CN103344617B - 光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜及试验方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜及试验方法。包括样品台、显微镜物镜、成像激光发射器、相机和激活激光发射器。所述样品台的上表面承载透光衬底，所述样品台具有一个贯通上下表面的通孔，所述透光衬底覆盖在所述通孔上。所述透光衬底的上表面承载着相互接触时会发生生物化学反应的物质分子A和物质分子B。所述透光衬底下方安装显微镜物镜，所述显微镜物镜下方安装相机。所述显微镜物镜的前透镜面向透光衬底的下表面，所述显微镜物镜的主轴延长线与透光衬底的上表面交点为o点。所述成像激光发射器发射出的成像激光束和激活激光发射器发射出的激活激光束汇聚成一路光束后，以大于临界角的入射角射入所述o点。

Description

光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜及试验方法

技术领域

    本发明涉及生物化学试验领域，特别是一种光激活显微跟踪监测系统。

背景技术

在生物、化学等科学领域中，在分子水平跟踪监测生物化学反应和信号发生过程有着重要的意义和作用，因为可以避免多步反应过程中多个分子同步的困难，也可以避免大量分子的复杂而不易调控的相互干扰，同时其获得的更为详尽的结果是常规体检测技术得不到的。单分子荧光技术通常利用发光分子/基团来定位跟踪单个目标分子， 探索生物化学过程的详尽信息，因而在生物、化学、材料等研究领域都有着广泛的应用。

然而单分子荧光技术的使用多局限于分子定位并跟踪其位置的变化，或者分子的旋转/空间构型变化，或者利用其自相关性来研究生物化学反应的平均动力学行为。在单分子水平上直接观测生物化学反应的动力学过程却一直是个难题，因为生物化学反应要求反应分子的浓度有个低限，而在这个浓度下荧光标志的目标分子往往会带来过高的背景荧光而使得观测单个荧光分子的发光无法实现。

光激活定位显微技术利用光激活荧光基团/分子的光激活特性，通过控制激活光的强度和开关以控制光激活荧光基团/分子的发光与否，然后使用成像光激发激活态荧光基团/分子发出荧光，而未被激活的其它荧光基团/分子则不会发荧光。光激活定位显微技术适用的样品往往是固定的样品并需要多次成像才能得到一幅完整的分子高分辨分布图。

然而，在单分子水平上直接观测化学反应及蛋白质间相互作用（与生物体内信号发生过程密切相关），并捕捉其详尽的动力学机制，技术的实现仍很困难，缺乏较普适的手段。

发明内容

本发明创造的目的是提供一种在分子水平监测生物化学反应的装置。

为实现本发明创造目的而采用的技术方案是这样的，一种光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜，包括样品台、显微镜物镜、成像激光发射器、相机和激活激光发射器。所述样品台的上表面承载透光衬底，所述样品台具有一个贯通上下表面的通孔，所述透光衬底覆盖在所述通孔上。所述透光衬底的上表面承载着相互接触时会发生生物化学反应的物质分子A和物质分子B，其中，所述物质分子A被固定在透光衬底的上表面，而物质分子B本身是可激活荧光分子或用可激活荧光基团标记了，实验前，物质分子B溶解或悬浮在溶液中，实验中，将物质分子B滴加到物质分子A中。所述透光衬底下方安装显微镜物镜，所述显微镜物镜下方安装相机。所述显微镜物镜的前透镜面向透光衬底的下表面，所述显微镜物镜的主轴延长线与透光衬底的上表面交点为o点。所述成像激光发射器发射出的成像激光束和激活激光发射器发射出的激活激光束汇聚成一路光束后，以大于临界角的入射角射入所述o点。

值得说明的是，本发明所涉及的发生生物化学反应的物质分子A和物质分子B即为实验目标反应的分子/生物大分子，在实施例部分有若干举例。将其中一种分子/生物大分子固定在透光衬底的上表面，即将其稀疏地连在透光衬底表面，连接方式可以采用一些常用的生物化学方法。本发明中，参与目标反应的一种分子/生物大分子在激活激光束照射较短时间（比如10微秒）后会发出荧光；或参与目标反应的一种分子/生物大分子在用可激活荧光基团标记后，再在激活激光束照射一定时间后会发出荧光。而该分子/生物大分子在不被激活激光束照射或过短时间（比如少于10微秒）照射均不会发出荧光。

本发明中，汇聚成一路光束的成像激光束和激活激光束后，以大于临界角的入射角射入所述o点，即是使其在透光衬底与透光衬底表面溶液（物质分子A和物质分子B的反应溶液）的接触界面发生全反射。所述临界角即为光线从透光衬底（光密介质）射向透光衬底上表面溶液（光疏介质）时，刚好发生全反射的入射角。即激活激光束只能够照射到透光衬底上表面的、参与目标反应的分子/生物大分子溶液的底部浅层（厚度约为100～300nm）。

本发明由于具有上述结构特征，可以用其进行生物化学反应动力学实验。即本发明的另一个目的是提供一种光激活单分子荧光生物化学反应动力学试验的方法，包括以下步骤：

1）将参与目标反应的物质A固定到透光衬底的上表面。即将其稀疏地连在玻璃透光衬底表面，连接方式可以采用一些常用的生物化学方法。

2）将参与目标反应的物质B滴加到固定在透光衬底上表面的物质A中；所述物质B本身是可激活荧光发光分子或对物质B进行了可激活荧光基团标记。即物质A和物质B是参与目标反应的一种分子/生物大分子，其中一种（物质B）在激活激光束照射一定且较短时间（比如10微秒）后会发出荧光；或在用可激活荧光基团标记后，再在激活激光束照射一定且较短时间（比如10微秒）后会发出荧光。本发明中，物质B本身或物质B在用可激活荧光基团标记后，再在激活激光束照射一定且较短时间（比如10微秒）后会发出荧光；物质A在任何情况下均不发出荧光。

3）通过相机对o点处就行连续拍摄。优选地，所述相机为EMCCD相机。

4）根据可激活荧光发光随时间的变化来研究详尽的反应的动力学过程。

在本发明中，所述物质B滴加到透光衬底的上表面的物质A中，物质B的分子在各个方向上，特别的垂直方向上，即物质B溶液的深度方向上，作布朗运动。

所述o点位于物质B和物质A的反应溶液内，由于激活激光束发生全反射，仅仅能够照射到o点处底层的溶液中（厚度约为100～300nm）。当运动着的物质分子B进入o点及其附近溶液时，由于其布朗运动的速度较快，停留时间短，不能被激活激光束激发出荧光。但是，当物质B分子在o点处与物质A发生反应，就会在o点处停留较长的时间，会发出荧光，被EMCCD相机透过物镜拍摄到。

附图说明

本发明创造的装置可以通过附图给出的非限定性实施例进一步说明。

图1为本发明的结构示意图。

图中： 1-样品台，2-显微镜物镜，3-二色镜Ⅱ，4-滤光片Ⅲ，5-滤光片Ⅳ，7-相机，9-二色镜Ⅰ，10-快门Ⅱ，11-滤光片Ⅱ，12-成像激光发射器，14-反射镜，15-快门Ⅰ，16-滤光片Ⅰ，17-激活激光发射器，18-透光衬底。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明创造作进一步说明，但不应该理解为本发明创造上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明创造上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明创造的保护范围内。

实施例1：

本实施例提供一种光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜，包括样品台1、显微镜物镜2、成像激光发射器12、相机7和激活激光发射器17。所述样品台1的上表面承载透光衬底18，所述样品台1具有一个贯通上下表面的通孔，所述透光衬底18覆盖在所述通孔上。本实施例中，所述透光衬底18为具有平整上下表面的玻片。

所述透光衬底18的上表面承载着相互接触时会发生生物化学反应的物质分子A和物质分子B，其中，所述物质分子A被固定在透光衬底18的上表面，而物质分子B本身是可激活荧光分子或用可激活荧光基团标记了，实验前，物质分子B溶解或悬浮在溶液中，实验中，将物质分子B滴加到物质分子A中。本实施例中，被固定在透光衬底18的上表面的物质分子A不作荧光标记，其本身也不会在激活激光发射器17所发射的激活激光束照射下发出荧光。

所述透光衬底18下方安装显微镜物镜2，所述显微镜物镜2下方安装相机7。本实施例中，所述显微镜物镜2与透光衬底18之间的距离不大于显微镜物镜2的工作距离。所述相机7为EMCCD相机，能够透过显微镜物镜2拍摄被显微镜物镜2放大了的图像，即能够捕捉物质分子B被激活后发出的荧光。

所述显微镜物镜2的前透镜面向（面对）透光衬底18的下表面，即显微镜物镜2设置在样品台1上的通孔下方,透光衬底18上发出的光线能够透过样品台1上的通孔到达显微镜物镜2的前透镜。所述显微镜物镜2的主轴延长线（穿过样品台1上的通孔）与透光衬底18的上表面交点为o点。

所述成像激光发射器12发射出的成像激光束和激活激光发射器17发射出的激活激光束汇聚成一路光束后，以大于临界角的入射角射入所述o点。所述临界角即为光从透光衬底18中进入透光衬底18上表面的溶液时发生全反射的入射角。进一步地，相机7与显微镜物镜2之间具有滤光片Ⅲ 4和滤光片Ⅳ 5。实验中，作为一种方式，在避光条件下进行操作。o点发出的荧光沿显微镜物镜2的主轴依次经过滤光片Ⅲ 4和滤光片Ⅳ 5后，激活激光和成像激光的散射光及其它背景散射光将被过滤掉，然后仅保留荧光发光到达相机7的镜头。

由于需要使得成像激光束和激活激光束汇聚成一束，作为一种实现方式，所述激活激光发射器17的前端放置反射镜14（参见图1，激活激光发射器17向上发射出激活激光，则反射镜14呈45°摆放在激活激光发射器17上方，将垂直方向的激活激光反射为水平方向的激活激光），所述成像激光发射器12前端放置二色镜Ⅰ9（参见图1，成像激光发射器12向上发射出成像激光，则二色镜Ⅰ9位于成像激光发射器12上方，将垂直方向的成像激光反射为水平方向的成像激光；同时，水平方向的激活激光进入二色镜Ⅰ9，与成像激光汇成一束），所述显微镜物镜2下方放置二色镜Ⅱ3。进一步，二色镜Ⅱ3的结构同二色镜Ⅰ9，但针对的激光波长不一样。并为一束的成像激光束和激活激光束通过二色镜Ⅱ3反射入显微镜物镜2后，再经过显微镜物镜2折射到o点。参见附图1，反射镜14、二色镜Ⅰ9和二色镜Ⅱ3的设置，目的是要改变光路，使得汇聚成一束的成像激光束和激活激光束能够以需要的角度到达o点。

进一步，成像激光束和激活激光束汇聚成一束后，先进入显微镜物镜2，再进入透光衬底18。显微镜物镜2会使得光束发生折射，但这种折射的角度可以通过调整激光光束聚焦到显微镜物镜2后焦平面的位置来调整。当入射角度大于全反射临界值后，光束会在o点处方式全反射。

一个实施例中，所述显微镜物镜2到透光衬底2的折射率为n₁，所述透光衬底18上溶液的折射率为n₂，且n₁ > n₂。

进一步地，为了控制激光的照射时间,所述激活激光发射器17发出的激活激光光束依次经过滤光片Ⅰ16和快门Ⅰ15后到达反射镜14。滤光片I16用来过滤除激活激光外其它可能的干扰光，而快门I 15控制激活激光的开启和开启时间。所述成像激光发射器12发射的成像激光束依次经过滤光片Ⅱ11和快门Ⅱ10后进入二色镜Ⅰ9。滤光片I 11用来过滤除成像激光外其它可能的干扰光，而快门I10控制成像激光的开启和开启时间。

实施例2：

采用实施例1所述光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜进行试验观测钙粘蛋白（E-Cadherin）分子间的相互作用的动力学过程的方法，包括以下步骤：

1）将参与目标反应的物质A，E-Cadherin分子，固定到透光衬底18的上表面。本实施例中，将在E-Cadherin的碳端通过(HIS)₆ 基团连接到透光衬底18的上表面的NTA-Ni²⁺ 位点上。实验中，E-Cadherin 分子在表面上的分布密度在2个每平方微米左右。

2）将参与目标反应的物质B， E-Cadherin与GFP组成的分子，滴加到固定有E-Cadherin分子的透光衬底18上溶液中。本实施例中，在室温下，将浓度为0.1μM溶液滴加到透光衬底18上的已经固定了E-Cadherin的透光衬底上的溶液中。进一步地，本实施例的在避光条件下进行，对物质B在被激活激光光束（405 nm, 50 mW）照射超过10 ms就可以在成像激光光束（488 nm, 120 mW）照射下发出能够被相机捕捉到的荧光。

3）通过相机7对o点处就行连续拍摄。本实施例中，采用EMCCD相机连续拍摄时，拍摄曝光时间是100 ms，每帧间隔为150 ms。在连续成像图像中找到发光光斑，并提取此发光位置发光强度随时间的变化曲线。这样可以观测物质B分子何时与物质A分子相结合，发光强度跳跃变强；何时与物质A分子分离，发光强度淬灭。

4）通过观测多个多次物质B分子与物质A分子相结合及分离，及观测其随物质A密度和物质B浓度变化而变化，可以得到其反应动力学过程的详尽信息。

实施例3：

采用实施例1所述光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜进行试验观测钙调蛋白（Calmodulin）与目标多肽分子间的相互作用的动力学过程的方法，包括以下步骤：

1）将参与目标反应的物质A，钙调蛋白分子，固定到透光衬底18的上表面。本实施例中，将在钙调蛋白分子的氮端通过(HIS)₆ 基团连接到透光衬底18的上表面的NTA-Ni²⁺ 位点上。实验中，钙调蛋白分子在表面上的分布密度在2个每平方微米左右。

2）将参与目标反应的物质B，用Alex488标记了的C28W分子，滴加到固定有钙调蛋白分子的透光衬底18上溶液中。本实施例中，在室温下，将浓度为1μM溶液滴加到透光衬底18上的已经固定了钙调蛋白的透光衬底上的溶液中。进一步地，对物质B在被激活激光光束（405 nm, 50 mW）照射超过10 ms就可以在成像激光光束（488 nm, 120 mW）照射下发出能够被相机捕捉到的荧光。

3）通过相机7对o点处就行连续拍摄。本实施例中，采用EMCCD相机连续拍摄时，拍摄曝光时间是100 ms，每帧间隔为150 ms。在连续成像图像中找到发光光斑，并提取此发光位置发光强度随时间的变化曲线。这样可以观测物质B分子何时与物质A分子相结合，发光强度跳跃变强；何时与物质A分子分离，发光强度淬灭。

4）通过观测多个多次物质B分子与物质A分子相结合及分离，及观测其随物质A密度和物质B浓度变化而变化，可以得到其反应动力学过程的详尽信息。

实施例4：

采用实施例1所述光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜进行试验观测α-连环蛋白（catenin）与粘着斑蛋白（vinculin）分子间的相互作用的动力学过程的方法，包括以下步骤：

1）将参与目标反应的物质A，α－连环蛋白分子，固定到透光衬底18的上表面。本实施例中，将在连环蛋白分子的碳端通过生物素（biotin）连接到透光衬底18的上表面的抗生素蛋白位点上。实验中，α－连环蛋白分子在表面上的分布密度在1个每平方微米左右。

2）将参与目标反应的物质B，用GFP标记了的粘着斑蛋白分子，滴加到固定有α－连环蛋白分子的透光衬底18上溶液中。本实施例中，在室温下，将浓度为0.2 μM溶液滴加到透光衬底18上的已经固定了α－连环蛋白的透光衬底上的溶液中。进一步地，对物质B在被激活激光光束（405 nm, 50 mW）照射超过10 ms就可以在成像激光光束（488 nm, 120 mW）照射下发出能够被相机捕捉到的荧光。

3）通过相机7对o点处就行连续拍摄。本实施例中，采用EMCCD相机连续拍摄时，拍摄曝光时间是100 ms，每帧间隔为150 ms。在连续成像图像中找到发光光斑，并提取此发光位置发光强度随时间的变化曲线。这样可以观测物质B分子何时与物质A分子相结合，发光强度跳跃变强；何时与物质A分子分离，发光强度淬灭。

4）通过观测多个多次物质B分子与物质A分子相结合及分离，及观测其随物质A密度和物质B浓度变化而变化，可以得到其反应动力学过程的详尽信息。

Claims (4)

1.光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜，其特征在于：包括样品台（1）、显微镜物镜（2）、成像激光发射器（12）、相机（7）和激活激光发射器（17）；

所述样品台（1）的上表面承载透光衬底（18），所述样品台（1）具有一个贯通上下表面的通孔，所述透光衬底（18）覆盖在所述通孔上；

所述透光衬底（18）的上表面承载着相互接触时会发生生物化学反应的物质分子A和物质分子B，其中，所述物质分子A被固定在透光衬底（18）的上表面，而物质分子B本身是可激活荧光分子或用可激活荧光基团标记了，实验前，物质分子B溶解或悬浮在溶液中，实验中，将物质分子B滴加到物质分子A中；

所述透光衬底（18）下方安装显微镜物镜（2），所述显微镜物镜（2）下方安装相机（7）；

所述显微镜物镜（2）的前透镜面向透光衬底（18）的下表面，所述显微镜物镜（2）的主轴延长线与透光衬底（18）的上表面交点为o点；

所述成像激光发射器（12）发射出的成像激光束和激活激光发射器（17）发射出的激活激光束汇聚成一路光束后，以大于临界角的入射角射入所述o点。

2.根据权利要求1所述的光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜，其特征在于：所述激活激光发射器（17）的前端放置反射镜（14），所述成像激光发射器（12）前端放置二色镜Ⅰ（9），所述显微镜物镜（2）下方放置二色镜Ⅱ（3）；

所述激活激光发射器（17）发出的激活激光光束经过反射镜（14）的反射后进入二色镜Ⅰ（9），所述成像激光发射器（12）发射的成像激光束进入二色镜Ⅰ（9）后与激活激光束并为一束；

并为一束的成像激光束和激活激光束通过二色镜Ⅱ（3）反射入显微镜物镜（2）后，再经过显微镜物镜（2）折射到o点。

3.根据权利要求2所述的光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜，其特征在于：所述激活激光发射器（17）发出的激活激光光束依次经过滤光片Ⅰ（16）和快门Ⅰ（15）后到达反射镜（14）；所述成像激光发射器（12）发射的成像激光束依次经过滤光片Ⅱ（11）和快门Ⅱ（10）后进入二色镜Ⅰ（9）。

4.采用1～3任一项权利要求所述光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜进行试验的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将参与目标反应的物质A固定到透光衬底（18）的上表面；

2）将参与目标反应的物质B滴加到固定在透光衬底（18）上表面的物质A中；所述物质B本身是可激活荧光发光分子或对物质B进行了可激活荧光基团标记；

3）通过相机（7）对o点处进行连续拍摄。