JP2009210889A - 共焦点顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】対物レンズの倍率によらず同じ共焦点性を得ることができる共焦点顕微鏡システムを実現すること。
【解決手段】試料を励起する励起光を共焦点スキャナおよび顕微鏡を介して試料に照射し、この試料の励起による蛍光画像を顕微鏡および共焦点スキャナを介してカメラに入力するように構成された共焦点顕微鏡システムにおいて、前記顕微鏡は、倍率の異なる複数の対物レンズを有し、前記共焦点スキャナは、穴径の異なる複数のピンホール列が形成されたニポウディスクと、このニポウディスクに対向し前記励起による蛍光画像を前記各ピンホールに集光する複数のマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイディスクと、これらニポウディスクとマイクロレンズアレイディスクの間に設けられた厚さの異なる複数のダイクロイックミラーとを備え、倍率の高い（低い）対物レンズが選択されたときは厚みの厚い（薄い）ダイクロイックミラーが励起光の光軸上に配置されて前記蛍光画像は穴径の大きい（小さい）ピンホールに入射されることを特徴とする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、回転式のピンホールアレイディスクを用いた共焦点顕微鏡システムに関し、特に、倍率の異なる複数の対物レンズによる共焦点画像の取得に関する。

従来から、生体や細胞などの観察や、半導体の表面観察などに共焦点顕微鏡システムが用いられている。

たとえばＣａイオンを含む細胞の観察にあたっては、対物レンズを移動させて焦点位置を調整し、レーザ光などを細胞に照射するとともに細胞上の集光点を走査し、細胞からの戻り光を検出して蛍光画像を得る。

このようにして試料から得られた蛍光画像に対して必要な画像処理を施して解析することにより、試料の観察を行うことができる。

このような共焦点顕微鏡システムに関連する先行技術文献としては次のようなものがある。

特許３９５２４９９号公報

図５は従来の共焦点顕微鏡システムの一例を示す構成図である。図５において、光源１０から出力される励起光は、共焦点スキャナ２０→顕微鏡３０→ステージ４０を経てステージ４０のプレート４１上に載置された試料５０に照射され、試料５０を励起して蛍光を発光させる。試料５０から出力される蛍光画像は、ステージ４０→顕微鏡３０→共焦点スキャナ２０を経てカメラ６０に入射され、電気信号に変換される。

カメラ６０から出力される電気信号は制御装置７０に入力される。制御装置７０は、カメラ６０からの撮像データに対して所定の画像処理を行うとともに、共焦点スキャナ２０の回転機構の回転を制御する。

共焦点スキャナ２０は、ニポウディスク２１、マイクロレンズディスク２２、ダイクロイックミラー２３、リレーレンズ２４、回転軸２５などで構成されている。

ニポウディスク２１とマイクロレンズディスク２２は回転軸２５で連結され、図示しないモータで同時に一定速度で回転駆動される。

ニポウディスク２１には、複数のピンホール２１ａが、中心から円の周縁に向かってたとえば扇状やアルキメデス螺旋状の複数個のピンホール列を形成するように設けられている。図５のピンホール列は、渦巻き状に形成されている。

ここで、ニポウディスク２１のピンホール２１ａは、試料５０からの蛍光が結像する点に位置するように配置されている。これにより、焦点を結ぶ光以外は遮断される。

マイクロレンズディスク２２には、ニポウディスク２１の各ピンホール２１ａの配置と同様な形状のマイクロレンズ列を形成するように、複数のマイクロレンズ２２ａが設けられている。これらマイクロレンズ２２ａは、光源１０からの励起光を集光してニポウディスク２１のピンホール２１ａに照射する。

ダイクロイックミラー２３は、ニポウディスク２１とマイクロレンズディスク２２の間に配置されていて、励起光を通過させるとともに試料５０からの蛍光を反射させる。

リレーレンズ２４は、ダイクロイックミラー２３で反射された試料５０からの蛍光を集光してカメラ６０に入射する。

すなわち、光源１０から試料５０に向かって照射される励起光は、マイクロレンズディスク２２の各マイクロレンズ２２ａにより個別の光束に集光されてダイクロイックミラー２３を通過し、ニポウディスク２１の各ピンホール２１ａを通過して顕微鏡３０に入射される。

そして励起光は、顕微鏡３０の結像レンズ３２を介して対物レンズ３１に入射され、さらに対物レンズ３１を介してステージ４０のプレート４１上に載置された試料５０に集光されて微小の光スポットを形成し、試料５０を励起する。

励起により試料５０から出力される蛍光は、再び顕微鏡３０の対物レンズ３１および結像レンズ３２を介してニポウディスク２１の各ピンホール２１ａに集光され、各ピンホール２１ａを通過する。そして蛍光は、ダイクロイックミラー２３で反射され、リレーレンズ２４を介してカメラ６０に入射される。

カメラ６０は、入射された蛍光共焦点画像を電気信号に変換して出力する。制御装置７０は、カメラ６０から入力される電気信号を画像データに変換処理して記憶する。

このように、各ピンホール２１ａからの光スポットで試料５０の観察領域全体をスキャンすることができ、試料５０の共焦点画像を取得することができる。

そして、各ピンホール２１ａは焦点を結ぶ光以外を遮断するため、試料５０からの蛍光を高感度で受光でき、コントラストの高い明瞭な像を得ることができる。

しかしながら、従来の共焦点顕微鏡システムでは、顕微鏡が１０倍、２０倍、・・・、１００倍などの倍率の異なる複数の対物レンズを有する場合であっても、ニポウディスクに形成されたピンホールの穴径は１種類しかないことから、このピンホールに焦点を結ぶ光以外は遮断されてしまい、対物レンズごとに共焦点画像を得ることができなかった。

いいかえれば、高倍率（低倍率）の対物レンズに合わせてピンホールの穴径を設計すると、低倍率（高倍率）の対物レンズでは共焦点性が得られなかった。

このように、従来の共焦点顕微鏡システムでは、倍率の異なる複数の対物レンズを有する場合であっても、対物レンズごとの共焦点画像が得られないという問題点があった。

本発明は上述の問題点を解決するものであり、その目的は、倍率の異なる複数の対物レンズを有する場合には、対物レンズごとの共焦点画像を取得できる共焦点顕微鏡システムを実現することにある。

このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
試料を励起する励起光を共焦点スキャナおよび顕微鏡を介して試料に照射し、この試料の励起による蛍光画像を顕微鏡および共焦点スキャナを介してカメラに入力するように構成された共焦点顕微鏡システムにおいて、
前記顕微鏡は、倍率の異なる複数の対物レンズを有し、
前記共焦点スキャナは、穴径の異なる複数のピンホール列が形成されたニポウディスクと、このニポウディスクに対向し前記励起による蛍光画像を前記各ピンホールに集光する複数のマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイディスクと、これらニポウディスクとマイクロレンズアレイディスクの間に設けられた厚さの異なる複数のダイクロイックミラーとを有し、
前記各対物レンズの倍率に応じて前記各ダイクロイックミラーを選択する選択手段を備えることを特徴とする。

請求項２記載の発明は、
請求項１記載の共焦点顕微鏡システムにおいて、
前記選択手段は、
倍率の高い対物レンズが選択されたときは厚みの厚いダイクロイックミラーを選択して励起光の光軸上に配置し、前記蛍光画像を穴径の大きいピンホールに入射させ、
倍率の低い対物レンズが選択されたときは厚みの薄いダイクロイックミラーを選択して励起光の光軸上に配置し、前記蛍光画像を穴径の小さいピンホールに入射させることを特徴とする。

請求項３記載の発明は、
請求項１または請求項２記載の共焦点顕微鏡システムにおいて、
前記ニポウディスクの各ピンホール列は、それぞれのピンホールを、各ピンホール列内の自身の穴径と異なる穴径のピンホールに対して全て同一方向に同一微小距離だけ離れた位置に設けることにより同一微小距離だけ離れて形成されることを特徴とする。

請求項４記載の発明は、
請求項１〜請求項３いずれかに記載の共焦点顕微鏡システムにおいて、
前記複数のダイクロイックミラーは、
屈折率、厚さ、前記励起光の光軸方向に対する傾きに基づき、前記励起光を屈折させて前記各ピンホールに入射させる位置に配置されることを特徴とする。

請求項５記載の発明は、
請求項１〜請求項４いずれかに記載の共焦点顕微鏡システムにおいて、
前記複数のダイクロイックミラーを水平方向に移動させるダイクロイックミラーセットを備えることを特徴とする。

請求項６記載の発明は、
請求項１〜請求項５のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システムにおいて、
前記カメラの取得した共焦点画像データを記憶し画像解析を行う制御装置を備えることを特徴とする。

請求項７記載の発明は、
請求項１〜請求項６のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システムにおいて、
前記ニポウディスクのピンホールが、前記ニポウディスクの中心から周縁に向かって扇状、うずまき状、螺旋状または直線に並べられていることを特徴とする。

本発明によれば、倍率の異なる複数の対物レンズを有する場合には、対物レンズごとの共焦点画像を取得できる。つまり、対物レンズの倍率によらず同じ共焦点性を得ることができる。

また、撮像のタイミングを制御する(切り分ける)ことなく、所望の蛍光画像を短時間で取得できる。

図１は本発明に係る共焦点顕微鏡システムの構成図であり、図５と共通する部分には同一の符号を付けている。図５との相違点は、図１では、ニポウディスク２１に穴径の異なる複数のピンホール２１ａおよび２１ｂが形成されていること、顕微鏡３０が倍率の異なる複数の対物レンズ３１および３３を有すること、異なる厚さのダイクロイックミラー２３および２６を水平方向に移動させる駆動機構を持つダイクロイックミラーセットＤＭＳを有することである。

図１において、顕微鏡３０は倍率の異なる対物レンズ３１および３３を有する。以下、対物レンズ３１の倍率は対物レンズ３３の倍率よりも高いものとして説明する。

またニポウディスク２１は、ガラスなどからなる円形状の透明基板の表面に遮光膜をコーティングした基板などであって、大小異なる２種類以上の穴径を持つピンホール２１ａ（穴径Ｒａ）およびピンホール２１ｂ（穴径Ｒｂ）が複数形成される。

たとえば図１のように、各ピンホール２１ａおよび２１ｂの穴径はＲａ＞Ｒｂとなるように形成される。また、後述のように穴径の大きいピンホール２１ａは倍率の高い対物レンズ３１により集光された試料５０からの戻り蛍光が入射され、穴径の小さいピンホール２１ｂは倍率の低い対物レンズ３３により集光された試料５０からの戻り蛍光が入射される。

ダイクロイックミラー２３および２６を含むダイクロイックミラーセットＤＭＳは、ニポウディスク２１とマイクロレンズディスク２２の間に配置される。なお、ダイクロイックミラー２３の厚さはダイクロイックミラー２６よりも厚いものとし、厚みの薄いダイクロイックミラー２３は穴径の大きいピンホール２１に対応し、厚みの厚いピンホール２１ｂは穴径の小さいピンホール２１ｂに対応するものとする。

ダイクロイックミラーセットＤＭＳにおけるダイクロイックミラーの移動方式については特に図示しないが、モータとリニアガイドなどから構成される直動機構、またはフィルタホイールなどの回転機構でもよい。

また特に図示しないが各対物レンズ３１、３３の倍率に応じて各ダイクロイックミラー２６または３３を選択する選択手段を有する。

また制御装置７０は、カメラ６０からの撮像データに対して所定の画像処理を行い、共焦点スキャナ２０の回転機構の回転を制御するほか、各対物レンズ３１、３３の倍率に応じて各ダイクロイックミラー２６または３３を選択するための選択機能を有し、各ダイクロイックミラーを選択するとともにダイクロイックミラーセットＤＭＳを制御してダイクロイックミラー２６または３３を配置させるものであってもよい。

図２は図１のピンホール２１ａ、２１ｂの配置を説明するニポウディスク２１の上面図である。ニポウディスク２１には、複数の穴径の大きいピンホール２１ａおよび穴径の小さいピンホール２１ｂがエッチングなどにより遮光膜が除去され、光が透過するように形成される。

ピンホール２１ａは、ニポウディスク２１の中心から円の周縁に向かって、たとえば扇状またはアルキメデス螺旋状に並んだ複数の「ピンホール列ＰＬａ」を構成する。またピンホール２１ｂも、ニポウディスク２１の中心から円の周縁に向かって、たとえば螺旋状に並んだ複数の「ピンホール列ＰＬｂ」を構成する。

ここで、各ピンホール列ＰＬｂは、それぞれのピンホール２１ｂを各ピンホール列ＰＬａ内のピンホール２１ａから全て同一方向に同一微小距離だけ離れた位置に設けることにより、ピンホール列ＰＬａから同一微小距離だけ離れて形成されることになる。

たとえば図２のピンホール列ＰＬｂ−１は、このピンホール列ＰＬｂ−１を形成する各ピンホール２１ｂを、ピンホール列ＰＬａ―１を形成する各ピンホール２１ａの中心から「９時」の方向に微小距離ｄ１２だけ離れた位置に設けることにより形成される。

なお、ピンホールの配置方式としては等角螺旋配置、正方配置、等ピッチ螺旋配置などがあるが、どのような配置方式であってもよい。

図３は図１のダイクロイックミラー２３、２６の配置の説明図であり、（Ａ）は厚みの薄いダイクロイックミラー２６の配置を示し、（Ｂ）は厚みの厚いダイクロイックミラー２６の配置を示している。

厚みの薄いダイクロイックミラー２３は穴径の大きいピンホール２１ａ用に使用され、厚みの厚いピンホール２１ｂは穴径の小さいピンホール２１ｂ用に使用される。

厚みの薄いダイクロイックミラー２６は、（Ａ）のように、ダイクロイックミラーセットＤＭＳによって各マイクロレンズ２２ａで集光した励起光が穴径の大きいピンホール２１ａに入射するように設置される。

また厚みの厚いダイクロイックミラー２３は、（Ｂ）のように、ダイクロイックミラーセットＤＭＳによって各マイクロレンズ２２ａで集光した励起光が穴径の小さいピンホール２１ｂに入射するように設置される。

このときダイクロイックミラー２３は、各マイクロレンズ２２ａで集光した励起光を所定の方向（たとえば９時の方向）に一定距離（ｄ１２）ずらして各ピンホール２１ｂに入射させる。

図４は、厚さの異なるダイクロイックミラーにより励起光のピンホールへの入射角度をずらす原理を説明する説明図である。図４において、励起光の光軸方向に対して傾いてダイクロイックミラー２３を設置した場合、光源１０から出射された励起光は、ダイクロイックミラー２３の材料の屈折率によって、ダイクロイックミラー２３に入射した位置から横にｄだけずれて出射される。

このずれ量ｄは、ダイクロイックミラーの傾きθ、屈折率ｎ、厚さｔなどに基づいて、スネル（Ｓｎｅｌｌ）の法則などによって一義的に求められるものである。たとえば、θ＝４５°、ｎ＝１．５（ガラス）の場合には、ｄ≒０．３ｔの関係にあることになる。

具体的には、ピンホール２１ａとピンホール２１ｂとの間隔が１００μｍである場合には、ダイクロイックミラー２３とダイクロイックミラー２６の厚さの差を３３０μｍにすることにより、各マイクロレンズ２２ａで集光した励起光は所定の方向（たとえば９時の方向）に３３０μｍずれて各ピンホール２１ｂに入射する。

以下、本発明に係る共焦点顕微鏡システム１００の動作について説明する。なお、従来例の動作と共通する動作については適宜省略する。

ステージ４０の上面には、適量の試料５０または試料５０を収容したプレート４１などが載置される。またステージ４０は、カメラ６０が試料５０の蛍光画像を取得できるように位置調整される。

図５の構成と同様に、ニポウディスク２１とマイクロレンズディスク２２は回転軸２５で連結され、図示しないモータで同時に一定速度で回転駆動される。

光源１０から試料５０に向かって照射される励起光は、マイクロレンズディスク２２のマイクロレンズ２２ａにより個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー２３または２６を通過し、ニポウディスク２１の各ピンホール２１ａまたはピンホール２１ｂを通過し顕微鏡３０に入射される。

このとき、顕微鏡３０において倍率の異なる対物レンズをそれぞれ使用する場合には、選択手段（図示せず）が、各対物レンズの倍率に応じて各ダイクロイックミラー２６または３３を選択し、ダイクロイックミラーセットＤＭＳを用いて厚みの厚いダイクロイックミラー２６を励起光の光軸上に配置する。なお制御装置７０が、各対物レンズ３１、３３の倍率に応じて各ダイクロイックミラー２６または３３を選択し、各ダイクロイックミラーを選択するとともにダイクロイックミラーセットＤＭＳを制御してダイクロイックミラー２６または３３を配置させてもよい。

たとえば、顕微鏡３０において倍率の高い対物レンズ３１を使用する場合には、ダイクロイックミラー２６を選択し、ダイクロイックミラーセットＤＭＳを用いて厚みの厚いダイクロイックミラー２６を励起光の光軸上に配置する。この場合、マイクロレンズ２２ａで集光した励起光は、ダイクロイックミラー２６により屈折されて穴径の大きいピンホール２１ａを通過し、顕微鏡３０に入射される。

また、顕微鏡３０において倍率の低い対物レンズ３３を使用する場合には、ダイクロイックミラー２３を選択し、ダイクロイックミラーセットＤＭＳを用いて厚みの薄いダイクロイックミラー２３を励起光の光軸上に配置する。この場合、マイクロレンズ２２ａで集光した励起光は、ダイクロイックミラー２３により屈折されて穴径の小さいピンホール２１ｂを通過し、顕微鏡３０に入射される。

そして励起光は、顕微鏡３０の結像レンズ３２を介して対物レンズ３１または３３に入射され、対物レンズ３１または３３によってステージ４０上の試料５０に集光される。

いいかえれば、対物レンズ３１または３３は、ニポウディスク２１の各ピンホール２１ａまたは各ピンホール２１ｂからの励起光を集光して、試料５０に微小の光スポットを形成する。

試料５０は、光源１０からの励起光によって蛍光を発生する。試料５０からの蛍光は、再び顕微鏡３０の対物レンズ３１または３３と結像レンズ３２を通り、ニポウディスク２１の各ピンホール２１ａおよびピンホール２１ｂに集光される。

このとき、各ピンホール２１ａまたは各ピンホール２１ｂは、焦点を結ぶ光以外を遮断する。各ピンホール２１ａまたは２１ｂを通過した蛍光は、ダイクロイックミラー２６または２３で反射され、リレーレンズ２４を介してカメラ６０に入射される。

たとえば、顕微鏡３０において倍率の高い対物レンズ３１を使用する場合には、試料５０からの蛍光は、穴径の大きい各ピンホール２１ａを通過して厚みの厚いダイクロイックミラー２６で反射され、リレーレンズ２４を介してカメラ６０に入射される。

また、顕微鏡３０において倍率の低い対物レンズ３３を使用する場合には、試料５０からの蛍光は、穴径の小さい各ピンホール２１ｂを通過して厚みの薄いダイクロイックミラー２３で反射され、リレーレンズ２４を介してカメラ６０に入射される。

このように、各ピンホール２１ａ、および２１ｂからの光スポットで試料５０の観察領域全体をスキャンすることができる。

カメラ６０は、その受光面と、ニポウディスク２１上の各ピンホール２１ａおよび２１ｂが並んでいる表面および試料５０の被観察面とが互いに光学的に共役関係になるように配置されているため、カメラ６０に試料５０の光学的断面像が結像され、共焦点画像を得ることができる。

カメラ６０は、取得した共焦点画像を電気信号に変換して出力する。制御装置７０はカメラ６０からの電気信号を画像データに変換処理して記憶する。

このように、本発明に係る共焦点顕微鏡システムは、穴径の異なるピンホールを複数ニポウディスク上に設け、厚さの異なるダイクロイックミラー複数設置することによって、倍率の異なる対物レンズが複数あっても共焦点画像を取得できる。いいかえれば、対物レンズの倍率によらず同じ共焦点性を得ることができる。

また、本発明に係る共焦点顕微鏡システムは、撮像のタイミングを制御する(切り分ける)ことなく、所望の蛍光画像を短時間で取得できる。

なお、上記実施例の制御装置７０は、各機能の動作を制御する演算制御部（たとえば、ＣＰＵ）、各種情報を格納する記憶部（図示せず）、外部機器とデータ通信する通信部（図示せず）から構成されるものであってよい。

たとえば制御装置７０の演算制御部は、主に各機能を統合的に制御し、記憶部（図示せず）に格納されているＯＳなどを起動して、このＯＳ上で格納されたプログラムを読み出して実行することにより、制御装置７０全体を制御し、制御装置７０固有の動作を行うものであってよい。たとえば記憶部のＲＡＭ（図示せず）は、その動作の際に作業領域として使用される。

また制御装置７０の記憶部（図示せず）は、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory)、フラッシュメモリ、ハードディスクなどであって、主にＯＳや制御装置として動作するためのプログラムや、対物レンズの焦点位置などの位置情報、試料５０などのサンプル情報、画像データ、画像解析結果情報などの各種情報を格納するものでよい。

さらに制御装置７０の通信部（図示せず）は、主にケーブルや通信ネットワークなどを介して外部機器とデータ通信するインターフェースであって、たとえば、カメラ６０などから撮像データなどの各種データを受信し、焦点を調整するための制御信号やその他制御信号などを送信する処理を行うものでよい。

また、上記実施例では、共焦点顕微鏡システムは、２種類の倍率が異なる対物レンズを有し、ニポウディスクに穴径が異なる２種類のピンホールが形成される例を示したが、倍率の異なる対物レンズが複数あっても共焦点画像を取得できるものであれば、３種類以上の倍率が異なる対物レンズを有し、ニポウディスクに穴径が異なる３種類以上のピンホールが形成されるものであってよい。

この場合には、ニポウディスクは、各対物レンズの倍率に合わせて各ピンホールの穴径をそれぞれ設計されるとともに各種ピンホールがそれぞれ所定の間隔をあけて配置され、各種ピンホールに合わせてダイクロイックミラー（３種類以上）を設置することになる。

また、ダイクロイックミラーセットＤＭＳは、倍率の異なる対物レンズが複数あっても共焦点画像を取得できるものであれば、制御装置７０などによって制御されてダイクロイックミラー２３、２６の位置および角度を変更制御できるものでもよい。

以上説明したように、本発明によれば、倍率の異なる対物レンズが複数あっても共焦点画像を取得でき、バイオテクノロジーやメディカル分野における研究開発の効率化への寄与が期待できる。

本発明に係る共焦点顕微鏡システムの構成図である。 図１のピンホール２１ａおよび２１ｂの配置を説明するニポウディスク２１の上面図である。 図１のダイクロイックミラー２３、２６の配置の説明図である。 厚さの異なるダイクロイックミラーにより励起光のピンホールへの入射角度をずらす原理を説明する説明図である。 従来の共焦点顕微鏡システムの一例を示す構成図である。

符号の説明

１０ 光源
２０ 共焦点スキャナ
２１ ニポウディスク
２１ａ、２１ｂ ピンホール
２２ マイクロレンズアレイディスク
２２ｂ マイクロレンズ
２３、２６ ダイクロイックミラー
２４ リレーレンズ
２５ 回転軸
３０ 顕微鏡
３１、３３ 対物レンズ
３２ 結像レンズ
４０ ステージ
４１ プレート
５０ 試料
６０ カメラ
７０ 制御装置
ＤＭＳ ダイクロイックミラーセット

Claims (7)

1. 試料を励起する励起光を共焦点スキャナおよび顕微鏡を介して試料に照射し、この試料の励起による蛍光画像を顕微鏡および共焦点スキャナを介してカメラに入力するように構成された共焦点顕微鏡システムにおいて、
   前記顕微鏡は、倍率の異なる複数の対物レンズを有し、
   前記共焦点スキャナは、穴径の異なる複数のピンホール列が形成されたニポウディスクと、このニポウディスクに対向し前記励起による蛍光画像を前記各ピンホールに集光する複数のマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイディスクと、これらニポウディスクとマイクロレンズアレイディスクの間に設けられた厚さの異なる複数のダイクロイックミラーとを有し、
   前記各対物レンズの倍率に応じて前記各ダイクロイックミラーを選択する選択手段を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡システム。
2. 前記選択手段は、
   倍率の高い対物レンズが選択されたときは厚みの厚いダイクロイックミラーを選択して励起光の光軸上に配置し、前記蛍光画像を穴径の大きいピンホールに入射させ、
   倍率の低い対物レンズが選択されたときは厚みの薄いダイクロイックミラーを選択して励起光の光軸上に配置し、前記蛍光画像を穴径の小さいピンホールに入射させることを特徴とする
   請求項１記載の共焦点顕微鏡システム。
3. 前記ニポウディスクの各ピンホール列は、それぞれのピンホールを、各ピンホール列内の自身の穴径と異なる穴径のピンホールに対して全て同一方向に同一微小距離だけ離れた位置に設けることにより同一微小距離だけ離れて形成されることを特徴とする
   請求項１または請求項２記載の共焦点顕微鏡システム。
4. 前記複数のダイクロイックミラーは、
   屈折率、厚さ、前記励起光の光軸方向に対する傾きに基づき、前記励起光を屈折させて前記各ピンホールに入射させる位置に配置されることを特徴とする
   請求項１〜請求項３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。
5. 前記複数のダイクロイックミラーを水平方向に移動させるダイクロイックミラーセットを備えることを特徴とする
   請求項１〜請求項４のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。
6. 前記カメラの取得した共焦点画像データを記憶し画像解析を行う制御装置を備えることを特徴とする
   請求項１〜請求項５のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。
7. 前記ニポウディスクのピンホールが、前記ニポウディスクの中心から周縁に向かって扇状、うずまき状、螺旋状または直線に並べられていることを特徴とする
   請求項１〜請求項６のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。

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