CN101868713A - 光束定形器、光学系统及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种光束定形器包括将幅度相等且符号相反的相位图案应用到两个正交偏振状态的偏振相关相位调节部件。在一个优选的实施例中,该光束定形器是由单轴对准下冻结的诸如可光聚合液晶聚合物之类的双折射材料制成的衍射元件,所述衍射元件包括多个区,每个区具有限定多个阶梯的阶梯状厚度。该光束定形器可以用来将像散引入偏振光束,或者对具有正交偏振状态的光束撤销像散。该光束定形器有利地用在诸如荧光扫描仪之类的检测设备中。
Description
技术领域
本发明涉及光束定形器,其特别地但不排他性地用于光学照射设备和方法中。例如,光学照射(和扫描)用在荧光检测系统和方法中。
背景技术
使用荧光检测的一个实例是在核酸测试(NAT)中。这是用于检测疾病的遗传倾向的分子诊断中的核心元素,其用于确定RNA的表示水平或者识别造成感染的病原体,比如细菌和病毒。
在许多情况下,特别是在病原体的识别中,合理样本体积内存在的靶DNA的量非常低,并且这不允许直接的检测。扩增(amplification)技术是必需的,以便获得靶材料的可检测的量。不同的扩增技术被提出并且用在日常实践中。最广泛使用的技术基于所谓的聚合酶链反应(PCR)。
扩增涉及在升高的温度(典型地>90摄氏度)下改变双链DNA的性质、在降低的温度(近似65度)下将引物(primer)特异性结合到DNA样本并且复制从引物位置开始的原始序列(在近似70度下)。这个过程重复并且在每个循环中加倍具有该特定序列的DNA的量(当以100%的效率进行时)。
扩增之后,通过例如在毛细管中的电泳分离之后或者在对施加到扩增产物在其上流动的表面上的斑点中的所谓捕获探针进行杂化之后测量加标记的扩增的DNA的荧光强度来检测靶DNA的存在性。
用于荧光检测的标准技术是使用扫描共焦显微镜。典型地,小的(<1μm)衍射极限斑(diffraction limited spot)用来激发焦平面内的荧光。在系统的检测部分中,只有由该单个激发点产生的光被检测到。
先前已经提出,一定数量的斑点或者整条线的并行激发允许扫描速度的增大,而对检测系统的共焦性没有重大影响。像素化检测器可以用来检测荧光发射。然而,也已经建议了使用更为紧凑的检测器,其基于简单光电二极管与狭缝的结合使用以允许共焦检测。
为了产生用于共焦线扫描的激发束,已经提出通过增加诸如圆柱透镜之类的添加所谓的像散的光学元件来修改用于利用聚焦斑进行扫描的光学设备。如果光束的截面定义为xy平面,那么光束中的每根射线由坐标(x,y)表征。如果坐标为(x,0)的x轴上的射线具有与坐标为(0,y)的y轴上的射线不同的焦点,那么光束是像散的。
利用圆柱透镜,那么从样本反射并且由收集透镜(物镜)收集的光将不再是准直束。该光将总是在至少一个方向上发散。当光用于自动聚焦或跟踪目的时,这可能需要额外的努力。
这种发散也可能在宽场荧光显微镜中出现。在这样的显微镜中,激发光离焦以照射样本的大面积。
发明内容
本发明的目的尤其是提供光束定形而不在光束内引入发散。
本发明由独立权利要求限定。从属权利要求限定了有利的实施例。
依照本发明,提供了一种光束定形器。该光束定形器可以用来将像散引入光束,但是也可以用来对具有正交偏振状态的光束撤销像散。
光束定形器可以包括由双折射材料形成的衍射元件。它可以例如包括多个区(zone),每个区包括限定多个(例如4个、5个或者超过5个)阶梯的阶梯状厚度。该部件可以用于将像散引入入射准直光束。
依照本发明,还提供了一种用于使用光束定形器照射样本的光学设备。
本发明的光束定形器因而可以用来对入射光离焦,从而可以获得线聚焦或者宽区域聚焦。然而,再次穿过光束定形器的反射光将再次(基本上)被准直。
所述光学设备包括检测从样本反射的光的第一检测器。该检测可以用来检查样本上的有关聚焦和跟踪等的照射情况。优选地,光学设备还包括控制器,例如自动聚焦系统,其用于根据对从样本反射并且由第一检测器检测的光的分析控制成像系统。因此,反射光可以用于标准的自动聚焦和跟踪方法。当使用分束路径时,这是特别重要的。在分束路径配置中,在扫描期间光路的一部分相对于光路的其余部分运动。例如,光源和自动聚焦检测器是固定的,而物镜被扫描以完全地审查样本。这导致物镜与第一信号检测器之间的距离的变化。
如果这些元件之间的光未被准直,那么信号检测器上的光束的直径将根据物镜的位置而改变。这将导致焦点位置的不希望的变化。因此,在分束路径设计中确保运动部分与固定部分之间的光束基本上准直是重要的。
因此,偏振调节装置的目的是在两次穿过该装置之后提供偏振的正交变化。例如,相位调节部件包括四分之一波片。
照射样本的光可以被设置成包括例如具有为衍射极限的线宽的线焦点。
所述系统优选地包括用于扫描成像系统的装置,并且控制器于是包括聚焦和跟踪系统。
光源(24)可以包括例如激光二极管或发光二极管或者任何其他适当的光源。
依照本发明,提供了一种结合了依照本发明的光学系统的检测设备。该检测设备包括能够检测由照射束产生的并且来自样本的辐射的第二检测器。特别是该检测的光用来获得样本的信息。检测设备受益于所述光学系统的所有优点并且提供改进的样本检查以及相对不那么复杂和昂贵的设备。
依照本发明,还提供了一种处理光束的方法、一种使用该处理方法照射样本的方法。
该照射方法可以包括这样的步骤,其中照射样本包括跨样本扫描偏振调节的光束,并且其中控制成像系统包括控制扫描。
附图说明
现在将参照附图详细地描述本发明的实例,在附图中:
图1示出了已知的荧光扫描仪;
图2示意性地示出了本发明的光学系统的操作;
图3示出了依照本发明的光束定形器的实施例;
图4示出了用于图3的光束定形器的区位置;以及
图5为示出了计算的光束定形器配置的一个实例的表格。
具体实施方式
本发明涉及使用例如相位板形式的光束定形器,其根据光束的偏振将相位图案(phase pattern)添加到光束。该板将幅度相等但是符号相反的相位图案添加到两个正交的偏振状态。此外,在一个实施例中,优选的是,光束定形器为具有笔直区的衍射元件并且由双折射材料制成。
光束定形器可以是用于作为生物传感过程的一部分,激发样本中的荧光以便随后检测的检测设备的一部分。
通过利用经过物镜的光辐射激发设备中的荧光团并且收集例如在反射模式下经过相同透镜的发光来检测所述荧光团的方法是已知的。在通过滤波器设备以便选择适当的波长范围之后,发光辐射被投影到传感器设备上。可以由不同的致动装置使透镜以受控的方式在三个方向上运动,以便允许在感兴趣样本上扫描。典型地,使用共焦成像装置。
图1示出了已知荧光扫描仪的基本部件。待研究的样本被限制到衬底20内的给定体积中。诸如激光器之类的光源24产生的光用来激发样本中的荧光。从光源发出的光由准直器透镜L1准直。然后,该准直光束在通过偏振分束器21、四分之一波片22、带通滤波器23和二向色分束器25之后借助于激发透镜26聚焦到样本内,所述二向色分束器即波长依赖反射器,其将激光定向到激发透镜26。
透镜26可以优选地在所有三个维度上相对于样本运动。该相对运动可以任意地解耦,例如,样本可以运动到x-y平面并且该透镜可以在z方向上运动。可替换地,样本可以保持固定并且该透镜独自具有所有三个自由度(x-y-z)。任何其他的设置也是可能的。
诱导的荧光(作为激发光聚焦到样本内的结果)由在该实例中为与激发透镜26相同的部件的收集透镜收集,并且定向到检测器28。
任何反射的未吸收激光再次由分束器25反射,而荧光亮度穿过分束器25。第二带通滤波器27提供进一步的滤波,并且光然后由将样本成像到检测器28上的成像透镜L2聚焦到检测器28上。
可以使用许多不同类型的检测器,例如光电倍增管、雪崩光电检测器、CCD检测器或者光电二极管检测器。
对于共焦成像,激发体积保持最小,理想地为激发透镜26能够创建的衍射极限斑。典型的共焦体积为立方微米的数量级,这取决于激发透镜26的强度(数值孔径,NA)。在该体积内产生的荧光由收集透镜收集并且成像到检测器上。在共焦方法中,焦点与检测路径上的点共焦。在检测路径上的该点处,典型地放置了小的针孔以便过滤掉来自不同于焦点的位置的任何光。
通过针孔的光被定向到检测器。有可能检测器本身起着针孔的作用,限制在于,检测器的侧向尺寸必须与按收集透镜26的焦距除以成像透镜L2的焦距调节的焦点尺寸匹配。
作为端点生物实验的结果,这种共焦模式最适合研究表面固定化测定(surface immobilization assay)。表面被扫描以分析整个样本。
检测器的横向尺寸通过考虑收集透镜26和成像透镜L2的场来设计。
当扫描相同表面时,控制装置29保持物镜的焦点精确地位于与分析物接触的分析设备的内表面处。物镜的焦点也可以有意地偏移。
本发明特别涉及对图1系统的修改,其适于提供共焦线而不是共焦斑形式的激发束。可替换地,本发明可以用来将光源离焦成激发体积。本发明使用了偏振相关相位板。
总体思想参照图2来解释。
图2a示出了标准光路。为了清楚起见,将光路展开。入射光36由聚焦透镜40聚焦到样本42上,并且反射光由相同的聚焦透镜40收集。反射光38因而完全平行。
如图2b中所示,为了修改焦点的位置,将折射元件44置于入射束36中。当光现在由透镜40聚焦时,焦点将如图所示位于样本42之前。反射光将由透镜40收集并且将再次穿过折射元件44。最终的出射束38将不平行地传播。
图2c示意性地示出了本发明的光学系统。入射束36是线性偏振的,并且元件48将相位图案添加到该束上。这将具有与折射元件44相同的效果。光穿过四分之一波片50。同样地,透镜40将聚焦到样本42之前。反射光由透镜40收集并且然后再次穿过四分之一波片50。当它再次撞击到元件48上时,偏振将因而超过90度旋转,并且这将添加一定相位图案,该相位图案与在入射束上添加的相位图案符号相反但是具有相同的幅度。这导致出射束38再次是平行的。
在一个优选的实施例中,相位板是由单轴对准下冻结的诸如可光聚合液晶聚合物之类的双折射材料制成的衍射元件。
这种材料的一个实例在波长λ=660nm下具有no=1.5323的寻常折射率(对于垂直于对准轴的偏振而言)以及ne=1.6679的非常折射率(对于平行于对准轴的偏振而言),给出平均折射率n=1.6001和双折射率Δn=0.1356。
所述衍射结构包括一定数量的区,每个区包括N个阶梯,其中优选地N=4或N=5。每个阶梯具有高度hj(j=0,1,...,N-1),其中参考阶梯hO=0。图4中以截面示出了该结构。因此,该结构被限定为一组重复的区,每个区具有相同阶梯高度的轮廓。
在图3中,衍射束发生像散异常,这取决于入射束的偏振(在附图平面内或者垂直于附图平面)。对于两个偏振而言,像散的量幅度相等但具有相反的符号。
于是,所述两个偏振模式的每个阶梯的相位(对于波长λ)为:
该相位结构将光束分裂成不同的衍射级。目的是最大化e模式的第+1(第-1)级和o模式的第-1(第+1)级的衍射效率。在这种情况下,以最高的可能的效率将幅度相等但是符号相反的相位图案添加到所述两个模式的光束。N阶梯光栅的最大效率为[sin(π/N)/(π/N)]2,其对于N=4简化为8/π2=81%并且对于N=5简化为25(5-√5)/8π2=88%。在以下情况下找到最佳值:
其中mo,j和me,j为整数。有可能找到一组高度hj,其在N=4下对于两种模式给出大约79%的衍射效率并且在N=5下对于两种模式给出大约85%的衍射效率。下表中给出了设计的一个实例。
j=0 | j=1 | j=2 | j=3 | |
hj(μm) | 0 | 2.746 | 9.353 | 7.151 |
Φo/2π | 0 | 2.215(2.25) | 7.543(7.50) | 5.767(5.75) |
Φe/2π | 0 | 2.779(2.75) | 9.465(9.50) | 7.237(7.25) |
该表给出了针对为o模式第+1级以及为e模式第-1级而给定的折射率值的N=4阶梯光栅的设计。括号中的相位值给出了理想值。
可能的应用的一个实例是提供一定相位图案,其将像散像差添加到光束,使得当光被物镜聚焦时,焦点将伸长为长度大约100μm的线。
所述区和阶梯的位置和宽度从形成的所需像散像差函数得到。该像散像差函数为:
其中x和y光瞳坐标,并且fp为相位元件产生的焦距。所需的像差函数仅依赖于x,因此所述区为在y方向上取向的直条纹。像散焦线之间的距离于是为:
其中a为光瞳半径,NA为物镜数值孔径且n为聚焦到其中的介质的折射率,并且焦线的长度为:
例如,取NA=0.60、n=1.33、a=1.75mm以及所需的L=100μm,结果为fp=114mm(在该分析中,忽略了相位元件与物镜之间的距离-如果将其考虑,那么会出现小的差别)。
区k-1与区k之间的边界由W=kλ限定。光瞳边缘处区的宽度于是如下:
其对于给定的数量给出Δx=43μm。对于4阶梯光栅而言,这意味着最小的阶梯宽度为大约11μm。图4以及图5的表格中呈现了数值计算的阶梯和区边界位置。图4示出了衍射相位元件的计算的区位置。对于给定的参数,区的总数为21,对于4阶梯实现而言,这意味着阶梯总数为84。
图4表明,区宽度在光瞳的增加的半径下减小,其中初始区宽度近似为0.4mm并且最终的区宽度近似为0.04mm。子区阶梯在每个区内。在图5中,可以看出,子区阶梯的宽度也逐渐减小。图5表明,第二区(子区5)起始于x=0.387937,其对应于图5中示出的第一阶梯。因此,图5中的阶梯的位置对应于子区4、8、12、16、......等等。
图5的表格由针对1.75mm的最大直径的计算而得到。最终的区因此被改变成适合1.75mm的最大值,并且未达到20.5的期望相位。表格中的值rho为归一化直径,其在0和1之间延伸。
相位板基准面(base level)以上的每个阶梯的高度从上表中导出。
如上面所解释的,为了提供线聚焦,衍射阶梯为y方向上的线,并且图5中提到的“半径”基本上为线性维度。在这种情况下,为关于零对称的结构,即阶梯值对于x的负和正值是相同的。
在第二实例中,当使用与上面相同的透镜(NA=0.60,n=1.33,a=1.75mm)时,相位图案可以被设计成导致直径为100μm的圆斑。在这种情况下,像差函数将依赖于x和y。最终的结果将是如图3和6中所描述的类似阶梯图案,但是设计将包括圆形图案而不是直线。因此,图5中提到的“半径”变成真正的半径。
在线扫描方法中,焦平面内线的方向被设置成垂直于快速扫描方向。这可以通过旋转激光器和光束定形器组件来实现。
所述聚焦和跟踪装置可以是产生自动聚焦误差信号的标准象限检测器。一种优选的方法是如例如US4079247中所描述的像散聚焦方法。在该方法中,通过像散透镜(例如圆柱透镜)将反射光聚焦到具有四个段的分段检测器上。该系统被对准,使得当样本处于成像透镜的理想焦点上时,光相等地落在所有四个检测器上。当样本置于理想焦点位置的任一侧时,这将导致水平或竖直的像散线。在其中采用了像散激发束并且其中不补偿反射光的标准线扫描系统中,反射束中固有的像散将导致检测的聚焦误差信号中的大偏移量。这将需要完全重新设计用于自动聚焦目的的光学系统。通过像在本发明中所示的那样补偿反射束中的像散,不需要对自动聚焦系统做出改变。
在上面的实例中,透镜26用于照射光和反射光以用于聚焦和跟踪,并且实际上用于荧光照射。然而,例如对于非正常方向的照射或者对于透射模式下的操作,可以使用单独的透镜。
已经给出了仅仅一个用于可能的偏振相关光束定形元件的详细设计。应当明白的是,该光束定形元件被设计成在光束穿过透镜26之后产生希望的照度分布。因此,该详细设计将依赖于系统中的其他光学部件(透镜L1、透镜26、带通滤波器23)以及用来形成光束定形元件的材料的双折射率。本领域技术人员使用上面解释的技术应当能够设计出适当的光束定形元件,并且因而所述单个实例不应当被认为限制了本发明的范围。
本发明可以实现为图2所示系统的单个附加部件并且插入到偏振分束器21与四分之一波片22之间。然而,可以将本发明应用到与图2中所示单个实例不同的其他光学激发/检测装置。
上面描述了本发明的部件的仅仅一种用途。然而,该部件可以具有其他的用途,其中希望针对第一光学过程实现光束定形,而且对于后续光学过程撤销光束定形的像散效应。
存在本文描述的实施例的各种修改。因此,例如参照借助于荧光团发荧光的样本描述了本发明。然而,本发明一般可以用在以通常的方式产生光学信号的设备中。因此,可以对样本进行测量,其吸收一部分照射线束,使得其余线束光被收集并且结合样本的一种或多种成分或者添加的有利于成分检测的物质(例如标记物质)的存在性、特性(identity)和/或浓度提供有关样本的构成的线索。类似地,由样本产生的线束的反射效应可以用在检测过程中。可替换地,线束可以用作激发源以便激发样本的一种/或多种成分或者添加的物质,使得得到可以被收集和检测的发光辐射。在这里,发光意在包括荧光和/或磷光。
总体而言,本发明涉及用于照射样本的线的产生。该照射线在前面描述的检测设备中是有利的。本发明特别有益于线扫描或共焦线扫描以便加速检测过程。然而,在一些情况下,可能不需要覆盖表面区域的扫描。本发明因而也将提供其优势。
本发明一般适用于样本分析领域,其中需要在体积或表面上检查样本。本发明的应用因而可以是在需要线激发的分析方法中。这些也包括对气体、液体和/或固体样本的分析。
因此,本发明可以用于样本的化学分析以便确定其构成或者它可以用来检查化学过程或生化过程或生物过程的演进或进展。改进的扫描速度允许每时间单位收集更多的数据点,从而导致改进的动态测量。
不限于生物分析领域的是,本发明的优选应用是在分子诊断领域,其基于例如扩增之后的核酸、蛋白质或者其他生化实体或生物实体的检测。另外的优选应用领域包括临床诊断、医护点(point-of-care)诊断、高级生物分子诊断研究和光学生物传感器,特别地涉及结合扩增方法的DNA检测,例如PCR、q-PCR等等。本发明也可以用作例如用于病理用途的对细胞和/或组织成像的线扫描仪。也可以用于检测蛋白质的免疫测定中的检测。
上述实施例说明了而不是限制了本发明,并且本领域技术人员在不脱离所附权利要求书的范围的情况下应当能够设计出许多可替换的实施例。在权利要求书中,置于括号之间的任何附图标记都不应当被视为限制了权利要求。措词“包括/包含”并没有排除存在权利要求中未列出的元件或步骤。元件之前的措词“一”并没有排除存在多个这样的元件。在列举了若干装置的设备权利要求中,这些装置中的一些可以由同一硬件项实施。在相互不同的从属权利要求中陈述了特定的技术措施这一事实并不意味着这些技术措施的组合不可以加以利用。
Claims (12)
1.一种光束定形器(48),包括将幅度相等且符号相反的相位图案应用到两个正交偏振状态的偏振相关相位调节部件。
2.如权利要求1所述的光束定形器,包括由双折射材料形成的衍射元件。
3.如权利要求2所述的光束定形器,其中衍射元件包括多个区(区1......区N),所述多个区中的每个区包括限定多个阶梯的阶梯状厚度。
4.如前面任何一项权利要求所述的光束定形器,用于将像散引入入射准直光束(36)。
5.一种用于照射样本的光学系统,包括:
光源(24);
如前面任何一项权利要求所述的光束定形器(48),其用于将光源发射的准直光束(36)转换成照射束;
成像系统(26),其用于利用照射束照射样本;
第一检测器,其用于检测从样本反射的光;以及
偏振调节装置(50),其位于光束定形器(48)与样本(20)之间,并且其中从样本(20)反射的光在由第一检测器检测之前穿过偏振调节装置(50)和光束定形器(48)。
6.如权利要求5所述的光学系统,还包括用于基于对第一检测器检测的光的分析控制成像系统(26)的控制器(29)。
7.一种检测设备,包括:
如权利要求5或6所述的光学系统;
光学收集装置,其用于收集从样本发射并且由照射束产生的光;以及
第二检测器(28),其用于检测收集的光。
8.如权利要求7所述的检测设备,其中成像系统和光学收集装置共享激发/收集透镜(26)。
9.一种处理光束的方法,包括将幅度相等且符号相反的相位图案应用到两个正交偏振状态。
10.一种用于照射样本的照射方法,包括步骤:
使用光源(24)产生准直光束;
使用权利要求9的处理方法将准直光束转换成转换的光束;
该照射方法包括另外的步骤:
将转换的光束通过偏振调节装置(50),从而产生照射光束;以及
通过使用成像系统(26)利用照射光束照射样本。
11.如权利要求10所述的照射方法,还包括步骤:
将从照射光束发出的从样本反射的反射光束通过偏振调节装置(50);
使用权利要求9的处理方法将该反射光束重新转换成重新转换的光束;
将该重新转换的光束传送到第一检测器;以及
基于对第一检测器检测的所述重新转换的光束的分析控制成像系统。
12.一种检测方法,包括:
权利要求9-11中任何一项的照射方法;
该照射方法包括另外的步骤:
收集从样本发射并且由照射光束产生的光;以及
检测该发射的被收集的光。
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