，包含： 試樣調製程序，將試樣加以攪拌、混合及螢光染色試藥，調製試樣；及 微生物量計算程序，自對該試樣照射特定波長之激發光而獲得之螢光發光之發光數，計算微生物量； 且該試樣調製程序，包含： 螢光染色程序，將一定量之試樣及該螢光染色試藥加以攪拌、混合； 靜置程序，將該螢光染色程序後之溶液靜置一定時間；及 稀釋程序，以不螢光發光之液體稀釋該靜置程序後之溶液。
該螢光染色程序，亦可於試樣容器置入該試樣容器整體容積之1～10％容量之試樣，且於該試樣容器置入相對於該試樣1容量1％容量之螢光染色試藥，攪拌、混合而成。 且亦可使用FDA，添加至稀釋前試樣中之濃度為0.01mM，形成該螢光染色試藥。
依本發明之微生物之檢查方法，用來測定試樣中之微生物量，其特徵在於： 該試樣中之微生物量之測定，包含： 試樣調製程序，將試樣加以攪拌、混合及螢光染色試藥，調製試樣；及 微生物量計算程序，自對該試樣照射特定波長之激發光而獲得之螢光發光之發光數，計算微生物量； 且該試樣調製程序，包含： 螢光染色程序，將一定量之試樣及該螢光染色試藥加以攪拌、混合； 靜置程序，將該螢光染色程序後之溶液靜置一定時間；及 pH調整程序，對該靜置程序後之溶液添加pH調整劑。 該pH調整程序，亦可於該螢光染色程序的溶液之pH為8.0時，於該pH調整程序添加pH調整劑，俾pH為6.0而成。 【發明之效果】
依本發明之微生物之檢查方法，首先，於螢光染色程序對少量之試樣攪拌、混合螢光染色試藥，接著，於靜置程序靜置溶液一定時間，且於稀釋程序以不螢光發光之液體稀釋。藉此，於該螢光染色程序攪拌、混合少量之試樣中所含有之微生物與螢光染色試藥，以完全無不均之狀態確實染色，於該稀釋程序添加稀釋液時，螢光染色試藥之染色活性度已不作用，最終程序之微生物量計算程序中，可減少背景成分之螢光發光，提高S／N比，更提升偵測精度。在此，在該螢光染色程序，於試樣容器置入該試樣容器整體容積之1～10％容量之試樣，且於該試樣容器置入相對於該試樣1容量1％容量之螢光染色試藥，攪拌、混合後，即可更提升偵測精度。且使用FDA，添加至稀釋前試樣中之濃度為0.01mM，形成該螢光染色試藥有效。
且本發明之微生物之檢查方法中， 該試樣調製程序，包含： 螢光染色程序，將一定量之試樣及該螢光染色試藥加以攪拌、混合； 靜置程序，將該螢光染色程序後之溶液靜置一定時間；及 pH調整程序，對該靜置程序後之溶液添加pH調整劑； 例如，於螢光染色程序試樣之pH若為弱鹼性，即可將試樣加以攪拌、混合中所含有之微生物與螢光染色試藥，以完全無不均之狀態確實染色，於該pH調整程序添加pH調整劑，試樣之pH為弱酸性時，螢光染色試藥之染色活性度已不作用，最終程序之微生物量計算程序中，可減少背景成分之螢光發光，提高S／N比，更提升偵測精度。此時，在該pH調整程序，於該螢光染色程序的溶液之pH為8.0時，於該pH調整程序添加pH調整劑，俾pH為6.0後，即可更提升偵測精度。
圖1係依第1實施例之微生物之檢查方法之概略程序圖，圖2係依第2實施例之微生物之檢查方法之概略程序圖。
如圖1及圖2所示，微生物之檢查方法，包含： 試樣調製程序，作為試樣採集壓艙水，攪拌、混合此試樣與螢光染色試藥，調製試樣；及 微生物量計算程序，使用微生物檢查裝置1，依對於試樣調製程序調製之試樣照射特定波長之激發光而獲得之螢光發光之發光數，計算微生物量。 本發明之第1實施例中，該試樣調製程序，包含： 螢光染色程序，將一定量之試樣及該螢光染色試藥加以攪拌、混合； 靜置程序，將該螢光染色程序後之溶液靜置一定時間；及 稀釋程序，以不螢光發光之液體稀釋該靜置程序後之溶液。
且第2實施例中，該試樣調製程序，包含： 螢光染色程序，將一定量之試樣及該螢光染色試藥加以攪拌、混合； 靜置程序，將該螢光染色程序後之溶液靜置一定時間；及 pH調整程序，對該靜置程序後之溶液添加pH調整劑。
參照圖1說明第1實施例之試樣調製程序。作業員，預先，準備例如以玻璃或石英或丙烯樹脂等光透射之透明材質形成，例如容積100ml之試樣容器2。又，採集試樣於此試樣容器2，添加螢光染色試藥等調製後，將試樣容器2收納於微生物檢查裝置1內，計算微生物量。又，以下「ml」表示毫升。
測定微生物量之際，預先宜將大量之壓艙水濃縮為一定量。又，作業員自濃縮為一定量之壓艙水使用吸管等作為試樣採集之，將試樣容器2全容積之1～10％容量之試樣置入試樣容器2。例如，試樣容器全容積若為100ml，置入試樣容器2之量宜在1ml～10ml之範圍內，為5ml尤佳。
其次，於試樣容器2內添加螢光染色試藥。此螢光染色試藥，可使用一般所知之鈣黃綠素AM（Calcein-AM，德國Promocell GmbH 公司製），或FDA亦即Fluorescein diacetate等。鈣黃綠素AM，傾向於易於對植物性浮游生物染色，另一方面，FDA，傾向於易於對動物性浮游生物染色。本發明中，作為染色試藥，宜使用FDA。此時，FDA之濃度為1mM時，試樣容器2中，宜對該試樣1容量置入1％容量之染色試藥。亦即，採集1ml試樣時，宜添加0.01ml亦即10μL 1mM濃度之FDA，採集5ml試樣時，宜添加0.05ml亦即50μL 1mM濃度之FDA，採集10ml試樣時，宜添加0.1ml亦即100μL 1mM濃度之FDA。其後，作業員於試樣容器2以轉子等攪拌機構混合、攪拌試樣溶液。以上係圖1中之螢光染色程序。
其次，作為圖1中之靜置程序，作業員靜置上述螢光染色程序後之試樣容器2一定時間。作為此時之條件，宜在20℃之環境下，靜置約30分鐘期間。
且作為圖1之稀釋程序，作業員於上述靜置程序後之試樣容器2使用不螢光發光之液體稀釋。稀釋之際，例如，宜使用背景雜訊少，亦即不發出螢光之人工海水，作為稀釋量置入試樣容器2之量，宜在對應試樣之採集量之90ml～99ml之範圍內。又，作為不螢光發光之液體，不限於人工海水，例如，作為不螢光發光之液體，可應用螢光染色試藥添加前，染色前之置入生物之試樣。藉此，例如，有不需另外準備、調製人工海水等不螢光發光之液體之優點。
如上述，首先，於少量之試樣攪拌、混合螢光染色試藥，接著，靜置此溶液一定時間，且以不螢光發光之液體稀釋靜置後之溶液。藉此，攪拌、混合少量之試樣中所含有之微生物與螢光染色試藥，以完全無不均之狀態確實染色，添加稀釋液時，螢光染色試藥之染色活性度已不作用，可減少背景成分之螢光發光。
其次，參照圖2說明第2實施例之試樣調製程序。與上述實施例相同，作業員，預先準備容積100ml之試樣容器2。又，作業員自濃縮為一定量之壓艙水，使用吸管等作為試樣採集之，將試樣容器2之全容積容量之試樣置入試樣容器2。例如，若試樣容器之全容積為100ml，即於試樣容器2置入100ml之試樣。又，作為螢光染色試藥使用FDA，且宜對試樣100ml，添加1ml亦即1000μL 1mM濃度之FDA。其後，作業員於試樣容器2以轉子等攪拌機構混合、攪拌試樣溶液。以上係圖2中之螢光染色程序。此時之溶液為pH8.0附近之弱鹼性。
又，作為圖2中之靜置程序，作業員靜置上述螢光染色程序後之試樣容器2一定時間。作為此時之條件，宜在20℃之環境下，靜置約30分鐘期間。
其次，作為圖2中之pH調整程序，作業員於上述靜置程序後之試樣容器2添加pH調整劑，溶液之pH為pH6.0附近之弱酸性。作為pH調整劑，例如，宜使用MES buffer，適當調節pH調整劑之濃度或置入量，俾pH自8.0轉變為6.0。
如上述，首先，於試樣攪拌、混合螢光染色試藥，接著，靜置此溶液一定時間，且於靜置後之溶液添加pH調整劑，調整pH。藉此，最初之螢光染色程序中pH為弱鹼性，將試樣加以攪拌、混合中所含有之微生物與螢光染色試藥，以完全無不均之狀態確實染色，添加最後之pH調整程序之pH調整劑時，pH轉變為弱酸性，螢光染色試藥之染色活性度已不作用，可減少背景成分之螢光發光。
圖1之第1實施例及圖2之第2實施例中之試樣調製程序後，進行以下之微生物量計算程序。
圖3係應用於微生物之檢查方法之檢查裝置之概略圖。說明該檢查裝置1之原理即知，將試樣容器2設置於檢查裝置1，按下操作部3之測定開始按鈕，藉此，於既定時間後點亮LED光源4，對試樣容器2照射透射激發光用帶通濾器5之光。此時，例如，照射作為波長特性450nm～490nm之波長之光，試樣容器2內之檢體亦即微生物螢光發光。又，此螢光透射螢光用帶通濾器6，以光電子增倍管（PMT）7檢測。
光電子增倍管（PMT）7，利用光電效果將光能量轉換為電氣能量，且附加電流放大功能，可以高感度檢測螢光發光。將檢測之電氣信號送往CPU基板8，計算一定臨限值以上之受光波形。
且CPU基板8，自受光波形計算值推定該試樣容器5內100ml水中存在之微生物數，顯示是否滿足排水基準於顯示部9。
以下，驗證上述第1實施例之結果。 驗證是否如上述第1實施例，因稀釋背景減少，其結果雜訊減少，S／N比提升。
作為未稀釋者之一例，對全容積100ml之試樣容器2，作為試樣置入內含生物之海水5ml、無生物之人工海水95ml、與1mM濃度之FDA 1ml，進行攪拌、混合。又，靜置此試樣容器2一定時間，具體而言在20℃之環境下靜置約30分鐘期間，以檢查裝置1測定。此時之背景成分顯示於圖4（a）。且顯示放大圖於圖4（b）。此時背景成分之電壓為0.3977V，信號電壓S為0.006118V，雜訊電壓N為0.001157V，S／N比為5.2878。
作為稀釋者之一例，以前述段落0025～0030之手法調整試樣，以檢查裝置1測定。此時之背景成分顯示於圖5（a）。且顯示放大圖於圖5（b）。此時背景成分之電壓為0.03977V，信號電壓S為0.006354V，雜訊電壓N為0.000479V，S／N比為13.2651。
比較未稀釋者與稀釋者即知，背景成分之電壓約減少至20分之1，S／N比提高約2.5倍。
如以上依本實施形態，於螢光染色程序對少量之試樣攪拌、混合螢光染色試藥，接著，於靜置程序靜置溶液一定時間，且於稀釋程序以不螢光發光之液體稀釋，故於該螢光染色程序攪拌、混合少量之試樣中所含有之微生物與螢光染色試藥，以完全無不均之狀態確實染色，於該稀釋程序添加稀釋液時，螢光染色試藥之染色活性度已不作用，最終程序之微生物量計算程序中，可減少背景成分之螢光發光，提高S／N比，更提升偵測精度。
且，該試樣調製程序，包含： 螢光染色程序，將一定量之試樣及該螢光染色試藥加以攪拌、混合； 靜置程序，將該螢光染色程序後之溶液靜置一定時間；及 pH調整程序，對該靜置程序後之溶液添加pH調整劑； 此時，於螢光染色程序試樣之pH若為弱鹼性，即可將試樣加以攪拌、混合中所含有之微生物與螢光染色試藥，以完全無不均之狀態確實染色，於該pH調整程序添加pH調整劑，試樣之pH為弱酸性時，螢光染色試藥之染色活性度已不作用，最終程序之微生物量計算程序中，可減少背景成分之螢光發光，提高S／N比，更提升偵測精度。 【產業上利用性】
本發明可應用於一種微生物之偵測方法等，可減少背景成分之螢光發光，提升偵測精度。
1‧‧‧檢查裝置
2‧‧‧試樣容器
3‧‧‧操作部
4‧‧‧LED光源
5‧‧‧激發光用帶通濾器
6‧‧‧螢光用帶通濾器
7‧‧‧光電子增倍管（PMT）
8‧‧‧CPU基板
9‧‧‧顯示部
2‧‧‧試樣容器
3‧‧‧操作部
4‧‧‧LED光源
5‧‧‧激發光用帶通濾器
6‧‧‧螢光用帶通濾器
7‧‧‧光電子增倍管（PMT）
8‧‧‧CPU基板
9‧‧‧顯示部
圖1係依第1實施例之微生物之檢查方法之概略程序圖。 圖2係依第2實施例之微生物之檢查方法之概略程序圖。 圖3係應用於微生物之檢查方法之檢查裝置之概略圖。 圖4(a)~(b)係顯示背景成分中，未稀釋者之一例之電壓波形圖。 圖5(a)~(b)係顯示背景成分中，稀釋者之一例之電壓波形圖。 圖6係顯示比較習知之背景成分，與活著的浮游生物通過之螢光強度之電壓波形圖。
Claims (2)
- 一種微生物之檢查方法，用來測定海水試樣中之微生物量，其特徵在於：該微生物之檢查方法，包含下述程序：將含有微生物之海水之試樣加以濃縮，並將濃縮試樣放入透明之試樣容器；將既定量之該濃縮試樣及既定量之螢光染色試藥加以攪拌、混合，而形成混合液；將該混合液靜置適當期間後，以不螢光發光之液體稀釋該混合液，而形成測試試樣；對該測試試樣照射特定波長之激發光；及根據螢光發光之發光數，計算經照射之測試試樣中之微生物量；該濃縮試樣之量，係該試樣容器整體容積之1~10%容量，該螢光染色試藥之量，係相對於該濃縮試樣1容量1%容量，該螢光染色試藥，係二乙酸螢光素酯(FDA)，該混合液中之該FDA之稀釋前濃度為0.01mM。
- 一種微生物之檢查方法，用來測定海水試樣中之微生物量，其特徵在於：該微生物之檢查方法，包含下述程序：將含有微生物之海水之試樣加以濃縮，並將濃縮試樣放入透明之試樣容器；將既定量之該濃縮試樣及既定量之螢光染色試藥加以攪拌、混合，而形成混合液；將該混合液靜置適當期間後，以不螢光發光之液體稀釋該混合液，而形成測試試樣；對該測試試樣照射特定波長之激發光；及根據螢光發光之發光數，計算經照射之測試試樣中之微生物量；該濃縮試樣之量，係該試樣容器整體容積之1~10%容量，該螢光染色試藥之量，係相對於該濃縮試樣1容量1%容量，該螢光染色試藥，係二乙酸螢光素酯(FDA)，該混合液中之該FDA之稀釋前濃度為0.01mM，該微生物之檢查方法，更包含下述程序：於形成該測試試樣之程序之後，更包含將該混合液之pH調整成6.0。
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