CN102047099A

CN102047099A - 光学照射设备和方法

Info

Publication number: CN102047099A
Application number: CN2009801194919A
Authority: CN
Inventors: E·M·H·P·范迪克; C·A·赫泽曼斯
Original assignee: Koninklijke Philips Electronics NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2008-05-26
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2011-05-04
Also published as: WO2009144614A1; US8742384B2; EP2163884A1; US20110068260A1; EP2283343B1; JP2011521269A; EP2283343A1

Abstract

一种用于检测来自样本(36)的2D区域的光的光学系统包括用于收集来自样本的收集区的光的收集透镜(34)。光检测器(44)位置相对于样本固定，并且反射器装置(61)将收集的光定向到检测器。反射器装置包括可动部件并且收集透镜(34)可相对于样本运动。收集透镜和可动部件可被配置成限定不同的收集区，并且所述部件的运动实现来自收集区的光定向到光检测器(44)的基本上不变的区域。这种布置避免了对于庞大检测器的需要以便检测来自通过跨样本扫描而形成的2D样本区域的信号。

Description

光学照射设备和方法

技术领域

本发明涉及光学照射设备和方法。例如，光学照射用于荧光检测系统和方法中。

背景技术

使用荧光检测的一个实例是在核酸测试(NAT)中。这是用于检测疾病的遗传倾向的分子诊断中的核心元素，其用于确定RNA的表示水平或者识别造成感染的病原体，比如细菌和病毒。

在许多情况下，特别是在病原体的识别中，合理样本体积内存在的靶DNA的量非常低，并且这不允许直接的检测。扩增(amplification)技术是必需的，以便获得靶材料的可检测的量。不同的扩增技术被提出并且用在日常实践中。最广泛使用的技术基于所谓的聚合酶链反应(PCR)。

扩增涉及在升高的温度(典型地＞90摄氏度)下改变双链DNA的性质、在降低的温度(近似65度)下将引物(primer)特异性结合到DNA样本并且复制从引物位置开始的原始序列(在近似70度下)。这个过程被重复并且在每个循环中加倍具有该特定序列的DNA的量(当以100％的效率进行时)。

扩增之后，通过例如在毛细管中的电泳分离之后或者在对施加到扩增产物在其上流动的表面上的斑点中的所谓捕获探针进行杂化之后测量加标记的扩增的DNA的荧光强度来检测靶DNA的存在性。

本发明涉及用来向样本提供照射的设备以及使用方法。

用于荧光检测的标准技术是使用扫描共焦显微镜。典型地，小的(＜1μm)衍射极限斑(diffraction limited spot)用来激发焦平面内的荧光。在系统的检测部分中，只有由该单个激发点产生的光被检测到。

先前已经提出，一定数量的斑点或者整条线的并行激发允许扫描速度的增大，而对检测系统的共焦性没有重大影响。像素化检测器可以用来检测荧光发射。

照相机的主要缺点是读出速度以及这些检测器相当庞大和昂贵这一事实。本发明的目的是通过牺牲沿着激发线的长度的空间分辨率来克服这些问题。更紧凑的解决方案对于医护点(Point of Care)测试解决方案是重要的。

发明内容

依照本发明，提供了一种用于检测来自样本的2D区域的光的光学系统，该系统包括：

-收集透镜，其用于收集来自样本的收集区的光；

-光检测器，其在使用中位置相对于样本固定；

-反射器装置，其用于将收集的光定向到检测器，

其中反射器装置包括可动部件并且收集透镜可相对于样本运动，

其中收集透镜和可动部件可被配置成限定不同的收集区，并且其中所述部件的运动实现来自收集区的光定向到光检测器的基本上不变的区域。

这种布置避免了需要庞大检测器以便检测来自通过跨样本扫描而形成的2D样本区域的信号。这允许实现更紧凑、更廉价和更简单的解决方案。

所述反射器装置可以包括在垂直的平面内反射收集的光的第一和第二反射器以及将从第二反射器输出的收集的光定向到检测器的第三反射器。垂直反射平面的使用意味着可以使一个反射器线性地运动而不影响用于另一个反射器的输入和输出光束的位置。第一和第二反射器因而优选地包括可动部件，其可沿着反射的收集的光的轴运动。输入到第三反射器并且从第三反射器输出的光的位置因而是静止的，从而可以使用小的静态检测器。

所述系统还可以包括用于照射样本的照射系统，该照射系统包括：

-光源，以及

-用于将光源输出定向到反射器装置的装置，

其中反射器装置将光源输出定向到样本。

相同的反射器装置因而用于照射样本并且用于收集来自样本的光，例如响应于照射而产生的激发光。

所述反射器装置同样可以包括在垂直的平面内反射收集的光的第一和第二反射器以及将从第二反射器输出的收集的光定向到检测器的第三反射器。此外，可以提供波长相关反射器。这种布置可以限定：

-样本与检测器之间的第一收集光路包括通过波长相关反射器的透射、在第一反射器处的反射、在第二反射器处的反射以及在第三反射器处的反射；并且

-反射器装置的输入和样本之间的第二光源光路包括在第二反射器处的反射以及在波长相关反射器处的反射。

这两个路径提供了激发光到样本的路径选择以及光的收集，这些路径之间具有波长选择性。第二路径优选地不到达第三反射器和第一反射器。

所述反射器装置还可以包括仅在第二光源路径中的圆柱透镜。这使得线状照射能够用来照射样本。

所述系统可以包括荧光检测系统，其中照射系统用于激发样本以产生荧光。收集区于是可以包括具有衍射极限宽度的线。

检测器的光敏区域优选地与由反射器装置提供给检测器的照射的尺寸和形状匹配。例如，检测器可以包括单个光敏区域，例如光电二极管。检测器还可以包括聚焦到检测表面上的成像透镜。

本发明还提供了一种收集来自样本的光的方法，该方法包括：

-扫描收集透镜以收集来自样本的一系列收集区的光；

-使用反射器装置将收集的光定向到检测器，

其中所述方法包括配置收集透镜和可动部件以限定不同的收集区，并且其中所述部件的运动实现来自收集区的光定向到光检测器的基本上不变的区域。

本发明还提供了一种测量来自样本的荧光的方法，该方法包括：

-跨样本扫描光学信号，从而将激发辐射提供给收集区；以及

-使用本发明的收集方法通过激发诱导的荧光收集从样本的分析区发射的光；以及

-检测收集的光。

附图说明

现在将参照附图详细地描述本发明的实例，在附图中：

图1示出了基于DVD光学系统的已知荧光扫描仪；

图2示出了使用本发明的光学扫描设备的共焦扫描仪的实例；

图3更详细地示出了图2系统中使用的检测器；

图4用来解释共焦扫描的要求；

图5示出了可以使用的检测放大器的实例；以及

图6示出了图5电路中不同点处的信号的曲线图。

具体实施方式

总体说来，本发明涉及一种用于收集来自样本的光的光学系统。反射器装置将收集的光定向到检测器，并且可被配置成限定样本上的不同收集区。反射器装置的部件的运动实现来自收集区的光定向到光检测器的基本上不变的区域。

该系统可以用于在样本中激发荧光以便随后作为生物感测过程的一部分而进行检测。

在器件中通过利用经过物镜的光辐射激发荧光团并且收集例如在反射模式下经过相同透镜的发光来检测所述荧光团的方法是已知的。在通过滤光器件以便选择适当的波长范围之后，发光辐射被投射到传感器件上。可以由不同的致动装置使透镜以受控的方式在三个方向上运动，以便允许在感兴趣样本上扫描。典型地，使用共焦成像装置。

图1示出了基于DVD光学系统的已知荧光扫描仪的基本部件。待研究的样本被衬底12限制到给定体积中，形成微流体部分10。诸如激光器之类的光源14产生的光用来激发荧光。光由准直透镜L1准直并且随后借助于激发透镜16聚焦到样本中。

透镜16可以优选地在所有三个维度上相对于样本运动。该相对运动可以任意地解耦，例如，样本可以在x-y平面运动并且透镜可以在z方向上运动。可替换地，样本可以保持固定并且透镜独自具有所有三个自由度(x-y-z)。任何其他的布置也是可能的。

激光由偏振分束器PBS(即偏振相关反射器)反射并且穿过四分之一波片λ/4和第一带通滤光器BP1。

二向色分束器DBS(即波长相关反射器)将激光定向到激发透镜16。

诱导的荧光(作为激发光聚焦到样本内的结果)由在该实例中为与激发透镜16相同的部件的收集透镜收集，并且定向到检测器18。

任何反射的未吸收激光再次由分束器DBS反射，而荧光亮度穿过分束器DBS。第二带通滤光器BP2提供进一步的滤光，并且光然后由将样本成像到检测器上的成像透镜L2聚焦到检测器28上。

可以使用许多不同类型的检测器，例如光子倍增管、雪崩光子检测器、CCD检测器或者光电二极管检测器。

对于共焦成像，激发体积保持最小，理想地为激发透镜16能够创建的衍射极限斑。典型的共焦体积为立方微米的数量级，这取决于激发透镜16的强度(数值孔径，NA)。在该体积内产生的荧光由收集透镜收集并且成像到检测器上。在共焦方法中，焦点与检测路径上的点共焦。在检测路径上的该点处，典型地放置小的针孔以便过滤掉来自不同于焦点的位置的任何光。

通过针孔的光被定向到检测器。有可能检测器本身起着针孔的作用，限制在于，检测器的侧向尺寸必须与按收集透镜16的焦距除以成像透镜L2的焦距调节的焦点尺寸匹配。

作为端点生物实验的结果，这种共焦模式最适合研究表面固定化测定(surface immobilization assay)。表面被扫描以分析整个样本。

检测器的侧向尺寸通过考虑收集透镜16和成像透镜L2的场来设计。

当扫描相同表面时，控制装置19保持物镜的焦点精确地位于与分析物接触的分析器件的内表面处。物镜的焦点也可以有意地偏移。

本发明可以应用到参照图1解释的衍射斑分析设备。

然而，也提出了使用一定数量的斑点或者甚至整条线并行地照射样本。这使得分析时间能够被减少。因此，可以使用共焦线而不是共焦斑形式的激发束。

本发明将参照共焦线激发系统来加以描述。基本的系统示于图2中。

图2的实例使用了拆分光学设计，其中部分光学器件是固定的并且部分光学器件是活动的。

该系统的基本功能与参照图1解释的相同。因此，来自激光器20的光利用透镜21准直以形成平行激发束22。该光是偏振的，使得它被偏振分束器23反射。该光然后穿过1/4λ片24，得到圆偏振光。接下来，该光穿过带通滤光器25以从激发光中丢弃任何不希望的波长。该光然后继续传送到扫描仪40。

扫描仪40执行共焦线扫描，并且也实现本发明的简化的检测器装置。

图3更详细地示出了扫描仪40并且示出了通过扫描仪的光路。

进入的光23越过镜42并且被镜31反射。圆柱透镜32在一个方向折射光，以便提供到共焦线的转换。光然后由二向色镜33反射并且由物镜34聚焦到样本36上。

由于由透镜32实现的一个方向上的发散，聚焦将导致线35。荧光分子由该激发光激发。

荧光具有更长的波长，并且像在图1的实例中一样，这使得荧光能够借助于波长相关部件而遵循与激发路径不同的路径。

物镜34可以在深度方向71上(垂直地朝向或远离样本)运动以便允许聚焦到样本上。此外，通过使透镜34在方向72上运动，可以使样本上的线35在垂直于(？？？你补写的所述平行于)焦线72长轴的方向上运动。因此，在方向72上的单轴扫描允许激发样本的2D区域。

反射的光以及荧光均利用物镜34收集。反射的光再次由二向色镜33反射并且再次穿过圆柱透镜32。这导致在一个方向上稍微会聚的光束。该光然后由镜31反射并且作为图2中的光束26再次进入所述光学器件。

参照图2，该光然后再次穿过带通滤光器25和1/4λ片24。由于该光现在两次穿过1/4λ片，因而它相对于原始激光旋转90度并且因而现在由偏振分束器23透射。

反射的光的一部分由分束器27反射。其由透镜28a通过Foucault棱镜29聚焦到分裂检测器30a上。来自该检测器的信号用于将光自动聚焦到样本36上。

撞击分束器27的光的一部分被透射并且由透镜28b聚焦到分裂检测器30b上。该分裂检测器的信号用来允许跟踪样本36上的特征。

回到图3，荧光由二向色镜33透射并且由镜41反射。该光然后在进入的光之下在镜31上反射并且因而被镜42反射。滤光器45用来进一步将荧光与激发光分离。透镜43用来将光投射到检测器44上。圆柱透镜32导致样本36上的线照射，并且检测器44上的图像是该线的投影。

可以看出，扫描仪40实现两个光路。一个是样本36与检测器44之间的用于收集光的路径。这包括通过波长相关反射器33的透射、在第一反射器(镜41)处的反射、在第二反射器(镜31)处的反射以及在第三反射器(镜42)处的反射。另一个路径是反射器装置的输入23和样本36之间的光源光路。这包括在第二反射器(镜31)处的反射以及在波长相关反射器33处的反射。该第二路径不到达第三反射器(镜42)和第一反射器(镜41)，但是包括圆柱透镜32。

标记为61的框中所示的部件可以被认为一起限定了反射器装置。两个镜31和41在垂直的平面内反射收集的光。这意味着用于镜41的输入和输出光束处于包含该镜表面的法线的第一平面内。用于镜31的输入和输出光束处于包含该镜表面的法线的第二平面内，并且第一和第二平面彼此垂直。通过这种方式，如图3中可见，限定了3D Z形路径(具有成直角的拐角)。这意味着可以独立地调节每个镜，以便提供沿着一个轴的线束扫描。此外，它意味着即使跨样本扫描线束，光束相对于镜42的位置也是静止的。

为了建立样本的图像，使选择的元件50(透镜34、圆柱线32、反射器41以及波长相关反射器33)在箭头51所示的方向上运动。该方向垂直于圆柱透镜32产生的线的方向，并且与镜41反射的收集光的路径平行，即与入射到波长相关反射器33上的激发光的路径平行。这允许在沿着激发线的轴的第一方向上扫描。

为了在垂直方向上扫描，选择的元件50在示为62的方向上与镜31一起运动。这与镜31的进入的激发光平行，即与镜31反射的收集光平行。

这种布置确保了在测量样本上的不同位置时，检测器44上的图像以及图2中所绘的其他光学部件上的光不移动。在扫描期间，以特定积分时间/带宽读出检测器。

因此，所述反射器装置允许在感兴趣样本上扫描线束。此外，共享的光学部件确保了提供给检测器44的光束保持静止。

本发明的这种实现因此允许并行激发方法与作为检测器44的简单光电二极管结合使用。检测器的有源区域的形状因而与照射斑的形状匹配并且这保持静态。

对于共焦操作，重要的是使检测器的光电二极管的形状和尺寸与激发线的尺寸匹配。这可以从图4看出，图4通过示出共焦显微镜的光路描绘了共焦检测的一般原理。

如图4a中所示，来自激光器100的光201由透镜102聚焦到衬底103上。在激发焦点中产生的荧光202由透镜102经由二向色镜101成像到检测器104上。

图4b描绘了检测器平面内的光。聚焦光被聚焦到小斑点，并且离焦贡献203导致检测器平面上更大的斑点302。当线用来照射样本时，得到的荧光也将在检测器平面内形成窄线304，这种情形在图4c中绘出。同样地，透镜(102)的焦平面之外产生的荧光将在检测器平面内形成更大的斑点303。

因此，为了丢弃背景，重要的是确保检测器的尺寸和取向与检测器平面内的荧光线匹配。衬底上的激发线可以为近似100μm×1μm。如果在检测路径中使用了10倍的放大率，那么荧光将在检测器上形成近似1mm×10μm的条纹。

原则上，有可能制造具有该尺寸的有源区域的二极管。其优点在于，有源区域相当小，导致暗电流降低。然而，当设计特定二极管不可行时，有可能使用其中部分有源区域被掩蔽的二极管。这可以通过直接在二极管上添加(金属)掩模或者通过将具有窄缝的屏置于二极管之前来完成。在这种情况下，透镜43(在图3中)的焦点应当与缝的开口重合；于是，只要所有穿过缝的光被收集，则可以将二极管置于缝之后的任意距离处。

优选地，使用积分放大器读出检测的信号。这优选地作为涉及的低电流水平的结果。例如，所产生的荧光的量可能在700nm处为大约200fW。这将导致大约～100fA的电流信号。

原则上，可以利用跨阻抗放大器将该电流转换为电压。然而，这种放大器的问题在于，所需的大电阻器添加了大量的噪声。一种更好的方法是使用如图5中所示具有小的积分电容器C(例如100pF)的积分运算放大器。其将电流转换成电压，该电压然后可以利用快速而精确的模数转换器测量。

图6示出了出现在图5电路中的基于其中三个区在样本表面上限定的仿真的各种不同波形，其表现出100fA的最大信号强度以及150μm的直径。在仿真期间，以1mm/s的速度扫描样本。

图5的电路包括用于接收来自受激发的荧光的光子的检测器44。得到的输入电流示于图6a中。

所述运算放大器示为80，具有在到倒相输入端的反馈路径中并联的电容器C和开关S。这些部件可以是运算放大器封装的片上部件。ADC 82提供采样的积分器输出作为输出，如图6b所示。在该仿真中，来自实际测量的噪声被添加到该信号。

在框84中的串行处理、低通滤波(60Hz和120Hz处)和ΔT＝7.3ms的微分之后，得到图6c中所示的输出。不同的斑点可以清楚地与背景区分。

本发明可以用在紧凑光学生物传感器领域，特别是用在医护点测试设置中。这样的生物传感器可以用来检测不同类型的分子，例如蛋白质、DNA/RNA以及分子诊断领域中的小分子。

所述光学系统可以基于标准CD/DVD播放器/记录器的光学器件。

在上面的实例中，透镜34用于激发光和荧光，并且它也可以用于聚焦和跟踪信号。单独的透镜可以用于激发光和荧光，其例如利用非法向照射方向，或者工作于透射模式下。

本发明特别有益于共焦扫描/线扫描。然而，更一般地，本发明涉及光学收集装置对样本的扫描，收集的信号被路由到静态检测器上的相同位置，使得检测器孔径可以与样本的扫描区的尺寸匹配。这个概念可以用于其中将激发光提供给样本的荧光检测，但是它也可以仅用于其中不需要激发的光收集，例如用于检测发光。

上述实例中的扫描可以在两个方向上进行。然而，特别是当使用共焦线收集区时，仅仅一个方向上的扫描可能就足够了。本发明也可以应用到在样本上扫描共焦收集斑的系统。

本发明的优选的应用是在分子诊断、临床诊断、医护点诊断、高级生物分子诊断研究和光学生物传感器领域，特别地涉及结合诸如PCR、q-PCR之类的扩增方法的DNA检测。本发明也可以用作例如用于病理用途的对细胞和/或组织成像的线扫描仪。也可以用于检测蛋白质的免疫测定中的检测。

上面的详细实例是仅仅一个实例。大量的其他设计是可能的，例如其中扫描整个光学器件或者其中相对于光学器件扫描样本的系统。

上面的实例使用圆柱透镜以产生线状激发光和收集区(事实上，线是圆柱透镜和样本透镜的组合传递函数的结果)。可以代替圆柱透镜而使用相位板。

各种其他的修改对于本领域技术人员将是清楚明白的。

Claims

1.一种用于检测来自样本(36)的2D区域的光的光学系统，包括：

-收集透镜(34)，其用于收集来自样本的收集区的光；

-光检测器(44)，其在使用中位置相对于样本固定；

-反射器装置(61)，其用于将收集的光定向到检测器，

-其中反射器装置包括可动部件并且收集透镜(34)可相对于样本运动，

其中收集透镜和可动部件可被配置成限定不同的收集区，并且其中所述部件的运动实现来自收集区的光定向到光检测器(44)的基本上不变的区域。

2.如权利要求1所述的系统，其中所述反射器装置包括在垂直的平面内反射收集的光的第一(41)和第二(31)反射器以及将从第二反射器输出的收集的光定向到检测器(44)的第三反射器(420。

3.如权利要求2所述的系统，其中第一(41)和第二(31)反射器包括可动部件，其可沿着反射的收集的光的轴运动。

4.如前面的任何一项权利要求所述的系统，还包括用于照射样本的照射系统(20，21)，该照射系统包括：

-光源(20)；以及

-用于将光源输出(22)定向到反射器装置(61)的装置(21，23)，

其中反射器装置(61)将光源输出(22)定向到样本(36)。

5.如权利要求4所述的系统，其中所述反射器装置包括在垂直的平面内反射收集的光的第一(41)和第二(31)反射器、将从第二反射器输出的收集的光定向到检测器的第三反射器(42)以及波长相关反射器(33)，其中：

-样本与检测器之间的第一收集光路包括通过波长相关反射器(33)的透射、在第一反射器(41)处的反射、在第二反射器(31)处的反射以及在第三反射器(42)处的反射；并且

-反射器装置的输入(22)和样本(36)之间的第二光源光路包括在第二反射器(31)处的反射以及在波长相关反射器(33)处的反射。

6.如权利要求5所述的系统，其中第二路径不到达第三反射器(42)和第一反射器(41)。

7.如权利要求5或6所述的系统，其中所述反射器装置还包括仅在第二光源路径中的圆柱透镜(32)或相位板。

8.如权利要求5、6或7所述的系统，包括荧光检测系统，其中照射系统(20，21)用于激发样本(36)以产生荧光。

9.如前面的任何一项权利要求所述的系统，其中收集区包括具有衍射极限宽度的线。

10.如前面的任何一项权利要求所述的系统，其中检测器(44)的光敏区域与由反射器装置(61)提供给检测器的照射的尺寸和形状匹配。

11.如前面的任何一项权利要求所述的系统，其中检测器(44)包括单个光敏区域。

12.如权利要求11所述的系统，其中检测器(44)包括光电二极管。

13.如前面的任何一项权利要求所述的系统，其中检测器(44)包括聚焦到检测表面上的成像透镜(43)。

14.一种收集来自样本的光的方法，包括：

-扫描收集透镜(34)以收集来自样本的一系列收集区的光；

-使用反射器装置(61)将收集的光定向到检测器(44)，

其中反射器装置(61)包括可动部件并且收集透镜(34)可相对于样本运动，

其中所述方法包括配置收集透镜(34)和可动部件以限定不同的收集区，并且其中所述部件的运动实现来自收集区的光定向到光检测器(44)的基本上不变的区域。

15.一种测量来自样本的荧光的方法，包括：

-跨样本扫描光学信号(22)，从而将激发辐射提供给收集区；以及

-使用权利要求14的方法通过激发诱导的荧光收集从样本的分析区发射的光；以及

-检测收集的光。