CN1933784A - 用便携式观察系统进行全身成像 - Google Patents

Abstract

介绍了用便携式仪器对完整受试体内的荧光蛋白进行成像的方法。

Description

用便携式观察系统进行全身成像

相关申请的交叉参考

本申请要求美国法典第35卷第119条(e)之规定，就2004年1月26日提交的60/539,464号和2004年1月29日提交的U.S.60/540,599号申请的相关权益。在此引用这些文件的内容以供参考。

技术领域

此发明涉及使用便携式仪器进行基于体内荧光蛋白的成像方法。用简单的外部成像技术观察受试体内具有荧光蛋白的细胞。配置后，这种便携式观察装置可筛选大量具有荧光蛋白的受试体。

背景技术

全身成像技术已用于监测未受损身体内的“示踪分子”。例如，Brenner等人已在转移性恶性黑瘤病人身上对碘-123-2-羟基-3-碘-6-甲氧基-N-[(1-乙基-2-吡咯烷基)甲基]苯甲酰胺(IBZM)全身成像和铊-201闪烁扫描法的诊断价值进行过比较研究(Brenner，等人，Eur.J.Nucl.Med.，(1999)26：1567-1571)。Nucl.Med.，(1999)26：1567-1571).Benard等人对在全身PET(正电子放射断层扫描)成像中使用137铯进行衰减校正的处理技术进行了临床价值评估(Benard，等人，J.Nucl.Med.，(1999)40：1257-1263)。Jerusalem等人的研究表明：在Hodgkin病和非Hodgkin淋巴瘤的治疗后评估中，18F-荧光脱氧葡萄糖的全身正电子放射X射线断层摄影术比传统的计算X线断层摄影成像技术具有更高的诊断和预知价值(Jerusalem，等人，Blood，(1999)94：429-433)。Eustace等人讨论了全身MR(磁共振)成像的实际问题、临床应用及未来发展方向(Eustace，等人，Magn.Reson.Imaging Clin.(N.Am.)(1999)7：209-236)。Engelson等人研究了脂肪在躯干肿大(用磁共振成像进行量化)的HIV感染者体内的分布情况，(Engelson，等人Am.J.Clin.Nutr.(1999)69：1162-1169)。Valk等人利用[18F]-荧光脱氧葡萄糖的全身正电子放射断层扫描(PET)来处理复发性结肠癌(Valk，等人，Arch.Surg.(1999)134：503-511)。Saunders等人评估了[18F]-荧光脱氧葡萄糖全身正电子放射断层扫描(PET)成像在肺癌各时期中的作用(Saunders，等人，Ann.Thorac.Surg.(1999)67：790-797)。

这项很有价值的技术让人们可以形象地观察体内的基因表达、感染和瘤细胞转移，并且在了解遗传性后遗症的发展和研究改变其遗传征兆途径方面，该技术非常有用。与所述较为复杂的系统不同，该技术在其早期会伤害身体，它要求切除组织或用半透明材料制作皮下创口。

近期，此技术已发展为用光放射来观察完整动物体内的肿瘤细胞或其它细胞的行为。例如，PCT公开的WO97/18841描述了如何用lux操纵子来改变Salmonella(沙门氏菌)，使这些感染源(infectious agent)发出荧光。无需外源荧光的激发，便可直接跟踪观察完整动物体内所发生的感染过程，但在观察期间，需对受试者进行固定，以便获得足够清晰的图象。因此，必须将动物固定在一个不透光的盒子里，图像由一个带电荷耦合元件的照相机生成，该照相机带有连接至Argus50图像处理器的两阶段微通道增强头。此方法需要使受试体保持不动，用光电探测装置来测量从受试体内部光源半分子处发射出的光子，直到发射出的光子生成图像为止，然后透过所述哺乳动物器官的不透明组织观察图像。要获得有用的图像，则需要采用复杂的技术。

PCT出版物WO98/49336描述了用绿色荧光蛋白(GFP)做标记的转移模型。正如该出版物所描述的一样，GFP常用来标记荧光蛋白，这些荧光蛋白不仅可以发出绿色荧光，也可以发出许多其它颜色的荧光。无需固定受试体，就可以对植入肿瘤的转移情况进行实时观察，因为这种蛋白能发射出非常强的荧光。在这种情况下，用荧光显微法观察完整动物体内的状况，同样要求采用相当复杂的技术。随后的PCT出版物WO00/40274介绍了类似的技术。这些技术延伸到用绿色荧光蛋白对基因表达(在WO 01/71009中)和感染进程(在WO2004/016766中)进行观察。

Yang等人在所发表的Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(2000)97：1206-1211中，对这些成果进行了详细说明，文中展示了肿瘤在活小鼠体内的生长和转移的实时荧光照片。全身光学成像系统利用外部光源，对受试体不会造成伤害。它以前所未有的方式提供了对完整动物体内的恶性生长和扩散的连续性可视监测。Yang等人已构造了能稳定并以高水平表达Aequoreavictoria绿色荧光蛋白(GFP)的人类和啮齿动物肿瘤，并且已将这些肿瘤移植到合适的动物体内。全身光学成像系统可显示：原发结肠肿瘤及其在肝脏和骨骼内转移瘤的实时生长情况。成像可使用透视性外荧光显微镜，或者荧光盒及热电制冷色电荷耦合元件照相机。转移和微转移的成像程度视其大小而定。然而，用于观察的仪器也是相当复杂的。

为获得高倍放大的图像，可使用Leica荧光立体显微镜，LZ12型(配有50瓦的汞灯)。使用D425/60带通滤光器和470DCXR分色镜就实现有选择地激发GFP。发射的荧光通过位于HamamatsuC5810-3-芯片制冷色电荷耦合元件照相机(Hamamatsu Photonics Systems，Bridgewater，NJ)上的长通滤光器GG475收集(Chroma Technology，Brattleboro，VT)。对图像进行对比度和亮度处理，并用IMAGE PRO PLUS 3.1软件进行分析(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)。1,024×724像素的图像可直接由IBMPC捕获，或通过SLV-R-1000型号的高清晰度Sony VCR(Sony，Tokyo)上的视频输出连续捕获。

整个动物的较小放大倍数的成像过程在由蓝色光纤(Lightools Research，Encinitas，CA)照明的光盒里进行，利用上面提到的热电制冷色电荷耦合元件照相机生成图像。

此外，对GFP荧光强度进行测量，以记录不同时间内各成像区域激发亮度的变化。通过将小鼠表皮上天然的红色荧光作为基准来矫正这些因素，可矫正GFP所造成的内在绿色荧光的增加量。此方法可行是由于GFP光中红光量相对较少。因此，以表皮图像中红光和绿光的通道构成作为基础，并以相对红光来计算绿色荧光。计算出皮肤图像中无和有GFP时各像素的绿光与红光的通道比率(γ)。在没有GFP存在的情况下，整个小鼠表皮图像的γ值相当稳定，在0.7-1.0之间变化。当动物体内有GFP荧光时，相对于红光，绿光的成份有所增加，这表现在较高的γ值上。将像素数目与每个γ值大于1的像素相乘，计算出GFP荧光总量的近似值。这个乘积大致对应于无GFP的皮肤最大γ值之上的总体GFP荧光[I’GFP]。在没有GFP存在时，小鼠表皮图像中γ值大于1的像素数小于0.02％；并且该数量随GFP的表达而增加。在图1A和1B中，以病毒注入大脑和肝脏后的时间函数分别表示[I’GFP]的值。

将从完好的动物活体获得的各器官的高倍放大图像与死亡并解剖后立即进行直接观察的类似器官进行比较。图片显示了基因表达在各种器官中的分布情况。无一例外的是，这些从外部获取的图像与那些在裸露器官上所观察到的景象相类似。

将活体动物置于光盒中观察，同样可监测到基因表达，这样便可对活体动物及动物体内发生的表达进行实时观察。例如，用光盒对裸露小鼠肝脏中GFP表达进行72小时的观察后可得到所述结果。基因转导24小时后，在裸鼠脑中，也观察到相似的结果。

Weissleder及其同事向带肿瘤的动物体内导入探针，此探针被蛋白酶激活时，能以红外线的频率发射荧光。具有适宜蛋白酶的肿瘤能激活探针，因此可以从外部观察这些肿瘤。此系统不适用于非常强的“肝脏对肿瘤”背景荧光，这意味着无法研究肿瘤如何转移到肝脏-最重要的转移位置之一。此外，研究的最长时限为96小时，这一时间无法满足生长和药效研究的需要。肿瘤细胞必须具有适宜的蛋白酶活性才能被观察到，同时探针要有选择性地导入肿瘤。

很明显，以往的技术虽然有用，但却需要相当复杂的设备，这些技术无法在短时间内对大量受试体做出快速评估。当前的发明利用便携式且可满足多种观察需要的设备解决了这些问题。

发明内容

此发明涉及使用便携式仪器进行荧光蛋白成像的方法。用外部成像技术观察有受试体的荧光蛋白。用便携式激发光源(如手电筒(flashlight)可实时观察一个或多个受试体，此类光源的第一滤光器用作激发光源，第二滤光器有校准地接收发射光。

这种观察技术有许多用途-跟踪观察肿瘤细胞的生长和转移，感染的发展，基因的表达及评估影响这些过程的因素。因此，这种观察方法可在作为肿瘤细胞模型或感染模型的实验动物身上进行实验，并且这些模型可用作评估治疗方案的系统，并用于观察各种刺激对新陈代谢功能的作用的系统。

不管在何种条件下观察荧光信号，要获得信息含量丰富的图像，必须确保便携式设备上激发滤光器与观察滤光器进行正确匹配。

因此，一方面，此发明旨在提供一种透过完整受试体的皮肤显现荧光蛋白的方法，该方法包括使用附带有第一滤光器的便携式光源将激发光施加至所述受试体；以及通过第二滤光器观察所述蛋白的发射光。具体地说，这种成像方法可用于监控肿瘤的生长和转移情况，观察各种方案对所述生长和转移的作用，监测基因表达和观察各种刺激对此类表达的影响，监测感染和观察各种治疗和方案对所述感染的影响。

本发明的实施方式

本发明涉及将荧光蛋白作为示踪物，使用便携式光源进行激发并使用便携式滤光器进行的受试体体内或全身成像方法。

已有多种恰当的荧光蛋白为人们所熟知。例如，从能进行生物发光的水母Aequorea Victoria克隆而来的绿色荧光蛋白(GFP)(AnticancerRes.(1994)14：85-92)基因可以作为有效的细胞标记，常被选用，以满足这些条件(Science(1994)263：802-805；Nat.Biotechnol.(1996)14：606-609805；Nat.Biotechnol.(1996)14：606-609)。GFP的cDNA编码分子量为27kDa的带283个氨基酸的单肽(Gene(1992)111：229-233；Nat.Biotechnol.(1996)14：1252-1256)，该肽不需要其它Aequorea蛋白、底物或辅因子，就可发出荧光(Biochemistry(1993)32：1212-1218)。最近，通过各种技术已获得可以更高亮度表达GFP基因的“功能获得”突变体(Nature(1995)373：663-664；Biotechnology(1995)13：151-154；Gene(1996)173：33-38；Nat Biotechnol(1996)14：315-319；NatBiotechnol.(1996)14：315-319)，此突变体已通过人源化，能高水平地进行表达并发出信号(J.Virol.(1996)70：4646-4654)。来源于Discosomacoral的红色荧光蛋白(RFP)也已见诸报道，预计其对于体内成像研究的作用将得到证明(PNASUSA(2000)97：11990-11995；FEBS Lett.(2000)14：315-130；Nat Biotechnol.(1999)17：969-973。

几个研究组已筛选出能同时在体内体外稳定和高水平地表达GFP的肿瘤细胞系。已经将这些细胞移植到动物体内，在新鲜组织中进行原位观察(PNASUSA(1997)94：11573-11576)。此外，表达GFP的瘤细胞在各大器官(包括肝、肺、脑、脊髓、中轴骨和淋巴结)中都能看见，不论随后是否发生移植。已针对下列癌症开发出转移疾病GFP模型：肺癌(Clin Exp Metastasis.(1997)15：547-552)、前列腺癌(Cancer Res.(1999)59：781-786)、黑素瘤(Clin CancerRes.(1999)5：3549-3559)、结肠癌(PNAS USA(2000)97：1206-1211)、胰腺癌(ClinExp Metastasis(2000)18：213-218)、乳腺癌(Clin Exp Metastasis(1999)17：537-544)、卵巢癌(Clin Exp Metastasis(1999)17：417-422)、和脑癌(Neurosurgery(1998)43：1437-1442)。由此看出，用GFP基因转染的肿瘤细胞是一种帮助在体内观察肿瘤生长、血管新生、休眠、散播、浸染和转移的强大工具。

以下表格I列出了一些已知的荧光蛋白和它们的激发及发光特性。

                           表I

                         荧光蛋白

荧光蛋白	最大激发波长	最大发射波长
			蓝色荧光蛋白(ECFP)*AmCyan绿色荧光蛋白(ECFP)*emeraldGFPmGFP5erZsGreen黄色荧光蛋白(EYFP)*ZsYellow红色荧光蛋白(DsRed)*AsRed	434466489485-488405和477496514531558573	477488508510510506527540583595

^*摘自BDBiosciences，SanJose，CA。

对于这些蛋白在完整受试体内的位置，可以用操作简便的带有合适滤光器的任选手持式激发光源进行跟踪，并可使用经调整可传输出发射光线的滤光器，任选通过肉眼即可直接进行观察。例如，匈牙利布达佩斯的生物实验设备有限公司(Biological Laboratory Equipment，Ltd，Budapest，Hungary)(网站：blsltd.com)生产了多种适于采用本发明(claimed invention)方法进行观察的轻便设备。

总的来说，这些设备包括一个激发光源，一个或多个激发滤光器和一个或多个阻截滤光器。设备中的激发光源和探测组件可能为相同结构的一部分，也可能分属不同组件。

激发光源通常包括超亮的蓝光发光二极管(LED’s)。激发频率通常在400-600nm范围内，用一个具有特定截止频率的激发滤光器实现。阻截过滤器的截止值典型地低于500nm。

一种采用所公布方法的设备是类似矿工探照灯的护目镜(goggle)装置，通过它可让使用者在检查时自由走动。该装置包括光源(典型地为明亮蓝色LED’s)和目镜上方的阻截滤光器组成。此装置的宽通道阻截过滤器适用于观察荧光蛋白发射的光。可用不同的过滤器来观察不同荧光蛋白发射的荧光。

预计可采用本发明的另一种优选设备是一个固定装置，大量样品可从该设备下方通过。在优选的实施方案中，该设备可从多个独立、便携、可互换的光源处发光。如需要，这些光源能够分别对准不同方向。

在设计采用本发明方法的装置时，应使之能够实现裸眼观察。此外，还可将阻截滤光器连接到照相机，以便将图像显示在监视器上，并进行数字化存储。可用标准软件处理图像，并根据需要重复成像步骤而不会动物造成伤害。

总的来说，激发光发射装置和阻截过滤器的特征在于是“便捷”，也就是简单小巧，可将其拿在手上，携带方便。激发光发射装置的大小和总体形状都类似普通的手电筒，但带有合适的滤光器，该滤光器的作用是使适当波长的激发光波能施加到受试体。光束的宽度视观察所需的受试体面积而定。用于观察的第二滤光器要足够小巧，可以拿在手中，便于配置。例如，能够将其放入护目镜中，放入框架里(像一个放大镜)或安装于支架上。如需记录图像，那么最后那种安装于支架上的方式尤其备受青睐。

虽然便携式激发和观察工具都足够简单小巧，可以手持，但在使用时，应可将它们安装于一个或几个支撑物上，以静态方式使用。当需要进行多次观察或观察多个受试体时，这就显得尤为有用。

一个首选的应用便是对肿瘤细胞的发展和转移进行监测。使用便携式定量皮下全身荧光成像装置，就能在受试体体外观察结肠、前列腺、乳房、脑、肝脏、淋巴结、肺、胰腺、骨和其他器官中表达荧光蛋白的肿瘤细胞。这种技术还能与体内肿瘤细胞转导相结合，用于实时成像和靶定肿瘤细胞，从而筛选出对肿瘤细胞有疗效的化合物。使用荧光蛋白作标记的肿瘤/转移模型的详细描述，可以在以上引用的WO00/40274中找到，在此引入作为参考。具体而言，在一个实施方案中，可利用病毒对肿瘤细胞的趋向性，将具有荧光蛋白表达系统的一个或多个外源核酸序列导入目标肿瘤细胞。逆转录病毒载体就是一个优选的实例，这在授予Russell等人的美国专利5,998,192号中有所描述，在此引入作为参考。此专利讨论了重组C型鼠白血病病毒(MLV)的用途。腺病毒载体也在授予Henderson等人的美国专利6,676,935号中有所提及，在此引入作为参考。具有天然或人工趋向性的病毒(用于任何一种或多种癌细胞)均可被用于将外源核酸导入目标肿瘤细胞。“趋向性”用于描述在肿瘤细胞和普通细胞之间优先感染前者的病毒，或同时感染两类细胞，但只在肿瘤细胞中具有转录活性的病毒。

因此，肿瘤特异性病毒能将荧光蛋白导入肿瘤细胞中。病毒基因组导入目标肿瘤细胞后，细胞结构就会转录编码荧光蛋白的一个或多个基因，由此产生荧光蛋白。由于病毒的特异性，它们将优先标记肿瘤细胞。

其它的转导系统(例如，通过脂质体或直接将核酸送入肿瘤细胞)预计都可与本发明结合使用。也可以通过外科移植(包括同位移植)将肿瘤导入受试体，以此处描述的方法开展研究。

其它应用包括：对WO2004/016766中描述的感染源进行标记，以此对感染作用的发展过程和本质进行监测，上文对此已有所提及，在此引入作为参考。发明方法的另一应用是：监测基因表达，尤其是对WO01/71009中描述的各种外部刺激的反应进行监测，上文对此已有所提及，在此引入作为参考。

在所述所有情况中，通过对候选方案或刺激存在和不存在时肿瘤的生长和迁移、基因的表达或感染进行比较，就能对各种方案、治疗方法或刺激物的影响进行监测。由于本发明的观察方法简单直观，因而可以快速对大量方案和刺激物的疗效及安全性进行评估。

本发明中使用何种受试体取决于具体的应用。举例来说，若要监测肿瘤的发展，那么免疫应答减弱的啮齿动物或与肿瘤同源的啮齿动物便是最实用的受试体。感染模型包括更广范围内的实验动物包括含鸟类。要评估基因表达，基本上可以使用任何动物作为受试体，包括啮齿动物、兔、大型家畜如牛和猪及鸡的家畜，甚至包括那些通常为野生的动物。受试体主要受制于所要观察的代谢或细胞活性的性质，对于此处描述的观察系统没有特别的要求。

下面示例旨在阐明本发明，但本发明的用途不限于此。

实施例1

肿瘤细胞的体内荧光蛋白标记

按照Hasegawa等人的方法制备GFP逆转录病毒上清液(“In vivo tumordelivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence ofmetastasis，”Cancer Gene Therapy(2000)7：1336-1340)。准备腹膜内长有人类胃肿瘤的裸鼠(Hasegawa等人也曾讨论过这种情况)。癌细胞植入小鼠后的4-10天内，将逆转录病毒上清液注入小鼠腹膜内。

使用GFsP-5成像装置从外部获取小鼠图像，该装置外形类似矿工探照灯。每隔一周进行一次检查，这样通过GFP的表达可以观察到肿瘤的生长和转移情况。正常组织均未被GFP逆转录病毒转导。逆转录GFP导入两周后，在生殖腺脂肪组织、大网膜、肠中观察到GFP表达的肿瘤细胞，表明GFP基因已有效转导了肿瘤细胞，其表达已经可以检测到。解剖验证体外观察结果。

实施例2

具有卵巢肿瘤碎块的受试体的高通量外部筛选

将体积约为1mm³的表达GFP的中国鼠卵巢肿瘤碎片(CHO-K1-GFP)注入三十只裸鼠体内，以便筛选对肿瘤组织具有潜在抑制作用的化合物。通过外科同位移植(SOI)，在裸鼠卵巢浆膜内植入肿瘤碎块，卵巢肿瘤就会生长(请参阅Chishima，等人，Cancer Res.(1997)57：2042-2047).

将饲养在单独笼子中的动物放置在一个旋转桌上，使其通过GFP-Vid-187(Biological Laboratory Equipment，Ltd，Budapest，Hungary)前方，GFP-Vid-187包括一个安装在标准数字视频照相机上的光源。由于具有强烈的荧光，可以通过照相机采集的视频对这些肿瘤进行观察。对照相机拍摄的图像从直观上进行分析，然后将它们输入计算机以便进行进一步分析。

实验动物接受各种候选化合物，而对照动物只接受盐水。研究中，接受对肿瘤细胞有疗效的候选化合物的动物所发射的荧光比对照动物少。通过观察可知，对照动物体内的荧光可扩散到整个腹腔，包括结肠、盲肠、小肠，脾和腹膜壁。用GFP荧光来跟踪肿瘤细胞的扩散；在所有对照小鼠的肺上探测到许多微转移，在肝脏、肾、对侧卵巢、肾上腺、侧大动脉淋巴结和胸膜上也探测到许多微转移。

Claims (17)

1.一种透过完整受试体的皮肤显现荧光蛋白的方法，该方法包括用附带有第一滤光器的便携式光源用激发光施加至所述受试体；通过第二滤光器观察所述蛋白发射的光线。

2.权利要求1的方法，其中便携式光源是LED手电筒。

3.权利要求1或2中的方法，其中第二滤光器作为护目镜提供。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述的荧光蛋白在肿瘤细胞中表达。

5.权利要求4中的方法，其中所述的肿瘤细胞是通过同位移植导入免疫应答减弱动物或同基因动物体内。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中荧光蛋白由感染源表达。

7.权利要求1-3中任一项的方法，其中通过人工将荧光蛋白连接到需要研究表达的基因的调控系统上。

8.权利要求1-3中任一项的方法，其中通过多于一种的荧光蛋白进行观察。

9.一种监测完整受试体内肿瘤生长的方法，包括：

将带有第一滤光器的便携式激发光源发出的激发光施加至受试体，所述受试体带有以荧光蛋白标记的肿瘤细胞；和

用第二滤光器观察所述肿瘤细胞在完整的受试体内定位。

10.权利要求9中的方法，其中将激发光的施加和观察作为时间函数来执行。

11.权利要求9或10中的方法，还包括用候选方案治疗所述受试体，并比较用候选方案治疗过的所述受试体与没有用候选方案治疗过的受试体的肿瘤细胞定位。

12.一种监测完整受试体内基因表达的方法，该方法包括：

用带有第一滤光器的便携式激发光源将激发光施加至受试体，该受试体包括编码荧光蛋白的核苷酸序列，该荧光蛋白以人工的方式连接到要对其表达进行检测的基因的调控序列上，和

用第二滤光器观察完整受试体内荧光蛋白的存在情况或数量。

13.权利要求12中的方法，其中将所述激发光的施加和观察作为时间函数来执行。

14.权利要求12或13中的方法，还包括对受试体提供刺激，并比较在提供所述刺激与不提供所述刺激的情况下受试体所发射出的荧光水平。

15.一种监测受试体感染进展的方法，包括：

用带有第一滤光器的便携式激发光源将激发光施加至带有由荧光蛋白标记的感染源的受试体，和

用第二滤光器观察所述感染源在完整的受试体内的定位。

16.权利要求15中的方法，其中将激发光的施加和观察作为时间函数来执行。

17.权利要求15或16中的方法，还包括用候选方案治疗所述受试体，和比较用候选方案治疗过的所述受试体与没有用候选方案治疗过的受试体内的感染源定位。