JP2016183916A - Ｄｎａチップ画像のスポット有効性判定装置、ｄｎａチップ画像のスポット有効性判定方法、及びｄｎａチップ画像のスポット有効性判定プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＮＡチップ画像におけるゴミや擬似的なスポットに基づく誤検出を防止して、ＤＮＡチップを用いた検査の精度を向上させたＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置、方法及びプログラムを提供する。
【解決手段】プローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物がプローブに結合された状態で、ＤＮＡチップを撮影して得られるＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置であり、画像の二値化処理に用いられる閾値として、ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、ＤＮＡチップ画像から複数の二値化画像を作成する多段階二値化処理部と、二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出するスポット形状及び位置検出部と、スポット形状及び位置検出部により検出されたスポットの形状及び位置の良否を判定するスポット形状及び位置判定部を備える。
【選択図】図６

Description

本発明は、ＤＮＡチップを用いて非検査物を特定する技術に関し、特にプローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物がプローブに結合し、このＤＮＡチップを撮影して得られたＤＮＡチップ画像のスポットの有効性を判定するためのＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法、及びＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムに関する。

近年、食品検査や環境検査、臨床試験、家畜衛生等におけるカビや食中毒菌などの微生物の検査や、遺伝子検査などにおいて、ＤＮＡチップを用いた検査が行われている。このようなＤＮＡチップを用いた検査では、一般的に、まずＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などによって検査試料中に含まれるＤＮＡの一部を増幅して蛍光標識し、得られた増幅産物をＤＮＡチップに固定化されたプローブに結合させ、結合した増幅産物の標識を検出することによって、被検査物が特定される。
この標識の検出は、増幅産物がプローブに結合したＤＮＡチップを撮影して、得られたＤＮＡチップ画像におけるスポットを検出することによって行われる。すなわち、ＤＮＡチップ画像のスポットは、増幅産物の標識に対応して画像上に現れる。

したがって、このようなＤＮＡチップを用いた検査では、ＤＮＡチップ画像において、スポットが正確かつ良好に現れていることが重要である。
ところが、従来、ＤＮＡチップ上にゴミが存在すると、ゴミをスポットとして誤検出してしまうことがあるという問題があった。
また、ＤＮＡチップの製造上の問題や、あるいはＤＮＡチップを用いた検査作業中にチップ表面に触れてしまったりすることなどにより、本来はスポットが形成されない場合において、ムラや形状異常のある擬似的なスポットが発生し、これがスポットとして誤検出されてしまうことがあるという問題があった。

スポットの有無の判定などに関連する技術としては、例えば特許文献１に記載のＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像解析方法を挙げることができる。
この解析方法では、検出エリアを有するテンプレートを蛍光画像のスポットにあてはめ、検出エリアにおいて枠をｎピクセルずつジャンプさせながら輝度を測定し、各検出エリアにおいて輝度が検出された枠から上下各ｎピクセル、左右各ｎピクセルのブロック内にある枠について輝度を測定することにより、スポットの有無の判定が行われている。

また、特許文献２に記載のマイクロアレイ解析方法では、複数のスポットを有するマイクロアレイ基板を撮像し、得られたデジタル画像データからスポット毎の輝度分布曲線を算出してピークとなる座標を検出し、スポット毎の輝度分布曲線のピークとなる座標からスポットの位置関係を判定し、判定されたスポットの輝度を測定することにより、スポットの有無の判定が行われている。

さらに、特許文献３に記載の判定方法では、画像データにおいてスポットの位置を決定してスポットに対応するピクセル群を抽出し、抽出したピクセル群における検出強度のメジアン値と、ピクセル群から上位所定割合および／または下位所定割合のピクセルを除いた群における検出強度のメジアン値との比または差を算出し、算出した比または差と、所定の基準値とに基づいて、スポットの信頼性の良否を判定することが行われている。

特開２００９−２０４４１４号公報 特開２００９−６８９９６号公報 特開２０１３−１８６００７号公報 特開２００８−２５６４２８号公報

しかしながら、これらの解析方法では、スポットの検出精度を向上できるものの、ＤＮＡチップにおいて、スポットが形成される位置の中心付近にゴミが存在した場合などに、ゴミがスポットとして誤検出されることを有効に排除し得るものではなかった。
また、ＤＮＡチップの製造上又は検査作業中の問題で、ムラや形状異常のあるスポットが発生した場合に、その誤検出を有効に排除可能なものでもなかった。

ここで、特許文献４には、マイクロアレイ画像を二値化することなどによって、マイクロアレイ画像に分布するノイズに影響されずに、複数のスポットを有するブロックの位置を、基準スポット位置等の情報なしに自動的に検出する技術が開示されている。
しかしながら、この特許文献４に記載の技術も、ゴミがスポットとして誤検出されることや、ムラや形状異常のあるスポットによる誤検出を防止し得るものではなかった。

本発明は、上記の事情にかんがみなされたものであり、ＤＮＡチップ画像におけるゴミや擬似的なスポットに基づく誤検出を防止でき、ＤＮＡチップを用いた検査の精度を向上させることが可能なＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法、及びＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムの提供を目的とする。

上記目的を達成するため、本発明のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置は、プローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物が前記プローブに結合された状態で、前記ＤＮＡチップを撮影して得られるＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置であって、画像の二値化処理に用いられる閾値として、前記ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、前記ＤＮＡチップ画像から複数の二値化画像を作成する多段階二値化処理部と、前記二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出するスポット形状及び位置検出部と、スポット形状及び位置検出部により検出されたスポットの形状及び位置の良否を判定するスポット形状及び位置判定部とを備えた構成としてある。

また、本発明のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法は、プローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物が前記プローブに結合された状態で、前記ＤＮＡチップを撮影して得られるＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法であって、画像の二値化処理に用いられる閾値として、前記ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、前記ＤＮＡチップ画像から複数の二値化画像を作成するステップと、前記二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出するステップと、検出されたスポットの形状及び位置の良否を判定するステップとを有する方法としてある。

また、本発明のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムは、プローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物が前記プローブに結合された状態で、前記ＤＮＡチップを撮影して得られるＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムであって、コンピュータに、前記ＤＮＡチップ画像を入力させ、画像の二値化処理に用いられる閾値として、前記ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、前記ＤＮＡチップ画像から複数の二値化画像を作成させ、前記二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出させ、検出されたスポットの形状及び位置の良否を判定させることを実行させるものとしてある。

本発明によれば、ＤＮＡチップ画像におけるゴミや擬似的なスポットに基づく誤検出を防止でき、ＤＮＡチップを用いた検査の精度を向上させることが可能となる。

本発明の実施形態に係るＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置による多段階二値化処理を示す説明図である。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置による輝度のムラ及びＳ／Ｎ比値を算出するための解析領域を示す説明図である。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置による処理工程を示すフローチャートである。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置による基準スポット検出の処理工程を示すフローチャートである。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置による通常スポット検出の処理工程を示すフローチャートである。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置によるスポット形状及び位置判定結果を示す図である。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置による輝度のムラ及びＳ／Ｎ比判定結果、並びに総合判定結果を示す図である。

以下、本発明のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法、及びＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムの好ましい実施形態について説明する。

本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置は、プローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物がプローブに結合された状態で、ＤＮＡチップを撮影して得られるＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置であって、画像の二値化処理に用いられる閾値として、ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、ＤＮＡチップ画像から複数の二値化画像を作成する多段階二値化処理部と、二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出するスポット形状及び位置検出部と、スポット形状及び位置検出部により検出されたスポットの形状及び位置の良否を判定するスポット形状及び位置判定部とを備えたことを特徴とする。
また、本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置は、スポット形状及び位置検出部により検出されたスポットにおける輝度のムラを検出する輝度ムラ検出部と、輝度ムラ検出部により検出された輝度のムラの良否を判定する輝度ムラ判定部とをさらに備えたものとすることも好ましい。
さらに、本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置は、スポット形状及び位置検出部により検出されたスポットにおけるＳ／Ｎ比値を算出するＳ／Ｎ比算出部と、Ｓ／Ｎ比算出部により算出されたＳ／Ｎ比値の良否を判定するＳ／Ｎ比判定部とをさらに備えたものとすることも好ましい。

本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法は、プローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物がプローブに結合された状態で、ＤＮＡチップを撮影して得られるＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法であって、画像の二値化処理に用いられる閾値として、ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、ＤＮＡチップ画像から複数の二値化画像を作成するステップと、二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出するステップと、検出されたスポットの形状及び位置の良否を判定するステップとを有することを特徴とする。
また、本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法は、検出されたスポットにおける輝度のムラを検出するステップと、検出された輝度のムラの良否を判定するステップとをさらに備えたものとすることも好ましい。

本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムは、プローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物がプローブに結合された状態で、ＤＮＡチップを撮影して得られるＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムであって、コンピュータに、ＤＮＡチップ画像を入力させ、画像の二値化処理に用いられる閾値として、ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、ＤＮＡチップ画像から複数の二値化画像を作成させ、二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出させ、検出されたスポットの形状及び位置の良否を判定させることを実行させることを特徴とする。
また、本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムは、コンピュータに、検出されたスポットにおける輝度のムラを検出させ、検出された輝度のムラの良否を判定させるものとすることも好ましい。

本実施形態の前提として、ＤＮＡチップ画像の被写体であるＤＮＡチップには、上記の通り、プローブが固定化（スポッティング）されて、ＤＮＡチップ上にプローブからなるスポットが形成されている。そして、このプローブに対して、蛍光などで標識された被検査物を結合（ハイブリダイズ）させた状態で、ＤＮＡチップを撮影することで、本実施形態において用いられるＤＮＡチップ画像を得ることができる。

検査試料に被検査物のＤＮＡが含まれている場合、ＤＮＡチップ画像において、プローブが固定化されているスポットの位置に対応して、蛍光などで示されたスポットが現れる。
このように、「スポット」の用語には、一般的に、「ＤＮＡチップ上に形成されたスポット」と、「ＤＮＡチップ画像に現れたスポット」の２つの意味があるが、本実施形態において、単に「スポット」と称する場合は、「ＤＮＡチップ画像に現れたスポット」を意味するものとして用いている。

また、本実施形態の前提として、ＤＮＡチップ上には、各スポットの位置を推定するための基準となるスポット（基準スポット）と、被検査物を検出するための通常のスポット（通常スポット）が固定化されている。そして、ＤＮＡチップ画像において、これらにそれぞれ対応する基準スポットと通常スポットが現れる。

例えば、ＤＮＡチップ上に、縦に８個及び横に８個の合計６４個のスポットをマトリックス状に形成し、最下段の両端のスポットを基準スポットとし、残りのスポットを通常スポットとして用い、ＤＮＡチップ画像において、これらに対応する基準スポットと通常スポットが現れるようにすることができる。
本実施形態において、単に「スポット」と称する場合は、基準スポットと通常スポットの両方を含む意味として用いている。

次に、本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置について、図１〜図３を参照して説明するが、本発明のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置は、これに限定されるものではなく、前述した本発明の特徴を有し、かつ同様の効果を奏する範囲で適宜変更することが可能である。図１は、本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置の構成を示すブロック図である。図２は、多段階二値化処理を示す説明図であり、図３は、輝度のムラ及びＳ／Ｎ比値を算出するための解析領域を示す説明図である。

図１に示されるように、本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０は、ＤＮＡチップ画像入力部１０１、多段階二値化処理部１０２、スポット形状及び位置検出部１０３、スポット形状及び位置判定部１０４、検出エラー処理部１０５、輝度ムラ検出部１０６、輝度ムラ判定部１０７、Ｓ／Ｎ比算出部１０８、Ｓ／Ｎ比判定部１０９、通常スポット位置推定部１１０、及び判定結果出力部１１１を備えている。

ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０は、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、サーバー、スマートフォン、タブレットコンピュータなどの各種コンピュータを用いて構成でき、上記各構成は、コンピュータにおけるＣＰＵ及びメモリ等から構成することができる。また、このような各構成を備えた専用の計数装置として構成することもできる。

ＤＮＡチップ画像入力部１０１は、ＤＮＡチップ画像を撮影して得られたＤＮＡチップ画像を、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に入力する。入力されたＤＮＡチップ画像は、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０におけるハードディスクやメモリ等に記憶させることができる。

多段階二値化処理部１０２は、入力されたＤＮＡチップ画像に対して、二値化処理を実行して、複数の二値化画像を作成することができる。
すなわち、本実施形態における二値化処理は、ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、複数の二値化画像を作成可能な点に特徴がある。

具体的には、多段階二値化処理部１０２は、ＤＮＡチップ画像の輝度の最小値と最大値を用いて、その最小値から最大値までの間において、図２に示すように、例えば等間隔（Ｎ刻み，Ｎ＝正の整数）など網羅的に複数の閾値を設定して、各閾値を用いて複数の二値化画像を作成することができる。この輝度の最小値と最大値は、予めＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に記憶させたものを用いてもよく、多段階二値化処理部１０２によりＤＮＡチップ画像にもとづき決定されたものを用いてもよい。

スポット形状及び位置検出部１０３は、多段階二値化処理部１０２により作成された二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出する。
また、スポット形状及び位置検出部１０３は、スポットの形状として、スポットの円形度及び大きさを検出し、スポットの位置として、スポットの中心位置を検出することができる。

スポットの円形度、大きさ、及び中心位置を検出する方法としては、例えば二値化画像をラベリング処理することにより行うことができる。
具体的には、二値化画像において、スポットの形状及び位置の検出処理を行う一定範囲に対してラスタスキャンを行い、縦、横、斜め方向に連続している部分を同じラベルにする８連結ラベリング処理を行って、同じラベルで示されたピクセル（pixel）にもとづきスポットを検出し、そのピクセル数を面積Ｓ（大きさ）として取得することができる。また、外側のピクセルを線で繋いだ長さを周囲長Ｌとして、４πＳ／Ｌ^２の式により円形度を得ることができる。また、同じラベルで示されたピクセルの全ての座標の平均値を算出し、これを中心位置として取得することができる。

スポットの形状及び位置の検出処理を行う一定範囲は、基準スポットについては、基準スポットを探索する一定範囲として、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に予め記憶させておくことができる。
また、通常スポットについては、後述する通常スポット位置推定部１１０によって推定され、通常スポットを探索する一定範囲として、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に記憶させたものを用いることができる。

スポット形状及び位置判定部１０４は、スポット形状及び位置検出部１０３により得られたスポットの円形度、大きさ、及び中心位置が、良好であると判定される設定範囲内にあるか否かを判定する。
具体的には、例えば円形度が０．６以上、大きさが５０ピクセル以上かつ３００ピクセル以下、中心位置が推定された位置に対して半径１０ピクセル以内の場合に、良好と判定することができる。このような場合、スポットの形状が異常ではなく、位置も良好と判定することができる。
ただし、本実施形態は、これらの数値に限定されるものではなく、判定基準は適宜変更することができる。特に、この具体例では単位としてピクセルを用いているところ、大きさと中心位置は、撮影に用いるカメラの画素数やレンズ倍率によって大きく変わるため、これらの数値はあくまでも参考として示したものである。

スポットの中心位置を判定する理由は、スポットを探索する範囲としてＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に記憶された一定範囲と、ＤＮＡチップ画像における実際のスポットの位置との間に大きなズレが生じる場合があるためである。
このようなズレが生じる主たる原因は、ＤＮＡチップの製造工程においてプローブをＤＮＡチップにスポッティングする時、製造装置の機械精度とプローブを含む薬品の表面張力の状態によって、スポットの位置の精度が左右されることにある。
本実施形態によれば、スポットの中心位置を判定することによって、スポットの有効性を高い精度で判定することが可能になっている。

検出エラー処理部１０５は、基準スポットの検出において、スポット形状及び位置判定部１０４により、スポットの形状又は位置が良好でないと判定された場合、判定結果出力部１１１によりエラーを出力させて、処理を終了させることができる。

輝度ムラ検出部１０６は、スポット形状及び位置検出部１０３により検出されたスポットにおける輝度のムラを検出する。
このとき、輝度ムラ検出部１０６は、ＤＮＡチップ画像入力部１０１により入力されたＤＮＡチップ画像における当該スポットの輝度のムラを検出する。
また、輝度ムラ検出部１０６は、図３に示すように、スポットの大きさより小さい範囲を輝度解析範囲４として設定して、この解析範囲における輝度のムラを検出する。このように、解析範囲をスポットの大きさより小さい範囲にすることで、スポットにおける最も輝度の高い部分を検出対象とすることができ、安定した検出結果を得ることが可能となる。

輝度のムラを検出するための指標としては、次の２つを用いることができる。
まず、第一の輝度ムラ指標として、変動値（ＣＶ値）、すなわちスポットにおける輝度の標準偏差を輝度の平均値で割った値を用いることができる。
また、第二の輝度ムラ指標として、スポットにおける輝度から最小値、最大値、及び平均値を取得して、次の式（１）にもとづき算出した値を用いることができる。
（輝度の最大値−輝度の最小値）／輝度の平均値・・・式（１）

輝度ムラ判定部１０７は、輝度ムラ検出部１０６により検出された輝度のムラの良否を判定する。
具体的には、例えば変動値が２０以下の場合に、ムラがなく、良好であると判定できる。より好ましくは、変動値が１５以下、さらに好ましくは１０以下の場合に良好であると判定できる。
また、例えば第二の輝度ムラ指標が０．５以下の場合に、ムラがなく、良好であると判定できる。より好ましくは、第二の輝度ムラ指標が０．３以下の場合に良好であると判定できる。

Ｓ／Ｎ比算出部１０８は、スポット形状及び位置検出部１０３により検出されたスポットにおけるＳ／Ｎ比値を算出する。
このとき、Ｓ／Ｎ比算出部１０８は、ＤＮＡチップ画像入力部１０１により入力されたＤＮＡチップ画像における当該スポットのＳ／Ｎ比値を算出する。
具体的には、Ｓ／Ｎ比算出部１０８は、スポットにおける輝度の中央値を取得すると共に、バッググラウンド値としてスポットの周辺における輝度の中央値を取得し、次の式（２）にもとづきＳ／Ｎ比値を算出することができる。
（輝度の中央値−バッググラウンド値）／バッググラウンド値・・・式（２）
バッググラウンド値は、例えば図３に示すように、スポットを囲む四角形におけるスポットの外側四隅を対象として、取得することができる。

Ｓ／Ｎ比判定部１０９は、Ｓ／Ｎ比算出部１０８により算出されたＳ／Ｎ比値の良否を判定する。
具体的には、例えばＳ／Ｎ比値が３以上の場合に、良好であると判定することができる。ただし、Ｓ／Ｎ比値は、ＤＮＡチップの種類によって、閾値が変動するものであるため、ＤＮＡチップの種類毎に輝度が十分に検出できたと判定可能な値であれば良く、当該閾値に限定されないことは言うまでもない。

通常スポット位置推定部１１０は、スポット形状及び位置検出部１０３によって検出された基準スポットの位置にもとづいて、ＤＮＡチップ画像における通常スポットの位置を推定する。
その方法は特に限定されないが、例えば検出された基準スポットの中心位置にもとづいて、通常スポットが配置されると想定される位置の座標（グリッド）を算出することにより行うことができる。

判定結果出力部１１１は、少なくともスポット形状及び位置判定部１０４による判定結果を出力する。
また、判定結果出力部１１１は、輝度ムラ判定部１０７による判定結果、及び／又は、Ｓ／Ｎ比判定部１０９による判定結果を出力することもできる。
さらに、判定結果出力部１１１は、これら全ての判定結果にもとづいて、スポットの有効性を判定する総合判定結果を出力することもできる。

また、判定結果出力部１１１によって、検出エラー処理部１０５により基準スポットの検出エラーと判定されたエラー結果を出力することも可能である。
判定結果の具体的な出力方法は、特に限定されないが、例えばＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に接続されたディスプレイなどの表示装置に出力することができる。

次に、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０における処理手順について、図４〜図６を参照して説明する。図４は、本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置による処理工程を示すフローチャートである。図５は、基準スポット検出の処理工程を示すフローチャートであり、図６は、通常スポット検出の処理工程を示すフローチャートである。本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムは、コンピュータなどの情報処理装置に、以下の処理を実行させる。

図４に示すように、まずＤＮＡチップ画像入力部１０１が、ＤＮＡチップ画像をＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に入力する（ステップ１０）。入力されたＤＮＡチップ画像は、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に記憶される。
次に、基準スポットの検出処理が実行され（ステップ２０）、次いで通常スポットの検出処理が実行され（ステップ３０）、最後に判定結果出力部１１１により、スポットの有効性の判定結果が出力される（ステップ４０）。

次に、基準スポットの検出処理（ステップ２０）について、図５を参照して、詳細に説明する。
まず、多段階二値化処理部１０２が、ＤＮＡチップ画像に対して、二値化処理を実行して、二値化画像を作成する（ステップ２００）。

このとき、多段階二値化処理部１０２は、例えば予めＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に記憶された輝度の最小値と最大値を用いて、最小値から最大値までの間の輝度をＮ刻みにするように、二値化処理で用いる閾値を設定することができる。また、多段階二値化処理部１０２により、ＤＮＡチップ画像にもとづいて、輝度の最小値と最大値を決定するようにしてもよい。
そして、多段階二値化処理部１０２は、まずは最初の閾値を用いて、ＤＮＡチップ画像にもとづき最初の二値化画像を作成する。

次に、スポット形状及び位置検出部１０３が、基準スポットの内、最初に探索する基準スポットの範囲としてＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に予め記憶された一定範囲に対して、スポットの形状及び位置の検出処理を実行する（ステップ２０１）。
例えば、図２に示される二値化処理１回目，閾値ｂ１のＤＮＡチップ画像１における一方の基準スポット２ａを探索するための一定範囲２−１に対して、スポットの形状及び位置の検出処理が実行される。

次に、スポット形状及び位置判定部１０４により、検出された基準スポットの円形度、大きさ、及び中心位置が、良好な範囲としてＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に予め記憶された設定範囲内にあるか否かが判定される（ステップ２０２）。
基準スポットの円形度、大きさ、及び中心位置のいずれかが設定範囲内でなければ（ステップ２０２のＮＯ）、全ての閾値に対応する、全ての二値化画像について、スポットの形状及び位置の検出処理が実行されたか否かを確認する（ステップ２０３）。

二値化処理に用いられていない閾値がまだ存在している場合（ステップ２０３のＮＯ）、次の閾値を用いて二値化画像を作成し、スポットの形状及び位置の検出処理を実行して、検出された基準スポットの円形度、大きさ、及び中心位置のいずれかが設定範囲内でなければ、同様の処理を繰り返す（ステップ２００〜２０２）。
そして、全ての閾値に対応する、全ての二値化画像について、スポットの形状及び位置の検出処理が実行されていた場合（ステップ２０３のＹＥＳ）、検出エラー処理部１０５により、エラー処理が実行される（ステップ２０４）。

一方、基準スポットの円形度、大きさ、及び中心位置が設定範囲内であれば（ステップ２０２のＹＥＳ）、基準スポットの形状又は位置が良好であると判定され、次に輝度ムラ検出部１０６により、ＤＮＡチップ画像における当該基準スポットの輝度のムラを検出する処理が実行される（ステップ２０５）。
したがって、この場合、二値化処理に用いられていない閾値がまだ存在している場合であっても、次の閾値を用いた二値化画像の作成、スポットの形状及び位置の検出並びに判定処理は行われない。すなわち、一つの二値化画像で基準スポットの形状又は位置が良好であると判定されると、以降は当該基準スポットについて二値化処理を行うことなく、次にその基準スポットの輝度に関する検出及び判定処理が行われる。

次に、輝度ムラ判定部１０７により、輝度のムラが、良好な範囲としてＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に予め記憶された設定範囲内にあるか否かが判定される（ステップ２０６）。
そして、輝度のムラが設定範囲内でなければ（ステップ２０６のＮＯ）、検出エラー処理部１０５により、エラー処理が実行される（ステップ２０４）。

一方、輝度のムラが設定範囲内であれば（ステップ２０６のＹＥＳ）、次にＳ／Ｎ比算出部１０８により、ＤＮＡチップ画像における当該基準スポットのＳ／Ｎ比値を算出する処理が実行される（ステップ２０７）。
次に、Ｓ／Ｎ比判定部１０９により、Ｓ／Ｎ比値が、良好な範囲としてＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に予め記憶された設定範囲内にあるか否かが判定される（ステップ２０８）。
そして、Ｓ／Ｎ比値が設定範囲内でなければ（ステップ２０８のＮＯ）、検出エラー処理部１０５により、エラー処理が実行される（ステップ２０４）。

一方、Ｓ／Ｎ比値が設定範囲内であれば（ステップ２０８のＹＥＳ）、全ての基準スポットについて探索を行ったか否かを確認する（ステップ２０９）。
そして、探索する基準スポットがまだ残っている場合（ステップ２０９のＮＯ）、次の基準スポットについて、二値化画像の作成以降の処理を再度実行する（ステップ２００〜２０９）。

この場合、既に行われた二値化画像の作成処理により作成された二値化画像については、これらをＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に記憶させておくことで、作成処理を省略することができる。また、最初にステップ１００を実行する際に、全ての閾値について二値化画像を作成しておくことも可能である。これは、後述する通常スポット検出においても同様であり、さらに基準スポット検出において作成された二値化画像を、通常スポット検出において用いることも可能である。

そして、全ての基準スポットについて探索が終了した場合（ステップ２０９のＹＥＳ）、次に通常スポットの検出処理（ステップ３０）を実行する。

次に、通常スポットの検出処理（ステップ３０）について、図６を参照して、詳細に説明する。
最初に、通常スポット位置推定部１１０が、スポット形状及び位置検出部１０３によって検出された基準スポットの位置にもとづいて、ＤＮＡチップ画像における通常スポットの位置（座標）を推定する（ステップ３００）。推定された通常スポットの位置は、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に記憶され、各通常スポットについて、以下の処理が行われる。

まず、多段階二値化処理部１０２が、ＤＮＡチップ画像に対して、二値化処理を実行して、二値化画像を作成する（ステップ３０１）。
多段階二値化処理部１０２は、基準スポットの検出処理の場合と同様に、まずは最初の閾値を用いて、ＤＮＡチップ画像にもとづき最初の二値化画像を作成する。

次に、スポット形状及び位置検出部１０３が、通常スポットの内、最初に探索する通常スポットの範囲としてＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に記憶された一定範囲に対して、スポットの形状及び位置の検出処理を実行する（ステップ３０２）。
例えば、図２に示される二値化処理１回目，閾値ｂ１のＤＮＡチップ画像１における通常スポット３ａを探索するための一定範囲３−１に対して、スポットの形状及び位置の検出処理が実行される。

次に、スポット形状及び位置判定部１０４により、検出された通常スポットの円形度、大きさ、及び中心位置が、良好な範囲としてＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に予め記憶された設定範囲内にあるか否かが判定される（ステップ３０３）。
通常スポットの円形度、大きさ、及び中心位置のいずれかが設定範囲内でなければ（ステップ３０３のＮＯ）、全ての閾値に対応する、全ての二値化画像について、スポットの形状及び位置の検出処理が実行されたか否かを確認する（ステップ３０４）。

二値化処理に用いられていない閾値がまだ存在している場合（ステップ３０４のＮＯ）、次の閾値を用いて二値化画像を作成し、スポットの形状及び位置の検出処理を実行して、検出された通常スポットの円形度、大きさ、及び中心位置のいずれかが設定範囲内でなければ、同様の処理を繰り返す（ステップ３０１〜３０３）。
そして、全ての閾値に対応する、全ての二値化画像について、スポットの形状及び位置の検出処理が実行されていた場合（ステップ３０４のＹＥＳ）、当該通常スポットの形状又は位置は良好でないと判定され、次に輝度のムラの検出処理が行われる（ステップ３０５）。

なお、基準スポットは必ず検出されるべきものであるため、検出できない場合には、エラー処理が実行されるが、通常スポットは、検査試料に当該通常スポットに対応する検出対象の被検査物が含まれていない場合には、検出されないのが正常であるため、通常スポットの形状又は位置が良好でないと判定されてもエラー処理は実行しない。

一方、通常スポットの円形度、大きさ、及び中心位置が設定範囲内であれば（ステップ３０３のＹＥＳ）、通常スポットの形状又は位置が良好であると判定され、次に輝度ムラ検出部１０６により、ＤＮＡチップ画像における当該通常スポットの輝度のムラを検出する処理が実行される（ステップ３０５）。
したがって、この場合、二値化処理に用いられていない閾値がまだ存在している場合であっても、次の閾値を用いた二値化画像の作成、スポットの形状及び位置の検出並びに判定処理は行われない。すなわち、一つの二値化画像で通常スポットの形状又は位置が良好であると判定されると、以降は当該通常スポットについて二値化処理を行うことなく、次にその通常スポットの輝度に関する検出及び判定処理が行われる。

次に、輝度ムラ判定部１０７により、輝度のムラが、良好な範囲としてＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に予め記憶された設定範囲内にあるか否かが判定される（ステップ３０６）。なお、前述の通り、基準スポットの場合と異なり、通常スポットについては、輝度のムラが良好でないと判定されてもエラー処理は行わない。

次に、Ｓ／Ｎ比算出部１０８により、ＤＮＡチップ画像における当該通常スポットのＳ／Ｎ比値を算出する処理が実行される（ステップ３０７）。
そして、Ｓ／Ｎ比判定部１０９により、Ｓ／Ｎ比値が、良好な範囲としてＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０に予め記憶された設定範囲内にあるか否かが判定される（ステップ３０８）。なお、この場合も、前述の通り、基準スポットの場合と異なり、通常スポットについては、Ｓ／Ｎ比値が良好でないと判定されてもエラー処理は行わない。

そして、全ての通常スポットについて探索を行ったか否かを確認し（ステップ３０９）、探索する通常スポットがまだ残っている場合（ステップ３０９のＮＯ）、次の通常スポットについて、二値化画像の作成以降の処理を再度実行する（ステップ３０１〜３０９）。
全ての基準スポットについて探索が終了した場合（ステップ３０９のＹＥＳ）、判定結果出力部１１１によって、判定結果の出力処理を実行する（ステップ４０）。

出力する判定結果には、全ての基準スポット及び通常スポットのそれぞれについて、スポット形状及び位置が良好であるか否か、輝度のムラが良好であるか否か、及びＳ／Ｎ比値が良好であるか否かの情報を含めることができる。そして、これら全てが良好であるスポットは、総合判定結果として、有効なスポットであるとの情報を含めることができ、また、これらのいずれかが良好でないと判定されたスポットは、総合判定結果として、有効なスポットでないとの情報を含めることができる。
この判定結果は、判定結果出力部１１１によって、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置１０のディスプレイに出力したり、あるいはプリンターから帳票として出力することなどが可能である。

なお、本実施形態で説明した処理フローはこれに限定されず、同様の結果が得られる範囲で適宜変更することが可能である。
例えば、図５，６に示すフローチャートでは、各種検出処理の後、直ちにその判定処理を行っているが、判定処理を判定結果出力処理の前にまとめて実行してもよい。
具体的には、輝度のムラの検出とＳ／Ｎ比値の検出の両方を先に行った後に、輝度のムラとＳ／Ｎ比値の判定を行うようにすることができる。また、多段階二値化処理によって、最初に全ての閾値の二値化画像を作成して、スポットの形状及び位置の検出を行い、その判定を輝度のムラとＳ／Ｎ比値の判定と共に行うようにすることも可能である。

さらに、スポット毎に処理を行う他、スポットの形状及び位置の検出及び判定を全てのスポットについて行った後に、輝度のムラの検出及び判定を全てのスポットについて行い、次いでＳ／Ｎ比値の検出及び判定を全てのスポットについて行うようにすることも可能である。

以上説明したように、本実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法、及びＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムによれば、ＤＮＡチップ画像の輝度にもとづき網羅的に複数の閾値を設定して、二値化画像を作成することができ、これらを用いてスポットの形状及び位置が良好であるか否かを判定することができる。
したがって、特定の最適な閾値を考慮することなく、スポットの形状及び位置の検出並びに判定を高い精度で行うことが可能となっている。
また、スポットの輝度のムラとＳ／Ｎ比値が良好であるか否かの判定を併せて行うことができるため、スポットの有効性の判定精度をより向上させることが可能になっている。

上述した実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法、及びＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムを用いて、ＤＮＡチップ画像におけるスポットの有効性を判定する実験を行った。

具体的には、図７，８に示すように、２つの基準スポット（実施例１，２）と、７つの通常スポット（実施例３，４、比較例１〜５）に対して、図４〜図６に示されたフローの処理を実行して、各スポットの有効性の判定を行った。
実施例１〜４のスポットは、スポットの形状及び位置、輝度のムラ、Ｓ／Ｎ比値が全て良好であり、いずれも正常なものである。
また、比較例１，５のスポットは、変形したものであり、比較例２のスポットは、中心位置がずれたものであり、比較例３のスポットは、輝度にムラがあり、比較例４のスポットは、Ｓ／Ｎ比値が小さいものである。

その結果、実施例１〜４のスポットは、円形度、大きさ、中心位置、輝度ムラ、及びＳ／Ｎ比値のいずれもが良好であり、総合判定として有効なものであると判定された。
一方、比較例１は、Ｓ／Ｎ比値以外の全ての結果が良好でないと判定され、総合判定として有効なものでないと判定された。
また、比較例２は、中心位置と輝度ムラが良好でないと判定され、総合判定として有効なものでないと判定された。

また、比較例３は、輝度ムラが良好でないと判定され、総合判定として有効なものでないと判定された。
また、比較例４は、円形度、大きさ、中心位置及びＳ／Ｎ比値が良好でないと判定され、総合判定として有効なものでないと判定された。
また、比較例５は、円形度、大きさ、及び中心位置が良好でないと判定され、総合判定として有効なものでないと判定された。

このように、上述した実施形態のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置、ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法、及びＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムによれば、スポットの有効性の判定を高い精度で行うことができることが確認された。

本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、図１のブロック図に示される各構成をまとめたり、あるいはより詳細な機能毎に分割したりすることが可能である。また、本発明を、基準スポットを備えていないＤＮＡチップに適用するために、図４〜６から基準スポットの検出処理を省略し、通常スポットの推定位置を予めＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置に記憶させて実行するものとするなど適宜変更することが可能である。

本発明は、食品検査や環境検査、臨床試験、家畜衛生等におけるカビや食中毒菌などの微生物の検査や、遺伝子検査等の分野において、好適に利用することが可能である。

１ ＤＮＡチップ画像
２（２−１，２−２，・・・） 基準スポットの探索範囲
２ａ 基準スポット
３（３−１，３−２，・・・） 通常スポットの探索範囲
３ａ 通常スポット
４ 輝度解析範囲
５ バックグラウンド解析範囲
１０ ＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置
１０１ ＤＮＡチップ画像入力部
１０２ 多段階二値化処理部
１０３ スポット形状及び位置検出部
１０４ スポット形状及び位置判定部
１０５ 検出エラー処理部
１０６ 輝度ムラ検出部
１０７ 輝度ムラ判定部
１０８ Ｓ／Ｎ比算出部
１０９ Ｓ／Ｎ比判定部
１１０ 通常スポット位置推定部
１１１ 判定結果出力部

Claims (15)

1. プローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物が前記プローブに結合された状態で、前記ＤＮＡチップを撮影して得られるＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置であって、
   画像の二値化処理に用いられる閾値として、ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、前記ＤＮＡチップ画像から複数の二値化画像を作成する多段階二値化処理部と、
   前記二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出するスポット形状及び位置検出部と、
   スポット形状及び位置検出部により検出されたスポットの形状及び位置の良否を判定するスポット形状及び位置判定部と、を備えた
   ことを特徴とするＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
2. スポット形状及び位置検出部により検出されたスポットにおける輝度のムラを検出する輝度ムラ検出部と、
   前記輝度ムラ検出部により検出された輝度のムラの良否を判定する輝度ムラ判定部と、をさらに備えた
   ことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
3. 前記多段階二値化処理部が、前記ＤＮＡチップ画像の輝度の最小値と最大値にもとづいて、前記最小値から前記最大値までの間に網羅的に設定された複数の閾値を用いて、複数の二値化画像を作成する
   ことを特徴とする請求項１又は２記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
4. 前記複数の閾値が、前記最小値から前記最大値までの間に等間隔に設定されたことを特徴とする請求項３記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
5. 前記スポット形状及び位置検出部が、スポットの形状として、スポットの円形度及び大きさを検出し、スポットの位置として、スポットの中心位置を検出する
   ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
6. 前記輝度ムラ検出部が、スポットの輝度のムラとして、スポットにおける輝度の標準偏差を輝度の平均値で割った値、又は、スポットにおける輝度から最小値、最大値、及び平均値を取得して、次の式（１）にもとづき算出する
   ことを特徴とする請求項２記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
   （輝度の最大値−輝度の最小値）／輝度の平均値・・・式（１）
7. スポット形状及び位置検出部により検出されたスポットにおけるＳ／Ｎ比値を算出するＳ／Ｎ比算出部と、
   前記Ｓ／Ｎ比算出部により算出されたＳ／Ｎ比値の良否を判定するＳ／Ｎ比判定部と、をさらに備えた
   ことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
8. 前記Ｓ／Ｎ比算出部が、スポットにおける輝度の中央値を取得すると共に、バッググラウンド値としてスポットの周辺における輝度の中央値を取得し、次の式（２）にもとづきＳ／Ｎ比値を算出する
   ことを特徴とする請求項７記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
   （輝度の中央値−バッググラウンド値）／バッググラウンド値・・・式（２）
9. 前記スポット形状及び位置検出部が、前記ＤＮＡチップ画像における各スポットの位置を推定するための基準となる基準スポットの位置に対応する一定範囲に対して、スポットの形状及び位置を検出することにより、基準スポットを検出する
   ことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
10. 検出された前記基準スポットの位置にもとづいて、前記ＤＮＡチップ画像における前記基準スポット以外のスポットの位置を推定するスポット位置推定部を、さらに備え、
    前記スポット形状及び位置検出部が、前記スポット位置推定部により推定されたスポットの位置に対応する一定範囲に対して、スポットの形状及び位置を検出することにより、スポットを検出する
    ことを特徴とする請求項９記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
11. 少なくとも前記スポット形状及び位置判定部による判定結果を出力する判定結果出力部を、さらに備えたことを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定装置。
12. プローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物が前記プローブに結合された状態で、前記ＤＮＡチップを撮影して得られるＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法であって、
    画像の二値化処理に用いられる閾値として、前記ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、前記ＤＮＡチップ画像から複数の二値化画像を作成するステップと、
    前記二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出するステップと、
    検出されたスポットの形状及び位置の良否を判定するステップと、を有する
    ことを特徴とするＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法。
13. 検出されたスポットにおける輝度のムラを検出するステップと、検出された輝度のムラの良否を判定するステップと、をさらに備えたことを特徴とする請求項１２記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定方法。
14. プローブが固定化されたＤＮＡチップにおいて、標識された被検査物が前記プローブに結合された状態で、前記ＤＮＡチップを撮影して得られるＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラムであって、
    コンピュータに、
    前記ＤＮＡチップ画像を入力させ、
    画像の二値化処理に用いられる閾値として、前記ＤＮＡチップ画像の輝度の全体に分布する複数の閾値を用いて、前記ＤＮＡチップ画像から複数の二値化画像を作成させ、
    前記二値化画像におけるスポットの形状及び位置を検出させ、
    検出されたスポットの形状及び位置の良否を判定させる
    ことを実行させるためのＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラム。
15. コンピュータに、検出されたスポットにおける輝度のムラを検出させ、検出された輝度のムラの良否を判定させることを特徴とする請求項１４記載のＤＮＡチップ画像のスポット有効性判定プログラム。