CN104204778A - 荧光检测装置及荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种荧光检测装置，即使在使用在对试样照射激发光的方向上配置了一定厚度的试样的微阵列时，也能准确地检测试样发出的荧光强度。本发明的荧光检测装置(6)是对从含荧光物质的透光性试样(4)发出的荧光进行检测的荧光检测装置，其具有：对试样照射激发光的激发光照射设备(12)、检测试样发出的荧光的检测设备(18)、基于试样的尺寸来调整激发光相对于试样的照射角的照射角调整设备(14)。

Description

荧光检测装置及荧光检测方法

技术领域

本发明涉及荧光检测装置及使用其的荧光检测方法。

背景技术

微阵列是指用于将多个检查、实验的对象物固定后，对其进行一次性检查、实验的材料或者技术的总称。特别在生物学、医学、药学方面，从20世纪末开始将以核酸为对象的DNA微阵列作为中心的开发正在推进，渐渐能够利用。

例如，在利用DNA微阵列时，从样品中提取mRNA，对经过反转录而合成的cDNA进行生物素标记，与在DNA微阵列的基板上的DNA进行杂交。然后，对经杂交而形成的试样照射激发光，由荧光显微镜、荧光激光扫描仪等检测试样中所含的荧光物质发出的荧光强度。基于检测的荧光强度可以判定mRNA的表达量。

对在微阵列中配置的试样照射激发光来检测来自试样的荧光的荧光检测装置，一般有同轴落射方式和非同轴落射方式的2种方式。同轴落射方式中，通过在激发光的光路上设置的聚光透镜对试样照射激发光，且从被激发光激发的试样发出的荧光由相同聚光透镜聚光以在摄像元件上聚焦。

该同轴落射方式中，由于在激发光通过聚光透镜时所产生的聚光透镜的自发荧光而使得装置背景上升，从而难以准确地检测出来自试样中的微弱荧光。

这里，作为改善同轴落射方式的缺点的装置，已知有专利文献1所示的非同轴落射方式。专利文献1中记载的装置中，从斜下方向试样照射激发光，通过在试样下方配置的透镜使试样发出的荧光聚光，以使得不与该激发光的光轴重合。该装置中，由于激发光不通过透镜，可以防止透镜的自发荧光的产生。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2005-62023号公报

发明内容

发明要解决的课题

在使用在载玻片等平面基板的表面配置试样的微阵列时，由于相对于对试样照射激发光的方向的试样的厚度小，因此，通过专利文献1中记载的那样的现有的装置，激发光可以充分地进入到试样中，可以准确地检测试样发出的荧光强度。

但是，在使用在平板状的部件中形成的贯通孔中填充试样的微阵列(例如三菱丽阳社制的纤维型DNA芯片(ジェノパール(注册商标)，日本特许第4150330号公报、日本特许第3654894号公报等))时，由于相对于激发光的照射方向，试样的厚度大，在专利文献1中记载的那样的现有的装置中，激发光不能充分地进入到试样中，不能准确地检测试样发出的荧光强度。

因此，本发明的主要目的是提供一种荧光检测装置及荧光检测方法，即使在使用相对于对试样照射激发光的方向上配置有一定厚度的试样的微阵列时，也能准确地检测试样发出的荧光强度。

用于解决课题的方法

为了实现上述目的，根据本发明的第1发明，荧光检测装置是用于检测由含荧光物质的透光性试样发出的荧光的荧光检测装置，其特征在于，具备：对试样照射激发光的激发光照射设备、检测试样发出的荧光的检测设备、基于试样的尺寸调整激发光相对于试样的照射角的照射角调整设备。

此外，本发明的第1发明中，优选照射角调整设备调整激发光的照射角，以使得激发光相对于试样的照射角θ满足以下算式。

[数1]

这里，t为试样的厚度，y为试样的宽度。

此外，本发明的第1发明中，优选在试样的厚度为0.1～1mm的情况下，照射角调整设备调整激发光的照射角，以使得激发光相对于试样的照射角θ在15～60°的范围内。

此外，本发明的第1发明中，优选荧光检测装置具备在从试样向着检测设备的荧光的光路上配置的、将荧光聚焦于检测设备的聚光透镜，激发光照射设备由以聚光透镜的光轴为中心的圆周上以均等的角度间隔配置的多个激发光照射设备构成，或者，由在聚光透镜的周围配置的圆环型的激发光照射设备构成。

此外，本发明的第1发明中，优选荧光检测装置具备焦点调整设备，其对聚光透镜及检测设备相对于配置了试样的微阵列的距离在聚光透镜的光轴方向上进行调整。

此外，本发明的第1发明中，优选荧光检测装置具备检测位置调整设备，其使聚光透镜及检测设备与配置了试样的微阵列在与聚光透镜的光轴正交的方向上相对移动。

此外，本发明的第1发明中，优选荧光检测装置进一步具有将透射试样的透射光照射到试样的透射光照射设备，检测设备配置在透射试样的透射光的光路上，检测透射该试样的透射光。

此外，本发明的第1发明中，优选荧光检测装置进一步具备用于使从透射光照射设备射出的透射光扩散的扩散板，扩散板配置在从透射光照射设备向着试样的透射光的光路上。

此外，本发明的第1发明中，优选荧光检测装置进一步具备扩散板移动设备，其在从透射光照射设备向着试样的透射光的光路上插入取出扩散板。

此外，根据本发明的第2发明，荧光检测方法是使用本发明的第1发明所记载的荧光检测装置的荧光检测方法，其包括：由激发光照射设备对试样照射激发光，激发该试样中所含的荧光物质的工序、通过检测设备检测被激发的荧光物质所发出的荧光的工序。

此外，本发明的第2发明中，优选荧光检测装置具备：聚光透镜，所述聚光透镜在从试样向着检测设备的荧光的光路上配置，并将荧光聚焦于检测设备；以及焦点调整设备，所述焦点调整设备对聚光透镜及检测设备相对于配置了试样的微阵列的距离在聚光透镜的光轴方向上进行调整，荧光检测方法包括，通过焦点调整设备，对聚光透镜及检测设备相对于微阵列的距离在聚光透镜的光轴方向上进行调整，从而使聚光透镜的焦点集中于试样上的工序，在使聚光透镜的焦点集中于试样上的工序之后，实施照射激发光到试样的工序。

此外，本发明的第2发明中，优选荧光检测装置具备将透射试样的透射光照射到试样的透射光照射设备，使聚光透镜的焦点集中于试样上的工序包括：通过透射光照射设备将透射光照射到试样上的工序、通过焦点调整设备使聚光透镜及检测设备相对于微阵列的距离在聚光透镜的光轴方向上阶段地变化，同时通过检测设备检测透射试样的透射光的工序、基于检测设备所检测的透射光的图像，判定聚光透镜的焦点在试样上的聚焦位置的工序。

此外，本发明的第2发明中，优选荧光检测装置具备检测位置调整设备，其使聚光透镜及检测设备与微阵列在与聚光透镜的光轴正交的方向上相对移动，检测荧光的工序包括：通过检测位置调整设备使聚光透镜及检测设备与微阵列在与聚光透镜的光轴正交的方向上相对移动的工序、在位置调整设备所引起的每次移动时，检测被激发的荧光物质所发出的荧光的工序。

此外，本发明的第2发明中，优选荧光检测装置具备用于使从透射光照射设备射出的透射光扩散的扩散板，将透射光照射到试样的工序包括将扩散板设置在从透射光照射设备向着试样的透射光的光路上的工序，照射激发光的工序包括将扩散板从由透射光照射设备向着试样的透射光的光路上取出的工序。

发明效果

根据本发明的荧光检测装置及荧光检测方法，可以抑制因聚光透镜的自发荧光导致的装置背景的上升，并且即使在使用相对于试样照射激发光的方向上配置了一定厚度的试样的微阵列时，也能准确地检测试样发出的荧光强度。

附图说明

图1是适用于本发明的实施方式中的荧光检测装置的微阵列的示意平面图。

图2是显示本发明的实施方式中的荧光检测装置的构成的示意图。

图3是显示本发明的实施方式中的荧光检测装置中的激发光相对于试样的照射角的放大侧视图。

图4是显示通过使激发光相对于试样的照射角为20°的本发明的实施例1的荧光检测装置对微阵列的试样的荧光量的检测结果的线图。

图5是显示通过使激发光相对于试样的照射角为55°的本发明的实施例2的荧光检测装置对微阵列的试样的荧光量的检测结果的线图。

图6是显示通过使激发光相对于试样的照射角为70°的比较例1的荧光检测装置对微阵列的试样的荧光量的检测结果的线图。

图7是显示比较例2的通过使用高压水银灯作为激发光源的一般的同轴落射方式的荧光显微镜对微阵列的试样的荧光量的检测结果的线图。

具体实施方式

(1)微阵列

首先，通过图1对本发明的实施方式的荧光检测装置中适用的微阵列的一例进行说明。图1是适用于本发明的实施方式的荧光检测装置的微阵列的示意平面图。需要说明的是，所适用的微阵列并不限于图1的微阵列，本发明的实施方式的荧光检测装置中可以适用配置了一定厚度的试样的各种微阵列。

例如，图1的微阵列1具有不透射光的平板状部件2。该部件2中，配置了多个试样4以贯通部件2的两面之间。对试样4的形状没有特别限定，优选具有圆形截面。在试样4中固定有能作为与检体杂交的探针的生态相关物质。探针在试样4的内部直接固定或者通过凝胶间接固定。对部件2的材质没有特别限定，优选为例如在丙烯酸系、聚碳酸酯、聚氨酯等树脂中混炼入炭黑而成的难反射光且难透射光的材质。

对于探针的固定中所使用的凝胶没有特别限定，可列举例如丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-丙烯酰胺基乙氧基乙醇，N-丙烯酰胺基氨基丙醇、N-羟甲基丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羟乙酯、(甲基)丙烯酸、烯丙基糊精等单体中的至少一种以上与亚甲基双(甲基)丙烯酰胺、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯等多官能性单体共聚而成的凝胶。此外，作为能够在微阵列1中使用的凝胶，可列举例如，琼脂糖、藻酸、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙二醇等凝胶或者将它们交联而成的凝胶。

这样的微阵列1可以通过日本特开2000-270878号公报中记载的那样的方法来制造。荧光检测装置可以单独测定1块微阵列1，或者对区分成多个区域的容器(所谓的孔板)的各区域内配置的多个微阵列1进行测定。

(2)荧光检测装置

接着，参照图2及图3，对本发明的优选实施方式的荧光检测装置的构成进行说明。图2是显示本发明的实施方式中的荧光检测装置的构成的示意图。

如图2所示，荧光检测装置6具有装载微阵列1的装载台8。在装载台8的上方设置照射透射微阵列1中的凝胶的透射光的透射光照射设备10。此外，在装载台8的下方，设置从微阵列1的斜下方照射激发光的激发光照射设备12和调整向微阵列1的试样4照射激发光的照射角的照射角调整设备14。进而，在装载台8的下方，设置将透射微阵列1中的凝胶的透射光及从微阵列1发出的荧光聚光的聚光透镜16。聚光透镜16被配置为以使光轴相对于装载台8上设置的微阵列1的面方向正交。在该聚光透镜16的下方，设置检测由聚光透镜16聚焦的透射光及荧光的检测设备18。为了不使激发光、环境光入射到检测设备18，检测设备18具备使从微阵列1中的试样4发出的荧光透射且不使激发荧光物质的激发光透射的荧光用滤光器20。

透射光照射设备10、装载台8、聚光透镜16及检测设备18以该顺序配置在聚光透镜16的光轴上。此外，将激发光照射设备12配置为使激发光的光路不进入检测设备18，即激发光从不直接入射到聚光透镜16的位置直接地或通过光纤等导光设备间接地对微阵列1照射激发光。

(2-1)透射光照射设备

将透射光照射设备10配置在聚光透镜16的光轴上，使得可以从在装载台8上装载的微阵列1的上方相对于微阵列1的表面垂直地照射透射光。

对于透射光照射设备10中采用的光源的种类没有特别限定，但使用能够射出透射荧光用滤光器20的波长的光的光源。

例如，在试样4含有荧光色素Cy5(如果照射650nm的激发光，则发出660nm的荧光)时，为了仅使从该试样4发出的荧光到达检测设备18，则使用荧光用滤光器20来仅通过658～665nm的光。这种情况下，在透射光照射设备10中使用能够射出波长为658～665nm的光的光源。

作为透射光照射设备10所使用的光源，可以使用例如卤素灯、LED、激光等。其中，优选能够对微阵列1的试样4全体照射透射光的面照射用型LED。

从透射光照射设备10照射的透射光的强度、从透射光照射设备10至微阵列1或聚光透镜16的距离设定为可以使透射光到达聚光透镜16。

此外，根据需要，为了抑制透射光到达微阵列1时的光量斑，可以在透射光照射设备10与微阵列1之间配置使从透射光照射设备10射出的透射光扩散的扩散板22。扩散板22例如由白色的亚克力板、贴附纸的透明玻璃板等构成。

该扩散板22由扩散板移动设备24来支撑。扩散板移动设备24在从透射光照射设备10向着试样4的透射光的光路上插入取出扩散板22。该扩散板移动设备24由旋转螺线管、DC电机构成。扩散板22通过减速机构或者直接地与扩散板移动设备24的驱动轴连接，能够对应于扩散板移动设备24的动作，在从透射光照射设备10向着试样4的透射光的光路上的位置与从透射光照射设备10向着试样4的透射光的光路以外的位置之间移动。

(2-2)装载台

装载台8装载作为测定对象的微阵列1。装载台8上设置窗或形成孔以使透射光、激发光、从试样4发出的荧光等通过。装载台8还可以装载多个微阵列1。

装载台8由检测位置调整设备26来支撑，所述位置调整设备26用于使聚光透镜16及检测设备18与微阵列1在与聚光透镜16的光轴正交的方向上相对移动。该检测位置调整设备26由例如利用显微镜用的双轴XY台等来构成。

而且，装载台8由焦点调整设备28来支撑，所述焦点调整设备28用于调整聚光透镜16及检测设备18与微阵列1在聚光透镜16的光轴方向上的距离。该焦点调整设备28由例如利用显微镜用的Z台等来构成，使装载台8沿着聚光透镜16的光轴移动。

(2-3)激发光照射设备

激发光照射设备12射出对微阵列1中配置的试样4中的荧光物质进行激发的波长成分的光。例如，作为激发光照射设备12，可以使用LED、激光、高压水银灯、氙灯、金属卤化物等。而且，还可以将来自光源的光通过用纤维、透镜等导光来照射。该激发光照射设备12由照射角调整设备14来支撑。

激发光照射设备12射出的光的照度分布优选尽可能均匀，可以通过例如遮蔽(shading)补偿这样的公知的方法来补偿。此外，激发光照射设备12射出的光的强度优选尽可能强。

为了将由激发光照射设备12射出的激发光的波长成分限定在使试样4中的荧光物质激发的波长成分，在激发光照射设备12与微阵列1之间配置激发用滤光器30。该激发用滤光器30仅透射使试样4中的荧光物质激发的波长成分的光，将其他的波长成分的光去掉。

例如，作为荧光色素使用Cy5(如果照射650nm的激发光，则发出660nm的荧光)时，为了仅对试样4照射激发光，使用仅通过波长为650nm左右的光的激发用滤光器30。由此，由于不能使波长为660nm的光照射到微阵列1，因此可以防止在微阵列1的表面反射的波长660nm的光射入到聚光透镜16中来提升背景。

图3是显示本发明的实施方式中的荧光检测装置6中相对于试样4的激发光的照射角的放大侧视图。这里的“照射角”是指相对于在装载台8上装载的微阵列1的试样4的下表面的照射角(图3中的θ)。即，在设定装载台8的水平面内的微阵列1的位置而使得试样4的中心轴线与聚光透镜16的光轴一致的状态下，从激发光照射设备12以照射角θ照射激发光至试样4的下表面。

从激发光照射设备12照射至试样4的激发光的照射角θ相对于试样4的下表面优选为15～60°的范围内。通过使照射角θ为15°以上，可以防止激发光被聚光透镜16遮挡、激发光照射设备12与聚光透镜16接触。此外，通过使照射角θ为60°以下，即使对于具有一定厚度的试样4也能使激发光充分进入，可以准确地检测来自试样4的荧光。激发光的照射角θ更优选为15～55°的范围内，进一步优选为15～45°的范围内。

此外，还可以调整激发光的照射角θ以使得照射角θ满足以下算式。

[数2]

这里，“t”表示试样4的厚度(mm)，“y”表示试样4的长径或直径(mm)。试样4的厚度t优选为0.1～1mm的范围。试样4的厚度t更优选为0.1～0.5mm，进一步优选为0.1～0.25mm。试样4的直径y只要是能够实现上述的优选照射角θ的范围即可。

从激发光照射设备12照射到试样4的激发光的照射角θ由照射角调整设备14来调整。该照射角调整设备14将激发光照射设备12以激发光照射到的试样4的下表面为中心沿着圆弧旋转移动，例如由手动或自动的Gonio台构成。

该照射角调整设备14通过手动或自动来使激发光照射设备12旋转移动，以实现如上所述的对应于试样4的厚度t而确定的照射角θ。

优选抑制照射分布来向试样4照射均匀的激发光，因此优选设置多个(2个以上)激发光照射设备21。激发光照射设备12的个数没有特别限定，即使多于8个也不易获得进一步提高的效果，优选设置2～8个激发光照射设备12。

在使用多个激发光照射设备12的情况下，优选将各激发光照射设备12在以聚光透镜16的光轴为中心的圆周上均等地配置。例如，在配置4个激发光照射设备12的情况下，在以聚光透镜16的光轴为中心的圆周上，以90°间隔配置各激发光照射设备12。

此外，还可以在聚光透镜16的周围配置圆环型的激发光照射设备12。圆环型的激发光照射设备12例如通过在具有柔软性的圆环状基板上高密度地安装光源来构成。这种情况下，将圆环型的激发光照射设备12配置为圆环形状的中心轴线与微阵列1的面方向正交。照射角调整设备14使具有柔软性的圆环状的基板的倾斜发生改变，从而实现如上所述的对应于微阵列的厚度t而确定的照射角θ。即使通过该圆环型的激发光照射设备，也能够抑制照射到试样4的激发光的照射分布。

可以根据照射的激发光的强度、激发光照射设备12的数量等来适宜选择激发光照射设备12与微阵列1之间的距离。激发光照射设备12与微阵列1之间的距离越近则激发光的衰减变小，因而优选激发光照射设备12靠近微阵列1。但是，如果激发光照射设备12与微阵列1之间的距离过近，则激发光照射设备12进入到聚光透镜16的视野内，因此，优选保持激发光照射设备12不进入到聚光透镜16的视野内的程度的距离。

(2-4)聚光透镜

作为聚光透镜1，可以使用显微镜用的物镜等。由于微阵列检测装置1用于检测试样4发出的荧光，因而优选将荧光显微镜用所设计的自发荧光少的透镜来用作聚光透镜16。

对聚光透镜16的种类没有特别限定，为了避免因聚光透镜16遮蔽从激发光照射设备12照射的激发光，优选使用工作距离(在微阵列1上聚焦时的微阵列1与聚光透镜16的前端之间的距离)长、外径细的透镜。

(2-5)检测设备

作为检测设备18，可以使用CCD传感器、CMOS传感器或线传感器等。特别地，优选将具有传感器冷却功能的冷却CCD照相机用于检测设备18，以使得从微阵列1试样4发出的微弱的荧光能够以噪音少的方式被检测或摄像。检测设备18与镜筒(未图示)一起来组装到荧光检测装置6中，以使得该检测设备18的光轴与聚光透镜16的光轴一致(在光轴上配置成一条直线)。

此外，检测设备18中还可以配置用于使微阵列1的试样4发出的荧光透射而不使激发荧光物质的激发光透射的荧光用滤光器20。例如，在使用Cy5(如果照射650nm激发光，则发出660nm的荧光)作为荧光色素的情况下，例如使用仅使658～665nm的光通过的滤光器作为荧光用滤光器20，以使得反射的激发光、从试样4之外进入的光等不进入到检测设备18。通过使用这样的荧光用滤光器20可以仅将荧光输送到检测设备18。

通过检测设备18检测的荧光(被摄像到的图像)传输至计算机等计算装置，依据任意算法来进行图像解析、数据处理。在数据处理中，将微阵列1的各试样4的每个灰度值数值化，输出为CSV数据等。

(3)微阵列的检测方法

(3-1)由通过对微阵列照射透射光而得到的微阵列的透射光图像来调整 焦点的工序

将微阵列1安装到装载台8上，通过焦点调整设备28使装载台25沿着聚光透镜16的光轴移动，以使得聚光透镜16的前端与微阵列1之间的距离为聚光透镜16的工作距离(由聚光透镜16的型号已知)。之后，由扩散板移动设备24在从透射光照射设备10向着试样4的透射光的光路上配置扩散板22。然后，在隔着扩散板22，透射光照射设备10向微阵列1照射透射光的状态下，例如，使装载台8在沿着聚光透镜16的光轴以0.05mm间距在前后1mm之间移动，同时由检测设备18对因透射微阵列1的试样4的透射光而产生的微阵列1的透射图像进行摄像。然后，将摄像到最高反差(contrast)的(反差极大)透射图像时的装载台25的位置确定为聚光透镜16的焦点在试样4上聚焦的焦点位置。在该焦点位置检测的透射光(透射图像)被传输到计算装置，在(3-4)中的后述的工序中用于数值化处理。

(3-2)通过向微阵列的试样照射激发光来激发试样中结合的荧光物质的 工序

接着，停止由透射光照射设备10的透射光的照射，由扩散板移动设备24、从透射光照射设备10向着试样4的透射光的光路上除去扩散板22。然后，由激发光照射设备12向微阵列1的试样4照射激发光。此时的激发光的照射角等条件如上所述。通过向试样4照射激发光，可以激发试样4中结合的荧光物质。

(3-3)检测由被激发的试样发出的荧光的工序

在由激发光照射设备12照射激发光的状态下，由检测设备18检测由微阵列1的试样4发出的荧光(对荧光图像进行摄像)。这里，将检测的荧光(摄像到的荧光图像)传输到计算装置，供于在(3-4)中的后述的工序的数值化处理。

(3-4)进行数值化处理的工序

在(3-1)中的上述工序中，透射光仅透射微阵列1的试样4的部分，不透射其他部分(包含不透射光的部件2)。因此，将在(3-1)的工序中得到的透射图像基于任意设定的阈值进行二进制化，试样4的部分以“1”表示、包含不透射光的部件2的其他部分以“0”表示。由该二进制化的图像算出各试样4的重心坐标并储存。

然后，在由(3-3)中的上述工序所得到的荧光图像中，测定以各试样4的重心坐标为中心的规定半径(微阵列1的试样4的内径)的圆所包围的区域的像素的灰度值(显示由检测设备18检测的光的亮度的数值)。由此，检测微阵列1的试样4的荧光量。

(3-5)移动装载台的工序

在装载台8装载了多个微阵列1的情况下，通过利用检测位置调整设备26来移动装载台8，从而检测各微阵列1的试样4发出的荧光。即，通过上述的各工序，在检测1个微阵列1的试样4发出的荧光后，由检测位置调整设备26使装载台8在与聚光透镜16的光轴正交的方向上移动，将未进行荧光检测的微阵列1配置在聚光透镜16的光轴上。然后，通过上述的各工序，检测由该微阵列1的试样4发出的荧光。对于装载台8上装载的全部微阵列1反复进行这样的装载台8的移动和微阵列的试样4发出的荧光的检测。

实施例

以下是本发明的实施例。

1.微阵列的制作

首先，准备2张厚度0.1mm的多孔板。在该多孔板的中央部将合计25个直径0.32mm的贯通孔空出0.42mm的间隔，配置为5行×5列的格子状。在这些多孔板的全部贯通孔内，通过由炭黑着色的聚碳酸酯制中空纤维(外径0.28mm、内径0.18mm、长度500mm)。使通过该中空纤维的2张多孔板相互分离50mm，在这些分离的多孔板间通过填充由炭黑着色的聚氨酯树脂，得到两端具有未被树脂固定化的部分的20mm见方且长度50mm的棱柱状的中空纤维排列体。

在得到的中空纤维排列体中的各中空纤维内，填充将二甲基丙烯酰胺(3.8质量％)凝胶前体溶液与以表1所示浓度比率稀释、调整了的Cy5荧光物质混合而成的溶液，使凝胶前体溶液与Cy5荧光物质重合。之后，利用切片机，沿着与中空纤维的轴线方向正交的方向，从棱柱状的中空纤维排列体切出厚度0.25mm的薄片，从而得到微阵列(毛细管、阵列、片)。将所得的微阵列置于载玻片上，在浸渍于水中的状态下施加盖玻片安装到装载台上。

[表1]

No.	Cy5浓度比率
		1	1
2	0.2
		3	0.04
4	0.008
		5	0.0016
6	0.00032

2.荧光检测装置构成

由表2所示的部件构成如图1所示的荧光检测装置。

[表2]

构成部件	详细	制造商	型号等
				激发光照射设备	红色LED	CCS	HLV2系列红
透射光照射设备	白色LED	CCS	HPR系列
				荧光用滤光器	Cy5用荧光滤光器	欧米茄光学	XF3030
激发用滤光器	Cy5用激发滤光器	欧米茄光学	XF1026
				聚光透镜	物镜(2×)	奥林巴斯	XLFLUOR 2×
扩散板	白色亚克力板	-	白色3mm
				检测设备	冷却CCD照相机	BITRAN	BS-41L

实施例1

本实施例1中使用的微阵列，如上所述，试样厚度为0.25mm、试样直径为0.18mm。这种情况下，由上述算式(1)算出照射角θ为约20°。这里，将激发光照射设备配置为以激发光相对于微阵列的试样的表面为20°的照射角来照射。将4个激发光照射设备在将聚光透镜的光轴作为中心的圆周上以90°间隔均等地配置。聚光透镜与微阵列的距离为21mm时，使得聚光透镜的摄像范围内的光量分布为中央与周边有约5％左右的光量差。

首先，在由透射光照射设备对微阵列的试样仅照射透射光的状态下，将装载台沿着聚光透镜的光轴以0.05mm的间距在前后1mm之间移动，同时，由检测设备对由透射微阵列的试样的透射光所成的透射图像进行摄像。然后，将摄像最高反差(反差极大)的透射图像时装载台的位置确定为焦点。此外，将在该焦点所摄像的透射图像基于规定的阈值进行二进制化，算出各试样的重心坐标。

图4是显示通过使激发光相对于微阵列的试样的照射角为20°时本发明的实施例1的荧光检测装置对微阵列的试样的荧光量的检测结果的线图。在该图4中，横轴表示Cy5荧光物质的浓度比率，纵轴表示由荧光检测装置检测的荧光量。由本实施例1的荧光检测装置检测的微阵列的试样所发出的荧光的结果，如图4所示，在Cy5的浓度比率从0.00032至1的全部范围内，Cy5的浓度比率与检测到的荧光量之间得到高的直线性。即可知，由实施例1的荧光检测装置能够非常准确地检测到试样发出的荧光。

实施例2

图5是显示通过使激发光相对于微阵列的试样的照射角为55°时本发明的实施例2的荧光检测装置对微阵列的试样的荧光量的检测结果的线图。除了使激发光相对于微阵列的试样的照射角为55°以外，与实施例1同样地进行实验。该实施例2中，如图5所示，在Cy5浓度从0.00032至1的全部范围内，Cy5的浓度比率与检测到的荧光量之间得到高的直线性。即可知，由实施例2的荧光检测装置能够非常准确地检测到试样发出的荧光。

比较例1

图6是显示通过使激发光相对于微阵列的试样的照射角为70°时的比较例1的荧光检测装置对微阵列的试样的荧光量的检测结果的线图。除了使激发光相对于微阵列的试样的照射角度为70°以外，与实施例1同样地进行实验。该比较例1中，如图6所示，在Cy5浓度从0.0016至1的范围内，Cy5的浓度比率与检测到的荧光量之间得到直线性，但在Cy5浓度为0.0016以下的范围内Cy5的浓度比率与检测到的荧光量之间没有得到直线性。即，在比较例1的荧光检测装置中，未准确地检测到试样发出的荧光。

比较例2

图7是显示比较例2的通过使用高压水银灯作为激发光源的一般的同轴落射方式的荧光显微镜(尼康制ECLIPSE E600)对微阵列的试样的荧光量的检测结果的线图。该比较例2中，由于因聚光透镜内的自发荧光等而装置背景高，如图7所示，在Cy5浓度从0.0016至1的范围内，Cy5的浓度比率与检测到的荧光量之间得到直线性，但在Cy5浓度为0.0016以下的范围内，Cy5的浓度比率与检测到的荧光量之间没有得到直线性。即，在比较例2的荧光显微镜中，未准确地检测到试样发出的荧光。

符号说明

1   微阵列

2   不透射光的部件

4   试样

6   荧光检测装置

8   装载台

10  透射光照射设备

12  激发光照射设备

14  照射角调整设备

16  聚光透镜

18  检测设备

20  荧光用滤光器

22  扩散板

24  扩散板移动设备

26  检测位置调整设备

28  焦点调整设备

30  激发用滤光器

Claims (14)

1.一种荧光检测装置，其特征在于，是对由含荧光物质的透光性试样发出的荧光进行检测的荧光检测装置，其具备：对所述试样照射激发光的激发光照射设备、检测所述试样发出的荧光的检测设备、基于试样的尺寸调整激发光相对于所述试样的照射角的照射角调整设备。

2.如权利要求1所述的荧光检测装置，其中，所述照射角调整设备调整所述激发光的照射角，以使得激发光相对于所述试样的照射角θ满足以下算式，

[数1]

其中，t为所述试样的厚度，y为所述试样的宽度。

3.如权利要求1所述的荧光检测装置，其中，在所述试样的厚度为0.1～1mm的情况下，所述照射角调整设备调整所述激发光的照射角，以使得所述激发光相对于所述试样的照射角θ在15～60°的范围内。

4.如权利要求1～3的任一项所述的荧光检测装置，其中，具备在从所述试样向着所述检测设备的荧光的光路上配置的、将所述荧光聚焦于所述检测设备的聚光透镜，

所述激发光照射设备由在以所述聚光透镜的光轴为中心的圆周上以均等的角度间隔配置的多个激发光照射设备构成，或者，由在所述聚光透镜的周围配置的圆环型的激发光照射设备构成。

5.如权利要求4所述的荧光检测装置，其中，具备焦点调整设备,其对所述聚光透镜及所述检测设备相对于配置了所述试样的微阵列的距离在所述聚光透镜的光轴方向上进行调整。

6.如权利要求4或5所述的荧光检测装置，其中，具备检测位置调整设备，其使所述聚光透镜及所述检测设备与配置了所述试样的微阵列在与所述聚光透镜的光轴正交的方向上相对移动。

7.如权利要求1～6的任一项所述的荧光检测装置，其中，进一步具有将透射所述试样的透射光照射到所述试样的透射光照射设备，

所述检测设备配置在透射所述试样的透射光的光路上，检测透射该试样的透射光。

8.如权利要求7所述的荧光检测装置，其中，进一步具备用于使从所述透射光照射设备射出的透射光扩散的扩散板，

所述扩散板配置在从所述透射光照射设备向着所述试样的透射光的光路上。

9.如权利要求8所述的荧光检测装置，其中，进一步具备扩散板移动设备，其在从所述透射光照射设备向着所述试样的透射光的光路上插入取出所述扩散板。

10.一种荧光检测方法，是使用权利要求1～9的任一项所述的荧光检测装置的荧光检测方法，其包括：

由所述激发光照射设备对所述试样照射激发光，激发该试样中所含的荧光物质的工序，

通过所述检测设备检测所述被激发的荧光物质所发出的荧光的工序。

11.如权利要求10所述的荧光检测方法，其中，

所述荧光检测装置具备：

聚光透镜，所述聚光透镜在从所述试样向着所述检测设备的荧光的光路上配置，并将所述荧光聚焦于所述检测设备；以及

焦点调整设备，所述焦点调整设备对所述聚光透镜及所述检测设备相对于配置了所述试样的微阵列的距离在所述聚光透镜的光轴方向上进行调整，

所述荧光检测方法包括，通过所述焦点调整设备，对所述聚光透镜及所述检测设备相对于所述微阵列的距离在所述聚光透镜的光轴方向上进行调整，从而使所述聚光透镜的焦点集中于所述试样上的工序，

在使所述聚光透镜的焦点集中于所述试样上的工序之后，实施照射所述激发光到试样的工序。

12.如权利要求11所述的荧光检测方法，其中，

所述荧光检测装置具备将透射所述试样的透射光照射到所述试样的透射光照射设备，

使所述聚光透镜的焦点集中于所述试样上的工序包括：

通过所述透射光照射设备将透射光照射到所述试样上的工序，

通过所述焦点调整设备使所述聚光透镜及所述检测设备相对于所述微阵列的距离在所述聚光透镜的光轴方向上阶段地变化，同时通过所述检测设备检测透射所述试样的透射光的工序，

基于所述检测设备所检测的透射光的图像，判定所述聚光透镜的焦点在所述试样上的聚焦位置的工序。

13.如权利要求12所述的荧光检测方法，其中，

所述荧光检测装置具备检测位置调整设备，其使所述聚光透镜及所述检测设备与所述微阵列在与所述聚光透镜的光轴正交的方向上相对移动，

所述检测荧光的工序包括：

通过所述检测位置调整设备使所述聚光透镜及所述检测设备与所述微阵列在与所述聚光透镜的光轴正交的方向上相对移动的工序；以及

在所述检测位置调整设备所引起的每次所述移动时，检测所述被激发的荧光物质所发出的荧光的工序。

14.如权利要求12或13所述的荧光检测方法，其中，

所述荧光检测装置具备用于使从所述透射光照射设备射出的透射光扩散的扩散板，

将所述透射光照射到所述试样的工序包括将所述扩散板配置在从所述透射光照射设备向着所述试样的透射光的光路上的工序，

所述照射激发光的工序包括将所述扩散板从由所述透射光照射设备向着所述试样的透射光的光路上取出的工序。