CN108913599B - 一种活细胞原位培养长时程多模信息检测方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种活细胞原位培养长时程多模信息检测方法及系统，该检测系统包括微流控芯片活细胞原位培养模块、多模信息检测模块、多维运动控制模块和数字信息存储处理与显示模块；微流控芯片活细胞原位培养模块用于对活细胞进行培养；多模信息检测模块采用白光干涉高光谱解析、吸收或发射光谱解析、电阻抗、细胞自发荧光和/或激发荧光方式对活细胞进行长时程原位无损检测；数字信息存储处理与显示模块通过多维运动控制模块控制微流控芯片活细胞原位培养模块中活细胞的运动，获取活细胞的三维空间位置信息以及检测信息进行存储、处理和显示，完成对活细胞多模信息的长时程、原位、五维信息融合检测。

Description

一种活细胞原位培养长时程多模信息检测方法及系统

技术领域

本发明是关于一种活细胞原位培养长时程多模信息检测方法及系统，涉及细胞分析检测技术领域。

背景技术

细胞作为生命活动的基本单位，在生命科学、医学的基础科研和临床应用中非常重要，基于CO₂恒温培养箱、显微技术和荧光标记的细胞形态结构与功能的检测方法，已经不能满足人们对活细胞生长发育、迁移运动、分裂分化、凋亡与癌变、细胞的免疫耐受与反应、细胞吞噬、细胞相互之间、细胞与基质、细胞与可溶性分子的相互作用等复杂细胞行为和功能分析的使用要求。电镜、近场光学、随机光重建显微技术等高分辨率测量方法和色谱、质谱、分光光度测量等分离提纯测量方法，均不适用于活细胞培养原位长时程在线测量。因此，进行活细胞培养多模态、多层次(亚细胞水平、分子离子水平、动物在体水平)、无损的可视化原位长时程在线检测研究，以及开发新型科学仪器，对生命科学、医学和临床医疗前沿领域的单细胞分析、复杂细胞功能研究以及重要细胞事件和生命现象的发现将至关重要。

要实现活细胞形态结构与功能多模信息的长时程原位在线检测，首先必须解决好细胞培养与多种检测方法并存的技术难题。细胞培养是维持细胞生长与保持细胞活性的重要手段，现有细胞培养方法主要有CO₂恒温细胞培养箱、显微培养装置和显微镜活细胞工作站。其中，CO₂恒温细胞培养箱具有良好的细胞培养与活性保持功能，但是它的体积相对较大，不具备细胞检测功能，也不适合被集成进入其它细胞检测系统中。显微培养装置是一种小型化的细胞培养箱，可以与显微镜配套集成使用进行细胞光学显微成像检测，但是在细胞培养换液方面依然存在一定的灌流扰动问题，对保持细胞原位检测有较大的影响，需要进一步发展完善。且由于体积大幅度减小，显微培养装置在温控精度方面不如CO₂恒温细胞培养箱。显微镜活细胞工作站是显微镜和CO₂恒温细胞培养箱的集合体，结构松散，体积相对较大，具有光学显微成像检测功能，但是温控精度方面同样不如CO₂恒温细胞培养箱。由此可见，以上三种流行的细胞培养方法与硬件装置均不能满足活细胞在线长时程原位多模式并行检测使用要求。微流控芯片细胞培养方法是近年发展起来的先进细胞培养方法，通过对微流控芯片细胞培养载体表面选择性进行化学修饰，对温度和流体进行精确控制，以及调节细胞培养基及营养物质配比等手段，能模拟生物体内的细胞生长环境，具有高度的可控性。由于微流控芯片可以灵活地设计各种腔体和管道，为不同类型细胞的共培养提供了非常便利的手段，在共培养的基础上，还可以根据需要设计各种微结构来研究细胞与细胞的相互作用。经过近十余年的发展，微流控芯片细胞培养方法现已广泛应用于高通量药物筛选、组织工程研究、干细胞研究、肿瘤研究、毒物分析和辅助生殖技术等领域中。根据培养环境的不同，基于微流控芯片的细胞培养体系可分为贴壁细胞二维培养、悬浮细胞培养、贴壁细胞三维培养以及不同类型细胞之间的共培养，在活细胞在线原位多模式并行检测应用中具有良好的发展潜力。

要实现活细胞形态结构与功能多模信息的长时程原位在线检测，需要发展多模式的活细胞原位无损检测方法，并通过系统集成融合在一起，才能实现活细胞多样化形态结构与复杂功能的长时程可视化测量分析。光学显微技术贯穿于三百多年的细胞发展历史进程中，从1665年细胞发现到深入了解细胞的内部结构、从二维到三维、从裸眼观察到数字化成像，可以说光学显微技术依然是今天细胞检测的重要工具之一。随着细胞研究的深入，光学显微技术在活细胞高倍成像和亚微米以下层次的高分辨率检测应用中出现了2个重大技术瓶颈难题，一个是光学衍射极限(理论最小分辨率约为200nm)，另一个是高倍光学显微镜成像的工作距离很短(<1mm)。通常60×大数值孔径(NA>0.6)显微成像的工作距离小于1mm，80×水镜显微成像的工作距离小于0.5mm，100×油镜显微成像的工作距离小于0.2mm。因此，高倍显微成像需要对被测对象进行专门的制片处理，做成满足短工作距离要求的薄显微切片才能进行检测。对于活细胞检测，尤其是检测悬浮细胞，在这种短工作距离的空间限制条件下，很难设计细胞培养装置和构建多模式融合的在线检测系统。光学荧光标记共焦扫描方法可以实现亚细胞水平的细胞切片检测，但是其速度较慢，荧光标记常常影响细胞活性，因此，不能满足活细胞长时间培养过程中的细胞器、分子、离子等多种信息原位检测实际应用需要。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种不影响细胞活性且能够对细胞器、分子、离子等多种信息进行长时程原位检测的活细胞原位培养长时程多模信息检测方法及系统。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种活细胞原位培养长时程多模信息检测方法，其特征在于包括以下内容：设置一包括有微流控芯片活细胞原位培养模块、多模信息检测模块、多维运动控制模块和数字信息存储处理与显示模块的活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，其中，微流控芯片活细胞原位培养模块设置有微流控芯片，微流控芯片上设置有微型细胞捕获定位单元、细胞培养液输入/输出控制微阀、温度控制单元、温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器；根据待检测活细胞的形态结构与功能指标，将待检测活细胞通过微流控管道输入微型细胞捕获定位单元，使得待检测活细胞在微型细胞捕获定位单元内形成单细胞阵列，并定位在微型细胞捕获定位单元中；其中，微型细胞捕获定位单元间通过微流控管道相互连接，实现细胞间相互通讯与物质交换，通过细胞培养液输入/输出控制微阀输入/输出培养液，保持细胞营养供应；数字信息存储处理与显示模块根据温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器实时采集的微流控芯片的温度、湿度和CO₂浓度，向微流控芯片通入CO₂和纯净水，并通过温度控制单元对微流控芯片进行加热，使得微流控芯片的温度、湿度和CO₂浓度达到细胞培养条件要求；数字信息存储处理与显示模块通过多维运动控制模块控制微流控芯片的运动状态，并实时获取微流控芯片中待检测活细胞的三维空间位置信息；多模信息检测模块采用白光干涉高光谱解析、吸收或发射光谱解析、电阻抗、细胞自发荧光和/或激发荧光的方式，对微流控芯片中待检测活细胞的细胞形态结构、细胞器、分子、离子分布信息进行长时程原位无损检测，并将检测信息发送至数字信息存储处理与显示模块；数字信息存储处理与显示模块对待检测活细胞的三维空间位置信息以及多模信息检测模块检测的细胞形态结构与功能信息进行存储、处理和显示，完成对活细胞形态结构与功能多模信息的长时程、原位、五维信息融合检测；所述长时程、原位、五维信息融合检测，包括获取活细胞的XYZ三维空间结构形态信息，一维细胞内细胞器、分子、离子的自发荧光或激发荧光随时间变化的信息，以及一维细胞电阻抗随时间变化的信息，实现几个小时、几天、几周、几个月甚至一年以上的连续活细胞形态结构与功能信息的无损、位置相对固定的高速在线测量。

进一步，所述多模信息检测模块采用白光干涉高光谱解析、吸收或发射光谱解析、电阻抗、细胞自发荧光和/或激发荧光的方式，对微流控芯片中待检测活细胞的细胞形态结构、细胞器、分子、离子分布信息进行长时程原位无损检测，具体为：通过白光干涉高光谱解析，用于获取待检测活细胞的Z向厚度nm水平超分辨形态结构变化信息；通过电阻抗，用于获取一维细胞电阻抗随时间变化的信息；通过吸收或发射光谱解析，用于获取待检测活细胞内分子、离子的变化信息；通过激发荧光的方式，采用细胞器、分子、离子的染色剂或标记探针在激发光照射诱导下产生发射荧光，获取待检测活细胞内细胞器、分子、离子的空间动态分布和随时间变化的信息；通过细胞自发荧光的方式，采用生物素酶或紫外光激发产生自发荧光，用于获取待检测活细胞内细胞器、分子、离子的空间动态分布和随时间变化的信息。

进一步，所述细胞器、分子、离子的染色剂或标记探针包括：蛋白融合钙离子探针，如GCaMP、GCaMP6或GCaMP-X；细胞中分子、离子的荧光蛋白探针即绿色荧光蛋白GFP或红色荧光蛋白RFP；其他可与细胞器、分子和离子结合的染色剂、纳米材料、量子点、有机荧光染料等。它们可以长时程显示细胞形态结构与功能的动态变化信息，而不会进入细胞核并聚集导致活细胞钙响应异常、活细胞损伤并凋亡等问题。

进一步，该检测系统包括微流控芯片活细胞原位培养模块、多模信息检测模块、多维运动控制模块和数字信息存储处理与显示模块；所述微流控芯片活细胞原位培养模块用于对活细胞进行培养，并保持活细胞生长活性状态；所述多模信息检测模块用于采用白光干涉高光谱解析、吸收或发射光谱解析、电阻抗、细胞自发荧光和/或激发荧光方式，对活细胞的细胞形态结构、细胞器、分子、离子分布信息进行长时程原位无损检测，并将检测信息发送至所述数字信息存储处理与显示模块；所述数字信息存储处理与显示模块用于通过所述多维运动控制模块，控制所述微流控芯片活细胞原位培养模块中活细胞的运动，获取活细胞的三维空间位置信息以及所述多模信息检测模块检测的细胞形态结构与功能信息并进行存储、处理和显示。

进一步，所述微流控芯片活细胞原位培养模块设置有微流控芯片，所述微流控芯片上设置有微型细胞捕获定位单元、培养液输入控制微阀、培养液输出控制微阀、三维电阻抗测量单元、温度控制单元、温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器；所述微流控芯片中心设置有用于对活细胞进行捕获定位的若干所述微型细胞捕获定位单元，所述微型细胞捕获定位单元中的细胞间可以相互通讯与物质交换，并通过培养液输入/输出控制微阀接口输入培养液，保持细胞营养供应；每一所述微型细胞捕获定位单元内均设置有用于对活细胞进行电阻抗测量的所述三维电阻抗测量单元，每一所述三维电阻抗测量单元均具有三维立体微电极结构；所述微流控芯片上设置有所述培养液输入控制微阀和培养液输出控制微阀，所述培养液输入控制微阀分别连接每一所述微型细胞捕获定位单元的进口，每一所述微型细胞捕获定位单元的出口分别连接所述培养液输出控制微阀；所述微流控芯片一侧设置有补水控制微阀，所述微流控芯片下部设置有第一水槽和第二水槽，所述补水控制微阀的出口连接所述第一水槽的进口，所述第一水槽的出口连接所述第二水槽的进口；所述微流控芯片上还设置有CO₂气体控制微阀以及所述温度控制单元、温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器，所述温度控制单元用于控制所述微流控芯片的温度，所述温度反馈传感器用于实时采集所述微流控芯片的温度数据，所述湿度反馈传感器用于实时采集所述微流控芯片的湿度数据，所述CO₂浓度反馈传感器用于实时采集所述微流控芯片的CO₂浓度数据；每一所述三维电阻抗测量单元分别电连接所述多模信息检测模块，所述培养液输入控制微阀、培养液输出控制微阀、补水控制微阀、CO₂气体控制微阀、温度控制单元、温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器还分别电连接所述数字信息存储处理与显示模块。

进一步，所述多模信息检测模块用于贴壁和悬浮的不同培养状态细胞的多模信息原位检测，包括一共焦面成像光学系统、两探测单元和一多通道电阻抗测量单元，其中，所述共焦面成像光学系统包括激发光源、双焦面成像透镜组、聚光镜、激发滤色片、发射滤色片和两分光器件；每一所述探测单元均包括CCD面成像探测器和微操作光纤传感高光谱探测器，其中，所述CCD面成像探测器具有1000帧/s的成像速度，所述CCD面成像探测器采用面成像单元的CCD或点检测单元的光电倍增管、光电池、光电二极管；所述微操作光纤传感高光谱探测器具有200KHz的高速信号检测能力，满足高速原位在线测量需要；所述激发光源发射的光依次通过所述聚光镜、激发滤色片、分光器件和双焦面成像透镜组的物镜，汇聚到所述微流控芯片内的活细胞上，活细胞中细胞器、分子、离子标记的荧光探针经激发光诱导产生荧光，荧光经所述双焦面成像透镜组的物镜收集后被一所述分光器件反射，再依次经所述发射滤色片、双焦面成像透镜组的成像透镜和另一分光器件传输至两所述探测单元；所述多通道电阻抗测量单元连接每一所述三维电阻抗测量单元，两所述探测单元与所述多通道电阻抗测量单元分别连接所述数字信息存储处理与显示模块。

进一步，所述双焦面成像透镜组由表面序号为第1～7的成像透镜、表面序号为第8～17的物镜、表面序号为第18的微流控芯片载体底板等效模型和表面序号为第19的培养液等效模型组成；所述成像透镜由第一镜片、第二镜片、第三镜片和第四镜片组成；所述物镜由第五镜片、第六镜片、第七镜片、第八镜片、第九镜片和第十镜片组成；所述第一镜片与第二镜片、第三镜片与第四镜片、第五镜片与第六五镜片、第七镜片与第八镜片分别组成胶合透镜；各镜片的具体参数如下表1所示，其中，表中单位为mm,公差为±1.0mm：

表1：双焦面成像透镜组中各镜片参数

进一步，所述多模信息检测模块包括光纤传感高光谱探测单元、多通道电阻抗测量单元和激发光源，其中，所述光纤传感高光谱探测单元包括分叉光纤传感器和光谱探测器，所述分叉光纤传感器采用均匀分布或同心圆分布的光纤排列结构；所述分叉光纤传感器的一根中心光纤连接所述激发光源，向所述微流控芯片中的活细胞导入激发光使得活细胞产生荧光，所述分叉光纤传感器的多根周围光纤将活细胞产生的荧光发送至所述光谱探测器；所述多通道电阻抗测量单元连接每一所述三维电阻抗测量单元，所述光谱探测器和多通道电阻抗测量单元还分别连接所述数字信息存储处理与显示模块。

进一步，所述多模信息检测模块包括光纤传感高光谱探测单元、多通道电阻抗测量单元和激发光源，其中，所述光纤传感高光谱探测单元包括光纤传感器和光谱探测器；所述激发光源直接向所述微流控芯片中的活细胞发射激发光使得活细胞产生荧光，所述光纤传感器将活细胞产生的荧光发送至所述光谱探测器；所述多通道电阻抗测量单元连接每一所述三维电阻抗测量单元，所述光谱探测器和多通道电阻抗测量单元还分别连接所述数字信息存储处理与显示模块。

进一步，所述多维运动控制模块包括电机、驱动器和多路控制板卡；所述电机通过传动机构连接所述微流控芯片并与所述驱动器连接，所述驱动器连接所述多路控制板卡，所述多路控制板卡连接所述数字信息存储处理与显示模块，所述多路控制板卡采用CAN总线通讯、网络通讯、USB通讯或串口通讯控制协议，接收所述数字信息存储处理与显示模块发出的控制信息，并根据控制信息通过所述驱动器控制所述电机，经所述传动机构带动所述微流控芯片运动；所述多路控制板卡还根据控制信息，通过所述驱动器控制所述激发滤色片、发射滤色片和光源的切换，以及控制所述光纤传感高光谱探测器的微操作位移台实现光纤传感探针的位置移动。

进一步，所述数字信息存储处理与显示模块包括微处理器、液晶显示器、后台数据库和活细胞原位培养长时程多模信息检测分析模块；所述微处理器用于通过所述多维运动控制模块控制所述微流控芯片的运动状态以及所述多模信息检测模块的信号采集，并获取活细胞的三维空间位置信息；所述微处理器用于根据所述温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器实时采集的数据，控制对应所述细胞培养液输入控制微阀、细胞培养液输出控制微阀、CO₂气体控制微阀和补水控制微阀的开启或关闭，以及通过所述温度控制单元控制所述微流控芯片的温度；所述活细胞原位培养长时程多模信息检测分析模块用于对所述多模信息检测模块检测的细胞形态结构与功能信息进行检测分析，得到活细胞的形态结构与功能多模信息；所述后台数据库用于实时存储活细胞的三维空间位置信息以及活细胞的形态结构与功能多模信息；所述液晶显示器用于实时显示活细胞的形态结构与功能多模信息。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明设置有一种通过GCaMP-X蛋白融合探针、电阻抗和/或白光干涉等方式，对活细胞的细胞形态结构、细胞器、分子、离子等信息进行长时程、原位、五维信息融合的检测方法，以及对活细胞形态结构与功能多模信息长时程原位培养检测系统，活细胞在微流控芯片上通过蛋白融合钙调素探针进行细胞器和离子示踪，可以长时程显示细胞形态结构与功能的动态变化信息，而不会进入细胞核并聚集导致活细胞钙响应异常、活细胞损伤并凋亡等问题，能够实现几个小时、几天、几周、几个月甚至1年以上的长时程细胞功能无损原位检测。2、本发明可以采用不同的多模信息检测方式，同时满足活细胞的XYZ三维空间结构形态信息，活细胞内细胞器、分子、离子的自发荧光或激发荧光随时间变化的信息，以及活细胞电阻抗随时间变化等五维信息在几个小时、几天、几周、几个月甚至1年以上的长时程原位无损检测的应用需要，面成像探测具有1000帧/s的成像速度，微操作光纤传感高光谱探测器具有200KHz的高速信号检测能力，满足高速原位在线测量需要，例如钙成像、离子通道、定向分化、凋亡等。3、本发明中多模信息检测模块可以通过白光干涉高光谱解析，获取微流控芯片中的活细胞Z向厚度nm水平超分辨形态结构变化信息；可以通过白光干涉高光谱解析，获取活细胞Z向厚度nm水平超分辨形态结构变化信息，实现对活细胞功能信息的长时程原位无损检测；也可以通过吸收或发射光谱解析，获取活细胞内分子、离子变化信息，实现对活细胞功能信息的长时程原位无损检测；通过电阻抗，获取一维细胞电阻抗随时间变化的信息，实现对活细胞功能信息的长时程原位无损检测；通过激发荧光的方式，采用蛋白融合钙调素即探针钙离子探针GCaMP、GCaMP6、GCaMP-X等标记、细胞中分子、离子的荧光蛋白探针标即绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP等标记，或者其他可与细胞器、分子和离子结合的染色剂、纳米材料、量子点、有机荧光染料，通过激发光诱导产生发射荧光，获取待检测活细胞内细胞器、分子、离子的激发荧光随时间变化的信息，实现对活细胞功能信息的长时程原位无损检测；或细胞自发荧光的方式，采用生物素酶或紫外光激发产生自发荧光，获取待检测活细胞内细胞器、分子、离子的自发荧光随时间变化的信息，实现对活细胞功能信息的长时程原位无损检测。4、本发明可以根据实际应用需要，进行单维或2维或多维度的信息检测任意组合，例如实现活细胞的Z向厚度变化的白光干涉或相衬的无损测量，或XY二维空间结构形态平面成像，或XYZ三维空间结构形态信息重建，或一维细胞内细胞器、分子、离子的自发荧光或激发荧光随时间变化信息的测量，或一维细胞电阻抗随时间变化信息的测量，以及以上多种维度信息的任意组合测量和多维信息融合显示等，可以广泛应用于细胞分析检测技术领域中。

附图说明

图1是本发明检测系统的结构示意图；

图2是本发明检测系统中微流控芯片的结构示意图；

图3是本发明检测系统中多模信息检测模块实施例1的结构示意图；

图4是本发明检测系统中多模信息检测模块实施例2的结构示意图；

图5是本发明检测系统中多模信息检测模块实施例3的结构示意图；

图6是本发明的基于恒温培养箱的光纤传感高光谱探测单元结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。

如图1所示，本发明提供的活细胞原位培养长时程多模信息检测系统包括微流控芯片活细胞原位培养模块MC、多模信息检测模块MO、多维运动控制模块MD和数字信息存储处理与显示模块SP。

微流控芯片活细胞原位培养模块MC用于对活细胞进行培养，培养并保持活细胞生长活性状态。

多模信息检测模块MO用于采用白光干涉高光谱解析、吸收或发射光谱解析、电阻抗、细胞自发荧光和/或激发荧光等方式，对微流控芯片活细胞原位培养模块MC中培养的活细胞的细胞形态结构、细胞器、分子、离子分布信息进行长时程原位无损检测，并将检测信息发送至所述数字信息存储处理与显示模块SP。

数字信息存储处理与显示模块SP用于通过多维运动控制模块MD，控制微流控芯片活细胞原位培养模块MC中活细胞的运动，获取活细胞的三维空间位置信息以及多模信息检测模块MO检测的细胞形态结构与功能信息并进行存储、处理和动态显示，完成对活细胞形态结构与功能多模信息的长时程、原位、五维信息融合检测。

在一个优选的实施例中，如图2所示，微流控芯片活细胞原位培养模块MC设置有微流控芯片，微流控芯片中心纵向间隔设置有微型细胞捕获定位单元C1～C3，用于对活细胞进行捕获定位。微型细胞捕获定位单元C1～C3内均设置有三维电阻抗测量单元ME，每一三维电阻抗测量单元ME均具有三维立体微电极结构，用于从上下和四周对活细胞进行电阻抗测量。微流控芯片一侧设置有细胞培养液输入控制微阀YI，微流控芯片另一侧设置有细胞培养液输出控制微阀YO，细胞培养液输入控制微阀YI通过微流控管道MT分别连接微型细胞捕获定位单元C1～C3的进口，微型细胞捕获定位单元C1～C3的出口分别通过微流控管道MT连接细胞培养液输出控制微阀YO。微流控芯片上部设置有CO₂气体控制微阀GI、温度控制单元WK和供电接口K1，CO₂气体控制微阀GI用于向活细胞通入CO₂气体，温度控制单元WK用于控制微流控芯片的温度，供电接口K1连接外部电源为微流控芯片的各用电部件供电。微流控芯片下部设置有水槽W1～W2，微流控芯片下部一侧设置有补水控制微阀WI，补水控制微阀WI的出口连接水槽W1的进口，水槽W1的出口连接水槽W2的进口。微流控芯片下部还设置有温度反馈传感器S1、湿度反馈传感器S2和CO₂浓度反馈传感器S3，温度反馈传感器S1用于实时采集微流控芯片的温度数据，湿度反馈传感器S2用于实时采集微流控芯片的湿度数据，CO₂浓度反馈传感器S3用于实时采集微流控芯片的CO₂浓度数据。每一三维电阻抗测量单元ME分别通过电信号接口K2连接多模信息检测模块MO，多模信息检测模块MO与三维电阻抗测量单元ME配合使用，能够得到活细胞的电阻抗随时间变化的信息。细胞培养液输入控制微阀YI、细胞培养液输出控制微阀YO、CO₂气体控制微阀GI、温度控制单元WK、补水控制微阀WI、温度反馈传感器S1、湿度反馈传感器S2和CO₂浓度反馈传感器S3还分别电连接数字信息存储处理与显示模块SP。

在一个优选的实施例中，如图3所示，多模信息检测模块MO用于贴壁和悬浮等不同培养状态细胞的多模信息原位检测，包括一大数字孔径、长工作距离的共焦面成像光学系统、两探测单元OD和OP、一多通道电阻抗测量单元EI，其中，共焦面成像光学系统包括激发光源OS、双焦面成像透镜组、聚光镜L3、激发滤色片F1、发射滤色片F2、分光器件S1、分光器件S2和光阑PH，分光器件S1和分光器件S2均可以采用分束镜或二向色镜，两探测单元包括一CCD(电荷耦合器件)成像探测器OD和一微操作光纤传感高光谱探测器，其中，CCD面成像探测器可以采用面成像单元的CCD或点检测单元的光电倍增管、光电池、光电二极管，CCD面成像探测器具有1000帧/s的成像速度；微操作光纤传感高光谱探测器包括光谱模块OP、光纤传感探针OF和微操作位移台MT，微操作光纤传感高光谱探测器具有200KHz的高速信号检测能力，满足高速原位在线测量需要。

共焦面成像光学系统分为激发光路和信号探测光路两个部分，激发光路位于微流控芯片下方，设置有激发光源OS，激发光源OS与微流控芯片之间沿光轴依次设置有聚光镜L3、激发滤色片F1、分光器件S1和双焦面成像透镜组的物镜L1。信号探测光路设置有双焦面成像透镜组的物镜L1、分光器件S1、发射滤色片F2、双焦面成像透镜组的成像透镜L2、分光器件S2和光阑PH。激发光源OS发射的光通过聚光镜L3准直后依次经激发滤色片F1、分光器件S1和双焦面成像透镜组的物镜L1汇聚到微流控芯片内的活细胞上，活细胞中细胞器、分子、离子标记的荧光探针经激发光诱导产生荧光，活细胞中的荧光分子经激发产生荧光，荧光经物镜L1收集并准直成平行光后经分光器件S1反射，再经发射滤色片F2、双焦面成像透镜组的成像透镜L2、分光器件S2和光阑PH后被CCD面成像探测器OD接收，另一部分荧光经分光器件S2反射后被微操作光纤传感高光谱探测器接收。多通道电阻抗测量单元EI通过电信号接口K2连接每一三维电阻抗测量单元ME，两探测单元和多通道电阻抗测量单元EI分别连接数字信息存储处理与显示模块SP。

在一个优选的实施例中，双焦面成像透镜组由表面序号为第1～7的成像透镜L2、表面序号为第8～17的物镜L1、表面序号为第18的微流控芯片载体底板等效模型和表面序号为第19的培养液等效模型MYM组成；成像透镜L2由第一镜片、第二镜片、第三镜片和第四镜片组成；物镜L1由第五镜片、第六镜片、第七镜片、第八镜片、第九镜片和第十镜片组成；第一镜片与第二镜片、第三镜片与第四镜片、第五镜片与第六五镜片、第七镜片与第八镜片分别组成胶合透镜；各镜片的具体参数如下表1所示(其中，表1中的ZK3、BAF9等玻璃材料的标号均为标准光学玻璃材料排号)：

表1：双焦面成像透镜组中各镜片参数(单位mm，公差±1.0mm)

在一个优选的实施例中，如图4所示，多模信息检测模块MO还可以是采用光纤传感高光谱探测单元、多通道电阻抗测量单元和激发光源OS，其中，光纤传感高光谱探测单元包括分叉光纤传感器OF和光谱探测器OD1，分叉光纤传感器OF采用均匀分布或同心圆分布的光纤排列结构。分叉光纤传感器OF的一根中心光纤连接激发光源OS，向微流控芯片中的活细胞导入激发光使得活细胞产生荧光，分叉光纤传感器OF的多根周围光纤将活细胞产生的荧光发送至光谱探测器OD1。多通道电阻抗测量单元连接每一所述三维电阻抗测量单元ME，光谱探测器OD1和多通道电阻抗测量单元还连接数字信息存储处理与显示模块SP。其中，光谱探测器OD1可以替换为滤色片加上CCD或滤色片加上PMT(光电倍增管)，进而实现对一定波长范围的活细胞形态结构、活细胞内分子离子变化的动态信息检测。

在一个优选的实施例中，如图5所示，多模信息检测模块MO还可以是采用光纤传感高光谱探测单元、多通道电阻抗测量单元和激发光源OS，其中，光纤传感高光谱探测单元包括光纤传感器OF1和光谱探测器OD1。激发光源OS直接向微流控芯片中的活细胞发射激发光，光纤传感器OF1将活细胞产生的荧光发送至光谱探测器OD1。多通道电阻抗测量单元连接每一所述三维电阻抗测量单元ME，光谱探测器OD1和多通道电阻抗测量单元还连接数字信息存储处理与显示模块SP。

在一个优选的实施例中，多维运动控制模块MD包括电机、传动机构、驱动器和多路控制板卡，其中，传动机构可以采用现有器件。三个电机分别通过传动机构连接微流控芯片并与连接驱动器连接，驱动器连接多路控制板卡，多路控制板卡连接数字信息存储处理与显示模块SP，多路控制板卡采用CAN总线通讯、网络通讯、USB通讯或串口通讯等控制协议，接收数字信息存储处理与显示模块SP发出的控制信息，并根据控制信息通过驱动器控制电机经传动机构带动微流控芯片运动；多路控制板卡根据控制信息，对多模信息检测模块MO的信号采集进行一维时间控制，满足对活细胞形态结构与功能多模信息采集的应用需要；多路控制板卡还根据控制信息，通过驱动器控制光纤传感探针OF的位置移动；多维运动控制模块MD还包括用于对激发滤色片F1、发射滤色片F2和光源进行切换控制的器件，在实际使用中，可以采用现有技术公开的任意能够实现对激发滤色片F1、发射滤色片F2和光源进行切换目的的器件。

在一个优选的实施例中，数字信息存储处理与显示模块SP包括微处理器、液晶显示器、后台数据库和活细胞原位培养长时程多模信息检测分析模块。微处理器用于通过多维运动控制模块MD控制微流控芯片的运动状态以及多模信息检测模块MO的信号采集，并获取活细胞的三维空间位置信息；微处理器用于根据温度反馈传感器S1、湿度反馈传感器S2和CO₂浓度反馈传感器S3实时采集的数据，控制对应细胞培养液输入控制微阀YI、细胞培养液输出控制微阀YO、CO₂气体控制微阀GI和补水控制微阀WI的开启或关闭，以及通过温度控制单元WK控制微流控芯片的温度。活细胞原位培养长时程多模信息检测分析模块用于对多模信息检测模块MO获取的检测信息进行检测分析，得到活细胞形态结构与功能的多模信息。后台数据库用于实时存储活细胞的三维空间位置信息以及活细胞形态结构与功能的多模信息。液晶显示器用于实时显示活细胞形态结构与功能的多模信息，实现对活细胞形态结构与功能多模信息的存储、处理和动态显示。

在一个优选的实施例中，如图6所示，还可以借助恒温培养箱HWB代替微流控芯片，以保持细胞活性，简化微流控芯片活细胞原位培养模块MC的结构，或直接用培养皿培养细胞，分叉光纤传感器OF的一根中心光纤连接光源OS向微流控芯片中的活细胞导入激发光使得活细胞产生荧光，分叉光纤传感器OF的多根周围光纤将活细胞产生的荧光发送至光谱探测器OD1，将活细胞的检测信息导出，输入至数字信息存储处理与显示单元SP进行存储、处理与动态显示；也可以根据实际应用需要，进行单维或2维或多维度的信息检测任意组合，例如实现活细胞的Z向厚度变化的白光干涉或相衬的无损测量，或XY二维空间结构形态平面成像，或XYZ三维空间结构形态信息重建，或一维细胞内细胞器、分子、离子的自发荧光或激发荧光随时间变化信息的测量，或一维细胞电阻抗随时间变化信息的测量，以及以上多种维度信息的任意组合测量和多维信息融合显示等。

基于上述活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，本发明还提供一种活细胞原位培养长时程多模信息检测方法，包括以下步骤：

1)根据待检测活细胞的形态结构与功能指标，开启细胞培养液输入控制微阀YI，将待检测活细胞跟随培养液通过微流控管道加入微型细胞捕获定位单元C1～C3，根据微流控芯片的结构作用，使得待检测活细胞形成单细胞或少数几个细胞，相应进入微型细胞捕获定位单元C1～C3内形成单细胞阵列，并定位在微型细胞捕获定位单元C1～C3中，以保持细胞的活性。其中，微型细胞捕获定位单元C1～C3间通过微流控管道相互连接，实现细胞间相互通讯与物质交换，通过细胞培养液输入控制微阀YI和细胞培养液输出控制微阀YO输入和输出培养液，保持细胞营养供应。

2)数字信息存储处理与显示模块SP根据温度反馈传感器S1、湿度反馈传感器S2和CO₂浓度反馈传感器S3实时采集的微流控芯片的温度、湿度和CO₂浓度，开启CO₂气体控制微阀GI和补水控制微阀WI，向微流控芯片通入CO₂和纯净水，并通过温度控制单元WK对微流控芯片进行加热控温，使得微流控芯片的温度、湿度和CO₂浓度达到细胞培养条件要求，例如CO₂浓度为5％、湿度为100％和温度为37℃。

3)数字信息存储处理与显示模块SP通过多维运动控制模块MD控制微流控芯片的运动状态，并实时获取微流控芯片中待检测活细胞的三维空间位置信息。

4)多模信息检测模块MO采用白光干涉高光谱解析、吸收或发射光谱解析、电阻抗、细胞自发荧光和/或激发荧光的方式，对微流控芯片中待检测活细胞的细胞形态结构、细胞器、分子、离子分布信息进行长时程原位无损检测，并将检测信息发送至数字信息存储处理与显示模块SP。

5)数字信息存储处理与显示模块SP对待检测活细胞的三维空间位置信息以及多模信息检测模块MO检测的细胞形态结构与功能信息进行存储、处理和动态显示，完成对活细胞形态结构与功能多模信息的长时程、原位、五维信息融合检测。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。

Claims (11)

1.一种活细胞原位培养长时程多模信息检测方法，其特征在于包括以下内容：

设置一包括有微流控芯片活细胞原位培养模块、多模信息检测模块、多维运动控制模块和数字信息存储处理与显示模块的活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，其中，微流控芯片活细胞原位培养模块设置有微流控芯片，微流控芯片上设置有微型细胞捕获定位单元、细胞培养液输入/输出控制微阀、温度控制单元、温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器；

根据待检测活细胞的形态结构与功能指标，将待检测活细胞通过微流控管道输入微型细胞捕获定位单元，使得待检测活细胞在微型细胞捕获定位单元内形成单细胞阵列，并定位在微型细胞捕获定位单元中；其中，微型细胞捕获定位单元间通过微流控管道相互连接，实现细胞间相互通讯与物质交换，通过细胞培养液输入/输出控制微阀输入/输出培养液，保持细胞营养供应；

数字信息存储处理与显示模块根据温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器实时采集的微流控芯片的温度、湿度和CO₂浓度，向微流控芯片通入CO₂和纯净水，并通过温度控制单元对微流控芯片进行加热，使得微流控芯片的温度、湿度和CO₂浓度达到细胞培养条件要求；

数字信息存储处理与显示模块通过多维运动控制模块控制微流控芯片的运动状态，并实时获取微流控芯片中待检测活细胞的三维空间位置信息；

多模信息检测模块采用白光干涉高光谱解析、吸收或发射光谱解析、电阻抗、细胞自发荧光和/或激发荧光的方式，对微流控芯片中待检测活细胞的细胞形态结构、细胞器、分子、离子分布信息进行长时程原位无损检测，并将检测信息发送至数字信息存储处理与显示模块；

数字信息存储处理与显示模块对待检测活细胞的三维空间位置信息以及多模信息检测模块检测的细胞形态结构与功能信息进行存储、处理和显示，完成对活细胞形态结构与功能多模信息的长时程、原位、五维信息融合检测。

2.如权利要求1所述的一种活细胞原位培养长时程多模信息检测方法，其特征在于，所述多模信息检测模块采用白光干涉高光谱解析、吸收或发射光谱解析、电阻抗、细胞自发荧光和/或激发荧光的方式，对微流控芯片中待检测活细胞的细胞形态结构、细胞器、分子、离子分布信息进行长时程原位无损检测，具体为：

通过白光干涉高光谱解析，用于获取待检测活细胞的Z向厚度nm水平超分辨形态结构变化信息；

通过电阻抗，用于获取一维细胞电阻抗随时间变化的信息；

通过吸收或发射光谱解析，用于获取待检测活细胞内分子、离子的变化信息；

通过激发荧光的方式，采用细胞器、分子、离子的染色剂或标记探针在激发光照射诱导下产生发射荧光，获取待检测活细胞内细胞器、分子、离子的空间动态分布和随时间变化的信息；

通过细胞自发荧光的方式，采用生物素酶或紫外光激发产生自发荧光，用于获取待检测活细胞内细胞器、分子、离子的空间动态分布和随时间变化的信息。

3.如权利要求2所述的一种活细胞原位培养长时程多模信息检测方法，其特征在于，所述细胞器、分子、离子的染色剂或标记探针包括：

蛋白融合钙离子探针，如GCaMP、GCaMP6或GCaMP-X；

细胞中分子、离子的荧光蛋白探针即绿色荧光蛋白GFP或红色荧光蛋白RFP；

其他可与细胞器、分子和离子结合的染色剂、纳米材料、量子点、有机荧光染料。

4.一种活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，其特征在于，该检测系统包括微流控芯片活细胞原位培养模块、多模信息检测模块、多维运动控制模块和数字信息存储处理与显示模块；

所述微流控芯片活细胞原位培养模块用于对活细胞进行培养，并保持活细胞生长活性状态；

所述多模信息检测模块用于采用白光干涉高光谱解析、吸收或发射光谱解析、电阻抗、细胞自发荧光和/或激发荧光方式，对活细胞的细胞形态结构、细胞器、分子、离子分布信息进行长时程原位无损检测，并将检测信息发送至所述数字信息存储处理与显示模块；

所述数字信息存储处理与显示模块用于通过所述多维运动控制模块，控制所述微流控芯片活细胞原位培养模块中活细胞的运动，获取活细胞的三维空间位置信息以及所述多模信息检测模块检测的细胞形态结构与功能信息并进行存储、处理和显示。

5.如权利要求4所述的一种活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，其特征在于，所述微流控芯片活细胞原位培养模块设置有微流控芯片，所述微流控芯片上设置有微型细胞捕获定位单元、培养液输入控制微阀、培养液输出控制微阀、三维电阻抗测量单元、温度控制单元、温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器；

所述微流控芯片中心设置有用于对活细胞进行捕获定位的若干所述微型细胞捕获定位单元，每一所述微型细胞捕获定位单元内均设置有用于对活细胞进行电阻抗测量的所述三维电阻抗测量单元，每一所述三维电阻抗测量单元均具有三维立体微电极结构；

所述微流控芯片上设置有所述培养液输入控制微阀和培养液输出控制微阀，所述培养液输入控制微阀分别连接每一所述微型细胞捕获定位单元的进口，每一所述微型细胞捕获定位单元的出口分别连接所述培养液输出控制微阀；所述微流控芯片一侧设置有补水控制微阀，所述微流控芯片下部设置有第一水槽和第二水槽，所述补水控制微阀的出口连接所述第一水槽的进口，所述第一水槽的出口连接所述第二水槽的进口；

所述微流控芯片上还设置有CO₂气体控制微阀以及所述温度控制单元、温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器，所述温度控制单元用于控制所述微流控芯片的温度，所述温度反馈传感器用于实时采集所述微流控芯片的温度数据，所述湿度反馈传感器用于实时采集所述微流控芯片的湿度数据，所述CO₂浓度反馈传感器用于实时采集所述微流控芯片的CO₂浓度数据；

每一所述三维电阻抗测量单元分别电连接所述多模信息检测模块，所述培养液输入控制微阀、培养液输出控制微阀、补水控制微阀、CO₂气体控制微阀、温度控制单元、温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器还分别电连接所述数字信息存储处理与显示模块。

6.如权利要求5所述的一种活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，其特征在于，所述多模信息检测模块用于贴壁和悬浮的不同培养状态细胞的多模信息原位检测，包括一共焦面成像光学系统、两探测单元和一多通道电阻抗测量单元，其中，所述共焦面成像光学系统包括激发光源、双焦面成像透镜组、聚光镜、激发滤色片、发射滤色片和两分光器件；所述两探测单元包括一CCD面成像探测器和一微操作光纤传感高光谱探测器，其中，所述CCD面成像探测器具有1000帧/s的成像速度，所述CCD面成像探测器采用面成像单元的CCD或点检测单元的光电倍增管、光电池、光电二极管；所述微操作光纤传感高光谱探测器具有200KHz的高速信号检测能力，满足高速原位在线测量需要；

所述激发光源发射的光依次通过所述聚光镜、激发滤色片、分光器件和双焦面成像透镜组的物镜，汇聚到所述微流控芯片内的活细胞上，活细胞中细胞器、分子、离子标记的荧光探针经激发光诱导产生荧光，荧光经所述双焦面成像透镜组的物镜收集后被一所述分光器件反射，再依次经所述发射滤色片、双焦面成像透镜组的成像透镜和另一分光器件传输至两所述探测单元；

所述多通道电阻抗测量单元连接每一所述三维电阻抗测量单元，两所述探测单元与所述多通道电阻抗测量单元分别连接所述数字信息存储处理与显示模块。

7.如权利要求6所述的一种活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，其特征在于，所述双焦面成像透镜组由表面序号为第1～7的成像透镜、表面序号为第8～17的物镜、表面序号为第18的微流控芯片载体底板等效模型和表面序号为第19的培养液等效模型组成；所述成像透镜由第一镜片、第二镜片、第三镜片和第四镜片组成；所述物镜由第五镜片、第六镜片、第七镜片、第八镜片、第九镜片和第十镜片组成；所述第一镜片与第二镜片、第三镜片与第四镜片、第五镜片与第六五镜片、第七镜片与第八镜片分别组成胶合透镜；各镜片的具体参数如下表1所示，其中，表中单位为mm,公差为±1.0mm：

表1：双焦面成像透镜组中各镜片参数

8.如权利要求5所述的一种活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，其特征在于，所述多模信息检测模块包括光纤传感高光谱探测单元、多通道电阻抗测量单元和激发光源，其中，所述光纤传感高光谱探测单元包括分叉光纤传感器和光谱探测器，所述分叉光纤传感器采用均匀分布或同心圆分布的光纤排列结构；

所述分叉光纤传感器的一根中心光纤连接所述激发光源，向所述微流控芯片中的活细胞导入激发光使得活细胞产生荧光，所述分叉光纤传感器的多根周围光纤将活细胞产生的荧光发送至所述光谱探测器；

所述多通道电阻抗测量单元连接每一所述三维电阻抗测量单元，所述光谱探测器和多通道电阻抗测量单元还分别连接所述数字信息存储处理与显示模块。

9.如权利要求5所述的一种活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，其特征在于，所述多模信息检测模块包括光纤传感高光谱探测单元、多通道电阻抗测量单元和激发光源，其中，所述光纤传感高光谱探测单元包括光纤传感器和光谱探测器；

所述激发光源直接向所述微流控芯片中的活细胞发射激发光使得活细胞产生荧光，所述光纤传感器将活细胞产生的荧光发送至所述光谱探测器；

所述多通道电阻抗测量单元连接每一所述三维电阻抗测量单元，所述光谱探测器和多通道电阻抗测量单元还分别连接所述数字信息存储处理与显示模块。

10.如权利要求6、8或9所述的一种活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，其特征在于，所述多维运动控制模块包括电机、驱动器和多路控制板卡；

所述电机通过传动机构连接所述微流控芯片并与所述驱动器连接，所述驱动器连接所述多路控制板卡，所述多路控制板卡连接所述数字信息存储处理与显示模块，所述多路控制板卡采用CAN总线通讯、网络通讯、USB通讯或串口通讯控制协议，接收所述数字信息存储处理与显示模块发出的控制信息，并根据控制信息通过所述驱动器控制所述电机，经所述传动机构带动所述微流控芯片运动；所述多路控制板卡还根据控制信息，通过所述驱动器控制所述激发滤色片、发射滤色片和光源的切换，以及控制所述光纤传感高光谱探测器的微操作位移台实现光纤传感探针的位置移动。

11.如权利要求5所述的一种活细胞原位培养长时程多模信息检测系统，其特征在于，所述数字信息存储处理与显示模块包括微处理器、液晶显示器、后台数据库和活细胞原位培养长时程多模信息检测分析模块；

所述微处理器用于通过所述多维运动控制模块控制所述微流控芯片的运动状态以及所述多模信息检测模块的信号采集，并获取活细胞的三维空间位置信息；所述微处理器用于根据所述温度反馈传感器、湿度反馈传感器和CO₂浓度反馈传感器实时采集的数据，控制对应所述细胞培养液输入控制微阀、细胞培养液输出控制微阀、CO₂气体控制微阀和补水控制微阀的开启或关闭，以及通过所述温度控制单元控制所述微流控芯片的温度；

所述活细胞原位培养长时程多模信息检测分析模块用于对所述多模信息检测模块检测的细胞形态结构与功能信息进行检测分析，得到活细胞的形态结构与功能多模信息；

所述后台数据库用于实时存储活细胞的三维空间位置信息以及活细胞的形态结构与功能多模信息；

所述液晶显示器用于实时显示活细胞的形态结构与功能多模信息。

Images