JP2000019114A

JP2000019114A - 微弱蛍光検出方法および微弱蛍光検出装置

Info

Publication number: JP2000019114A
Application number: JP10188515A
Authority: JP
Inventors: Koichi Kato; 宏一加藤; Izumi Wake; 泉和氣; Kenji Yasuda; 賢二安田; Takeshi Sakamoto; 健坂本
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1998-07-03
Publication date: 2000-01-21

Abstract

(57)【要約】【課題】微弱蛍光を検出し、検出のＳ／Ｎ比を改善す
る手法およびこの手法を用いた装置を提供すること。【解決手段】光源１１で発生した光はバンドパスフィ
ルター２１を通過し、キャピラリー管４１内を流れる試
料５１に付加された蛍光色素に照射される。前記蛍光色
素より等方的に発光した微弱蛍光は球形ガラス６１の表
面にコートされた全反射膜により、検出器８１方向へと
反射する。さらに、球形ガラス６１の検出器８１に向き
合う面は凹レンズ状に整形され、集光レンズの役割を果
たす。集められた光はエミッションフィルター７１を通
過し、検出器８１の像面に効率よく集光する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微弱蛍光検出方法
および微弱蛍光検出装置に関し、特に試料に付加された
蛍光色素より等方的に発散する微弱蛍光を検出するのに
適した微弱蛍光検出方法および微弱蛍光検出装置に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】光による微小物質の観察に関する歴史は
古く、レーウェンフックの発明した単式レンズに始ま
り、現在では医学・生物学・理学・工学の研究・教育の
みならず半導体産業・医療関係などにおいても光を使用
した定量的観察技術は必須なものとなっている。

【０００３】しかし、例えば光学顕微鏡において、期待
する試料を観察することは確立された技術であり、理論
的には分解能は光の回折限界である0.2 オmに限定され
る。しかしながら、近年、近接場光を使用することによ
り、従来の空間分解能が改善され、コンピューターによ
るビデオコントラスト法など画像処理技術により、最適
な条件においては光学観察の分解能はオングストローム
に迫ることが分かってきた。この技術については、井上
が『ビデオマイクロスコピー』（１９８６年）第３９３
頁から第４２２頁（S. Inoue,『Video Microscopy』 Pl
enum Press (1986), pp393-422）において詳しく述べて
いる。

【０００４】一方、微弱蛍光の検出を難しくしている問
題として、二つの大きな原因が挙げられる。第一の原因
として、光学系自身の発光、およびゴミ、フィルター、
オイルなどより発生するノイズが挙げられる。第二の原
因として、蛍光シグナルを増幅する際に発生する検出器
由来のノイズが挙げられる。

【０００５】まず、微弱蛍光を検出時に問題となるノイ
ズ発生の第一の原因ついて説明する。色素より発光した
微弱蛍光が検出器の光電面までに至るまでに発生するノ
イズの具体的な原因は、溶液、オイルからのラマン散
乱、フィルターから漏れてくる入射光、対物レンズ、オ
イル、ゴミなどの発光などによるものである。これらの
対策として、強力で褪色しにくい蛍光色素、色素の適正
な励起波長、観察波長、対物レンズ、ダイクロイックミ
ラー、シャープカットフィルター、オイル、蛍光を発し
ない石英製のカバーガラスとスライドを評価および選択
することにより、ノイズを通常の落射照明法の1/40まで
低減することが可能であることが報告されている。ま
た、照明法としてエバネッセント光による照明が有効で
あり、ノイズは通常の落射照明法の1/2000まで低減され
ることが船津らによってネーチャー第374号( 1995年 )
第555頁から第559頁( Funatsu et al., Nature 374(199
5), pp.555-559 )に報告されている。

【０００６】次に微弱蛍光の検出時に問題となるノイズ
発生の第二の原因ついて説明する。これは検出器由来の
ノイズによるものである。現在の微弱蛍光の検出器とし
て代表的なものは光電子増倍管を用いたものであるが、
これは、２次電子放出を利用して、光電子による微弱な
光電流を増幅する真空管である。現状の技術では、光電
子増倍管の増幅率は最大１０⁸であるが、問題となるの
は光電子増倍管は光が入射していない状態でもわずかな
がら暗電流が存在することであり、これが微弱蛍光検出
の際のノイズとなる。暗電流により発生するノイズにつ
いての対策として、装置回路を冷却することにより暗電
流を低減させ、Ｓ／Ｎ比や検出限界を向上させる試みが
積極的になされている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術で述べた
微弱蛍光観察技術は、大きく分けて二つの要素技術から
なる。それらは、第一に微小物体が発光する微弱蛍光を
検出する際に問題となる光学系自体によるノイズを極限
まで低減させる技術、第二に蛍光シグナルを電気的に増
幅する際に発生する検出器由来のノイズを冷却し、低減
させる技術である。これらの要素技術により、微弱蛍光
検出のＳ／Ｎ比を向上させ、微弱蛍光を効率よく検出
し、観察することが可能となった。上記の微弱蛍光観察
技術は将来の医療技術における生体微量活性物質の検出
の可能性を示した。しかし、上記従来の微弱蛍光観察技
術を既存のDNA解析装置などの微弱蛍光検出に直接適用
するには多くの技術的困難が存在する。

【０００８】まず、光学系自体によるノイズを低減する
技術を既存の蛍光検出装置に応用することの問題につい
て述べる。まず第一の問題として照明法が挙げられる。
DNA解析装置において、蛍光色素を付加した試料は半径
0.25-0.5 mm程度のキャピラリー管内部を溶液の流れに
より輸送されているが、上記照明法であるエバネッセン
ト場はキャピラリー管内部へ150 nm しか染み出さない
ため、この照明法ではキャピラリー管のガラス表面から
150 nm 以上の深さをブラウン運動しながら通過する試
料を観察することはできないことが問題となる。第二の
問題として蛍光色素の褪色が挙げられる。現状の微弱蛍
光観察技術では、量子収率が高くかつ褪色に強い蛍光色
素を選択した場合においても分子の存在が確認できる程
度である。どのような蛍光色素（例えば pHやCa²⁺など
のイオン量をモニターする蛍光色素など）についても微
弱蛍光観察が可能といったレベルにはなく、一般性に欠
けることが問題となる。第三の問題として実験環境が挙
げられる。上記の微弱蛍光の検出はゴミによるノイズを
極力低減するため、クリーンルーム内で実験が行われて
いた。しかし、既存のDNA解析装置は防塵対策を考慮し
て設計されていない。従って実験環境を整えることは一
般的に難しく、現実的でないことが問題となる。

【０００９】次に、蛍光シグナルを電気的に増幅する際
に発生する検出器由来のノイズを低減させる技術を既存
の蛍光検出装置に応用することの問題について述べる。
これは現状の光電子倍増管の増幅率は高々１０⁸である
が、更に増幅率を上げることは技術的に困難であるとい
う問題である。増幅率を上げるにつれて、ノイズ成分も
増加してしまい、定量的な測定を行うことができないの
で、いかに増幅率を下げるかが課題となる。従って微弱
蛍光の検出能を向上させるためには、検出器の光電面に
到達する以前の光子数を増やす必要がある。

【００１０】生体微量活性物質の挙動の観測を実現する
ためには、特殊な照明法や環境に依存することなく、従
来の装置の特性を維持しつつ、簡易に、かつ安価に、蛍
光色素が褪色するまでに放出される百万個程度の光子を
効率よく回収し、電気信号として取り出す技術の確立が
必要であった。一方、微弱蛍光を検出するために使用さ
れる既存の油浸対物レンズの開口数 (N.A) は最高でも
1.4であるので、対物レンズにより回収され、光電子増
倍管などの検出器へ到達する光は等方的に発散される光
量の高々４割程度であった。従って、試料の発光点から
検出器の像面方向へ進行しない微弱蛍光は単に発散する
光として、回収の努力がされてこなかった。

【００１１】本発明は、上記課題を解決するため、試料
から等方的に発する微弱蛍光を効率よく反射かつ集光
し、従来回収されて来なかった光を回収することで微弱
蛍光強度を向上し、検出のＳ／Ｎ比を改善することを目
的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するため、従来の光学系では回収されて来なかった発
散光について、これを効率よく捉えるため、反射し、回
収する簡便な光学系を導入する手段を有する。また、こ
れにより微弱蛍光の検出感度増強およびＳ／Ｎ比を改善
する手段を有する。

【００１３】具体的には、キャピラリー電気泳動やスラ
ブゲル電気泳動、あるいは蛍光顕微鏡において、反射膜
によりコートされた球形ガラスあるいは楕円球ガラスな
どを使用することで、等方的に発光する微弱蛍光をより
広い角度かつ方向で反射し、集光することにより、蛍光
検出感度、Ｓ／Ｎ比を向上する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明の第1の実施例として、キ
ャピラリー電気泳動における微弱蛍光の回収率を向上す
る方法および装置について図1を用いて以下に説明す
る。本装置は試料５１に付加された蛍光色素を励起する
光源１１、試料５１を通過させるキャピラリー管４１、
集光部としての球形ガラス６１、集光された光を光電変
換をする検出器８１、検出器制御部９１より構成され
る。本実施例では、微弱蛍光が検出される方向、励起光
通過光路３１、キャピラリー管４１は互いに直交してお
り、それぞれx, y, z軸に平行な方向を向いている。各
部が交差する部分で試料は発光し、その発光位置が中心
となるように球形ガラス６１が配置される。

【００１５】光源１１で発生した光は、バンドパスフィ
ルター２１を通過することにより試料５１に付加された
蛍光色素を励起するのに適当な波長が選択される。光は
球形ガラス６１に開けられた励起光通過光路３１にそっ
て目的の試料５１が存在するキャピラリー管４１に導入
され、更に球形ガラス６１外部へと抜けるように構成さ
れている。これは、励起光を球形ガラス６１球内にこも
らせず、ノイズの原因となる励起光による余計な散乱光
や迷光などを減少させる効果を持つ。キャピラリー管４
１内には、試料５１が一定速度で矢印４１１の方向へ溶
媒とともに移動している。図２に図１で示した第１の実
施例のＡ−Ａ断面図を示す。球形ガラス６１の表面には
全反射膜６１１がコーティングされている。励起光通過
光路３１に試料５１が到達すると、試料５１に付加され
た蛍光色素は励起され、微弱な蛍光を発する。試料５１
に付加された蛍光色素は等方的に蛍光を放射するが、こ
の蛍光は球形ガラス６１上の全反射膜６１１により反射
される。反射された光子は検出器８１に到達するか、あ
るいは励起光光路３１から外部に放出される。従って、
放出された光子が検出器８１に到達する確率は従来に比
べて高くなるので、球形ガラスの中心と励起光光路３１
の入射部の縁を直線により結んだときの角度を５度とし
て計算したとき、従来の蛍光検出における回収率である
４割を最大９割に向上させることができる。また、ノイ
ズを除去し、目的となる蛍光シグナルのみを取り出すた
めにエミッションフィルター７１を検出器８１の前に配
置する。本発明により、従来は検出器８１由来のショッ
トノイズに埋もれ、検出不可能であった微弱蛍光シグナ
ルも効率よく検出され、Ｓ／Ｎ比の改善により計測時間
を短縮することができる。

【００１６】図３に、本発明の第２の実施例の模式図を
示す。本実施例では球形ガラス６２の前に集光レンズ５
２１が設置されている。これにより、試料５２に対して
励起光を絞って照射することが可能となり、試料５２が
効率良く励起される。また、励起光はキャピラリー管４
２の全範囲を証明せず、照明される必要のない領域にあ
る試料５２を励起することがないので、必要のない発光
・迷光などによる余分なバックグラウンドノイズを低減
することができる。

【００１７】図４に、本発明の第３の実施例の模式図を
示す。本実施例ではキャピラリー管３７と励起光源１７
１は平行に、それらに対して垂直な位置に検出器８７が
それぞれz, z, x軸に平行な方向に配置されている。ま
た、光源１７１から直進する光路と検出光路が交差する
位置にダイクロイックミラー２７が配置されている。

【００１８】光源１７１で発生した光は、バンドパスフ
ィルター１７２を通過することにより試料４７に付加さ
れた蛍光色素を励起するのに適当な波長に選択される。
光は集光レンズ２７１を通過し、球形ガラス５７１に開
けられた通過口２７２を経て目的の試料４７が存在する
キャピラリー管３７に導入される。集光レンズ２７１は
試料４７に対して励起光を効率よく照射する。キャピラ
リー管３７内には、試料４７が一定速度で矢印４７１の
方向へ溶媒とともに移動している。球形ガラス５７１の
表面には全反射膜５７２がコーティングされている。通
過口２７２に試料４７が到達すると、試料４７は励起さ
れ、微弱な蛍光を発する。試料４７は等方的に蛍光を放
射するが、この蛍光は球形ガラス５７１上の全反射膜５
７２により反射される。通過口から放出されるまで光子
は反射を続ける。放出された光子は集光レンズ２７１に
より検出器８７の方向に集光される。これにより９割以
上の微弱蛍光を回収することが可能である。通過口２７
２から放出された光子はダイクロイックミラー２７、バ
ンドパスフィルター６７を経て検出器８７に到達する。

【００１９】図５に、本発明の第４の実施例の模式図を
示す。本実施例では第３の実施例で示したものと同様な
機構によって励起光をキャピラリー管３８内を流れる試
料４８に照射する。試料４８は、カルシウム濃度の計測
が可能なレシオイメージング用の蛍光色素により染色さ
れている。レシオイメージング法は、蛍光のスペクトル
をアイソスベスティックポイント前後の２波長の蛍光強
度の比をとることで、カルシウムやプロトンなどの様々
なイオン濃度を決定すること手法である。通過口２８２
より放出してきた微弱蛍光はアイソスベスティックポイ
ント付近で透過光と反射光に分割するダイクロイックミ
ラー２８３により、それぞれバンドパスフィルター７８
１、７８２を経て検出器８８１、８８２に到達する。蛍
光強度は制御部９８で計算され、カルシウムイオン濃度
を算出することができる。

【００２０】図６に、本発明の第５の実施例の模式図を
示す。本実施例では第１の実施例で示したものと同様な
機構によって励起光をキャピラリー管４４内を流れる試
料５４に照射する。楕円球形ガラス６４は表面を全反射
膜６４１でコートされ、試料５４からの光を検出器８４
の像面に向かって反射するように設計・研磨されてい
る。図７に図６で示した第５の実施例のＢ−Ｂ断面図を
示す。試料５４より全方向に発光した蛍光は全反射膜６
４１を表面に施した楕円球形ガラス６４により、検出器
８４方向へと反射する。さらに楕円球形ガラス６４の検
出器８４に向き合う面５４１は全反射膜６４１でコート
されておらず、面５４１は凹レンズ状に整形され、集光
レンズの役割を果たす。従って、検出器８４の像面に光
は効率よく集光する。また、ノイズを除去するためにエ
ミッションフィルター７４が置かれる。本発明により、
従来は検出器８４由来のショットノイズに埋もれ、検出
不可能であった微弱蛍光シグナルも効率よく検出され、
Ｓ／Ｎ比の改善により計測時間を短縮することができ
る。上記第１から第６の実施例では液体中の試料の検出
について述べたが、これは気体中での試料微粒子の検出
にも全く同じ本発明の装置構成を用いることができる。

【００２１】本発明の第７の実施例として、スラブゲル
電気泳動における微弱蛍光の回収率を向上する方法及び
装置について図８を用いて以下に説明する。本装置は光
源１５１、ダイクロイックミラー９５、ゲル２５、反射
用ガラス５５、集光用ガラス６５、エミッションフィル
ター７５、検出器８５より構成される。本実施例では、
励起光源１５１から光が直進する光路とゲル２５から検
出器８５への光路が直交しており、その交差する位置に
ダイクロイックミラー９５が４５度の傾きを持って配置
される。また、ゲル２５、エミッションフィルター７
５、検出器８５が平行に配置されている。反射用ガラス
５５、集光用ガラス６５は平行面を向き合わせる形で、
互いに平行に設置される。反射用ガラス５５、集光用ガ
ラス６５はゲル２５の厚み分だけ離れており、反射用ガ
ラス５５と集光用ガラス６５の間隔に観察するゲル２５
が挿入され、固定できる仕組みになっている。目的とな
る、微量の蛍光色素により染色された試料３５、４５は
電気泳動によりゲル２５のレーン上で分離されている。
また、反射用ガラス５５、集光用ガラス６５は半円筒形
のガラスが直径方向に直線状に結合することにより構成
される。各半円筒状ガラスの直径の長さはゲル２５を分
離するレーンの間隔と一致している。

【００２２】光源１５１から矢印１５２の方向へ発せら
れた励起光はバンドパスフィルター１５３を通過し、試
料３５、４５に付加された蛍光色素を励起するのに適当
な波長に変換される。励起光はダイクロイックミラー９
５により矢印１５４の方向に反射され、ゲル上の試料３
４、３５に付加された蛍光色素を励起する。蛍光色素は
励起され、発光する。反射ガラス５５、集光ガラス６５
により、等方的に発光した蛍光は集光され、矢印１５５
の方向に進行する。ダイクロイックミラー１５５、エミ
ッションフィルター７５を通過し、検出面８５に至る。
なお、検出面８５にはスリット８５１が設置される。ス
リット８５１は検出面８５上の一画素分の間隔でｘｙ平
面に水平な方向に設置されており、等方的に発せられた
蛍光のｘｙ平面成分のみを取り出す効果を持つ。従っ
て、ゲル２５上の異なった位置で発光し、検出面に様々
な角度で入射してくる蛍光のｘｙ平面成分のみを検出す
ることが可能である。従って、ノイズとなる蛍光を除去
し、Ｓ／Ｎ比を向上させることが可能になる。

【００２３】図９に図８で示した第７の実施例のＣ−Ｃ
断面図を示す。図９に示されるように、ゲル２５のレー
ン上で分離された試料３５より直接検出器８５の方向に
発光した微弱蛍光は、集光用ガラス６５が凸レンズの働
きをすることで検出器８５の光電面に集められる。検出
器８５とは逆の方向に発光した微弱蛍光は全反射膜６５
１によりコーティングされた反射用ガラス５５により反
射され、さらに集光用ガラス６５により検出器８５の光
電面に集光される。したがって試料３５より等方的に発
光する微弱蛍光を効率良く回収し、検出することができ
る。また、ノイズを除去するためエミッションフィルタ
ー７５が検出器８５の前に置かれる。隣り合ったレーン
の試料４５より発光する蛍光は、集光用ガラス６５が集
光レンズの役割をしているために、試料３５からの微弱
蛍光の検出面に侵入することはなく、試料３５からの微
弱蛍光に対してノイズになることはない。また、検出器
８５はゲル全体を画像として記録することが可能なよう
に設計されているため、ゲル２５から発光した微弱蛍光
を１枚のイメージとして検出・記録することが可能であ
る。なお、分子量が近く、同一レーン上のバンドが近い
ゲル２５については、目的とするバンドが十分分離する
まで電気泳動を続け、バンド間の分離距離を長くするこ
とで、イメージングすることが可能である。

【００２４】本発明の第８の実施例として蛍光顕微鏡に
おける微弱蛍光の回収率を向上する方法および装置につ
いて図１０を用いて以下に説明する。本装置は試料５６
に付加された蛍光色素を励起する光源１６、試料５６を
保持するステージ４６２、集光部としての半球形ガラス
６６および対物レンズ４６１、集光された光を光電変換
をする検出器８６より構成される。

【００２５】光源１６で発生した光は、バンドパスフィ
ルター２６を通過することにより試料５６を励起するの
に適当な波長を持った光に変換される。ダイクロイック
ミラー３６によりステージ４６２に向かって反射され
る。試料５６を含む液体６６４はスライドガラス６６６
とカバーガラス６６５により挟まれ、ステージ４６２に
設置されており、入射してきた励起光により試料５６に
付加された蛍光色素は等方的に発光する。ステージ４６
２より下方に発散する光は対物レンズ４６１により集め
られ、ミラー６６２を経て、エミッションフィルター７
６を通過し、検出器８６に至る。一方、ステージ４６２
より上方に発散する光に対しては、半球面に対して全反
射膜６６１をコートされた半球形ガラス６６により、反
射され、回収される。半球形ガラス６６はx、y方向にマ
イクロメーター６６３によって、ステージ４６２に対し
て相対的に微動できる機構になっている。ステージ４６
２より上方に発した光は半球形ガラス６６により反射さ
れ、再び試料面に集められ、対物レンズ４６１により集
光され、上述の光路を経て、検出器８６に至る。従来の
光学系と比較して検出器８６の光電面に到達する光子数
は２倍となり、従ってＳ／Ｎ比は１.４倍となる。本発
明により、従来の検出器８６由来のショットノイズに埋
もれて検出不可能であった微弱蛍光シグナルも効率よく
検出が可能となる。また、励起光の強度と蛍光色素の寿
命は反比例の関係にあるので、観察したい試料５６の蛍
光が微弱であるが試料５６をより長時間観察したい場合
において、上述した発散する光を反射し、回収する技術
を使用することにより、従来蛍光シグナルを得るために
必要であった励起光強度を弱めることができるため、試
料５６を観察できる時間を延ばすことが可能であり、本
発明が有効である。

【００２６】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明を用いるこ
とによって、試料より等方的に発光する微弱蛍光を反射
し、回収することにより、微弱蛍光強度および検出のＳ
／Ｎ比を向上し、短時間、高分解能で計測することがで
きるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施例の基本構成を示す模式
図。

【図２】図１で示した第１の実施例の装置のＡ−Ａ断面
図。

【図３】本発明の第２の実施例の装置の断面図。

【図４】本発明の第３の実施例の基本構成を示す模式
図。

【図５】本発明の第４の実施例の基本構成を示す模式
図。

【図６】本発明の第５の実施例の基本構成を示す模式
図。

【図７】図６で示した第５の実施例の装置のＢ−Ｂ断面
図。

【図８】本発明の第６の実施例の基本構成を示す模式
図。

【図９】図８で示した第６の実施例の装置のＣ−Ｃ断面
図。

【図１０】本発明の第７の実施例の基本構成を示す模式
図。

【符号の説明】

１１、１４、１６、１５１、１７１、１８１…照明光
源、２１、２４、２６、１５３、１７２、１８２…バン
ドパスフィルター、２５…ゲル、３１、３２、３４…励
起光通過光路、２７２、２８２…通過口、３５、４５…
電気泳動により分離した各バンド、２７、３６、２８
１、２８３、９５…ダイクロイックミラー、３７、３
８、４１、４２、４４…キャピラリー管、４１１、４４
１、４７１、４８１…試料を含む溶液が流れていく方
向、４７、４８、５１、５２、５４、５６…試料、５５
…反射用ガラス、２７１、２８３、５２１…集光レン
ズ、５４１…凹レンズ上に研磨された楕円形ガラスの表
面、５７１、５８１、６１、６２…球形ガラス、５５
１、５７２、５８２、６１１、６２１、６４１、６６１
…全反射膜、６６４…液体、６６５…カバーガラス、６
６６…スライドガラス、６４…楕円球形ガラス、６５…
集光用ガラス、６６…半球形ガラス、６６３…マイクロ
メーター、６７、７８１、７８２、７１、７２、７４、
７５、７６…エミッションフィルター、８１、８２、８
７、８８１、８８２、８４、８５、８６…検出器、８５
１…スリット、９１、９２、９７、９８、９４…検出器
制御部、１５４…励起光の方向、４６１…対物レンズ、
６６２…ミラー、４６２…ステージ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者安田賢二埼玉県比企郡鳩山町赤沼2520番地株式会社日立製作所基礎研究所内 (72)発明者坂本健埼玉県比企郡鳩山町赤沼2520番地株式会社日立製作所基礎研究所内Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 DA05 EA01 EA19 GA04 GA07 GB03 GB05 HA04 HA09 JA03 LA01 MA01 MA04 MA11 NA01 NA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛍光色素を付加した試料を含む流体を光透
過性を持つ容器に保持あるいは通過させ、前記蛍光色素
を励起する波長の光を照射し、前記蛍光色素を励起した
ときに等方的に発光する蛍光を反射して回収し、前記蛍
光色素を励起する波長の光を除去し、前記蛍光を検出す
ることを特徴とした微弱蛍光検出方法。
【請求項２】蛍光色素を付加した試料と、前記試料を含
む流体を保持あるいは通過させる光透過性を持つ容器
と、前記蛍光色素を励起する波長の光を照射する手段
と、前記蛍光色素を励起したときに等方的に発光する蛍
光を反射し、回収するための手段と、前記蛍光色素を励
起する波長の光を除去する手段と、前記蛍光を検出する
手段より構成されることを特徴とした微弱蛍光検出装
置。
【請求項３】請求項２記載の装置において、前記容器が
可視光を透過するキャピラリー管であり、またキャピラ
リー管を通る溶液の流れにより前記試料を輸送すること
を特徴とした微弱蛍光検出装置。
【請求項４】請求項２記載の装置において、前記容器内
がゲルで充たされており、前記容器は可視光を透過する
ことを特徴とした微弱蛍光検出装置。
【請求項５】請求項２記載の装置において、前記試料よ
り発光する微弱蛍光を反射し、集光するための手段が、
研磨され、全反射膜によりコーティングされたガラスに
より構成されることを特徴とした微弱蛍光検出装置。
【請求項６】請求項５記載の装置において、全反射膜に
よりコーティングされたガラスが球形に研磨されている
ことを特徴とした微弱蛍光検出装置。
【請求項７】請求項５記載の装置において、全反射膜に
よりコーティングされたガラスが楕円球形に研磨されて
いることを特徴とした微弱蛍光検出装置。
【請求項８】請求項２記載の装置において、前記光源よ
り前記蛍光色素を励起する波長帯を透過し、反射する手
段が、バンドパスフィルターおよびダイクロイックミラ
ーにより構成されることを特徴とした微弱蛍光検出装
置。
【請求項９】請求項２記載の装置において、前記光源よ
り前記蛍光色素を励起する波長帯を除去する手段とし
て、蛍光シグナルとして検出したい波長帯のみを透過さ
せる光学フィルターを使用することを特徴とした微弱蛍
光検出装置。
【請求項１０】請求項２記載の装置において、前記蛍光
色素を効率よく励起するため、前記励起光を前記試料に
集光する光学レンズを配置することを特徴とした微弱蛍
光検出装置。
【請求項１１】請求項２記載の装置において、前記蛍光
色素が各種イオン濃度に感受性を持つ蛍光色素であり、
この蛍光スペクトルを光学的に分割し、その蛍光強度比
を解析することによりイオン濃度を測定する手段を持つ
ことを特徴とした微弱蛍光検出装置。
【請求項１２】蛍光顕微鏡下で、蛍光色素を付加した試
料を含む流体をカバーガラスとスライドガラスで挟み込
み、前記蛍光色素を励起する波長の光を照射し、前記蛍
光色素を励起したときに等方的に発光する蛍光を反射し
て回収し、前記蛍光色素を励起する波長の光を除去し、
前記蛍光を検出することを特徴とした微弱蛍光検出方
法。
【請求項１３】蛍光顕微鏡下で、蛍光色素を付加した試
料と、前記試料を含む流体と、前記流体をカバーガラス
とスライドガラスで挟み込むことからなる標本と、前記
蛍光色素を励起する波長の光を照射する手段と、前記蛍
光色素を励起したときに等方的に発光する蛍光を反射
し、回収する手段と、前記蛍光色素を励起する波長の光
を除去する手段と、前記蛍光を検出する手段より構成さ
れることを特徴とした微弱蛍光検出装置。
【請求項１４】請求請１３記載の装置において、全反射
膜によりコーティングされたガラスが半球形に研磨され
ていることを特徴とした微弱蛍光検出装置。
【請求項１５】請求項１３記載の装置において、前記光
源より前記蛍光色素を励起する波長帯を透過し、反射す
る手段が、バンドパスフィルターおよびダイクロイック
ミラーにより構成されることを特徴とした微弱蛍光検出
装置。
【請求項１６】請求項１３記載の装置において、前記光
源より前記蛍光色素を励起する波長帯を除去する手段と
して、蛍光シグナルとして検出したい波長帯のみを透過
させる光学フィルターを使用することを特徴とした微弱
蛍光検出装置。
【請求項１７】請求項１３記載の装置において、前記蛍
光色素がイオン濃度に感受性を持つ蛍光色素であり、こ
の蛍光スペクトルを光学的に分割し、その蛍光強度比を
解析することによりイオン濃度を測定する手段を持つこ
とを特徴とした微弱蛍光検出装置。
【請求項１８】光源から発した光を通過させるバンドパ
スフィルタと、蛍光色素が付加された試料が流れるキャ
ピラリー管と、球形ガラスの表面にコートされ、前記光
の照射により前記蛍光色素から発せられた微弱蛍光を反
射する全反射膜と、反射された前記微弱蛍光をエミッシ
ョンフィルターを介して検出する検出器と、を有し、前
記球形ガラスの前記検出器に対向する面が、凸レンズ状
に整形されていることを特徴とする微弱蛍光検出装置。
【請求項１９】光源から発した光を通過させるバンドパ
スフィルタと、蛍光色素が付加された試料が流れるキャ
ピラリー管と、楕円球形のガラスの表面にコートされ、
前記光の照射により前記蛍光色素から発せられた微弱蛍
光を反射する全反射膜と、反射された前記微弱蛍光をエ
ミッションフィルターを介して検出する検出器と、を有
し、前記楕円球形のガラスの前記検出器に対向する面
が、凸レンズ状に整形されていることを特徴とする微弱
蛍光検出装置。
【請求項２０】光源から発した光を通過させる第一の光
分離手段と、試料が流れる流路と、反射部材の表面にコ
ートされ、前記光の照射により前記試料から発せられた
微弱蛍光を反射する全反射膜と、反射された前記微弱蛍
光を第二の光分離手段を介して検出する検出器と、を有
し、前記反射部材の前記検出器に対向する面が、凸レン
ズ状に整形されていることを特徴とする微弱蛍光検出装
置。
【請求項２１】前記試料は、蛍光色素が付加された試料
であり、前記反射部材は、球形ガラスまたは楕円球形の
ガラスであることを特徴とする請求項２０に記載の微弱
蛍光検出装置。