KR20070003879A - 휴대용 관찰 시스템을 사용한 전신 이미징 - Google Patents

휴대용 관찰 시스템을 사용한 전신 이미징 Download PDF

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Abstract

간단한 휴대용 계기를 사용하여 무손상 실험 대상의 형광 단백질을 이미지화하는 방법이 설명되어 있다.
휴대용 관찰 시스템, 이미징, 형광

Description

휴대용 관찰 시스템을 사용한 전신 이미징{WHOLE BODY IMAGING USING PORTABLE OBSERVATION SYSTEMS}
관련 출원에 대한 교차 참고
[0001] 본 출원은 2004년 1월 26일 제출한 미국 출원 60/539,464의 35　U.S.C.　§119(e) 및 2004년 1월 29일 제출한 미국 출원 U.S.　60/540,599의 효력에 그 기반을 둔다. 이 문서의 내용은 본 문서에 참고로 포함되어 있다.
기술 분야
[0002] 본 발명은 휴대용 계기를 사용한 생체 내 형광 단백질 방출에 기반을 둔 이미징 방법에 관한 것이다. 형광 단백질을 함유한 세포는 간단한 외부 이미징 기법을 사용하여 실험 대상 내에서 관찰된다. 형광 단백질을 함유한 많은 실험 대상을 선별하도록 휴대용 관찰 장치가 구성되었다.
[0003] 전신 이미징 기법은 무손상 신체에서 "추적 분자"를 모니터하기 위해 사용되었다. 예를 들어, Brenner는 전이성 악성 흑생종 환자에 대한 악성 탈륨-201 섬광 계수법과 비교하여 요오드-123-2-수산기-3-요오도-6-메톡시-N-[(1-에틸-2-피롤리디닐)메틸] 벤즈아마이드 (IBZM) 전신 이미징에 대해 연구했다. (Brenner, et　al., Eur. J. Nucl. Med., (1999) 26:1567-1571). Benard는 전신 PET 이미징의 137C로의 감쇠 보정을 위한 처리 기법을 임상 평가했다(Benard, et　al., J.　Nucl. Med., (1999) 40:1257-1263). Jerusalem은 림프성 망내피종(호지킨씨병)과 비호지킨 림프종의 치료후 평가를 위해 18F-fluorodeoxyglucose(FDG)를 사용한 전신 양전자 방출 단층촬영술은 종래의 전산 단층 촬영 스캔 이미징보다 더 높은 진단 및 예후 인자 가치를 가진다는 사실을 입증했다(Jerusalem, et　al., Blood, (1999) 94:429-433). Eustace는 전신 MR 이미징의 실제적 문제, 임상적 응용과 향후 방향에 대해 논했다(Eustace, et　al., Magn. Reson. Imaging Clin. (N. Am.) (1999) 7:209-236). Engelson은 전신 자기 공명 이미징으로 정량화하여 몸통 확장을 보고한 HIV-감염 환자의 지방 분포에 대해 연구했다.(Engelson, et　al., Am. J. Clin. Nutr. (1999) 69:1162-1169). Valk는 재발성 결장 직장암의 관리에 [18F]fluorodeoxyglucose와 전신 양전자 방출 단층촬영술(PET)을 사용했다(Valk, et　al., Arch. Surg. (1999) 134:503-511). Saunders는 폐암의 단계 별로 불소-18-fluorodeoxyglucose 전신 양전자 방출 단층촬영술을 평가했다(Saunders, et　al., Ann. Thorac. Surg. (1999)　67:790-797).
[0004] 유전자 발현, 감염과 생체 내 종양 전이를 가시화하는 기능은 분명히 고유 후유증의 진행을 이해하는 것 뿐만 아니라 이 진행을 바꾸기 위한 메커니즘을 고안하는데 유용한 귀중한 기술이다. 상기 설명한 것과 같은 더 복잡한 시스템과는 달리 방출된 빛의 감지를 채택한 이 기술의 초기 형태는 침습형이며 조직을 절개하거나 예를 들어, 반투명 물질로 된 피하창을 제공해야 했다.
[0005] 상대적으로 최근에 무손상 동물의 다른 세포나 종양 세포의 내부 행동을 관찰하기 위해 빛 방출을 사용하는 기법들이 고안되었다. 예를 들어, PCT 출판물 WO　97/18841에서는 살모넬라균을 완화하기 위한 lux operon에 대해 설명하여 이 감염원은 바이오 형광물질이 되었다. 감염의 과정은 형광물질을 외부 자극하지 않고도 무손상 동물에서 추적할 수 있지만 관찰하기 위해서는 충분한 이미지 강도를 제공하기 위한 실험 대상의 고정화가 필요했다. 그러므로, 동물은 완전 차광 상자에 고정하고 Argus　50 이미지 센서에 부착된 2단계 마이크로채널 증강기 헤드를 전하결합소자로 이미지를 만들어야 했다. 이 방법에서는 실험 대상을 고정된 상태로 유지하고, 광자 방출 이미지가 구축될 때까지 광검출기 장치로 실험 대상에 위치한 빛 발생 부분에서의 광자 방출을 측정하고, 언급된 동물의 불투명한 조직을 통해 이미지를 감지해야 했다. 의미있는 이미지를 얻으려면 복잡한 기술이 필요하다.
[0006] PCT 출판물 WO　98/49336은 마커로 녹색 형광 단백질을 사용하는 전이 모델에 대해 설명한다. 이 출판물에 언급된 대로, GFP는 단지 녹색이 아니라 다양한 색을 방출하는 형광 단백질에 대해 일반적으로 사용되는 명칭이다. 이 단백질에서 나오는 고강도 형광성으로 인해 실험 대상을 고정할 필요 없이 이식된 종양으로부터의 전이를 실시간으로 관찰할 수 있었다. 이 경우에는 형광 현미경을 통해 무손상 동물에서의 기록이 관찰되었으며 소견을 위해서도 상당히 복잡한 기술이 필요하다. 후속 PCT 출판물 WO　00/40274에서도 비슷한 기법이 설명되었다. 이 기법은 WO　01/71009에서는 녹색 형광 단백질을 사용한 유전자 발현의 관찰까지, 그리고 WO　2004/016766에서는 감염 진행까지도 확대되었다.
[0007] 이 접근법은 살아 있는 쥐에서 형광 종양이 자라고 전이되는 이미지를 실시간으로 보여주는Yang( et　al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (2000) 97:1206-1211))에 의해 더 자세하게 설명되었다. 전신 광학 이미지 시스템은 외부적이며 비침습형이다. 이 시스템은 무손상 동물 내에서 악성 성장과 확산에 대한 시각적 모니터링을 전례없이 연속적으로 제공할 수 있다. Yang은 매우 높은 수준의 Aequorea victoria 녹색 형광 단백질(GFP)을 안정적으로 발현하는 새로운 인간 및 설치류의 종양을 설정해서 이를 적절한 동물에게 이식했다. 전신 광학 이미지는 간과 골격의 전이성 병변과 주요 결장 종양의 진전을 실시간으로 보여주었다. 이미징은 전체 조명된(trans-illuminated) 형광(epifluorescence) 현미경 또는 형광등 상자와 열전기적으로 냉각된 칼라 전하결합 소자 카메라이다. 전이와 미소 전이가 이미지화될 수 있는 깊이는 그 크기에 달려 있었다. 하지만 관찰을 위해 사용된 기구는 복잡했다.
[0008] 높은 배율로의 가시화를 위해 50-W 수은 램프가 장착된 Leica 형광 스테레오 현미경, 모델 LZ12이 사용되었다. GFP의 선택적인 여기(excitation)는 D425/60 대역 통과 필터와 470 DCXR 색선별 거울을 통해 생성되었다. 방출된 형광 물질은 Hamamatsu C5810- 3칩 냉각 칼라 전하 결합 소자 카메라의 장거리 통과 필터GG475 (Chroma Technology, Brattleboro, VT)를 통해 수집되었다(Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater, NJ). 이미지는 밝기와 컨트라스트를 위해 처리되고 IMAGE PRO PLUS　3.1 소프트웨어로 분석되었다(Media Cybernetics, Silver Springs, MD). 1,024 x 724 화소의 이미지는 IBM PC를 통해 직접 또는 고해상도 소 니 VCR 모델 SLV-R-1000(Sony, Tokyo)의 비디오 출력을 통해 연속적으로 캡처되었다.
[0009] 동물 전체를 가시화했던 더 낮은 배율에서의 이미징은 파란색 광섬유(Lightools Research, Encinitas, CA)로 비추고 상기 설명된 것처럼 열전기적으로 냉각된 칼라 전하결합소자 장치 카메라를 사용하여 이미지 처리한 라이트 박스에서 수행되었다.
[0010] 또한 시간과 이미징 영역에 따라 조명의 변화를 설명하기 위해 GFP 형광물질의 강도가 측정된다. GFP에서 초래한 고유한 녹색 형광물질에 대한 증가를 교정하기 위한 기본선으로 쥐의 피부에 내재한 적색 형광물질을 사용하여 이 요소는 교정된다. GFP 빛에 적색 루미넌스가 상대적으로 적기 때문에 가능했다. 결과적으로 피부 이미지의 적색과 녹색 채널 구성에 기반을 두어 녹색 형광물질은 적색과 비교하여 계산되었다. GEP가 있는 상태와 없는 상태에서 피부 이미지에 각 화소에 대한 녹색-적색 채널 비율(K)이 결정되었다. GEP가 없는 상태에서는 이미지 전반에서 쥐 피부에 대한 K의 값은 0.7에서　1.0 사이로 상당히 일정했다. 동물로부터의 GFP 형광물질의 공헌은 적색에 비교하여 녹색 구성요소를 증가시켰으며, 이는 더 높은 K 값에서 반영되었다. GFP 형광 물질의 총량은 화소의 수를 곱해서 어림잡았으며, 여기에서 값 K 은 각 화소의 K 값의 1배보다 높았다. 이러한 곱은 GEP 없이 피부에 대한 최대값 K 이상으로 적분 GFP 형광 [I’ GFP]에 해당한다. GEP 없이 K 값이 > 1.0인 GFP 쥐 피부에서 화소의 수는0.02% 이하였으며 GFP 발현과 함께 증가 했다. [I’ GFP]의 값은 각각 뇌와 간에 대해 그림 1A와　1B에서 바이러스 주입 후 시간의 함수로 표시되었다.
[0011] 사망 또는 절개 직후 관찰된 비슷한 조직 또는 살아 있는 무손상 동물에서 고배율로 취했을 때의 다양한 기관의 이미지가 비교되었다. 이미지는 다양한 기관의 유전자 발현의 분포를 보여준다. 모든 경우에서 외부적으로 만들어진 이미지는 노출된 기관의 이미지와 비슷하다.
[0012] 라이트 박스에서 살아 있는 동물을 봤을 때 유전자의 발현을 모니터할 수 있었으므로 이것이 동물에게서 발생될 때 살아 있는 동물의 발현을 실시간으로 관찰할 수 있었다. 예를 들어, 72시간 후 실험용 쥐 간에서 GEP의 발현을 보면 이 결과가 확실하다. 비슷한 결과가 유전자 전달 후 24시간 후에 실험용 쥐에서도 발견된다.
[0013] Weissleder와 동료들은 프로테아제 활동에 의해 활성화될 때 적외선 주파수에서 형광을 발하는 프로브로 종양 동물에게 주입했다(Nat. Biotechnol. (1999) 17:375-378). 적절한 프로테아제가 있는 종양은 프로브를 활성화했으며 외부적으로 볼 수 있었다. 이 시스템은 매우 높은 간-종양 배경 형광물질에 의해 제한되며, 가장 중요한 전이 장소 중 간으로의 전이는 연구할 수 없다는 것을 의미한다. 또한, 연구의 시간 제한은 96 시간이므로 증가와 유효성 연구는 불가능했다. 종양은 감지할 수 있는 적절한 프로테아제 활동이 있어야 하며, 프로브는 종양에 선택적으로 전달되어야 한다.
[0014] 이전 기술은 유용하긴 했지만 복잡한 장치를 필요로 하고 짧은 기간 내에 많은 실험 대상을 신속하게 평가하지 못했던 것이 분명하다. 본 발명은 여러 관측에 대해 쉽게 맞출 수 있는 휴대용 장치를 활용하여 이러한 문제점을 해결했다.
본 발명의 내용
[0015] 본 발명은 휴대용 계기를 사용한 형광 단백질의 이미징 방법에 관한 것이다. 형광 단백질은 외부 이미징 기법을 사용하여 실험 대상 내에서 관찰된다. 여기(excitation) 광원을 위한 1차 필터 및 방출된 빛을 받도록 조정된 2차 필터가 있는 휴대용 여기 광원(예를 들어 섬광등)을 사용하여 하나 이상의 실험 대상에 실시간 관찰을 수행할 수 있다.
[0016] 이 관찰 기법은 많은 상황에 적용된다 - 종양의 증가와 전이를 추적하는 상황, 감염의 진행을 추적하는 상황, 유전자 발현을 추적하는 상황, 그리고 이들 프로세스 각각에 영향을 미칠 수 있는 요소를 평가하기 위한 상황에 적용된다. 그러므로, 종양 모델 또는 감염 모델로 역할을 하는 실험용 동물에 대해 관찰할 수 있으며 이러한 모델은 대사 기능에 대한 다양한 자극의 영향을 관찰하는 것 뿐만 아니라 치료 프로토콜을 평가하기 위한 시스템으로도 사용된다.
[0017] 여기 필터의 적절한 매칭과 휴대용 장치의 관찰 필터로 인해 형광 신호가 관찰되는 상황에 관계없이 정보를 위한 이미징이 가능하다.
[0018] 그러므로 어떤 한 측면에서 볼 때, 본 발명은 무손상 실험 대상의 피부를 통해 형광 단백질을 가시화하는 방법에 대한 것으로, 이 방법은 첨부된 1차 필터가 달린 휴대용 광원을 사용하여 해당 실험 대상에 여기 빛을 적용하고 2차 필터를 통해 단백질로부터의 방출을 관찰하는 것으로 구성된다. 특별한 측면에서, 종양 진행과 전이를 모니터하고, 진행과 전이에 대한 다양한 프로토콜의 영향을 관찰하고 유전자 발현을 모니터하고, 해당 발현에 대한 다양한 자극물의 영향을 관찰하고, 감염을 모니터하고 해당 감염의 진행에 대한 다양한 치료와 프로토콜의 영향을 관찰하기 위해 이 가시화가 채택된다.
발명을 수행하기 위한 형태
[0019] 본 발명은 추적자로서 형광 단백질을 사용하고 감지하기 위해 휴대용 필터 및 여기를 위한 휴대용 광원을 사용한, 실험 대상의 생체 내 또는 전신 이미징 방법과 관련된다.
[0020] 많은 수의 적절한 형광 단백질이 나와 있고 기법으로도 잘 알려져 있다. 예를 들어, 바이오 형광물질 해파리 Aequorea Victoria로부터 복제된 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자(Anticancer Res.(1994) 14:85-92)가 선택되었다. 세포 마커로서의 유용성을 가지기 때문에 이들 조건을 충족시키도록 하기 위함이다.(Science (1994) 263:802-805; Nat. Biotechnol. (1996) 14:606-609). GFP cDNA는 다른 Aequorea 단백질, 기질 또는 형광 보조인자를 필요로 하지 않는(Biochemistry (1993) 32:1212-1218), 분자량이 27　kDa (Gene (1992) 111:229-233; Nat. Biotechnol. (1996) 14:1252-1256)인 283 아미노산 단위체 폴리펩티드를 암호화한다. 최근에, GEP를 발현하는 기능 손실 돌연변이체(gain-of-function bright mutants)가 다양한 기법에 의해 생성되었으며(Nature (1995) 373:663-664; Biotechnology(1995) 13:151-154; Gene (1996) 173:33-38; Nat Biotechnol.(1996) 14:315-319; Nat Biotechnol. (1996) 14:315-319) 높은 발현과 신호를 위해 교화되었다(humanized)(J.　Virol. (1996) 70:4646-4654). 해면동물(Discosoma coral)로부터의 적색 형광 단백질(RFP)에 대해서도 설명되었으며 생체 내 이미징 연구에 유용함이 입증되었다. (PNAS USA (2000) 97:11990-11995; FEBS Lett. (2000) 479:127-130; Nat. Biotechnol. (1999)　17:969-973.
[0021] 여러 그룹들은 생체 밖과 생체 내에서 높은 수준으로 GEP를 안정적으로 발현하기 위해 종양 세포 라인을 선택했다 . 이 세포는 동물에 이식되어 신선한 상태의 조직에서 원래 위치에 가시화되었다(PNAS USA (1997) 94:11573-11576). 또한 GEP를 발현하는 종양 세포는 간, 폐, 뇌, 척수, 중축 골격과 림프 노드를 포함한 모든 주요 기관에서 후속적인 집락화(subsequent colonization)가 있거나 없는 상태로 가시화되었다. 폐암(Clin Exp Metastasis. (1997) 15:547-552), 전립선암(Cancer Res. (1999) 59:781-786), 흑색종 (Clin Cancer Res. (1999) 5:3549-3559), 직장암(PNAS USA (2000) 97:1206-1211), 췌장암 (Clin Exp Metastasis (2000) 18:213-218), 유방암(Clin Exp Metastasis (1999) 17:537-544), 난소암 (Clin Exp Metastasis (1999) 17:417-422)과 뇌암(Neurosurgery (1998) 43:1437-1442)을 위한 전이성 질환의 GFP 모델이 개발되었다. 이 검토는 GFP로 핵내 주입된 종양 세포는 종양 증가, 혈관 신생, 휴지상태, 살포와 전이의 생체 내 가시화를 위한강력한 도구라는 사실을 보여준다.
[0022] 아래 표 1은 여러 가지 알려진 형광 단백질과 단백질의 관련 여기 및 방출 특성을 보여준다.
형광 물질
형광 물질 여기 최대 파장 방출 최대 파장
시안 형광 단백질(ECFP)* 434 477
AmCyan 466 488
녹색 형광 단백질(EGFP)* 489 508
emeraldGFP 485-488 510
mGFP5er 405와 477 510
ZsGreen 496 506
황색 형광 단백질(EYFP)* 514 527
ZsYellow 531 540
적색 형광 단백질 (DsRed)* 558 583
AsRed 573 595
* 캘리포니아주 산호세, BD Biosciences 제공.
[0023] 무손상 실험 대상에서 이 단백질의 위치는 적절한 필터가 있는 간단한 광학 소형 여기 광원을 사용하여 추적하고 방출된 빛을 전하도록 맞추어진 필터를 사용하여 직접, 광학적으로 단지 눈으로 관찰했다. 예를 들어, 헝가리 부다페스트의 Biological Laboratory Equipment, Ltd(웹사이트:bls-ltd.com)는 본 발명의 방법과 함께 사용할 수 있는 많은 경량 휴대용 장치를 만들었다.
[0024] 일반적으로 이 장치는 여기 광원, 하나 이상의 여기 필터 및 하나 이상의 차단필터(barrier filter)로 구성된다. 구상된 장치의 여기 광원과 탐지 구성요소는 같은 구조의 일부이거나 다른 구성요소로 구분될 수 있다.
[0025] 여기 광원은 일반적으로 ultra bright 청색 LED로 구성된다. 여기 주파수의 범위는 일반적으로 400 ~　600　nm로서 이 범위는 특수한 차단 주파수(cut off frequency)가 있는 여기 필터를 사용하여 달성되었다. 차단 필터의 차단 주파수는 일반적으로 500　nm 이하이다.
[0026] 발표된 방법과 함께 사용하기 위한 하나의 장치는 광부의 램프와 비슷한 고글 어셈블리(goggle assembly)이며 이 장치는 검사를 수행하는 동안 사용자가 자유롭게 이동할 수 있게 해준다. 이 장치는 일반적으로 밝은 청색 LED와 접안렌즈 위의 차단 필터로 구성된다. 본 장치의 광 경로(wide path) 차단 필터는 형광 단백질 방출 관찰에 적합하다. 다른 형광 단백질로부터의 방출을 관찰하기 위해서 다른 필터를 사용할 수 있다.
[0027] 본 발명과 함께 사용하도록 구상된 다른 선호 장치는 많은 샘플이 통과할 수 있는 정지형 장치(stationary device)이다. 선호하는 구현 예에서, 이 장치는 많은 개별 휴대용 및 교환 가능 광원으로부터 빛을 발생한다. 필요한 경우, 이 광원은 개별적으로 조준할 수 있다.
[0028] 본 발명의 방법에 유용한 장치는 맨 눈으로 관찰할 수 있도록 설계할 수 있다. 대신, 차단 필터를 카메라에 연결하여 이미지를 모니터에 표시하고 디지털로 저장할 수 있다. 표준 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리할 수 있고, 이미징 절차는 실험 동물에게 해를 가하지 않으며 필요한 만큼 반복할 수 있다.
[0029] 일반적으로, 여기 빛 방출 장치 및 관찰하게 해주는 차단 필터는-“휴대용”이라는 특징을 가진다 - 즉, 충분히 간단하고 작아서 한 손에 잡거나 가지고 다닐 수 있다. 여기 빛 방출 장치는 크기와 전반적인 모양에서 일반적인 섬광등과 비슷하지만 실험 대상에 도달하는 적절한 여기 파장이 나올 수 있게 해주는 적절한 필터와 함께 제공된다. 빔 폭은 관찰할 대상 부분의 크기에 의해 결정된다. 관찰을 위해 사용되는 2차 필터는 충분히 작아서 손에 쥐고 휴대할 수 있으며 편리함을 돕도록 구성할 수도 있다. 예를 들어 고글에 맞추거나 프레임(확대경과 비슷)에 배치하거나 지지대에 장착할 수 있다. 마지막으로 언급한 옵션은 이미지를 기록하려는 경우 특히 권장할만하다.
[0030] 휴대용 여기와 관찰 도구는 충분히 간단하고 작아서 손으로 잡을 수 있는 반면 하나 이상의 지지대에 장착하고 정지형 모드(stationary mode)에서 사용할 수 있다. 이 장치는 특히 여러 번 관찰하거나 여러 실험 대상이 사용될 때 바람직하다.
[0031] 선호하는 한가지 적용은 종양의 진행과 전이를 모니터링하는 것이다. 직장, 전립선, 유방, 뇌, 간, 림프절, 폐, 췌장, 골수와 다른 기관의 형광 단백질 발현 종양은 휴대용 정량형 경피(transcutaneous) 전신 형광 이미징 장치의 사용으로 외부적으로 가시화할 수 있다. 생체 내 종양 세포 변환과 결합된 이 기술은 종양 세포에 대한 효율성을 위해 복합물을 선별하기 위해 종양 세포의 실시간 이미징 및 타케팅을 위해 사용할 수 도 있다. 마커로서 형광 단백질을 사용한 종양/전이 모델에 대한 자세한 설명은 상기 설명되어 본 문서에 참고자료로 통합된 WO　00/40274에 나와 있다. 특히 한 구현 예에서, 대상 종양 세포에 대한 형광 물질을 위한 발현 시스템으로 구성된 하나 이상의 외인 핵산 순서를 전달하기 위해 종양 세포에 대한 친화성(tropism)을 가진 바이러스가 채택되었다. 레트로 바이러스(역바이러스) 백터는 본 문서에 참조로 포함된 미국 특허 (번호5,998,192, Russell, et al.)에 설명된 것과 같은 선호하는 예이다. 이 특허에서는 재조합 C-타입 쥐과의 백혈병 바이러스(MLV)의 사용에 대해 논한다. 아데노비루스 벡터는 본 문서에 참조로 포함된 미국 특허(번호:　6,676,935, Henderson, et al.)에 설명된 것처럼 사용될 수도 있다. 하나 이상의 암 세포에 대한 자연 또는 조작된 친화성을 가진 모든 바이러스는 대상 종양 세포에 외인 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다. "친화성(Tropism)"은 정상 세포와 종양 세포에 영향을 미치지만 전사적으로(transcriptionally) 종양 세포에서만 활성인 모든 바이러스 뿐만 아니라 정상 세포보다 종양 세포를 먼저 감염시키는 바이러스에 대해 설명한다.
[0032] 그러므로, 종양의 특정한 바이러스는 형광 단백질을 종양 세포에 전달할 수 있다. 바이러스 게놈이 실험 대상 종양 세포에 도입된 후, 형광 단백질을 암호화한 유전자는 세포 기계(cellular machinery)에 의해 전사되며 형광 단백질이 생성된다. 바이러스의 특이성으로 인해 종양 세포는 별도로 식별된다.
[0033] 리포솜과 같은 다른 전달 시스템 또는 종양 세포에 대한 핵산 직접 적용에 관한 사항이 본 발명과 함께 사용하도록 구상되었다. 종양은 본 문서에 설명된 방법을 사용하여 연구용 대상에 동소적으로(orthotopically) 이식하는 것을 포함하여 외과 수술로 이식할 수도 있다.
[0034] 다른 응용은 상기 설명되어 본 문서에 참고자료로 통합된 WO　2004/016766에 설명된 대로 식별된 감염원을 사용하여 감염의 효과에 대한 성격과 진행을 모니터하는 것이다. 상기 설명되어 본 문서에 참고자료로 통합된 WO　01/71009에 설명된 대로 특히 다양한 외부 자극에 대한 응답과 관련하여 유전자 발현을 모니터링하는 것도 본 발명 방법을 응용하는 데에 유용하다.
[0035] 이 모든 상술한 경우에서 다양한 프로토콜, 치료나 자극물의 영향은 종양 증가와 전이 또는 유전자 발현, 후보 프로토콜이나 자극물의 존재나 부재시 감염을 비교하여 모니터할 수 있다. 본 발명의 관찰 방법은 간단하고 직접적이므로 많은 수의 프로토콜 및 자극물은 효율성과 안전을 위해 빨리 평가될 수 있다.
[0036] 본 발명에서 유용한 실험 대상의 성격은 응용이다. 예를 들어 종양 진행을 모니터링하기 위해서는 가시화된 종양이 있는 선천성의 설치류 또는 면역억제 설치류가 가장 편리하다. 감염 모델에는 새를 포함하여 더 폭 넓은 연구 동물이 포함된다. 유전자 발현 평가를 위해 설치류, 토끼 및 소, 돼지, 닭과 같은 가축, 일반적으로 야생인 동물을 포함하여 거의 모든 동물 대상을 사용할 수 있다. 실험 대상에 대한 제한은 본 문서에 설명된 관찰 시스템이 아니라, 관찰된 대사 또는 세포 활동에만 관련된다.
[0037] 본 발명을 제한하기 위해서가 아니라 예시를 위해 다음 예가 제공된다.
실시예 1
종양 세포의 생체 내 형광 단백질 표시
[0038] Hasegawa 에 따라 GFP 역바이러스 상청액(retroviral supernatants)이 준비된다.("전이의 향후 발생을 보고하기 위한 녹색 형광 단백질 유전자의 생체 내 종양 전달," Cancer Gene Therapy (2000) 7:1336-1340). Hasegawa가 주장하듯 인간 위 종양이 복강에서 자라게 하여 실험용 쥐를 준비했다. 역바이러스 상청액은 암 세포를 쥐에 이식한 후 4-10일 째에 복강으로 주입된다.
[0039] 광부의 램프와 비슷한 GFsP-5 이미징 장치를 사용하여 쥐를 외부로 이미지 처리한다. 이주마다 검사를 수행하여 종양 증가와 전이 형성을 GFP 발현으로 가시화할 수 있다. 정상 세포는 GFP 역바이러스에 의해 변환되지 않는다. 역바이러스 GFP 전달 후 2주 후, GFP-발현 종양 세포는 생식 지방, 더 큰 그물막(omentum)과 장에서 관찰되므로, 종양은 GFP 유전자에 의해 효과적으로 변환되고 그 발현에 의해 감지될 수 있다. 외부적으로 이루어진 관찰을 확인하기 위해 개복술이 수행된다.
실시예 2
난소 종양 조각을 가진 실험 대상의 고효율 외부 선별
[0040] 종양 조직에 대한 유효성을 위해 잠재적인 제암성 복합물을 선별하기 위해 30마리의 실험용 쥐에 약 1　mm3의 GFP-발현 중국 햄스터 난소 조각(CHO-K1-GFP)이 이식되었다. 실험용 쥐는 수술적 동소 이식(SOI)에 의해 실험용 쥐의 난소 장막에 종양 조각을 이식했고 난소 종양이 발전된다.(See, Chishima, et al., Cancer Res.(1997)　57:2042-2047).
[0041] 개별 우리에 수용된 동물을 회전 테이블에 배치하고 표준 디지털 비디오 카메라에 맞게 장착된 광원으로 구성된 GFP-Vid-187 (Biological Laboratory Equipment, Ltd, Budapest, Hungary) 앞으로 통과시킨다. 강력하게 형광성인 종양은 카메라에서 수집한 비디오 영상에서 관찰 가능하다. 카메라에서 수집한 이미지는 시각적으로 분석되어 추가 분석을 위해 컴퓨터에 입력된다.
[0042] 비교 동물에게는 염분을 주는 반면 실험 동물에게는 다양한 복합물을 준다. 연구 도중, 종양 세포에 대해 효과가 있는 복합물을 받은 동물은 비교 동물보다 형광 물질을 덜 보인다. 비교 동물에서의 형광성은 직장, 맹장, 소장, 비장과 복막강벽을 포함하여 복막강 공간 전반에 퍼지는 것으로 관찰된다. GFP 형광물질은 종양 확산을 추적하는데 사용된다: 모든 비교 쥐의 폐에서 다양한 마이크로 전이가 감지되고 간, 신장, 반대측 난소, 부신, 부대동맥 림프절과 측막에서도 여러 마이크로 전이가 감지된다.

Claims (17)

  1. 무손상 실험 대상의 피부를 통해 형광 단백질을 가시화하는 방법; 첨부된 1차 필터가 달린 휴대용 광원을 사용하여 해당 대상에 여기 빛을 적용하고 2차 필터를 통해 단백질로부터의 방출을 관찰하는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 휴대용 광원이 LED 섬광원인 것을 특징으로 하는 가시화 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2차 필터가 고글로 제공된 것을 특징으로 하는 가시화 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 해당 형광 단백질이 종양 세포로 발현되는 것을 특징으로 하는 가시화 방법.
  5. 제4항에 있어서, 해당 종양 세포가 면역 억제 또는 선천성 동물에 동소적으로 이식되는 것을 특징으로 하는 가시화 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 형광 단백질이 감염원으로 발현되는 것을 특징으로 하는 가시화 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 형광 단백질이 발현을 연구한 유전자에 대한 비교 시스템에 효율적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 가시화 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 형광 단백질에 대해 관찰하는 것을 특징으로 하는 가시화 방법.
  9. 무손상 실험 대상의 종양 증가를 모니터하는 방법으로서 다음 단계를 포함하여 이루어지는 방법:
    1차 필터가 있는 휴대용 여기 광원을 사용하여 여기 빛을 형광 단백질이 식별된 종양 세포로 구성된 실험 대상에 적용하는 단계;
    2차 필터를 사용하여 무손상 대상에서 해당 종양 세포의 위치를 관찰하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 여기 빛을 적용하고 관찰하는 것이 시간의 함수로 수행되는 것을 특징으로 하는 가시화 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 프로토콜로 해당 실험 대상을 처리하고 프로토 콜로 처리되지 않은 실험 대상에서 종양 세포의 위치와 프로토콜로 처리된 해당 실험 대상의 종양 세포의 위치를 비교하는 것을 포함하는 방법.
  12. 무손상 실험 대상에서 유전자 발현을 모니터하기 위한 방법으로; 이 방법은 1차 필터로 휴대용 여기 광원으로부터 여기 빛을 (발현이 모니터링된 유전자와 관련된 제어 순서에 연결된 형광 단백질을 암호화하는 핵산 순서로 구성된) 실험 대상에 적용하고, 2차 필터를 사용하여 무손상 피사체에 형광 단백질의 양 또는 존재를 관찰하는 것을 포함한다.
  13. 제12항에 있어서, 여기 빛의 적용과 관찰은 시간의 함수로 수행되는 것을 특징으로 하는 가시화 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 해당 자극물을 실험 대상에 제공하고; 해당 자극물이 제공되지 않은 실험 대상에 의해 방출되는 형광 레벨과 자극물을 제공했던 실험 대상에 의해 방출되는 형광 레벨을 비교하는 것을 포함하는 방법.
  15. 실험 대상에서 감염의 진행을 모니터하는 방법으로서 다음 단계를 포함하여 이루어지는 방법;
    1차 필터가 있는 휴대용 여기 광원을 사용하여 여기 빛을 형광 단백질이 식 별된 감염원으로 구성된 실험 대상에 적용하는 단계;
    2차 필터를 사용하여 무손상 실험 대상에서 해당 감염원의 위치를 관찰하는 단계.
  16. 제15항에 있어서, 여기 빛을 적용하고 관찰하는 것이 시간의 함수로 수행되는 것을 특징으로 하는 가시화 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 프로토콜로 해당 실험 대상을 처리하고 프로토콜로 처리되지 않은 실험 대상에서 감염원의 위치와 프로토콜로 처리된 해당 실험 대상의 감염원의 위치를 비교하는 것을 포함하는 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012077936A2 (en) * 2010-12-07 2012-06-14 National Cancer Center Fluorescence-sensing probe, and fluorescence detection method, sentinel lymph node dissection method and target-guided surgery method which use the probe
US8295900B2 (en) 2008-01-25 2012-10-23 Ls Cable & System Ltd. Terminal apparatus with built-in fault current limiter for superconducting cable system

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1281767A3 (en) 2001-07-31 2003-05-28 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of tumors
EP1369491A1 (en) 2002-06-05 2003-12-10 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue
EP1644492B1 (en) 2003-06-18 2009-01-07 Genelux Corporation Modified recombinant vaccinia viruses, uses thereof
US8642009B2 (en) 2005-12-16 2014-02-04 Catherine M. Shachaf Diagnostic system for the detection of skin cancer
JP2007282630A (ja) * 2006-03-22 2007-11-01 Glycomedics Inc オリゴ糖鎖合成方法
RU2008152808A (ru) * 2006-06-12 2010-07-20 Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. (Nl) Устройство для контроля тела, способ сбора данных о теле и способ определения наличия, местоположения и/или стадии раны
CA2934659A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois System and methods for measuring physiological parameters

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0660936T3 (da) * 1992-09-14 1999-05-25 Stanford Res Inst Int Op-konverterende reportermolekyle til biologiske og andre assays under anvendelse af laserexcitationsteknik
US6914250B2 (en) * 1997-03-07 2005-07-05 Clare Chemical Research, Inc. Fluorometric detection using visible light
CA2283267A1 (en) * 1997-03-07 1998-09-11 Clare Chemical Research Llc Fluorometric detection using visible light
WO2002080756A2 (en) * 2001-04-05 2002-10-17 The Johns Hopkins University Imaging systems for in vivo protocols
EP1432786B1 (en) * 2001-09-06 2009-07-22 Genomic Profiling Systems, Inc. Rapid detection of replicating cells
EP1452591B1 (en) * 2001-10-11 2009-12-02 Riken Fluorescent protein

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8295900B2 (en) 2008-01-25 2012-10-23 Ls Cable & System Ltd. Terminal apparatus with built-in fault current limiter for superconducting cable system
WO2012077936A2 (en) * 2010-12-07 2012-06-14 National Cancer Center Fluorescence-sensing probe, and fluorescence detection method, sentinel lymph node dissection method and target-guided surgery method which use the probe
WO2012077936A3 (en) * 2010-12-07 2012-10-04 National Cancer Center Fluorescence-sensing probe, and fluorescence detection method, sentinel lymph node dissection method and target-guided surgery method which use the probe

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WO2005072622A1 (en) 2005-08-11

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