CN101939635B - 基于倏逝照明和荧光的分子诊断系统 - Google Patents

Abstract

一种照明检测系统包括：激发辐射源和关联的辐射处理装置以及用于将来自辐射处理装置的激发辐射聚焦到样本的分析区域上的聚焦装置。辐射收集装置收集来自样本的分析区域的由所述激发产生的辐射，并且检测器检测收集的辐射。聚焦的激发辐射包括激发线，该激发线在样本中是倏逝的。这组合了线扫描(缩减分析时间)和倏逝激发(降低背景信号)的优点并且于是允许提高医护点应用的测量速度和精度。

Description

基于倏逝照明和荧光的分子诊断系统

技术领域

本发明涉及照明检测系统和方法，特别是在分子诊断领域。

背景技术

检测系统中使用的照明的一个实例是荧光，并且使用荧光检测的实例是在核酸测试(NAT)中。这是用于检测疾病的遗传倾向的分子诊断中的核心要素，其用于确定RNA表达水平或者识别造成感染的病原体(比如细菌和病毒)。

荧光的检测可以用于定性确定特定靶DNA样本的存在性并且用于定量确定样本中存在的DNA的量。本发明涉及用来检测荧光的设备以及使用方法。

在典型的分子诊断实验中，对生物样本(bio-sample)进行筛选(screen)以便检测特定生物成分(“靶”)，例如基因或蛋白质。这通过检测靶到捕获探针的选择性结合(称为杂化)的发生来完成，所述捕获探针附接到固体表面。杂化步骤之后典型地为其中所有未结合的靶分子被冲走的清洗步骤，并且最后执行检测步骤。

所述检测基于附接到靶分子的荧光标记的荧光检测。荧光检测需要非常灵敏且是表面特定的，以便最小化生物背景。理想地，荧光检测需要能够进行单荧光标记检测，同时该过程保持时间有效。

在不久的将来，所述检测需要在医院或者被设置用于诊断的实验室之外执行。这要求设备能够在相对较短的时间内进行灵敏的测量。

生物传感器中荧光检测的缺陷之一是该生物背景信号。在典型的实验中，需要检测结合到表面的分子的荧光。然而，表面邻近的生物成分可能产生大的背景信号。因此，需要相对较长的测量时间以便补偿背景。减轻该问题的一种标准方法是使用共焦滤波，使得来自小体积的激发被成像到使用的检测器上。

然而，使用共焦光学系统的问题同样是检测过程的长度，因为点聚焦(spot focus)需要跨样本的感兴趣区域扫描以便确保可靠性和灵敏性。

该问题的一种提出的解决方案是执行线扫描荧光检测。焦线跨样本扫描，从而可以缩减检测时间。然而，共焦滤波在沿着激发线的轴的方向上不是最佳的。这具有以下直接结果：检测的表面荧光受相对较大的背景信号影响并且灵敏度降低。

发明内容

本发明的目的是提供一种用在医护点诊断中的分析系统和方法，其中可以实现高的测量速度，而没有灵敏度和/或表面特异性的重大损失。

本发明由独立权利要求限定。从属权利要求限定了有利的实施例。

依照本发明，提供了一种照明检测系统。

利用依照本发明的系统，允许在不遭受灵敏度的损失的情况下实现增大速度的线扫描检测的强度。线聚焦用于增大的扫描速度使得线方向上的共焦性降低。因此，这种类型的检测的灵敏度降低。为了补偿该效应，并入了倏逝激发。利用倏逝激发给出增强的表面特异性，从而实现检测的灵敏度增强。本发明因而组合了线扫描(缩减分析时间)和倏逝激发(降低背景信号)的优点。这允许实现以上概述的医护点诊断应用。

关联的辐射处理装置优选地包括用于产生环形束形状的束定形变换器。该环形束形状可以用来利用激发辐射产生样本的倏逝激发。特别地，当聚焦束时，如果光具有超过临界角的到样本的入射角，那么将在样本中存在全内反射，并且只有近场倏逝光将进入样本以激发样本。束定形元件可以例如从激发辐射源的输出的平面平行圆形截面波前产生环形束形状。然而，所述截面不必是圆形的，并且可以是例如椭圆形、矩形或者甚至正方形。事实上，如下文进一步阐述的，只要满足临界角要求以便获得倏逝激发，那么任何形状都可以。

关联的辐射处理装置优选地还包括用于从环形束产生束形状的线形成元件，所述束形状由聚焦装置映射到激发线。这提供了允许仅在一个方向上扫描以便实现2D样本区域上的扫描的线照明。该线形成元件可以例如包括圆柱透镜或相位板。

辐射收集装置优选地用于收集来自样本的发光辐射，即荧光辐射和/或磷光辐射。优选地，使用荧光辐射检测，因为这是最灵敏的并且基于即时过程。

所述系统可以用来分析可以被激发的任何样本。这样的样本包括为固体、液体或气体的所有种类的材料，如果它们附接到表面的话。优选地，样本包括部位或腔室形式的分析表面，所述部位或腔室可以携带或包含待分析的化学物质。这样的腔室可以是所有体积的反应容器。优选地，所述系统包括寡或多核苷酸(例如DNA或RNA)分析系统。这样的系统包括基于这样的材料的复制的系统并且包括例如聚合酶链反应复制或者其他复制技术。

所述聚焦装置和辐射收集装置可以共享激发/收集透镜。这简化了所述系统，鉴于稳定性以及医院外的现场使用，这是所希望的。制造成本也将降低。

依照本发明，还提供了一种使用照明检测系统测量来自样本的分析辐射的方法。该方法尤其提供了上面关于所述设备解释的优点。

附图说明

现在，将参照附图详细地描述本发明的实例，在附图中：

图1用来说明倏逝激发的原理；

图2示出了本发明的分析设备；

图3示出了光如何被定形以便产生倏逝场；

图4示出了用在图2的系统中的束定形装置的第一实例；以及

图5示出了用在图2的系统中的束定形装置的第二实例。

具体实施方式

本发明涉及一种辐射分析设备和方法，其将线扫描检测与倏逝激发组合。利用倏逝激发给出增强的表面特异性，从而实现荧光检测的灵敏度增强，并且这使得更高速度的线扫描方法能够被采用。

首先，将参照图1解释倏逝激发的原理。在该实例中，辐射是光学辐射或光。检测的辐射是荧光辐射。本领域技术人员应当知道，也可以使用诸如UV辐射之类的其他类型的辐射。

激光器形式的辐射激发源用来提供激光束10，该激光束从高折射率介质n1(例如玻璃)聚焦到低折射率介质n2(例如水)。对于小于临界角θ0的角度而言，光将透射进入介质n2。然而，束定形装置12可以用来阻挡入射束的中心部分，使得没有光透射进入介质n2。这消除了介质n2的大部分激发。对于大于临界角θ0的角度而言，在所述两种介质之间的界面处发生全内反射，并且倏逝波可以传播到低折射率介质n2中，其具有作为传播距离(z)的函数的衰减的场幅度I(Z，θ1)。由于该倏逝波在z方向上迅速衰减，因而它可以用来探测仅仅那些在具有n1和n2的层之间的界面的表面附近存在的实体或分子。

当利用(短波长)激光激发时，荧光分子将开始在所有方向上辐射光。荧光的波长将长于激发波长。

该实例配置中的束定形装置可以是中心二向色掩模，其被设置成对于荧光波长是透明的，从而最大化收集效率。

图2示出了本发明实例的荧光扫描仪的基本部件。待研究的样本14由衬底(substrate)16限制在给定体积中，从而形成微流体部分。透镜包括如下面解释的浸没流体17。诸如激光器之类的源产生的激发光10用来激发荧光。光由光学装置处理，该光学装置在这个实例中包括束变换元件18和线形成元件20(圆柱透镜或相位板)。

处理的激发光由二向色镜22定向到样本，但是可以使用分束器。

激发光随后借助于激发透镜26聚焦到样本中，所述激发透镜可以相对于样本移动。

诱导的荧光(作为提供到样本中的倏逝激发光的结果)由收集透镜收集并且定向到检测器28，所述收集透镜在这个实例中是与激发透镜26相同的部件。

任何反射的激光(全内反射的光)由二向色镜或分束器22再次反射，而荧光亮度穿过该镜/分束器。

带通滤波器30提供进一步的滤波以便阻止激发光，并且该滤波的光由将样本成像到检测器28上的成像透镜32聚焦到检测器28上。可以使用许多不同类型的检测器，例如光子倍增管和雪崩光电二极管检测器。可以使用像素化检测器。

图2示出了穿过束定形元件18之前(32)和之后(34)的激发光的强度剖面(profile)。激发光的强度剖面从圆形平面平行波前变换到环形截面。光环的尺寸与透镜26的物理尺寸匹配，使得光在穿过透镜26之后在生物样本介质14中变成倏逝的。

光由整个光学系统聚焦到衬底/生物样本表面上。

线形成元件20(圆柱透镜/相位板)通过干扰波前在一个方向(例如圆柱透镜的作用方向)上的传播从小的斑点改变光聚焦。透镜26的焦平面内的原始斑点于是变成线。该线在一个方向上是衍射受限的并且其长度通过圆柱透镜/相位板20产生的发散/会聚给出。

对于圆柱透镜的实例而言，环形圈(annular ring)在等于圆柱透镜的焦距的距离处变换成线。在该透镜与焦距之间，光截面的形状连续地从环形圈通过椭圆环过渡到线。圆柱透镜具有比从圆柱透镜20到聚焦透镜26的距离长得多的焦距。因此，当进入聚焦透镜时，束的形状是稍微椭圆的环形圈。

将希望的线宽(其由聚焦透镜产生)作为参数，可以计算圆柱透镜的强度(焦距)以及隐含地由其引入的角偏差。该偏差例如仅仅大约几度。

因此，圆柱透镜用作线形成元件，但是光学信号在线形成之前被(聚焦透镜)进一步处理。聚焦透镜的输出是聚焦在样本表面处的线。

线的使用允许仅仅在一个方向上扫描以便覆盖样本的二维区域。该线可以例如具有大约100微米的长度以及大约0.7微米的衍射极限宽度。检测时间可以缩减和/或扫描速度可以降低。当样本运动时，扫描速度的降低是特别希望的，因为关联的加速可能干扰样本的微流体性质。

在图2示出的实施例中，圆柱透镜/相位板20置于二向色镜22与变换激发束的光学元件18之间。在实践中，圆柱透镜/相位板可以改为置于二向色镜22与透镜26之间或者光学元件18之前。束变换器18也可以置于不同的位置。然而，它优选地置于二向色分束器的上游，因为在这种情况下，产生的荧光可以被收集而不受束变换器影响。

激发线的光场在生物样本介质中是倏逝的，同时紧紧聚焦到衬底/生物样本表面上。结果，它仅仅选择性地激发衬底/生物样本表面上的荧光团。

反射的激发光(来自衬底/生物样本表面)可以用于聚焦和/或跟踪反馈环。该二次光路在图2中未示出，并且将不详加描述，因为常规的用于激发/收集透镜26的主动聚焦和跟踪装置可以与组合主动聚焦/跟踪的本发明的倏逝线激发的使用组合使用。

圆柱透镜20的强度或者相位板产生的波前失真优选地是有限的，使得线的侧向延伸处于透镜的场内，即波前失真保持在希望的值以下。

为了创建倏逝激发场，优选地使用浸没透镜(immersion lens)。可以使用也称为“近场”的固体浸没类型透镜，或者液体浸没类型。

在衬底/生物样本界面处获得倏逝场的条件由下式给出：

${\sin \mathrm{\α}}_{\mathrm{substrate}}>\frac{n_{\mathrm{bio}-\mathrm{sample}}}{n_{\mathrm{substrate}}}$

条件是透镜折射率(以及在液体浸没的情况下浸没流体的折射率)高于或等于衬底的折射率。根据相同的条件，显然，透镜26的数值孔径(NA)必须满足：

NA_imm.lens＞n_bio-sample

考虑透镜的几何结构，最小角条件(α_min)转化为撞击到浸没透镜上的光的环形圈的最小内径。这示于图3。

为了进行荧光收集，使用浸没透镜的全NA。

图4更详细地示出了将圆形束剖面32变换成环形束34的一种方式。所述光学元件关于轴40圆对称，并且通过使用有角度的入射面而提供分束功能。该元件具有锥形输入和输出表面，其用来相对于轴40发散并且然后会聚光束。输入表面突进元件体内，并且输出表面从元件体突出。这种布置提供了有效的光变换，因为所有的激发光被使用，从而潜在地产生更强烈的倏逝场。得到的环形的参数由光学元件的特征角α和β以及它的长度和输入束的半径确定。

图5示出了图4的光学元件的变型。该光学元件分割成两个部件。输入部件具有锥形输入表面(突进元件体内)和平坦输出表面，并且输出部件具有平坦输入表面和锥形输出表面(突出元件体)。

得到的环形的尺寸可以通过修改这两个部件之间的距离来调节，如图5中所示。

本发明并不限于上面描述的用于获得环形光的方法。也可以使用其他的方法，例如相位板、环形光阑或者二向色环。作为可替换方案，也可以使用Schwarzshield物镜，其中入射光朝抛物面镜反射，这导致物镜之后的聚焦的环形斑。

在上面的实例中，系统用于荧光检测。然而，本发明更一般地涉及样本的激发和所产生的光的检测。诱导的发光可以例如包括磷光。

在上面的实例中，使用二向色分束器DBS作为优选的解决方案。然而，也可以使用通常的(非二向色)分束器，尽管将浪费一些激发功率和收集的荧光。

所述衬底可以是任何适当材料的平板，例如可以是玻璃或聚合物，并且可以具有捕获元件，其具有介于每μm² 0.01与10⁶元件之间，优选地介于每μm² 10与10⁴元件之间的表面密度。

典型地，针对特定成分筛选所述样本、具有捕获元件的与样本接触的衬底或者在其与样本接触之后的衬底，所述成分例如生物成分，诸如寡核苷酸、DNA、RNA、基因、蛋白质、碳水化合物、脂质、细胞，细胞成分，诸如外细胞膜或内细胞膜，细菌，病毒，原生动物等等，也称为靶颗粒。

发光标记典型地附接到靶颗粒并且因而帮助检测靶颗粒。在一些实施例中，样本因而包括至少一个发光标记，也称为“光变颗粒”。这样的光变颗粒可以例如是荧光(如上所述)、电致发光或化学发光颗粒。光变颗粒可以是能够机械上、电学上、化学上或者以其他方式结合到结合部位的任何实体。它可以包括单分子或多个分子，优选地10到10⁸之间的分子和/或量子点状标记集合。如果使用了多个分子，典型地获得对于激发的更强的响应，从而导致更好的信噪比。

本发明的应用通常在分子诊断领域：临床诊断、医护点诊断、高级生物分子诊断研究——生物传感器、基因和蛋白质表达阵列、环境传感器、食品质量传感器等等。

各种其他修改对于本领域技术人员将是清楚明白的。在权利要求书中，置于括号之间的任何附图标记都不应当被视为限制了权利要求。动词“包括/包含”并没有排除存在权利要求中未列出的元件或步骤。元件之前的措词“一”或“一个”并没有排除存在多个这样的元件。在列举了若干装置的设备权利要求中，这些装置中的一些可以由同一硬件项实施。在相互不同的从属权利要求中陈述了特定的技术措施这一事实并不意味着这些技术措施的组合不可以加以利用。

Claims (11)

1.一种照明检测系统，包括：

激发辐射源和关联的辐射处理装置(18，20)，其用于提供激发辐射；

聚焦装置(26)，其用于将激发辐射聚焦到样本(14)的分析区域上；

辐射收集装置(26)，其用于收集来自样本的分析区域的以荧光或者磷光形式且由所述激发产生的分析辐射；

检测器(28)，其用于检测收集的分析辐射，

其中聚焦的激发辐射包括激发线，该激发线在样本中是倏逝的，以及其中该系统还包括用于跨样本扫描激发线的装置，其中辐射处理装置(18，20)包括用于产生环形束(34)的束定形元件(18)和用于变换该环形束的形状的线形成元件(20)，以便所述环形束在通过聚焦处理之后变换为激发线。

2.如权利要求1所述的照明检测系统，其中束定形元件(18)从激发辐射源的输出的平面平行圆形截面波前(32)产生环形束形状(34)。

3.如权利要求1所述的照明检测系统，其中线形成元件(20)具有比线形成元件(20)与聚焦装置(26)之间的距离更长的焦距。

4.如权利要求1所述的照明检测系统，其中线形成元件(20)包括圆柱透镜或相位板。

5.如权利要求1-4中任一项所述的照明检测系统，包括生物成分筛选系统。

6.如权利要求1-4中任一项所述的照明检测系统，其中聚焦装置(26)和辐射收集装置(26)共享激发/收集透镜(26)。

7.如权利要求1-4中任一项所述的照明检测系统，其中检测器(28)包括像素化光检测器。

8.一种使用照明检测系统测量来自样本的分析辐射的方法，包括：

产生激发辐射；

处理该激发辐射；

将处理的激发辐射聚焦，从而在样本的分析区域处提供在样本中倏逝的激发线；

跨所述样本扫描所述激发线；

收集来自分析区域的以荧光和/或磷光形式的由所述激发产生的分析辐射；以及

检测收集的分析辐射，

其中所述处理激发辐射包括使用束定形元件(18)产生环形束(34)以及使用线形成元件(20)来转换该环形束的形状，以使所述环形束在通过聚焦装置之后被变换成激发线。

9.如权利要求8所述的方法，其中收集分析辐射包括收集来自样本的发光辐射。

10.如权利要求8或9所述的方法，包括生物成分筛选方法。

11.如权利要求8或9所述的方法，其中所述处理激发辐射包括从激发辐射源的输出的平面平行圆形截面波前产生环形束形状。

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