JP2005062023A - 落射型蛍光測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 構造が簡素化されるとともに、励起光および蛍光の損失を抑えて、検出精度を向上させることができる落射型蛍光測定装置を提供する。
【解決手段】 検出窓２４を有する測定試料用ホルダー２３と、この測定試料用ホルダー２３を駆動可能なステージ２５と、前記検出窓２４を介して前記測定試料２２に斜め下方から励起光３２を照射する光ファイバー３０を有する励起光照射手段と、前記測定試料２２からの蛍光３３を偏光・集光する際にその蛍光３３の光軸が前記励起光３２の光軸に重ならないように前記測定試料の下方向に配置されるレンズ３４と、光源２６側の励起光及び検出側の蛍光３３を反射する鏡２８，３５とを具備する。
【選択図】図２

Description

本発明は、微小空間中で化学反応や分析を行うマイクロ・ナノチップテクノロジーなどに用いられる落射型蛍光測定装置に関するものである。

従来、マイクロチップテクノロジー分野において光学的な分析を行うためには、極少量の分析試料を高感度に測定するため、大型の特殊測定装置が必要であった。また、特に、従来の落射型蛍光測定装置においては、励起光と蛍光が同光軸上にあるため、波長選択フィルターを通して照射・検出することが必須である。

このことから、波長連続的な測定ができず、フィルターを通すことによる光量損失が避けられなかった。

一方、下記特許文献１には、励起光と蛍光とを同光軸上から外したと見られる光測定装置が開示されている。かかる光測定装置は、図７にその部分模式図を示すように、外部からの励起光１０１をステージ１０２上の透明なマイクロプレート１０３に照射して測定試料からの蛍光１０４をマイクロプレート１０３の底面１０３Ａおよびステージ１０２を介して検出するようにしている。
特開平１０−１９７４４９号公報 Ｋ．Ａｋａｓａｋａ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．Ｏｈｒｕｉ ａｎｄ Ｈ．Ｍｅｇｕｒｏ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５０（５），１１３９−１１４４（１９８６）．

しかしながら、上記した従来の光測定装置は、構造が複雑であり、励起光および蛍光をマイクロプレート１０３の底面１０３Ａおよびステージ１０２を介して検出するようにしているため、その励起光および蛍光の損失が大きく、検出精度が劣るといった問題があった。また、励起光の選択には波長選択フィルター（図示なし）を用いており、検出には感度の劣るＣＣＤ（図示なし）を用いている。さらに、測定試料をマイクロプレート１０３に分注する回分式であって、送液状態での分析は不可能であり、また、マイクロプレート１０３以外の試料容器をセットすることはできない。加えて、光照射位置について特にＺ軸方向に調整する機能を有してはいない。

本発明は、上記状況に鑑みて、構造が簡素化されるとともに、励起光および蛍光の損失を抑えて、検出精度を向上させることができる落射型蛍光測定装置を提供することを目的とする。

本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕落射型蛍光測定装置において、検出窓を有する測定試料用ホルダーと、この測定試料用ホルダーを駆動可能なステージと、前記検出窓を介して測定試料に斜め下方から励起光を照射する光ファイバーを有する励起光照射手段と、前記測定試料からの蛍光を偏光・集光する際に該蛍光の光軸が前記励起光の光軸に重ならないように下方向に配置されるレンズと、光源側の励起光及び検出側の蛍光を反射する鏡と、蛍光を検出する受光検出器とを具備することを特徴とする。

〔２〕上記〔１〕記載の落射型蛍光測定装置において、前記試料がセットされるマイクロチップを具備することを特徴とする。

〔３〕上記〔１〕記載の落射型蛍光測定装置において、前記励起光照射手段は、励起光を導入するために照射用光ファイバーを用い、前記測定試料の直近から直接的かつ光の減衰を抑えて励起光を照射することを特徴とする。

〔４〕上記〔３〕記載の落射型蛍光測定装置において、前記照射用光ファイバーを複数本配置することを特徴とする。

〔５〕上記〔１〕記載の落射型蛍光測定装置において、前記励起光照射手段は、外部から照射された励起光を反射鏡により反射し、前記照射用光ファイバーに直線的に導入する整光手段を有することを特徴とする。

〔６〕上記〔１〕記載の落射型蛍光測定装置において、前記ステージは３次元駆動ＸＹＺステージであり、前記測定試料用ホルダーの位置をＸＹＺ軸方向に微調整することが可能であることを特徴とする。

〔７〕上記〔１〕記載の落射型蛍光測定装置において、励起された測定試料から発した蛍光のうち、下方向に発せられた蛍光に対して偏光・集光のためのレンズを用いて採光の効率を高めることを特徴とする。

〔８〕上記〔１〕記載の落射型蛍光測定装置において、励起光と蛍光が導かれる光路を分離、遮光することによって蛍光検出の妨害となる散乱光・迷光の影響を低減することを特徴とする。

〔９〕上記〔１〕又は〔２〕記載の落射型蛍光測定装置において、蛍光分光光度計本体に取り付けられる、蛍光検出を妨害する外部からの迷光を遮光する開閉蓋を具備することを特徴とする。

〔１０〕上記〔９〕記載の落射型蛍光測定装置において、前記受光検出器の電源に接続される応動スイッチを備え、前記開閉蓋が開くと、前記応動スイッチが動作して、前記受光検出器の電源からの電力を遮断することを特徴とする。

〔１１〕上記〔１０〕記載の落射型蛍光測定装置において、前記開閉蓋の各筐体の接合面に遮光・変形可能な材料を備え、外部から前記試料がセットされるマイクロチップへ送排液を供給する配管と、電力を供給する配線とを挿入可能なことを特徴とする。

〔１２〕上記〔１１〕記載の落射型蛍光測定装置において、前記開閉蓋と蛍光分光光度計本体との接合面に遮光・変形可能な材料を設けることを特徴とする。

本発明によれば、次のような効果を奏することができる。

光ファイバーによって光照射することにより、照射光線の損失を抑えて測定試料の直近から直線的に測定試料へ光を照射することが可能である。

また、照射光と検出光の光軸を別とすることにより、従来型の落射装置で必須であった波長選択フィルターを必要とせず、高効率且つ連続的な波長検出が可能である。

これらの効率性を合わせることにより、マイクロ・ナノチップなどの微小空間中における極少量の試料でも、感度が良く精度の高い蛍光分析を行うことが可能である。

また、送液状態での分析が可能である。

さらに、光照射位置のＺ軸方向の調整が可能である。

検出窓を有する測定試料用ホルダーと、このホルダーを駆動可能なステージと、前記検出窓を介して前記測定試料に斜め下方から励起光を照射する光ファイバーを有する励起光照射手段と、前記測定試料からの蛍光を偏光・集光する際に該蛍光の光軸が前記励起光の光軸に重ならないように下方向に配置されるレンズと、光源側の励起光及び検出側の蛍光を反射する鏡と、蛍光を検出する受光検出器とを具備し、照射光線の損失を抑えて測定試料の直近から直線的に励起光を測定試料へ照射することができる。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

図１は本発明の実施例を示す蛍光測定装置の概略図である。

この図において、１は蛍光分光光度計、２は蛍光ユニット、３，４はスリット、５，６は回折格子型分光器、７は高輝度光源、８は電源、９は受光検出器、１０はコンピュータ、１１はコンピュータ１０に接続される出力装置である。

この図に示すように、蛍光分光光度計１は励起光を発する高輝度光源７と蛍光を受光する受光検出器９、および光量を調節するスリット３，４を備えている。また、任意の励起光および蛍光波長を選択するための回折格子型分光器５，６を有している。通常、光源７からスリット４を通して発せられた励起光は、試料溶液を含むマイクロチップ又は測定試料を有する蛍光ユニット２へ照射され、直角方向へ発せられた蛍光がスリット３を通り受光検出器９へ導かれる。その受光検出器９に導入された蛍光は、光電子増倍管（受光検出器９に内蔵）により電気信号に変換され、コンピュータ１０により解析される。スリット３，４の開閉、波長の選択、光電子増倍管への電圧付加等もコンピュータ１０で制御される。

蛍光分光光度計１に備えられた高輝度光源７からの励起光は回折格子型分光器５、スリット４を経て蛍光ユニット２内の測定試料に照射される。測定試料中に蛍光物質を含む場合、蛍光物質は可視・紫外域の励起光の吸収により励起状態に達する。励起された分子はもとの基底状態にもどる失活過程において光放射現象を起こし、試料物質の分子構造や電子状態に基づいた特有の波長域に蛍光を発する。この蛍光をスリット３、回折格子型分光器６を経て受光検出器９に導入することによって電気信号に変換し、コンピュータ１０によって試料の同定、定量、分子間相互作用などを解析することができる。

図２は本発明の実施例を示す落射型蛍光測定装置の模式図、図３はその落射型蛍光測定装置の蛍光ユニットの上部からみた要部平面図である。

この図に示すように、２１は蛍光ユニット、２２は測定試料〔ここではマイクロチップ（試料容器）を有している〕、２３は測定試料用ホルダー、２４は検出窓、２５は３次元駆動ＸＹＺステージ（位置調整ステージ）、２６は高輝度光源、２７Ａは回折格子型分光器、２７Ｂはスリット、２８は反射鏡、２９は整光器、３０は光ファイバー、３１は光ファイバー３０の励起光の照射口、３２は測定試料２２の近傍の下方斜め方向から照射される励起光、３３は測定試料２２から発した下方向へ向けられる蛍光、３４はその蛍光３３を受ける偏光及び／または集光のためのレンズ、３５はレンズ３４からの蛍光を受ける反射鏡、３６Ａはその反射鏡３５から反射される蛍光が通過するスリット、３６Ｂは回折格子型分光器、３７はその回折格子型分光器３６Ｂからの蛍光を受ける受光検出器（光電子増倍管内蔵）、３８は受光検出器３７へ電力を供給するための電源、３９は開閉蓋（後述）の開閉に応動する応動スイッチである。

このように、蛍光ユニット２１は、励起光３２及び蛍光３３を反射する複数の鏡２８，３５と、光ファイバー３０を固定し励起光３２を光ファイバー３０へ導入する整光器２９、励起光３２を減衰することなく測定試料２２近傍に導く複数本の光ファイバー３０、蛍光３３を集光・偏光するレンズ３４、測定試料２２及び／または試料容器をセットする検出窓２４を有する測定試料用ホルダー２３、セットされた測定試料２２の位置を任意に変更する３次元駆動ＸＹＺステージ２５を備えている。

ここでは、２本の光ファイバー３０を用いているが、励起光の光量、照射位置、セットされる測定試料２２の形などによって光ファイバー３０の本数を１本または複数本設置することが可能であり、強い蛍光を得るには２本以上の光ファイバー３０を設置することが好ましい。励起された測定試料２２から発した蛍光のうち、真下方向に発せられた蛍光３３について偏光及び／または集光のためのレンズ３４を用いて採光の効率を高めている。レンズ３４で集光された蛍光３３は反射鏡３５によりスリット３６Ａ方向へ導かれ、回折格子型分光器３６Ｂを経て受光検出器３７へと導入される。

本発明の落射型蛍光測定装置は、通常の落射型蛍光装置で使用される波長選択フィルターを必要とせず、連続的な励起波長照射及び／または蛍光波長測定が可能であり、従来技術では不可能であった励起光及び／または蛍光のスペクトル測定を可能とする。加えて、励起光と蛍光が導かれる光軸は異なり、それぞれの光路を分離、遮光することによって蛍光検出の妨害となる散乱光・迷光の影響を低減することができ、ＳＮ比を向上させることができる。

また、３次元駆動ＸＹＺステージ（位置調整ステージ）２５には励起光３２、蛍光３３の散乱光を抑えるため、反射防止加工を施し、励起光３２の照射と蛍光３３の採光のために任意の位置に検出窓２４を開けている。更に、測定試料用ホルダー２３の位置を設定するため、歪みの少ない金属製とし、必要に応じて任意の位置にマイクロチップ（試料容器）の固定溝及び／または固定具（図示なし）を備え、蛍光ユニット２１付属の位置調整用マイクロメーター（図示なし）に固定するようにしている。

この位置調整用マイクロメーターはｘ，ｙ，ｚ方向へ調整可能であり、任意の位置へマイクロチップ（試料容器）を固定することができる。つまり、３次元駆動ＸＹＺステージ２５の駆動により、励起光３２が測定試料２２へ照射される位置に適切に測定試料用ホルダー２３を固定することができる。このとき、測定試料２２の、励起光３２が照射される部位の体積が最大となる位置に３次元駆動ＸＹＺステージ２５を調整することで、最大の蛍光光量を発生させ、効率的に蛍光３３を測定することが可能である。

更に、本発明の落射型蛍光測定装置には、外部からの迷光を遮断するための開閉蓋が取り付けられている。また、この開閉蓋が開かれると同時に受光検出器３７の動作を遮断する応動スイッチ（例えば、プッシュ型マイクロスイッチ）３９が配置されるように構成されている。

図４は本発明の実施例を示す落射型蛍光測定装置の開閉蓋の構成図であり、図４（ａ）にその上面図、図４（ｂ）にその正面図を示している。また、図５にその落射型蛍光測定装置の開閉蓋が閉じている状態を示す斜視図、図６にその落射型蛍光測定装置の開閉蓋が開いている状態を示す斜視図が示されている。

これらの図において、４１は蛍光分光光度計本体、４２は開閉蓋、４３はその開閉蓋４２の一部を構成する第１の筐体、４４はその開閉蓋４２の一部を構成する第２の筐体、４５は鎖錠（ロック）装置、４６は枢支（ヒンジ）装置、３９は開閉蓋４２が開かれるとそれを検出する応動スイッチ（図２参照）（例えば、プッシュ型マイクロスイッチ）、４７は３次元駆動ＸＹＺステージ２５（図２参照）の位置調整用つまみ、４８は送排液用配管、４９は電力供給用配線、５０，５１は第１の筐体４３と第２の筐体４４が当接する部位（接合面）及び筐体４３，４４と蛍光分光光度計本体４１の接合面に設けられる変形可能な遮光用材料である。

図５に示すように、開閉蓋４２が閉じられていると、蛍光検出の妨害となる外部からの迷光を遮光する機能を有する。また、枢支（ヒンジ）装置４６により、左右又は前後に開閉可能である。つまり、図５に示す開閉蓋４２が閉じられた状態から、図６に示す開閉蓋４２が開かれた状態となると、第１の筐体４３が蛍光分光光度計本体４１から開かれて、応動スイッチ３９（図２参照）が動作する。つまり、開閉蓋４２の開放の際に過剰の採光を引き起こし、受光検出器３７（図２参照）の過電流による損傷が懸念されるため、蛍光分光光度計本体４１に第１の筐体４３が接する位置に応動スイッチ３９を配置して、開閉蓋４２の開放時にその応動スイッチ３９が動作することにより、電源３８（図２参照）の回路を開いて、受光検出器３７への電圧付加を切断する機能を有している。

また、マイクロチップなどを用いた分析の場合は、マイクロチップ側に外部から液を流すための配管４８および電力を供給するための配線４９が設けられており、それらを外部から導入可能なように開閉蓋４２が構成されている。すなわち、開閉蓋４２を構成する第１の筐体４３と第２の筐体４４との接合面に遮光用の変形可能な遮光用材料（例えば、スポンジ）５０，５１が２〜３ｍｍ程度の厚さで接着されている。また、筐体４３，４４と蛍光分光光度計本体４１とが合わさる部分にも接着されている。この遮光用材料５０，５１はスポンジなどの変形可能な部材からなるため、１ｍｍ程度の配管４８や配線４９であれば、その形状に合わせて変形し、開閉蓋４２内に散乱光・迷光が入り込むのを防ぐことができる。また、配管４８および配線４９は、図４〜図６に示した位置のみに保持されるのではなく、その保持位置を任意の位置に設定できるため、外部からの配管４８や配線４９を容易に導入することができる。因みに、配管４８としては、例えば、マイクロチップへの液導入用に皮膜加工された溶融ガラスのファイバー（外径０．２〜０．４ｍｍ）を用いることができる。

このように構成することにより、開閉蓋４２によって散乱光・迷光の影響を防ぎながら、マイクロチップを用いた流動分析や電気的制御を精確に行うことができる。
〔実験および結果〕
図２に示したような、マイクロチップを保持する平面の試料台を有し、Ｘ，Ｙ，Ｚ軸方向にそれぞれ１０ｍｍの可動範囲を持つ装置を用いて実験を行った。光源から照射された励起光は光ファイバー（径０．８ｍｍ）に導入され、測定試料用ホルダー下部からマイクロチップ底面に直近から照射される。試料から真下に発せられる蛍光は、測定試料用ホルダー下に設置されたレンズで集光され、分光器へ導入される。測定操作は通常の蛍光分光光度計と同じである。また、マイクロチップを使用する際、送排液用配管を導入することが必要なため、この落射型蛍光測定装置には上記したように、その際の外部からの迷光を遮断する特製の開閉蓋が装備されている。

上記の落射型蛍光測定装置を用いて蛍光測定を行った。測定に使用したマイクロチップはＰＤＭＳ製のものを用い、深さ５０〜１００μｍ、幅３００〜７００μｍの流路の凸型ガラス鋳型を用いて作製した。蛍光試薬として、ＳＯ₂ の蛍光指示薬として用いられるＮ−（９−ａｃｒｉｄｉｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（上記非特許文献１参照）を用い、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４３２ｎｍで検出した。蛍光誘導体化反応は室温下、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）を用いて行った。励起光は光ファイバーにより試料直近から直線的に照射されるため、蛍光側への迷光は非常に少ない。また、直近から励起光を照射し、レンズを用いて蛍光を集光することによって、微量の測定試料でも高感度に測定することが可能であった。

また、上記した本発明に基づき、測定試料（マイクロチップ使用）として、下記三件の蛍光及び発光に関する実験検討を実施した。
（１）免疫系細胞から放出されるアレルギー関連物質の蛍光測定
（２）溶液中に存在するＳＯ₂ の蛍光測定
（３）マクロファージから発生する活性酸素種の化学発光分析
これらの実施例に関して、従来型の装置である蛍光分光光度計を用いた比較結果よりも二桁以上高感度な絶対量感度を示した。また、従来の落射型蛍光顕微鏡では得ることのできなかった連続波長走査結果も得られた。

なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。

近年、微小空間中で化学反応や分析を行うマイクロ・ナノチップテクノロジーが注目を集めているが、本発明の落射型蛍光測定装置は、それらの光学的分析に用いる装置に適している。分析化学分野だけでなく、生化学、臨床医療、再生医療、組織工学、培養工学、生物生産、化学・創薬などが利用分野として挙げられる。

本発明の実施例を示す蛍光測定装置の概略図である。 本発明の実施例を示す落射型蛍光測定装置の模式図である。 本発明の実施例を示す落射型蛍光測定装置の蛍光ユニットの上部からみた要部平面図である。 本発明の実施例を示す落射型蛍光測定装置の開閉蓋の構成図である。 本発明の実施例を示す落射型蛍光測定装置の開閉蓋が閉じている状態を示す斜視図である。 本発明の実施例を示す落射型蛍光測定装置の開閉蓋が開いている状態を示す斜視図である。 従来の光測定装置の部分模式図である。

符号の説明

１ 蛍光分光光度計
２，２１ 蛍光ユニット
３，４，２７Ｂ，３６Ａ スリット
５，６，２７Ａ，３６Ｂ 回折格子型分光器
７，２６ 高輝度光源
８ 電源
９，３７ 受光検出器
１０ コンピュータ
１１ 出力装置
２２ 測定試料
２３ 測定試料用ホルダー
２４ 検出窓
２５ ３次元駆動ＸＹＺステージ（位置調整ステージ）
２８，３５ 反射鏡
２９ 整光器
３０ 光ファイバー
３１ 光ファイバーの励起光の照射口
３２ 励起光
３３ 蛍光
３４ レンズ（偏光・集光）
３８ 受光検出器へ電力を供給するための電源
３９ 応動スイッチ
４１ 落射型蛍光分光光度計本体
４２ 開閉蓋
４３ 第１の筐体
４４ 第２の筐体
４５ 鎖錠（ロック）装置
４６ 枢支（ヒンジ）装置
４７ ３次元駆動ＸＹＺステージの位置調整用つまみ
４８ 送排液用配管
４９ 電力供給用配線
５０，５１ 遮光用材料

Claims (12)

1. （ａ）検出窓を有する測定試料用ホルダーと、
   （ｂ）該測定試料用ホルダーを駆動可能なステージと、
   （ｃ）前記検出窓を介して測定試料に斜め下方から励起光を照射する光ファイバーを有する励起光照射手段と、
   （ｄ）前記測定試料からの蛍光を偏光・集光する際に該蛍光の光軸が前記励起光の光軸に重ならないように下方向に配置されるレンズと、
   （ｅ）光源側の励起光及び検出側の蛍光を反射する鏡と、
   （ｆ）蛍光を検出する受光検出器とを具備することを特徴とする落射型蛍光測定装置。
2. 請求項１記載の落射型蛍光測定装置において、前記試料がセットされるマイクロチップを具備することを特徴とする落射型蛍光測定装置。
3. 請求項１記載の落射型蛍光測定装置において、前記励起光照射手段は、励起光を導入するために照射用光ファイバーを用い、前記測定試料の直近から直接的かつ光の減衰を抑えて励起光を照射することを特徴とする落射型蛍光測定装置。
4. 請求項３記載の落射型蛍光測定装置において、前記照射用光ファイバーを複数本配置することを特徴とする落射型蛍光測定装置。
5. 請求項１記載の落射型蛍光測定装置において、前記励起光照射手段は、外部から照射された励起光を反射鏡により反射し、前記照射用光ファイバーに直線的に導入する整光手段を有することを特徴とする落射型蛍光測定装置。
6. 請求項１記載の落射型蛍光測定装置において、前記ステージは３次元駆動ＸＹＺステージであり、前記測定試料用ホルダーの位置をＸＹＺ軸方向に微調整することが可能であることを特徴とする落射型蛍光測定装置。
7. 請求項１記載の落射型蛍光測定装置において、励起された測定試料から発した蛍光のうち、下方向に発せられた蛍光に対して偏光・集光のためのレンズを用いて採光の効率を高めることを特徴とする落射型蛍光測定装置。
8. 請求項１記載の落射型蛍光測定装置において、励起光と蛍光が導かれる光路を分離、遮光することによって蛍光検出の妨害となる散乱光・迷光の影響を低減することを特徴とする落射型蛍光測定装置。
9. 請求項１又は２記載の落射型蛍光測定装置において、蛍光分光光度計本体に取り付けられる、蛍光検出を妨害する外部からの迷光を遮光する開閉蓋を具備することを特徴とする落射型蛍光測定装置。
10. 請求項９記載の落射型蛍光測定装置において、前記受光検出器の電源に接続される応動スイッチを備え、前記開閉蓋が開くと、前記応動スイッチが動作して、前記受光検出器の電源からの電力を遮断することを特徴とする落射型蛍光測定装置。
11. 請求項１０記載の落射型蛍光測定装置において、前記開閉蓋の各筐体の接合面に遮光・変形可能な材料を備え、外部から前記試料がセットされるマイクロチップへ送排液を供給する配管と、電力を供給する配線とを挿入可能なことを特徴とする落射型蛍光測定装置。
12. 請求項１１記載の落射型蛍光測定装置において、前記開閉蓋と蛍光分光光度計本体との接合面に遮光・変形可能な材料を設けることを特徴とする落射型蛍光測定装置。

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