WO2013137247A1 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents

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WO2013137247A1
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excitation light
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清水　浩司
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三菱レイヨン株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method using the same.
  • a microarray is a general term for a material or technology for fixing a large number of inspection / experiment objects and performing inspection / experiment at once.
  • development has been progressing and being used mainly for DNA microarrays targeting nucleic acids since the end of the 20th century.
  • mRNA is extracted from a sample, cDNA synthesized by reverse transcription is labeled with biotin, and hybridization is performed with DNA on the substrate of the DNA microarray. Then, the sample formed by hybridization is irradiated with excitation light, and the fluorescence intensity emitted from the fluorescent substance contained in the sample is detected by a fluorescence microscope, a fluorescence laser scanner, or the like. Based on the detected fluorescence intensity, the expression level of mRNA can be determined.
  • Fluorescence detection apparatuses that irradiate a sample arranged in a microarray with excitation light and detect fluorescence from the sample generally have two types of methods, a coaxial epi-illumination method and a non-coaxial epi-illumination method.
  • the coaxial epi-illumination method the sample is irradiated with excitation light through a condensing lens installed on the optical path of the excitation light, and the fluorescence from the sample excited by the excitation light is condensed by the same condensing lens, and the imaging device Focus on.
  • the apparatus background is raised by the auto-fluorescence of the condenser lens that occurs when the excitation light passes through the condenser lens, so it is difficult to accurately detect the weak fluorescence from the sample. .
  • Patent Document 1 a non-coaxial epi-illumination system as shown in Patent Document 1 is known as an apparatus that has improved the drawbacks of the coaxial epi-illumination system.
  • the sample is irradiated with excitation light obliquely from below, and the fluorescence from the sample is collected by a lens disposed below the sample so as not to overlap the optical axis of the excitation light.
  • this apparatus since excitation light does not pass through the lens, generation of autofluorescence of the lens is prevented.
  • a microarray in which a sample is arranged on the surface of a flat substrate such as a slide glass the thickness of the sample is small with respect to the irradiation direction of the excitation light on the sample. Excitation light can sufficiently enter the sample, and the fluorescence intensity from the sample can be accurately detected.
  • a microarray in which a sample is filled in a through-hole formed in a flat plate member for example, a fiber-type DNA chip manufactured by Mitsubishi Rayon (Genopal (registered trademark); Japanese Patent No. 4150330, Japanese Patent No.
  • the main object of the present invention is to detect fluorescence that can accurately detect the fluorescence intensity from a sample even when using a microarray in which a sample having a thickness with respect to the direction of excitation light irradiation to the sample is used.
  • An apparatus and a fluorescence detection method are provided.
  • the fluorescence detection device is a fluorescence detection device for detecting fluorescence from a translucent sample containing a fluorescent substance, and the excitation light is applied to the sample.
  • the irradiation angle adjusting means adjusts the irradiation angle of the excitation light so that the irradiation angle ⁇ of the excitation light with respect to the sample satisfies the following expression.
  • t is the thickness of the sample
  • y is the width of the sample.
  • the irradiation angle adjusting means has an irradiation angle ⁇ of excitation light with respect to the sample in a range of 15 to 60 ° when the thickness of the sample is 0.1 to 1 mm. Thus, the irradiation angle of the excitation light is adjusted.
  • the fluorescence detection apparatus includes a condensing lens disposed on the fluorescence optical path from the sample toward the detection means, and focuses the fluorescence on the detection means, and the excitation light irradiation means.
  • a condensing lens disposed on the fluorescence optical path from the sample toward the detection means, and focuses the fluorescence on the detection means, and the excitation light irradiation means.
  • the fluorescence detection apparatus adjusts a distance in the optical axis direction of the condensing lens between the condensing lens and the detection means and the microarray on which the sample is arranged. Means.
  • the fluorescence detection apparatus relatively moves the condenser lens and the detection means and the microarray on which the sample is arranged in a direction orthogonal to the optical axis of the condenser lens. Detection position adjusting means.
  • the fluorescence detection apparatus further includes a transmitted light irradiating unit that irradiates the sample with transmitted light that passes through the sample, and the detecting unit transmits light of the transmitted light that has transmitted through the sample.
  • the transmitted light that is arranged on the road and transmitted through the sample is detected.
  • the fluorescence detection apparatus further includes a diffusion plate for diffusing the transmitted light emitted from the transmitted light irradiation means, and the diffusion plate is separated from the transmitted light irradiation means by the sample. It arrange
  • the fluorescence detection device further includes a diffusion plate moving means for taking in and out the diffusion plate from the optical path of the transmitted light from the transmitted light irradiation means toward the sample.
  • the fluorescence detection method is a fluorescence detection method using the fluorescence detection apparatus according to the first invention of the present invention, wherein the sample is irradiated with excitation light by the excitation light irradiation means, A step of exciting the fluorescent substance contained in the sample, and a step of detecting the fluorescence emitted from the excited fluorescent substance by a detection means.
  • the fluorescence detection device is disposed on the fluorescence optical path from the sample to the detection means, and focuses the fluorescence on the detection means, the collection lens, and the detection And a focus adjusting means for adjusting the distance in the optical axis direction of the condensing lens between the means and the microarray on which the sample is arranged, and the fluorescence detection method includes the condensing lens and the detecting means by the focus adjusting means. Adjusting the distance of the condenser lens in the optical axis direction of the condenser lens to adjust the focal point of the condenser lens to the sample. After the step of focusing the condenser lens to the specimen, the excitation light is applied to the specimen. The process of irradiating is performed.
  • the fluorescence detection apparatus includes a transmitted light irradiating means for irradiating the sample with transmitted light that passes through the sample, and the step of focusing the condenser lens on the sample includes transmitted light.
  • the step of irradiating the sample with transmitted light by the irradiating unit, and the step of changing the distance in the optical axis direction of the condensing lens between the condensing lens, the detecting unit, and the microarray by the focus adjusting unit are performed stepwise.
  • the fluorescence detection device relatively moves the condenser lens and detection means and the microarray in a direction perpendicular to the optical axis of the condenser lens.
  • the fluorescence detection apparatus includes a diffusion plate for diffusing the transmitted light emitted from the transmitted light irradiation means, and the step of irradiating the sample with the transmitted light includes the diffusion plate Is disposed on the optical path of the transmitted light from the transmitted light irradiating means to the sample, and the step of irradiating the excitation light is a process of removing the diffuser plate from the optical path of the transmitted light from the transmitted light irradiating means to the sample. including.
  • the fluorescence detection device and the fluorescence detection method of the present invention an increase in the device background due to the autofluorescence of the condenser lens can be suppressed, and a sample having a thickness with respect to the direction of excitation light irradiation to the sample is disposed. Even when a microarray is used, the fluorescence intensity from the sample can be accurately detected.
  • 1 is a schematic plan view of a microarray applied to a fluorescence detection apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a schematic diagram illustrating a configuration of a fluorescence detection device according to an embodiment of the present invention. It is an enlarged side view which shows the irradiation angle of the excitation light with respect to the sample in the fluorescence detection apparatus by embodiment of this invention. It is a diagram which shows the detection result of the fluorescence amount of the sample of a microarray by the fluorescence detection apparatus of Example 1 of this invention which made the irradiation angle of the excitation light with respect to a sample 20 degrees.
  • FIG. 1 It is a diagram which shows the detection result of the fluorescence amount of the sample of a microarray by the fluorescence detection apparatus of Example 2 of this invention which set the irradiation angle of the excitation light with respect to a sample to 55 degrees. It is a diagram which shows the detection result of the fluorescence amount of the sample of a microarray by the fluorescence detection apparatus of the comparative example 1 which made the irradiation angle of the excitation light with respect to a sample 70 degrees. It is a diagram which shows the detection result of the fluorescence amount of the sample of a microarray by the common coaxial epifluorescence microscope which uses the high pressure mercury lamp for the excitation light source of the comparative example 2.
  • FIG. 1 It is a diagram which shows the detection result of the fluorescence amount of the sample of a microarray by the fluorescence detection apparatus of Example 2 of this invention which set the irradiation angle of the excitation light with respect to a sample to 55 degrees. It is a diagram which shows
  • FIG. 1 is a schematic plan view of a microarray applied to a fluorescence detection apparatus according to an embodiment of the present invention. Note that the applied microarray is not limited to the microarray of FIG. 1, and various microarrays in which thick samples are arranged can be applied to the fluorescence detection apparatus of the embodiment of the present invention.
  • the microarray 1 in FIG. 1 has a plate-like member 2 that does not transmit light.
  • a plurality of samples 4 are arranged so as to penetrate between both surfaces of the member 2.
  • the shape of the sample 4 is not particularly limited, but preferably has a circular cross section.
  • an ecological substance that can be a probe that hybridizes with the specimen is fixed.
  • the probe is fixed directly inside the sample 4 or indirectly through a gel.
  • the material of the member 2 is not particularly limited, but for example, a material in which carbon black is kneaded into a resin such as acrylic, polycarbonate, urethane, or the like, which hardly reflects light and is not easily transmitted.
  • the gel used for immobilizing the probe is not particularly limited.
  • Polymerized gels can be mentioned.
  • examples of the gel that can be used for the microarray 1 include gels such as agarose, alginic acid, dextran, polyvinyl alcohol, and polyethylene glycol, and gels obtained by crosslinking these.
  • Such a microarray 1 can be manufactured by a method as described in Japanese Patent Laid-Open No. 2000-270878.
  • the fluorescence detection apparatus may measure one microarray 1 alone, or may measure a plurality of microarrays 1 arranged in each section of a container (so-called well plate) divided into a plurality of sections. .
  • FIG. 2 is a drawing schematically showing a configuration of a fluorescence detection apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • the fluorescence detection apparatus 6 includes a loading stage 8 on which the microarray 1 is loaded. Above the loading stage 8, transmitted light irradiation means 10 for irradiating transmitted light that passes through the gel in the microarray 1 is provided. Further, below the loading stage 8, excitation light irradiation means 12 that irradiates excitation light obliquely below the microarray 1 and irradiation angle adjustment means 14 that adjusts the irradiation angle of the excitation light irradiated on the sample 4 of the microarray 1. Is provided.
  • a condenser lens 16 that condenses the transmitted light that has passed through the gel in the microarray 1 and the fluorescence from the microarray 1 is provided below the loading stage 8.
  • the condenser lens 16 is arranged so that the optical axis is orthogonal to the surface direction of the microarray 1 installed on the stacking stage 8.
  • detection means 18 for detecting transmitted light and fluorescence focused by the condenser lens 16.
  • the detection means 18 transmits fluorescence emitted from the sample 4 in the microarray 1 and does not transmit excitation light that excites the fluorescent substance so that excitation light or disturbance light does not enter the detection means 18.
  • the filter 20 is provided.
  • the transmitted light irradiation means 10, the loading stage 8, the condenser lens 16 and the detection means 18 are arranged on the optical axis of the condenser lens 16 in this order. Further, the excitation light irradiating means 12 prevents the detection means 18 from entering the optical path of the excitation light, that is, directly from the position where the excitation light does not enter the condenser lens 16 or through a light guide means such as an optical fiber. It is installed so as to indirectly irradiate the microarray 1 with excitation light.
  • the transmitted light irradiating means 10 is a condensing lens so that transmitted light can be irradiated perpendicularly to the surface of the microarray 1 from above the microarray 1 mounted on the stacking stage 8. It is arranged on 16 optical axes.
  • the type of the light source used for the transmitted light irradiation means 10 is not particularly limited, but a light source capable of emitting light having a wavelength that passes through the fluorescent filter 20 is used.
  • the sample 4 contains the fluorescent dye Cy5 (fluoresce at 660 nm when irradiated with excitation light at 650 nm)
  • the fluorescent filter 20 is used.
  • a light source capable of emitting light with a wavelength of 658 to 665 nm is used for the transmitted light irradiation means 10.
  • the light source used as the transmitted light irradiation means 10 for example, a halogen lamp, LED, laser, or the like can be used. Among these, a surface irradiation type LED capable of irradiating the entire sample 4 of the microarray 1 with transmitted light is preferable.
  • the intensity of the transmitted light irradiated from the transmitted light irradiation means 10 and the distance from the transmitted light irradiation means 10 to the microarray 1 or the condenser lens 16 are set so that the transmitted light can reach the condenser lens 16.
  • a diffuser plate 22 that diffuses the transmitted light emitted from the transmitted light irradiating means 10 is connected to the transmitted light irradiating means 10 and the microarray in order to suppress unevenness in the amount of light when the transmitted light reaches the microarray 1. You may arrange
  • the diffusion plate 22 is configured by, for example, a white acrylic plate, a transparent glass plate with paper attached thereto, or the like.
  • the diffusion plate 22 is supported by the diffusion plate moving means 24.
  • the diffusing plate moving unit 24 moves the diffusing plate 22 in and out of the optical path of the transmitted light from the transmitted light irradiating unit 10 toward the sample 4.
  • the diffusion plate moving means 24 is constituted by a rotary solenoid or a DC motor.
  • the diffusing plate 22 is connected to the drive shaft of the diffusing plate moving means 24 through a speed reduction mechanism or directly, and moves from the transmitted light irradiation means 10 to the sample 4 in accordance with the operation of the diffusing plate moving means 24. It is movable between the position on the optical path of the transmitted light and the position deviated from the optical path of the transmitted light from the transmitted light irradiation means 10 toward the sample 4.
  • the loading stage 8 loads the microarray 1 to be measured.
  • the loading stage 8 is provided with a window or a hole so that transmitted light, excitation light, fluorescence emitted from the sample 4 and the like can pass therethrough.
  • the loading stage 8 may load a plurality of microarrays 1.
  • the loading stage 8 is supported by detection position adjusting means 26 for relatively moving the condenser lens 16 and detection means 18 and the microarray 1 in a direction perpendicular to the optical axis of the condenser lens 16.
  • the detection position adjusting unit 26 is configured using, for example, a two-axis XY stage for a microscope.
  • the loading stage 8 is supported by a focusing lens 28 for adjusting the distance between the focusing lens 16 and the detection unit 18 and the microarray 1 in the optical axis direction of the focusing lens 16.
  • the focus adjusting unit 28 is configured using, for example, a Z stage for a microscope, and moves the stacking stage 8 along the optical axis of the condenser lens 16.
  • Excitation light irradiation means The excitation light irradiation means 12 emits light of a wavelength component that excites the fluorescent substance in the sample 4 arranged in the microarray 1.
  • the excitation light irradiation means 12 an LED, a laser, a high-pressure mercury lamp, a xenon lamp, a metal halide, or the like can be used.
  • the light from the light source can be irradiated by being guided by a fiber or a lens.
  • the excitation light irradiation means 12 is supported by the irradiation angle adjustment means 14.
  • the illuminance distribution of the light emitted from the excitation light irradiation means 12 is preferably as uniform as possible, and can be corrected by a known method such as shading correction. Further, it is preferable that the intensity of the light emitted from the excitation light irradiation means 12 is as strong as possible.
  • the excitation filter 30 is disposed between the excitation light irradiation means 12 and the microarray 1. Is done.
  • the excitation filter 30 transmits only light having a wavelength component that excites the fluorescent substance in the sample 4 and cuts light having other wavelength components.
  • the sample 4 when using Cy5 (fluorescent light of 660 nm when irradiated with excitation light of 650 nm) as a fluorescent dye, the sample 4 is irradiated with only excitation light, and therefore, an excitation filter that passes only light having a wavelength of around 650 nm. 30 is used. This prevents light having a wavelength of 660 nm from being applied to the microarray 1, thereby preventing light having a wavelength of 660 nm reflected from the surface of the microarray 1 from entering the condenser lens 16 and increasing the background. be able to.
  • Cy5 fluorescent light of 660 nm when irradiated with excitation light of 650 nm
  • FIG. 3 is an enlarged side view showing the irradiation angle of the excitation light on the sample 4 in the fluorescence detection device 6 according to the embodiment of the present invention.
  • the “irradiation angle” refers to an irradiation angle with respect to the lower surface of the sample 4 of the microarray 1 loaded on the loading stage 8 ( ⁇ in FIG. 3). That is, with the position of the microarray 1 in the horizontal plane of the loading stage 8 set so that the center axis of the sample 4 and the optical axis of the condenser lens 16 coincide with each other, the excitation light irradiation means 12 is applied to the lower surface of the sample 4. Excitation light is irradiated at an irradiation angle ⁇ .
  • the irradiation angle ⁇ of the excitation light applied to the sample 4 from the excitation light irradiation means 12 is preferably within a range of 15 to 60 ° with respect to the lower surface of the sample 4.
  • the irradiation angle ⁇ is more preferably in the range of 15 to 55 °, and further preferably in the range of 15 to 45 °.
  • the irradiation angle ⁇ of the excitation light may be adjusted so that the irradiation angle ⁇ satisfies the following formula.
  • t represents the thickness (mm) of the sample 4
  • y represents the major axis or diameter (mm) of the sample 4.
  • the thickness t of the sample 4 is preferably in the range of 0.1 to 1 mm.
  • the thickness t of the sample 4 is more preferably 0.1 to 0.5 mm, and further preferably 0.1 to 0.25 mm.
  • the diameter y of the sample 4 may be in a range in which the preferable irradiation angle ⁇ can be realized.
  • the irradiation angle ⁇ of the excitation light applied to the sample 4 from the excitation light irradiation unit 12 is adjusted by the irradiation angle adjustment unit 14.
  • the irradiation angle adjusting means 14 is for rotating the excitation light irradiating means 12 along an arc centered on the lower surface of the sample 4 irradiated with the excitation light, and is constituted by, for example, a manual or automatic goniostage. Is done.
  • the irradiation angle adjusting unit 14 rotates the excitation light irradiation unit 12 manually or automatically so as to realize the irradiation angle ⁇ determined according to the thickness t of the sample 4 as described above.
  • the sample 4 Since it is preferable to irradiate the sample 4 with uniform excitation light while suppressing the irradiation distribution, it is preferable to provide a plurality (two or more) of excitation light irradiation means 21.
  • the number of the excitation light irradiation means 12 is not particularly limited. However, since it is difficult to obtain further improvement even if the number is more than 8, it is preferable to provide 2 to 8 excitation light irradiation means 12. .
  • the respective excitation light irradiation means 12 are evenly arranged on the circumference around the optical axis of the condenser lens 16.
  • the excitation light irradiation means 12 are arranged at intervals of 90 ° on the circumference around the optical axis of the condenser lens 16.
  • annular excitation light irradiation means 12 may be disposed around the condenser lens 16.
  • the annular excitation light irradiation means 12 is configured, for example, by mounting light sources at high density on an annular substrate having flexibility.
  • the annular excitation light irradiation means 12 is arranged so that the center axis of the annular shape is orthogonal to the surface direction of the microarray 1.
  • the irradiation angle adjusting means 14 changes the inclination of the flexible annular substrate so as to realize the irradiation angle ⁇ determined according to the thickness t of the microarray as described above.
  • This annular excitation light irradiation means can also suppress the irradiation distribution of the excitation light irradiated on the sample 4.
  • the distance between the excitation light irradiation means 12 and the microarray 1 can be appropriately selected according to the intensity of the excitation light to be irradiated, the number of the excitation light irradiation means 12 and the like.
  • the excitation light irradiating means 12 enters the field of the condensing lens 16. It is preferable to keep the distance so as not to enter.
  • (2-4) Condensing Lens As the condensing lens 16, an objective lens for a microscope or the like can be used. Since the microarray detection apparatus 1 is used to detect fluorescence emitted from the sample 4, it is preferable to use a lens with low autofluorescence designed for a fluorescence microscope as the condenser lens 16.
  • the type of the condensing lens 16 is not particularly limited, but in order to avoid the excitation light irradiated from the excitation light irradiating means 12 being shielded by the condensing lens 16, the working distance (focus on the microarray 1) is selected.
  • the distance between the microarray 1 and the tip of the condensing lens 16 is long, and it is preferable to use a lens having a thin outer diameter.
  • Detection means As the detection means 18, a CCD sensor, a CMOS sensor, a line sensor, or the like can be used. In particular, a cooling CCD camera having a sensor cooling function is preferably used as the detection means 18 so that the weak fluorescence emitted from the sample 4 of the microarray 1 can be detected or imaged with little noise.
  • the detection means 18 is combined with a lens barrel (not shown) so that the optical axis of the detection means 18 is aligned with the optical axis of the condenser lens 16 (is arranged in a straight line on the optical axis). 6 is incorporated.
  • a fluorescence filter 20 for transmitting fluorescence emitted from the sample 4 of the microarray 1 and not transmitting excitation light for exciting the fluorescent substance may be disposed in the detection means 18.
  • Cy5 fluorescent light of 660 nm when irradiated with excitation light of 650 nm
  • reflected excitation light, light entering from outside the sample 4 or the like does not enter the detection means 18.
  • a filter that passes only light of 658 to 665 nm is used as the fluorescent filter 20.
  • Fluorescence (captured image) detected by the detection means 18 is sent to a computing device such as a personal computer, and image analysis and data processing are performed according to an arbitrary algorithm.
  • image analysis and data processing are performed according to an arbitrary algorithm.
  • the gradation value for each sample 4 of the microarray 1 is digitized and output as CSV data or the like.
  • Microarray detection method (3-1) Step of adjusting the focus position from the transmitted light image of the microarray obtained by irradiating the microarray with transmitted light
  • the microarray 1 is set on the loading stage 8, and the condenser lens
  • Move 25 Thereafter, the diffusion plate 22 is arranged on the optical path of the transmitted light from the transmitted light irradiation unit 10 toward the sample 4 by the diffusion plate moving unit 24.
  • the stacking stage 8 is moved between 0 and 1 mm along the optical axis of the condenser lens 16. While moving at a pitch of .05 mm, the detection means 18 captures a transmission image of the microarray 1 by the transmitted light that has passed through the sample 4 of the microarray 1. Then, the position of the stacking stage 25 when the transmission image having the highest contrast (maximum contrast) is captured is determined as the focal position where the focal point of the condenser lens 16 matches the sample 4. The transmitted light (transmitted image) detected at this focal position is sent to the arithmetic unit, and is used for the digitization process in the process described later in (3-4).
  • pixels in a region surrounded by a circle having a predetermined radius are measured (a numerical value indicating the brightness of light detected by the detecting means 18).
  • the fluorescence amount of the sample 4 of the microarray 1 is detected.
  • Step 3 Step of moving the loading stage
  • the loading stage 8 is moved by the detection position adjusting means 26 so that the sample 4 of each microarray 1 is moved.
  • the emitted fluorescence is detected. That is, after detecting the fluorescence emitted from the sample 4 of one microarray 1 by each step described above, the loading stage 8 is moved in the direction perpendicular to the optical axis of the condenser lens 16 by the detection position adjusting means 26, The microarray 1 on which fluorescence is not detected is arranged on the optical axis of the condenser lens 16. And the fluorescence emitted from the sample 4 of this microarray 1 is detected by each process mentioned above. Such movement of the loading stage 8 and detection of fluorescence emitted from the sample 4 of the microarray are repeated for all the microarrays 1 loaded on the loading stage 8.
  • Each hollow fiber in the obtained hollow fiber array is filled with a solution in which a dimethylacrylamide (3.8% by mass) gel precursor solution and a Cy5 fluorescent material diluted and adjusted at the concentration ratio shown in Table 1 are mixed. Then, the gel precursor solution and the Cy5 fluorescent material were polymerized. Thereafter, a microarray (capillary array sheet) was obtained by cutting out a 0.25 mm thick slice from the prismatic hollow fiber array along a direction perpendicular to the axial direction of the hollow fibers with a microtome. . The obtained microarray was placed on a slide glass and set on a loading stage with a cover glass in a state immersed in water.
  • a microarray capillary array sheet
  • Example 1 As described above, the microarray used in Example 1 has a sample thickness of 0.25 mm and a sample diameter of 0.18 mm. In this case, according to the above equation (1), the irradiation angle ⁇ is calculated to be about 20 °. Therefore, the excitation light irradiation means is arranged so that the excitation light is irradiated at an irradiation angle of 20 ° with respect to the surface of the microarray sample.
  • Four excitation light irradiating means were evenly arranged at intervals of 90 ° on the circumference centered on the optical axis of the condenser lens. When the distance between the condenser lens and the microarray was 21 mm, the light quantity distribution in the imaging range of the condenser lens was such that the light quantity difference was about 5% between the center and the periphery.
  • the loading stage is moved by 1 mm along the optical axis of the condenser lens at a pitch of 0.05 mm by the detecting means.
  • a transmission image by transmitted light that passed through the microarray sample was taken.
  • the position of the stacking stage when the transmission image having the highest contrast (maximum contrast) is captured is determined as the focus position.
  • the transmission image captured at this focus position was binarized based on a predetermined threshold value, and the barycentric coordinates of each sample were calculated.
  • FIG. 4 is a diagram showing the detection result of the fluorescence amount of the microarray sample by the fluorescence detection apparatus of Example 1 of the present invention in which the irradiation angle of the excitation light to the microarray sample is 20 °.
  • the horizontal axis indicates the concentration ratio of the Cy5 fluorescent substance
  • the vertical axis indicates the amount of fluorescence detected by the fluorescence detection device.
  • FIG. 5 is a diagram showing the detection result of the fluorescence amount of the microarray sample by the fluorescence detection apparatus of Example 2 of the present invention in which the irradiation angle of the excitation light to the microarray sample is 55 °.
  • the experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that the irradiation angle of the excitation light with respect to the microarray sample was set to 55 °.
  • Example 2 as shown in FIG. 5, high linearity was obtained between the concentration ratio of Cy5 and the detected fluorescence amount over the entire range of Cy5 concentration from 0.00032 to 1. That is, it was found that the fluorescence from the sample was detected very accurately by the fluorescence detection apparatus of Example 2.
  • FIG. 6 is a diagram showing the detection result of the fluorescence amount of the microarray sample by the fluorescence detection apparatus of Comparative Example 1 in which the irradiation angle of the excitation light to the microarray sample is 70 °.
  • the experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that the irradiation angle of the excitation light with respect to the microarray sample was set to 70 °.
  • Comparative Example 1 as shown in FIG. 6, in the range of Cy5 concentration from 0.0016 to 1, linearity was obtained between the concentration ratio of Cy5 and the detected fluorescence amount. When the concentration was in the range of 0.0016 or less, no linearity was obtained between the concentration ratio of Cy5 and the detected fluorescence amount. That is, in the fluorescence detection apparatus of Comparative Example 1, fluorescence from the sample was not accurately detected.
  • FIG. 7 is a diagram showing the detection result of the fluorescence amount of the sample of the microarray by a general coaxial epifluorescence microscope (Nikon ECLIPSE E600) using a high-pressure mercury lamp as an excitation light source in Comparative Example 2.
  • Comparative Example 2 since the apparatus background is high due to autofluorescence in the condenser lens, as shown in FIG. 7, when the Cy5 concentration is in the range from 0.0016 to 1, the concentration ratio of Cy5 is detected. Although the linearity was obtained between the fluorescence amount and the Cy5 concentration was 0.0016 or less, the linearity was not obtained between the concentration ratio of Cy5 and the detected fluorescence amount. That is, in the fluorescence microscope of Comparative Example 2, the fluorescence from the sample was not accurately detected.

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Abstract

　試料に対する励起光の照射方向に対して厚みのある試料が配置されたマイクロアレイを使用する場合でも、試料からの蛍光強度を正確に検出することができる蛍光検出装置を提供することを目的とする。本発明に係る蛍光検出装置(6)は、蛍光物質を含む透光性の試料(4)からの蛍光を検出する蛍光検出装置であって、試料に励起光を照射する励起光照射手段(12)と、試料からの蛍光を検出する検出手段(18)と、試料に対する励起光の照射角を試料の寸法に応じて調整する照射角調整手段(14)と、を備えている。

Description

蛍光検出装置及び蛍光検出方法
　本発明は、蛍光検出装置及びそれを用いた蛍光検出方法に関する。
　マイクロアレイとは、検査・実験の対象物を多数固定化しておき、これに対して一度に検査・実験を行うための材料または技術を指す総称である。特に生物学・医学・薬学の方面で、２０世紀末から核酸を対象とするＤＮＡマイクロアレイを中心として開発が進み、利用されるようになってきた。
　例えば、ＤＮＡマイクロアレイを利用する場合、サンプルからｍＲＮＡを抽出し、逆転写によって合成したｃＤＮＡをビオチン標識して、ＤＮＡマイクロアレイの基板上のＤＮＡとハイブリダイゼーションを行う。そして、ハイブリダイゼーションにより形成された試料に励起光を照射し、試料に含まれる蛍光物質が発する蛍光強度を蛍光顕微鏡や蛍光レーザースキャナー等で検出する。検出された蛍光強度に基づき、ｍＲＮＡの発現量を判定することができる。
　マイクロアレイに配置された試料に励起光を照射し、試料からの蛍光を検出する蛍光検出装置には、一般的に、同軸落射方式と非同軸落射方式との２種類の方式がある。同軸落射方式では、励起光の光路上に設置された集光レンズを通して試料に励起光を照射し、且つ、励起光によって励起された試料からの蛍光を同じ集光レンズで集光して撮像素子に合焦させる。
　この同軸落射方式では、励起光が集光レンズを通過する際に発生する集光レンズの自家蛍光によって装置バックグラウンドが上昇するので、試料からの微弱な蛍光を正確に検出することが困難である。
　そこで、同軸落射方式の欠点を改善した装置として、特許文献１に示すような非同軸落射方式が知られている。特許文献１に記載された装置では、試料に斜め下方から励起光を照射し、この励起光の光軸に重ならないように試料の下方に配置されたレンズにより試料からの蛍光を集光する。この装置では、励起光がレンズを通過しないため、レンズの自家蛍光の発生が防止される。
特開２００５－６２０２３号公報
　スライドガラス等の平面基板の表面に試料を配置したマイクロアレイを使用する場合、試料に対する励起光の照射方向に対して試料の厚みが小さいので、特許文献１に記載されたような従来の装置により、励起光を試料中に十分に進入させることができ、試料からの蛍光強度を正確に検出することが可能である。
　しかしながら、平板状の部材に形成された貫通孔中に試料が充填されたマイクロアレイ（例えば、三菱レイヨン社製の繊維型ＤＮＡチップ（ジェノパール（登録商標）；特許第４１５０３３０号公報、特許第３６５４８９４号公報等））を使用する場合、励起光の照射方向に対して試料の厚みが大きいので、特許文献１に記載されているような従来の装置では、励起光が試料中に十分に進入せず、試料からの蛍光強度を正確に検出することができない。
　従って、本発明の主な目的は、試料に対する励起光の照射方向に対して厚みのある試料が配置されたマイクロアレイを使用する場合でも、試料からの蛍光強度を正確に検出することができる蛍光検出装置及び蛍光検出方法を提供することにある。
　上記の目的を達成するため、本発明の第１発明によれば、蛍光検出装置は、蛍光物質を含む透光性の試料からの蛍光を検出する蛍光検出装置であって、試料に励起光を照射する励起光照射手段と、試料からの蛍光を検出する検出手段と、試料に対する励起光の照射角を試料の寸法に応じて調整する照射角調整手段と、を備えていることを特徴とする。
　また、本発明の第１発明において、好ましくは、照射角調整手段は、試料に対する励起光の照射角θが以下の式を満たすように、励起光の照射角を調整する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 （ここで、ｔは試料の厚みであり、ｙは試料の幅である。）
　また、本発明の第１発明において、好ましくは、照射角調整手段は、試料の厚みが０．１～１ｍｍである場合、試料に対する励起光の照射角θが１５～６０°の範囲内となるように、励起光の照射角を調整する。
　また、本発明の第１発明において、好ましくは、蛍光検出装置は、試料から検出手段に向かう蛍光の光路上に配置され、蛍光を検出手段に合焦する集光レンズを備え、励起光照射手段は、集光レンズの光軸を中心とした円周上に均等な角度間隔にて配置された複数の励起光照射手段、又は、集光レンズの周囲に配置された円環型の励起光照射手段により構成される。
　また、本発明の第１発明において、好ましくは、蛍光検出装置は、集光レンズ及び検出手段と、試料が配置されたマイクロアレイとの、集光レンズの光軸方向における距離を調整する、焦点調整手段を備える。
　また、本発明の第１発明において、好ましくは、蛍光検出装置は、集光レンズ及び検出手段と、試料が配置されたマイクロアレイとを、集光レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させる、検出位置調整手段を備える。
　また、本発明の第１発明において、好ましくは、蛍光検出装置は、更に、試料を透過する透過光を試料に照射する透過光照射手段を備え、検出手段は、試料を透過した透過光の光路上に配置され、当該試料を透過した透過光を検出する。
　また、本発明の第１発明において、好ましくは、蛍光検出装置は、更に、透過光照射手段から出射された透過光を拡散するための拡散板を備え、拡散板は、透過光照射手段から試料に向かう透過光の光路上に配置される。
　また、本発明の第１発明において、好ましくは、蛍光検出装置は、更に、透過光照射手段から試料に向かう透過光の光路上から拡散板を出し入れする拡散板移動手段を備える。
　また、本発明の第２発明によれば、蛍光検出方法は、本発明の第１発明による蛍光検出装置を使用する蛍光検出方法であって、励起光照射手段により励起光を試料に照射し、当該試料に含まれる蛍光物質を励起する工程と、励起された蛍光物質から発せられた蛍光を検出手段により検出する工程と、を含む。
　また、本発明の第２発明において、好ましくは、蛍光検出装置は、試料から検出手段に向かう蛍光の光路上に配置され、蛍光を検出手段に合焦する集光レンズと、集光レンズ及び検出手段と、試料が配置されたマイクロアレイとの、集光レンズの光軸方向における距離を調整する、焦点調整手段と、を備え、蛍光検出方法は、焦点調整手段により、集光レンズ及び検出手段と、マイクロアレイとの、集光レンズの光軸方向における距離を調整して、集光レンズの焦点を試料に合わせる工程を含み、集光レンズの焦点を試料に合わせる工程の後、励起光を試料に照射する工程を実行する。
　また、本発明の第２発明において、好ましくは、蛍光検出装置は、試料を透過する透過光を試料に照射する透過光照射手段を備え、集光レンズの焦点を試料に合わせる工程は、透過光照射手段により、透過光を試料に照射する工程と、焦点調整手段により、集光レンズ及び検出手段と、マイクロアレイとの、集光レンズの光軸方向における距離を段階的に変化させながら、試料を透過した透過光を検出手段により検出する工程と、検出手段により検出された透過光の画像に基づき、集光レンズの焦点が試料に合う位置を判定する工程と、を含む。
　また、本発明の第２発明において、好ましくは、蛍光検出装置は、集光レンズ及び検出手段と、マイクロアレイとを、集光レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させる、検出位置調整手段を備え、蛍光を検出する工程は、検出位置調整手段により、集光レンズ及び検出手段と、マイクロアレイとを、集光レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させる工程と、検出位置調整手段による移動の度に、励起された蛍光物質から発せられた蛍光を検出する工程と、を含む。
　また、本発明の第２発明において、好ましくは、蛍光検出装置は、透過光照射手段から出射された透過光を拡散するための拡散板を備え、透過光を試料に照射する工程は、拡散板を、透過光照射手段から試料に向かう透過光の光路上に配置する工程を含み、励起光を照射する工程は、拡散板を、透過光照射手段から試料に向かう透過光の光路上から取り除く工程を含む。
　本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法によれば、集光レンズの自家蛍光による装置バックグラウンド上昇を抑制することができるとともに、試料に対する励起光の照射方向に対して厚みのある試料が配置されたマイクロアレイを使用する場合でも、試料からの蛍光強度を正確に検出することができる。
本発明の実施形態による蛍光検出装置に適用されるマイクロアレイの概略的な平面図である。 本発明の実施形態による蛍光検出装置の構成を示す概略的な図面である。 本発明の実施形態による蛍光検出装置における、試料に対する励起光の照射角を示す拡大側面図である。 試料に対する励起光の照射角を２０°とした本発明の実施例１の蛍光検出装置による、マイクロアレイの試料の蛍光量の検出結果を示す線図である。 試料に対する励起光の照射角を５５°とした本発明の実施例２の蛍光検出装置による、マイクロアレイの試料の蛍光量の検出結果を示す線図である。 試料に対する励起光の照射角を７０°とした比較例１の蛍光検出装置による、マイクロアレイの試料の蛍光量の検出結果を示す線図である。 比較例２の、励起光源に高圧水銀ランプを使用した一般的な同軸落射方式の蛍光顕微鏡による、マイクロアレイの試料の蛍光量の検出結果を示す線図である。
　（１）マイクロアレイ
　まず、図１により、本発明の実施形態の蛍光検出装置に適用されるマイクロアレイの一例について説明する。図１は、本発明の実施形態の蛍光検出装置に適用されるマイクロアレイの概略的な平面図である。なお、適用されるマイクロアレイは、図１のマイクロアレイに制限されるものではなく、厚みのある試料が配置された各種のマイクロアレイを本発明の実施形態の蛍光検出装置に適用できる。
　例えば、図１のマイクロアレイ１は、光を透過しない平板状の部材２を有する。この部材２には、部材２の両面間を貫通するように複数の試料４が配置されている。試料４の形状は特に制限されるものではないが、円形断面を有することが好ましい。試料４には、検体とハイブリダイゼーションするプローブとなりうる生態関連物質が固定されている。プローブは、試料４の内部に直接的に、又はゲルを介して間接的に固定されている。部材２の材質は特に限定されないが、例えば、アクリル、ポリカーボネート、ウレタン等の樹脂にカーボンブラックを練り込んだ、光を反射し難く且つ透過し難い材質が好ましい。
　プローブの固定に使用されるゲルは特に限定されないが、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ－アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ－メチロールアクリルアミド、Ｎ－ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の少なくとも一種以上と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体とを共重合したゲルが挙げられる。その他、マイクロアレイ１に用いることのできるゲルとしては、例えば、アガロース、アルギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等のゲル、又はこれらを架橋したゲルが挙げられる。
　このようなマイクロアレイ１は、特開２０００－２７０８７８号公報に記載されたような方法によって製造することが可能である。蛍光検出装置は、１枚のマイクロアレイ１を単独で測定してもよく、あるいは、複数区画に分割された容器（いわゆるウェルプレート）の各区画に配置された複数のマイクロアレイ１を測定してもよい。
　（２）蛍光検出装置
　次に、図２及び図３を参照して、本発明の好ましい実施形態の蛍光検出装置の構成について説明する。図２は、本発明の実施形態による蛍光検出装置の構成を概略的に示す図面である。
　図２に示すように、蛍光検出装置６は、マイクロアレイ１を積載する積載ステージ８を備えている。積載ステージ８の上方には、マイクロアレイ１中のゲルを透過する透過光を照射する透過光照射手段１０が設けられている。また、積載ステージ８の下方には、マイクロアレイ１の斜め下方から励起光を照射する励起光照射手段１２と、マイクロアレイ１の試料４に照射される励起光の照射角を調整する照射角調整手段１４が設けられている。さらに、積載ステージ８の下方には、マイクロアレイ１中のゲルを透過した透過光及びマイクロアレイ１からの蛍光を集光する集光レンズ１６が設けられている。集光レンズ１６は、積載ステージ８上に設置されたマイクロアレイ１の面方向に対して光軸が直交するように配置される。この集光レンズ１６の下方には、集光レンズ１６によって合焦された透過光及び蛍光を検出する検出手段１８が設けられている。検出手段１８は、励起光や外乱光が検出手段１８に入射しないようにするために、マイクロアレイ１中の試料４から発せられる蛍光を透過させ、且つ、蛍光物質を励起させる励起光を透過させない蛍光用フィルター２０を備えている。
　透過光照射手段１０、積載ステージ８、集光レンズ１６及び検出手段１８は、この順序にて集光レンズ１６の光軸上に配置される。また、励起光照射手段１２は、励起光の光路に検出手段１８が入らないように、即ち、励起光が集光レンズ１６に直接入射しない位置から、直接的に又は光ファイバー等の導光手段を通して間接的に励起光をマイクロアレイ１に照射するように設置されている。
　（２－１）透過光照射手段
　透過光照射手段１０は、積載ステージ８上に積載されたマイクロアレイ１の上方から、マイクロアレイ１の表面に対して垂直に透過光を照射できるように、集光レンズ１６の光軸上に配置される。
　透過光照射手段１０に用いる光源の種類は特には限定されないが、蛍光用フィルター２０を透過する波長の光を出射可能な光源を使用する。
　例えば、試料４が蛍光色素Ｃｙ５（６５０ｎｍの励起光を照射すると、６６０ｎｍの蛍光を発する）を含む場合、この試料４からの蛍光のみを検出手段１８に到達させるため、６５８～６６５ｎｍの光だけ通過させるような蛍光用フィルター２０を使用する。この場合には、波長が６５８～６６５ｎｍの光を出射可能な光源を、透過光照射手段１０に使用する。
　透過光照射手段１０として使用する光源としては、例えば、ハロゲンランプ、ＬＥＤ、レーザー等を使用することができる。これらの中でも、マイクロアレイ１の試料４全体に透過光を照射可能な、面照射用タイプのＬＥＤが好ましい。
　透過光照射手段１０から照射される透過光の強さや、透過光照射手段１０からマイクロアレイ１又は集光レンズ１６までの距離は、集光レンズ１６に透過光を到達させることができるように設定される。
　また、必要に応じて、透過光がマイクロアレイ１に到達する際の光量斑を抑えるために、透過光照射手段１０から出射された透過光を拡散する拡散板２２を、透過光照射手段１０とマイクロアレイ１との間に配置してもよい。拡散板２２は、例えば白色のアクリル板や、紙を貼り付けた透明ガラス板等により構成される。
　この拡散板２２は、拡散板移動手段２４により支持されている。拡散板移動手段２４は、透過光照射手段１０から試料４に向かう透過光の光路上から拡散板２２を出し入れする。この拡散板移動手段２４は、ロータリーソレノイドやＤＣモータにより構成される。拡散板２２は、減速機構を介して、あるいは直接的に拡散板移動手段２４の駆動軸に連結されており、拡散板移動手段２４の動作に応じて、透過光照射手段１０から試料４に向かう透過光の光路上の位置と、透過光照射手段１０から試料４に向かう透過光の光路から外れた位置との間で、移動可能となっている。
　（２－２）積載ステージ
　積載ステージ８は、測定対象となるマイクロアレイ１を積載する。積載ステージ８には、透過光や励起光、試料４から発せられる蛍光等を通過させられるように、窓が設けられ、又は、孔が形成されている。積載ステージ８は、複数のマイクロアレイ１を積載してもよい。
　積載ステージ８は、集光レンズ１６及び検出手段１８と、マイクロアレイ１とを、集光レンズ１６の光軸と直交する方向に相対的に移動させるための検出位置調整手段２６により支持される。この検出位置調整手段２６は、例えば、顕微鏡用の２軸のＸＹステージ等を利用して構成される。
　さらに、積載ステージ８は、集光レンズ１６及び検出手段１８と、マイクロアレイ１との、集光レンズ１６の光軸方向における距離を調整するための焦点調整手段２８により支持される。この焦点調整手段２８は、例えば、顕微鏡用のＺステージ等を利用して構成され、積載ステージ８を集光レンズ１６の光軸に沿って移動させる。
　（２－３）励起光照射手段
　励起光照射手段１２は、マイクロアレイ１に配置された試料４中の蛍光物質を励起する波長成分の光を出射する。例えば、励起光照射手段１２としては、ＬＥＤ、レーザー、高圧水銀ランプ、キセノン灯、メタルハライド等を使用することができる。さらには、光源からの光をファイバーやレンズ等で導光することにより照射することもできる。この励起光照射手段１２は、照射角調整手段１４により支持されている。
　励起光照射手段１２が出射する光の照度分布は、できるだけ均一であることが好ましく、例えばシェーディング補正のような公知の方法により補正することができる。また、励起光照射手段１２が出射する光の強度は、できるだけ強い方が好ましい。
　励起光照射手段１２から出射される励起光の波長成分を、試料４中の蛍光物質を励起させる波長成分に限定するため、励起光照射手段１２とマイクロアレイ１との間に励起用フィルター３０が配置される。この励起用フィルター３０は、試料４中の蛍光物質を励起させる波長成分の光だけを透過させ、その他の波長成分の光をカットする。
　例えば、蛍光色素としてＣｙ５（６５０ｎｍの励起光を照射すると、６６０ｎｍの蛍光を発する）を使用する場合、励起光のみを試料４に照射するため、波長が６５０ｎｍ前後の光だけを通過させる励起用フィルター３０を使用する。これにより、波長が６６０ｎｍの光がマイクロアレイ１に照射されないようにすることができるので、マイクロアレイ１の表面で反射した波長６６０ｎｍの光が集光レンズ１６に入射してバックグラウンドを上昇させるのを防ぐことができる。
　図３は、本発明の実施形態による蛍光検出装置６における、試料４に対する励起光の照射角を示す拡大側面図である。ここで「照射角」とは、積載ステージ８に積載されたマイクロアレイ１の試料４の下面に対する照射角を指す（図３中のθ）。すなわち、試料４の中心軸線と集光レンズ１６の光軸とが合致するように、積載ステージ８の水平面内におけるマイクロアレイ１の位置をセットした状態で、励起光照射手段１２から試料４の下面に照射角θで励起光が照射される。
　励起光照射手段１２から試料４に照射される励起光の照射角θは、試料４の下面に対して１５～６０°の範囲内であることが好ましい。照射角θを１５°以上とすることにより、励起光が集光レンズ１６に遮られたり、励起光照射手段１２と集光レンズ１６が接触したりすることを防止できる。また、照射角θを６０°以下とすることにより、厚みのある試料４に対しても励起光を十分に進入させ、試料４からの蛍光を正確に検出することができる。励起光の照射角θは、１５～５５°の範囲内であることがより好ましく、１５～４５°の範囲内であることが更に好ましい。
　また、照射角θが以下の式を満たすように、励起光の照射角θを調整してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 　ここで、「ｔ」は試料４の厚み（ｍｍ）、「ｙ」は試料４の長径又は直径（ｍｍ）を表す。試料４の厚みｔは、０．１～１ｍｍの範囲が好ましい。試料４の厚みｔは、より好ましくは０．１～０．５ｍｍであり、更に好ましくは０．１～０．２５ｍｍである。試料４の直径ｙは、上記の好ましい照射角θを実現可能な範囲であれば良い。
　励起光照射手段１２から試料４に照射される励起光の照射角θは、照射角調整手段１４により調整される。この照射角調整手段１４は、励起光照射手段１２を、励起光が照射される試料４の下面を中心とした円弧に沿って回転移動させるものであり、例えば、手動又は自動のゴニオステージにより構成される。
　この照射角調整手段１４は、上述したように試料４の厚みｔに応じて決定された照射角θを実現するように、手動又は自動により、励起光照射手段１２を回転移動させる。
　照射分布を抑えて均一な励起光を試料４に照射するのが好ましいので、複数（２個以上）の励起光照射手段２１を設けることが好ましい。励起光照射手段１２の個数は特に限定されるものではないが、８個より多くしても更なる効果の向上は得られにくいので、２～８個の励起光照射手段１２を設けることが好ましい。
　複数の励起光照射手段１２を用いる場合は、各励起光照射手段１２を、集光レンズ１６の光軸を中心とした円周上に均等に配置することが好ましい。例えば、４個の励起光照射手段１２を配置する場合、集光レンズ１６の光軸を中心とした円周上に、９０°間隔で各励起光照射手段１２を配置する。
　また、集光レンズ１６の周囲に円環型の励起光照射手段１２を配置してもよい。円環型の励起光照射手段１２は、例えば、柔軟性を有する円環状の基板に高密度に光源を実装することにより構成される。この場合、円環型の励起光照射手段１２は、円環形状の中心軸線がマイクロアレイ１の面方向と直交するように配置される。照射角調整手段１４は、上述したようにマイクロアレイの厚みｔに応じて決定された照射角θを実現するように、柔軟性を有する円環状の基板の傾斜を変化させる。この円環型の励起光照射手段によっても、試料４に照射される励起光の照射分布を抑えることが可能である。
　励起光照射手段１２とマイクロアレイ１との距離は、照射する励起光の強さや励起光照射手段１２の数等に応じて適宜選択することができる。励起光照射手段１２とマイクロアレイ１との距離が近いほど励起光の減衰が小さくなるので、励起光照射手段１２がマイクロアレイ１に近い方が好ましい。しかし、励起光照射手段１２とマイクロアレイ１との距離が近すぎると、集光レンズ１６の視野内に励起光照射手段１２が入ることになるため、励起光照射手段１２が集光レンズ１６の視野内に入らない程度の距離を保つことが好ましい。
　（２－４）集光レンズ
　集光レンズ１６としては、顕微鏡用の対物レンズ等を使用することができる。マイクロアレイ検出装置１は、試料４から発せられる蛍光の検出に使用されるので、蛍光顕微鏡用に設計された自家蛍光の少ないレンズを集光レンズ１６に使用することが好ましい。
　集光レンズ１６の種類は特に限定されるものではないが、励起光照射手段１２から照射された励起光が集光レンズ１６によって遮蔽されることを避けるため、作動距離（マイクロアレイ１に焦点を合わせたときのマイクロアレイ１と集光レンズ１６の先端との距離）が長く、外径の細いレンズを使用することが好ましい。
　（２－５）検出手段
　検出手段１８としては、ＣＣＤセンサ、ＣＭＯＳセンサ又はラインセンサ等を使用することができる。特に、マイクロアレイ１の試料４から発せられた微弱な蛍光を少ないノイズで検出又は撮像できるように、センサ冷却機能を備えた冷却ＣＣＤカメラを検出手段１８に用いることが好ましい。検出手段１８は、この検出手段１８の光軸が集光レンズ１６の光軸と整合する（光軸上に一直線に配置される）ように、鏡筒（図示せず）と合わせて蛍光検出装置６に組み込まれる。
　また、検出手段１８に、マイクロアレイ１の試料４から発せられる蛍光を透過させ、蛍光物質を励起させる励起光を透過させないようにするための蛍光用フィルター２０を配置してもよい。例えば、蛍光色素としてＣｙ５（６５０ｎｍの励起光を照射すると６６０ｎｍの蛍光を発する）を使用する場合、反射した励起光や試料４の外から入ってきた光等が検出手段１８に入らないように、例えば６５８～６６５ｎｍの光だけ通過させるようなフィルターを蛍光用フィルター２０として使用する。このように蛍光用フィルター２０を使用することにより、蛍光のみが検出手段１８に届くようにすることができる。
　検出手段１８によって検出された蛍光（撮像された画像）はパソコン等の演算装置に送られ、任意のアルゴリズムに従って画像解析、データ処理が行われる。データ処理では、マイクロアレイ１の各試料４毎の階調値を数値化してＣＳＶデータ等に出力することが行われる。
　（３）マイクロアレイの検出方法
　（３－１）マイクロアレイに透過光を照射することによって得られたマイクロアレイの透過光画像からピント位置を調整する工程
　マイクロアレイ１を積載ステージ８上にセットし、集光レンズ１６の先端とマイクロアレイ１との距離が集光レンズ１６の作動距離（集光レンズ１６の仕様により既知）となるように、焦点調整手段２８により、集光レンズ１６の光軸に沿って積載ステージ２５を移動させる。その後、拡散板移動手段２４により、透過光照射手段１０から試料４に向かう透過光の光路上に拡散板２２を配置する。次いで、拡散板２２を介して透過光照射手段１０がマイクロアレイ１に透過光を照射している状態で、例えば、積載ステージ８を、集光レンズ１６の光軸に沿って前後１ｍｍの間を０．０５ｍｍピッチで移動させながら、検出手段１８により、マイクロアレイ１の試料４を透過した透過光によるマイクロアレイ１の透過画像を撮像する。そして、最もコントラストが高い（コントラストが極大）透過画像が撮像されたときの積載ステージ２５の位置を、集光レンズ１６の焦点が試料４に合う焦点位置として決定する。この焦点位置で検出された透過光（透過画像）は、演算装置へ送られ、（３－４）にて後述する工程で数値化処理に使用される。
　（３－２）マイクロアレイの試料に励起光を照射することにより、試料に結合した蛍光物質を励起する工程
　続いて、透過光照射手段１０による透過光の照射を停止し、拡散板移動手段２４により、透過光照射手段１０から試料４に向かう透過光の光路上から拡散板２２を抜去する。次いで、励起光照射手段１２によりマイクロアレイ１の試料４に励起光を照射する。このときの励起光の照射角等の条件は上述した通りである。励起光を試料４に照射することによって、試料４に結合した蛍光物質を励起することができる。
　（３－３）励起された試料からの蛍光を検出する工程
　励起光照射手段１２により励起光を照射している状態で、検出手段１８により、マイクロアレイ１の試料４による蛍光を検出（蛍光画像を撮像）する。ここで検出した蛍光（撮像した蛍光画像）は演算装置へ送られ、（３－４）にて後述する工程で数値化処理に供される。
　（３－４）数値化処理を行う工程
　（３－１）にて上述した工程において、透過光は、マイクロアレイ１の試料４の部分のみを透過し、光を透過しない部材２を含むその他の部分を透過しない。従って、（３－１）の工程で得られた透過画像を、任意に設定した閾値に基づいて２値化すると、試料４の部分は“１”、光を透過しない部材２を含むその他の部分は“０”で表現される。この２値化した画像から、各試料４の重心座標を算出し記憶する。
　次いで、（３－３）にて上述した工程で得られた蛍光画像において、各試料４の重心座標を中心とする所定半径（マイクロアレイ１の試料４の内径）の円に囲まれた領域の画素の階調値（検出手段１８により検出された光の明るさを示す数値）を測定する。これにより、マイクロアレイ１の試料４の蛍光量が検出される。
　（３－５）積載ステージを移動させる工程
　積載ステージ８が複数のマイクロアレイ１を積載している場合には、検出位置調整手段２６によって積載ステージ８を移動させることにより、各マイクロアレイ１の試料４から発せられる蛍光を検出する。即ち、上述した各工程により、１つのマイクロアレイ１の試料４から発せられる蛍光を検出した後、検出位置調整手段２６により、集光レンズ１６の光軸と直交する方向に積載ステージ８を移動させ、蛍光の検出が行われていないマイクロアレイ１を集光レンズ１６の光軸上に配置する。そして、上述した各工程により、このマイクロアレイ１の試料４から発せられる蛍光を検出する。このような積載ステージ８の移動とマイクロアレイの試料４から発せられる蛍光の検出とを、積載ステージ８に積載された全てのマイクロアレイ１について繰り返す。
　以下、本発明の実施例である。
　１．マイクロアレイの作製
　まず、厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を準備した。この多孔板の中央部には、直径０．３２ｍｍの貫通孔が、０．４２ｍｍの間隔を空けて、５行×５列の格子状に合計２５個配列されている。これらの多孔板の全ての貫通孔に、カーボンブラックで着色したポリカーボネート製中空繊維（外径０．２８ｍｍ、内径０．１８ｍｍ、長さ５００ｍｍ）を通過させた。この中空繊維を通過させた２枚の多孔板を互いから５０ｍｍ離間させ、それらの離間した多孔板間に、カーボンブラックで着色したポリウレタン樹脂を充填することにより、両端に樹脂で固定化されない部分を有する、２０ｍｍ角で長さ５０ｍｍの角柱状の中空繊維配列体を得た。
　得られた中空繊維配列体中の各中空繊維内に、ジメチルアクリルアミド（３．８質量％）ゲル前駆体溶液と表１に示す濃度比率で希釈・調整したＣｙ５蛍光物質とを混合した溶液を充填し、ゲル前駆体溶液とＣｙ５蛍光物質とを重合させた。その後、ミクロトームにて、中空繊維の軸線方向と直交する方向に沿って、角柱状の中空繊維配列体から厚さ０．２５ｍｍの薄片を切り出すことにより、マイクロアレイ（キャピラリー・アレイ・シート）を得た。得られたマイクロアレイをスライドガラス上に置き、水に浸した状態でカバーガラスをかけて積載ステージ上にセットした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　２．蛍光検出装置構成
　図１に示したような蛍光検出装置を、表２に示す部品により構成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　＜実施例１＞
　本実施例１で使用したマイクロアレイは、上述した通り、試料の厚さが０．２５ｍｍ、試料の直径が０．１８ｍｍである。この場合、上述の式（１）によれば、照射角θは約２０°と算出される。そこで、励起光照射手段を、励起光がマイクロアレイの試料の表面に対して２０°の照射角で照射されるように配置した。４個の励起光照射手段を、集光レンズの光軸を中心とした円周上に、９０°間隔で均等に配置した。集光レンズとマイクロアレイとの距離を２１ｍｍとした際に、集光レンズの撮像範囲内の光量分布が中央と周辺で約５％程度の光量差となるようにした。
　まず、透過光照射手段によりマイクロアレイの試料に透過光のみを照射した状態で、積載ステージを、集光レンズの光軸に沿って前後１ｍｍの間を０．０５ｍｍピッチで移動させながら、検出手段により、マイクロアレイの試料を透過した透過光による透過画像を撮像した。そして、最もコントラストが高い（コントラストが極大）透過画像が撮像されたときの積載ステージの位置をピント位置として決定した。また、このピント位置で撮像された透過画像を、所定の閾値に基づいて２値化し、各試料の重心座標を算出した。
　図４は、マイクロアレイの試料に対する励起光の照射角を２０°とした本発明の実施例１の蛍光検出装置による、マイクロアレイの試料の蛍光量の検出結果を示す線図である。この図４において、横軸はＣｙ５蛍光物質の濃度比率を示し、縦軸は蛍光検出装置により検出された蛍光量を示す。本実施例１の蛍光検出装置によりマイクロアレイの試料による蛍光を検出した結果、図４に示すように、Ｃｙ５の濃度比率が０．０００３２から１までの範囲全体にわたって、Ｃｙ５の濃度比率と検出された蛍光量との間に高い直線性が得られた。すなわち、実施例１の蛍光検出装置により、試料からの蛍光が非常に正確に検出されたことが分かった。
　＜実施例２＞
　図５は、マイクロアレイの試料に対する励起光の照射角を５５°とした本発明の実施例２の蛍光検出装置による、マイクロアレイの試料の蛍光量の検出結果を示す線図である。マイクロアレイの試料に対する励起光の照射角を５５°とした以外は、実施例１と同様に実験を行った。この実施例２では、図５に示すように、Ｃｙ５濃度が０．０００３２から１までの範囲全体にわたって、Ｃｙ５の濃度比率と検出された蛍光量との間に高い直線性が得られた。すなわち、実施例２の蛍光検出装置により、試料からの蛍光が非常に正確に検出されたことが分かった。
　＜比較例１＞
　図６は、マイクロアレイの試料に対する励起光の照射角を７０°とした比較例１の蛍光検出装置による、マイクロアレイの試料の蛍光量の検出結果を示す線図である。マイクロアレイの試料に対する励起光の照射角度を７０°とした以外は、実施例１と同様に実験を行った。この比較例１では、図６に示すように、Ｃｙ５濃度が０．００１６から１までの範囲においては、Ｃｙ５の濃度比率と検出された蛍光量との間に直線性が得られたものの、Ｃｙ５濃度が０．００１６以下の範囲ではＣｙ５の濃度比率と検出された蛍光量との間に直線性が得られなかった。すなわち、比較例１の蛍光検出装置では、試料からの蛍光が正確に検出されなかった。
　＜比較例２＞
　図７は、比較例２の、励起光源に高圧水銀ランプを使用した一般的な同軸落射方式の蛍光顕微鏡（ニコン製　ＥＣＬＩＰＳＥ　Ｅ６００）による、マイクロアレイの試料の蛍光量の検出結果を示す線図である。この比較例２では、集光レンズ内の自家蛍光等により装置バックグラウンドが高いため、図７に示すように、Ｃｙ５濃度が０．００１６から１までの範囲においては、Ｃｙ５の濃度比率と検出された蛍光量との間に直線性が得られたものの、Ｃｙ５濃度が０．００１６以下の範囲ではＣｙ５の濃度比率と検出された蛍光量との間に直線性が得られなかった。すなわち、比較例２の蛍光顕微鏡では、試料からの蛍光が正確に検出されなかった。
１　マイクロアレイ
２　光を透過しない部材
４　試料
６　蛍光検出装置
８　積載ステージ
１０　透過光照射手段
１２　励起光照射手段
１４　照射角調整手段
１６　集光レンズ
１８　検出手段
２０　蛍光用フィルター
２２　拡散板
２４　拡散板移動手段
２６　検出位置調整手段
２８　焦点調整手段
３０　励起用フィルター

Claims (14)

  1. 　蛍光物質を含む透光性の試料からの蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
    　前記試料に励起光を照射する励起光照射手段と、
    　前記試料からの蛍光を検出する検出手段と、
    　前記試料に対する励起光の照射角を試料の寸法に応じて調整する照射角調整手段と、
    を備えている、
    　ことを特徴とする蛍光検出装置。
  2. 　前記照射角調整手段は、前記試料に対する励起光の照射角θが以下の式を満たすように、前記励起光の照射角を調整する、
    　請求項１に記載の蛍光検出装置。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
    （ここで、ｔは前記試料の厚みであり、ｙは前記試料の幅である。）
  3. 　前記照射角調整手段は、前記試料の厚みが０．１～１ｍｍである場合、前記試料に対する前記励起光の照射角θが１５～６０°の範囲内となるように、前記励起光の照射角を調整する、
    　請求項１に記載の蛍光検出装置。
  4. 　前記試料から前記検出手段に向かう蛍光の光路上に配置され、前記蛍光を前記検出手段に合焦する集光レンズを備え、
    　前記励起光照射手段は、前記集光レンズの光軸を中心とした円周上に均等な角度間隔にて配置された複数の励起光照射手段、又は、前記集光レンズの周囲に配置された円環型の励起光照射手段により構成される、請求項１～３の何れか１項に記載の蛍光検出装置。
  5. 　前記集光レンズ及び前記検出手段と、前記試料が配置されたマイクロアレイとの、前記集光レンズの光軸方向における距離を調整する、焦点調整手段を備えた、請求項４に記載の蛍光検出装置。
  6. 　前記集光レンズ及び前記検出手段と、前記試料が配置されたマイクロアレイとを、前記集光レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させる、検出位置調整手段を備えた、請求項４又は５に記載の蛍光検出装置。
  7. 　更に、前記試料を透過する透過光を前記試料に照射する透過光照射手段を備え、
    　前記検出手段は、前記試料を透過した透過光の光路上に配置され、当該試料を透過した透過光を検出する、
    　請求項１～６の何れか１項に記載の蛍光検出装置。
  8. 　更に、前記透過光照射手段から出射された透過光を拡散するための拡散板を備え、
    　前記拡散板は、前記透過光照射手段から前記試料に向かう透過光の光路上に配置される、
    　請求項７に記載の蛍光検出装置。
  9. 　更に、前記透過光照射手段から前記試料に向かう透過光の光路上から前記拡散板を出し入れする拡散板移動手段を備えた、請求項８に記載の蛍光検出装置。
  10. 　請求項１～９の何れか１項に記載の蛍光検出装置を使用する蛍光検出方法であって、
    　前記励起光照射手段により励起光を前記試料に照射し、当該試料に含まれる蛍光物質を励起する工程と、
    　前記励起された蛍光物質から発せられた蛍光を前記検出手段により検出する工程と、を含む、
    　蛍光検出方法。
  11. 　前記蛍光検出装置は、前記試料から前記検出手段に向かう蛍光の光路上に配置され、前記蛍光を前記検出手段に合焦する集光レンズと、前記集光レンズ及び前記検出手段と、前記試料が配置されたマイクロアレイとの、前記集光レンズの光軸方向における距離を調整する、焦点調整手段と、を備え、
    　前記焦点調整手段により、前記集光レンズ及び前記検出手段と、前記マイクロアレイとの、前記集光レンズの光軸方向における距離を調整して、前記集光レンズの焦点を前記試料に合わせる工程を含み、
    　前記集光レンズの焦点を前記試料に合わせる工程の後、前記励起光を試料に照射する工程を実行する、請求項１０に記載の蛍光検出方法。
  12. 　前記蛍光検出装置は、前記試料を透過する透過光を前記試料に照射する透過光照射手段を備え、
    　前記集光レンズの焦点を前記試料に合わせる工程は、
    　前記透過光照射手段により、透過光を前記試料に照射する工程と、
    　前記焦点調整手段により、前記集光レンズ及び前記検出手段と、前記マイクロアレイとの、前記集光レンズの光軸方向における距離を段階的に変化させながら、前記試料を透過した透過光を前記検出手段により検出する工程と、
    　前記検出手段により検出された透過光の画像に基づき、前記集光レンズの焦点が前記試料に合う位置を判定する工程と、を含む、
    　請求項１１記載の蛍光検出方法。
  13. 　前記蛍光検出装置は、前記集光レンズ及び前記検出手段と、前記マイクロアレイとを、前記集光レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させる、検出位置調整手段を備え、
    　前記蛍光を検出する工程は、
    　前記検出位置調整手段により、前記集光レンズ及び前記検出手段と、前記マイクロアレイとを、前記集光レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させる工程と、
    　前記検出位置調整手段による前記移動の度に、前記励起された蛍光物質から発せられた蛍光を検出する工程と、を含む、
    　請求項１２記載の蛍光検出方法。
  14. 　前記蛍光検出装置は、前記透過光照射手段から出射された透過光を拡散するための拡散板を備え、
    　前記透過光を前記試料に照射する工程は、前記拡散板を、前記透過光照射手段から前記試料に向かう透過光の光路上に配置する工程を含み、
    　前記励起光を照射する工程は、前記拡散板を、前記透過光照射手段から前記試料に向かう透過光の光路上から取り除く工程を含む、
    　請求項１２又は１３に記載の蛍光検出方法。
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