CN101542273B - 紧凑式光学检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测系统，所述检测系统包括：光源，产生激发光，所述激发光具有足以激发样品中的荧光团的波长；激发滤波器，位于沿所述激发光的路径的第一路线上，所述激发滤波器透射来自所述光源的激发光；分束器，位于所述第一路线上，所述分束器沿第二路线将所述激发滤波器透射的激发光反射向位于所述分束器一侧的反射镜，并且透射沿所述第二路线反射的发射光；所述反射镜被放置为，沿垂直于第一和第二路线的第三路线，将来自分束器的激发光反射至样品中荧光团，其中，所述反射镜还沿第二路线将沿第三路线发射的发射光反射向所述分束器；发射滤波器，位于所述第二路线上所述分束器的另一侧；以及检测器，检测所述发射滤波器透射的发射光。

Description

紧凑式光学检测系统 
相关申请的交叉引用 
本申请要求2006年8月24日提交的美国临时专利申请60/839,678的优先权，并将其全部内容合并于此以作参考。 
技术领域
本发明总体涉及光学检测系统，具体涉及用于检测荧光信号的紧凑式光学检测系统。 
背景技术
目前已为各种应用(如新药研发、病原体检测等)开发出片上实验室系统。这些系统对生物或化学样品进行处理，并提供对于目标分子或微粒的定量或定性检测。这样的系统使用微型化组件，并被设计为便携式的，支持现场样品测试。 
特别地，在现场使用便携式设备来检测生物武器、病原体或病毒的需要促使人们去开发新类型的便携式热循环器，便携式热循环器对核酸的聚合酶链反应(PCR)检测十分有用，核酸的聚合酶链反应(PCR)检测包括实时PCR方法，亦称定量PCR。 
在这些便携式检测系统中采用了不同的检测技术，包括：质量流、电气化学和光学检测法。由于其鲁棒性、较高的信噪比和灵敏度，光学检测法(如荧光信号检测)更为常用。此类方法对于如实时PCR、毛细管电泳以及其他分析方法等应用而言是必不可少的。 
用于荧光信号检测的光学系统通常包括以下组件：光源，用于发出适当波长的光；激发滤波器，用于消除无用光；分色镜，用于分离激发和发射波长；发射滤波器，用于抑制激发波长；以及具有后级电子器件的检测器。 
用于实验室设备中的光学检测系统中的常用光源是水银灯、金属卤化 物灯、激光、以及最近出现的发光二极管(LED)。水银灯具有较高的输出功率和较宽的发射谱。激光也表现出较高的输出功率，并且不需要发射滤波器，因为激光是单色的。 
LED是最常见光源，因为它们比可选替代光源实质上更便宜。此外，由于LED寿命较长，因此LED优于激光。由于LED的光输出可以调制，因此LED还是十分方便的光源。由于LED的直径和长度只有几毫米，因此可以被集成入便携式系统，如用于实时PCR的便携式系统。 
然而，由于整个非定向荧光发射往往无法被通常集成于上述设备中的相对较小的检测器完全接收，因此往往需要具有较高增益的光学检测器。用于荧光光学检测系统的最常见的检测器是光电倍增管(PMT)、雪崩光电二极管、光子计数模块(PCM)、或基于电荷耦合器件(CCD)。上述检测器可能十分复杂、巨大或者昂贵，并且通常需要特殊的工作条件，如工作在完全黑暗或低温环境下。 
因此，需要一种设计简单、紧凑，可用于手持便携式设备中的用于检测荧光信号的改进的光学检测系统。 
发明内容
本发明涉及一种检测系统，用于检测例如来自包含于样品中的荧光团的荧光信号，检测系统内的部件的布置被设计为使得检测系统可以被制造为具有适当的尺寸(即较小的覆盖区)以包含于手持设备中。 
所述检测系统包括：已调制光源(例如LED光源)、激发滤波器、分束器、发射滤波器、一个或多个聚焦透镜、以及光检测器。 
所述检测系统包括传统反射镜，分束器和传统反射镜的组合用于以如下方式来反射激发光束和发射光束：光源和检测器可以被布置于相同平面内。方便地，样品可以位于不同平面内。举例而言，可以使用布置为实质上互相垂直的光源和检测器来配置检测系统。传统反射镜同分束器(如用于引导激发和发射光束方向的分色镜)的组合及所产生的光源和检测器的布置，导致了检测系统的组件布置更为紧凑，使检测系统易于微型化，并适于包含于手持片上实验室设备中。 
因此，一方面，提供了一种用于检测荧光信号的检测系统，包括：光 源，产生激发光，所述激发光具有足以激发样品中荧光团的波长；激发滤波器，位于沿所述激发光的路径的第一路线上，所述激发滤波器透射来自所述光源的激发光；分束器，位于所述第一路线上，所述分束器沿第二路线将所述激发滤波器透射的激发光反射向位于所述分束器一侧的反射镜，并且透射沿所述第二路线反射的发射光；所述反射镜被放置为，沿垂直于所述第一和第二路线的第三路线，将来自所述分束器的所述激发光反射至所述样品中的荧光团，其中，所述反射镜还沿所述第二路线将沿所述第三路线发射的发射光反射向所述分束器；发射滤波器，位于所述第二路线上所述分束器的另一侧；以及检测器，检测所述发射滤波器透射的发射光。 
在另一方面，提供了一种用于检测荧光信号的检测系统，包括：光源，产生激发光，所述激发光具有足以激发样品中荧光团的波长；激发滤波器，位于沿所述激发光的路径的第一路线上，所述激发滤波器将来自所述光源的激发光透射向反射镜；发射滤波器，位于第二路线上；所述反射镜被放置为，沿垂直于所述第一和所述第二路线的第三路线，将所述激发光反射至所述样品中的荧光团，其中，所述反射镜还沿所述第二路线将沿所述第三路线发射的发射光反射向所述发射滤波器；以及检测器，检测所述发射滤波器透射的发射光。 
可以通过使用多色光源(例如红/蓝/绿(RGB)LED)，并以复杂的三带通滤波器代替简单的单带通滤波器，很容易地将所述检测系统扩展至多于一个光学通道。这样的配置允许同时检测三种不同的荧光团或荧光染料。在这种情况下，可以通过使用一个光电二极管作为检测器应用不同频率，或通过使用相移，来独立调制和解调每种单色。附加通道可用于阳性、阴性或内部控制，以及用于原位温度监控。 
本检测系统可用于希望实现微型化的便携式设备，包括用于实时PCR或反转录(RT)-PCR、实时基于核酸序列扩增(NASBA)、实时全基因组扩增(WGA)、实时滚环扩增(RCA)、实时重组聚合酶扩增(RPA)、实时酶联免疫吸附测定(ELISA)、实时荧光免疫测定(FIA)或实时生物发光和化学发光测定的设备。 
因此，在另一方面，提供了一种热循环器设备，包括：如此处所述的检测系统；样品端口，用于接收包含荧光团的样品，所述样品端口被放置 为，使所述样品与从所述检测系统反射的激发光对准；加热器，被放置为与所述样品的接收端口相邻，用于加热所述样品；温度传感器，连接至所述加热器，用于检测所述加热器的温度；荧光信号处理器，连接至所述检测系统，用于处理所述检测系统所检测的荧光信号；用户接口模块，用于输入和输出数据；以及电源，用于为所述设备供电。 
结合附图，通过阅读以下对于本发明的特定实施例的说明，本发明的其他方面和特征对于所属领域技术人员将变得显而易见。 
附图说明
附图仅以示例方式示出了本发明的实施例，附图中， 
图1是本发明实施例的示例性光学检测系统的图； 
图2是适于与具有多个LED光源的检测系统一起使用的电子电路的示意图，为了用单个光电二极管检测器进行检测，对所述多个LED光源进行调制和解调； 
图3是适于与图1所示的检测系统一起使用的电子电路的示意图； 
图4结合了图1所示的检测系统的热循环器设备的示意图； 
图5是装配在金属外壳内的集成检测系统的照片，该照片示出了LED光源、聚焦透镜、和安装了光电二极管检测器的前置放大器的位置。 
图6是示出了通过实验获得的25℃处的荧光强度的图，所述实验使用图1的检测系统检测来自荧光素的荧光信号； 
图7是示出了使用结合了图1的检测系统的热循环器设备来产生的、对禽流感病毒HA基因的扩增PCR产品执行的融化曲线的图； 
图8是结合了图1检测系统的热循环器设备的实施例的不带外壳(顶部图像)和带有外壳(底部图像)的照片；箭头(顶部图像)指向其中发生PCR扩增的以油覆盖的液滴(实质反应室)； 
图9示出了光学检测系统实施例的剖面和透视图； 
图10是示出了通过实时PCR扩增得到的数据的图，所述实时PCR扩增使用结合了图1的检测系统的微型化热循环器设备以及6-FAM水解探针； 
图11是示出了通过实时PCR扩增得到的数据的图，所述实时PCR扩 增使用结合图1的检测系统的微型化热循环器设备以及用于检测H5N1禽流感病毒的基于SYBR Green I的实验方案； 
图12是本发明实施例的示例性微型化热循环器设备的实施例的完整系统的示意图；顶部图像表示热管理，中间图像表示光学信号处理装置，底部图像表示控制系统； 
图13是荧光特性曲线和对实时RT-PCR扩增的融化曲线分析，所述实时RT-PCR扩增使用了图11所示的微型化热循环器设备和用于检测H5N1禽流感病毒的基于SYBR Green I的实验方案；在内嵌图中示出了单次PCR循环的温度特性曲线； 
图14是作为循环次数的函数并对于背景噪声进行了归一化的、72℃分段处的复性步骤的最后5秒的荧光信号的平均幅度图；以及 
图15是示出了以1℃s-1的加热速率执行的对扩增PCR产品的融化曲线分析的图。 
具体实施方式
现在提供一种光学检测系统，用于检测例如来自包含于样品中的荧光团的荧光信号。由于其设计布局，可以容易地实现检测系统的微型化。 
所述检测系统可以包括全部以紧凑形式布置的：光源(例如LED光源)、一个或多个激发滤波器、一个或多个分束器、一个或多个检测或发射滤波器、一个或多个聚焦透镜、以及光检测器。 
具体地，检测系统的一个示例被设计为：使检测组件位于单一平面内，使样品接收端口位于该平面以外，允许检测组件堆叠在样品接收端口的上方或者下方。因此，检测系统可以被设计为片上实验室手持设备中的紧凑单元，其中，将对保持在样品接收端口中的样品进行操作或分析所需的任意组件堆叠在检测组件平面的上方或下方。结合紧凑的轻型组件的这样的设计布局可以减小检测系统所占面积、并且相应地可以减小结合了该检测系统的设备的尺寸。 
因此，在图1所示的一个实施例中，检测系统100包括光源112。光源112发出激发光束，用于与包含荧光团的样品相互作用，产生荧光信号，所述荧光信号最终在所述检测系统中被检测为激发光束与样品荧光团相 互作用的结果。 
光源112可以是用于产生具有适当波长的光的任意光源，所述适当波长用以激发包含于样品中的荧光团。适当的光源的示例包括：水银灯、激光、激光二极管、Nernst Stift(能斯脱发光元件)、金属卤化物灯、以及发光二极管(LED)。如果要将检测系统包含在手持设备中，则由于LED重量轻、尺寸小、成本低，因此可以将LED用作光源112。 
光源112可以是已调制光源。举例而言，可以调节光源112的频率和/或幅度。举例而言，可以对光源112进行调制，从而允许通过对检测信号进行解调来滤除无用光，例如环境光。可选地，可以通过对幅度进行相移对光源112进行调制。 
举例而言，LED可以在市场在买到，并且可以被选择为发射单色光或多色光。特别地，具有470至490nm间的峰值激发波长的青绿色LED适于激发诸如SYBR-Green I、Eva Green或6-羧基荧光素(6-FAM)等荧光团，上述荧光团是用于实时PCR应用的常用荧光染料。可用LED的一个示例是可以从ETG公司购得的ETG-5CE490-15，ETG-5CE490-15发射490mm的峰值波长，该波长位于可见光范围内。 
可选地，准直透镜114被布置为与光源112对准，使激发光束通过准直透镜114。可以使用适于聚焦激发光束的任意准直透镜。举例而言，可以使用诸如GELTECHTM模塑非球面透镜(Thorlabs公司)之类的商用透镜。 
光源112被布置为与激发滤波器116对准，使由光源112所产生的激发光束通过激发滤波器116，可选地，使激发光束在经过准直透镜114的准直后通过激发滤波器116。激发滤波器116可以是使具有激发荧光团所需波长的光能够通过滤波器，但阻挡或衰减其他波长的光的任意滤波器。激发滤波器116可以是带通滤波器，这样的滤波器是已知的。举例而言，可以从Chroma技术公司购得激发滤波器ET470/40x。 
为了进一步减小检测系统100的尺寸并改进该系统的光学性能，可以将准直透镜114和激发滤波器116组合。可以正对着光源112来安装这样的组合透镜/滤波器，减少光源112损失的光量，从而提高系统效率。参见例如Bruno等人的TRAC-Trend.Anal.Chem.，1994，13：190-198。 
从光源112通过激发滤波器116的光学路径定义了第一路线，激发光束沿所述第一路线传播。 
分束器118位于第一路线上激发滤波器116之后，并且被布置为：反射从激发滤波器116出现的滤波后的激发光束，在沿第二路线的光路中反射光束，所述沿第二路线的光路实质上垂直于沿从光源112到分束器118的第一路线的光路。 
分束器118被选择为，使其反射具有激发光束的波长的光，但使得具有发射光束的波长的光能够通过分束器。分束器118可以是任意合适的分束器，并且举例而言可以是分色镜。通常，分色镜将反射波长短于(或长于)给定波长的光，并透射波长长于(或短于)给定波长的光。在特定示例中，分束器118可以是分色镜T495LP，可由Chroma技术公司购得。 
传统反射镜120被布置为与分束器118对准，并以如下方式配置其角度，使沿第三路线，在实质上垂直于入射激发光束的路径中反射激发光束，因此所述第三路线与由第一路线和第二路线限定的平面正交。因此，激发光束从分束器118被反射向样品接收端口130，样品接收端口130与所要检测的荧光团(例如包含在样品中的荧光团)进行光学通信。 
因此，如图1所描述和说明的，光源112、分束器118和传统反射镜120总体上位于同一平面内。将这些组件对准，使得光源112一旦产生激发光束，该激发光束就在该平面内传播，直至由传统反射镜120反射，沿实质上垂直于该平面的方向传播。 
聚焦透镜122被布置为：将从传统反射镜120反射来的激发光束聚焦，使其传播至样品接收端口130内所要检测的荧光团所在的位置。 
根据包含检测系统100的设备的不同，样品接收端口130可以包括样品室，设计用于接受如液体等样品，或设计用于接受保存样品的试管、载玻片、或其他透明容器或表面，所述样品潜在地包括所要检测的荧光团。因此，可以通过使至少样品接收端130口浸入样品来使用检测系统100，或者可以通过将样品或保存样品的容器或表面放入样品接收端口130来使用检测系统100。 
因此，样品接收端口130位于由光源112、分束器118和传统反射镜120所限定的平面的上方或下方。 
当激发光束与所要检测的荧光团相互作用时，荧光团将从激发光束中吸收光，并发射出具有与激发光束不同波长的光，所发射的光通常具有更长的波长。发射光(称为发射光束)，传播回传统反射镜120，然后从传统反射镜120以与从荧光团到传统反射镜120的路径实质上垂直的角度，将发射光束反射回分束器118。由于分束器118被选择为透射具有发射光束波长的光，因此发射光束通过分束器118，而不被反射回光源112。 
发射滤波器124位于分束器118的与反射镜120相对的另一侧。发射滤波器124是允许具有发射光束波长的光通过滤波器而衰减或实质上阻挡其他波长的光的任意滤波器。举例而言，发射滤波器124可以是带通滤波器。例如，可以从Chroma技术公司购得发射滤波器ET525/50m。 
检测器126与发射滤波器124对准并位于其后，被放置为捕获经发射滤波器124滤波的发射光束。检测器126可以是能够检测具有预期频率的荧光信号的任意检测器，如光电倍增管(PMT)、光子计数模块(PCM)、光电二极管、雪崩光电二极管、或基于电荷耦合器件(CCD)。特别地，检测器可以是光电二极管。光电二极管是可以从市场上购买到的，包括可以从Siemens公司购得的硅光电二极管BPW21。 
为了充分检测发出的荧光信号，可以采用高增益检测器。可选地，检测系统100可以包括放大器128，用于对由检测器126产生的小幅度电流进行放大，当检测器126是光电二极管时尤其如此。此时，放大器128与检测器126进行通信。 
举例而言，放大器128可以是锁定放大器，对来自检测器126的信号进行调制/解调。微型化锁定放大器是已知的，并且在例如Hauser等人的Meas.Sci.Technol，1995，6：1081-1085中给出了对微型化锁定放大器的描述。 
在上述实施例中，沿第一路线的从光源112到分束器118的激发光束的路径实质上垂直于沿第二路线的从分束器118到传统反射镜120的路径。然而，应当理解的是，如果提供了足够的空间用于将光源和检测器布置在分束器附近，并且各条光路不会互相干扰，则该角度可以是锐角或钝角。还应当理解的是，第一路线和第二路线间的角度调整需要调整检测系统100的全部必要组件，使激发光束和发射光束被引导至如上所述的适当 的组件。 
方便地，样品中所要检测的荧光团位于与来自/去往分束器118的光束不相交的平面内。采用这种方式，样品可以被放置于样品接收端口130中位于入射和反射光束的光学路径上方或下方的平面内。这种设计布局允许通过将样品接收端口130移至检测系统100中其余组件的上方或下方空间体积的方式，使检测系统100保持较小的整体尺寸。这种配置的方便性还在于，当检测系统100包含于诸如片上实验室手持设备等设备时，样品端口130可以位于邻近或靠近对样品进行操作所需的任意设备组件，而不会对检测系统100造成干扰。 
此外，如上所述，检测系统可以被扩展为包括多于一个光学通道，可以用于检测单个样品内的多个荧光团，或用于监控样品中内部控制。 
举例而言，可以用诸如红/蓝/绿(RGB)LED等多色光源作为光源，以多带通滤波器代替单带通激发和发射滤波器。可选地，可以使用多于一个单色LED，这些单色LED可以全都具有相同频率范围或颜色，或分别具有不同的频率范围或颜色。 
可以通过独立地对每个光学通道进行调制/解调，举例而言，通过应用不同的调制频率来抑制不同光学通道间的串扰或干扰。因此，可以在独有的频率处调制每个光源或光学通道，各光源或光学通道具有自己的解调器。 
由于可以通过使用单个光电二极管应用不同频率来独立地调制和解调不同波长的荧光信号，因此只需要一个光电二极管作为检测器。 
图2示出了三光学通道系统的电子电路，每个光学通道以独有的频率加以调制，并且具有针对每个光学通道的独立的解调器。 
图3是采用检测系统100的光学荧光激发和检测电子电路的简化示意图。用脉冲电压产生器产生的电流脉冲为光源112(发光二极管LED1)供电，所述电流脉冲由晶体管Q1转换为电流。运算放大器OA1将由检测器126(光电二极管D1)检测的发射光信号转换为电压。运算放大器OA1的输出电压由运算放大器OA2进行放大，并由后接低通滤波器的解调器AD630进行滤波。 
虽然上述实施例包括分束器，但如果激发光束和发射光束的差异足够 大，以至于在光学上不会互相干扰，则可以省去检测系统中的分束器。 
在这样的实施例中，激发光束沿通过激发滤波器到反射镜的第一路线的路径传播，并沿垂直于第一路线的路径从反射镜通过聚焦透镜反射至样品端口。发射光束从样品端口返回反射镜，在反射镜处被反射镜反射向发射滤波器和共线检测器，其中反射方向沿第二路线，所述第二线路也垂直于从反射镜到样品端口的路径，该路径沿第三路线。举例而言，沿第一路线和第二路线的路径可以实质上沿同一路线，或者分开很小的角度，使检测器位于光源旁边。 
由于组件可以被布置为十分紧凑的方式，举例而言，其中检测系统100组合地使用分束器和传统反射镜，以引导各种光束通过适当的滤波器、透镜和检测器，因此，由于设计布局的缘故，检测系统100很容易实现微型化。使用如LED光源和光电二极管检测器等小型、轻型组件还可以减小检测系统的尺寸和重量。因此，在各种实施例中，检测系统可以被制造为具有约30mmx30mmx11mm的尺寸。 
这样的紧凑的轻型检测系统适于包含于片上实验室设备中，所述片上实验室设备包括便携式手持设备。因此，如上所述，该光学检测系统适用于检测以多种分析技术产生的荧光信号，所述多种分析技术包括：实时PCR或RT-PCR、实时基于核酸序列扩增(NASBA)、实时全基因组扩增(WGA)、实时滚环扩增(RCA)、实时重组聚合酶扩增(RPA)、实时酶联免疫吸附测定(ELISA)、实时荧光免疫测定(FIA)或实时生物发光和化学发光测定。 
实时PCR技术是基于对与PCR产物共价结合或交互的荧光团进行荧光检测而开发得到的技术。与传统PCR相比，这种方法提供关于测试样品中目标基因初始副本数量的附加信息。由于最近诸如SARS等传染病的爆发，以及当前禽流感病毒(H5N1)的威胁，十分需要真正的便携式实时PCR和/或基于RT-PCR的设备。 
目前，已使用微加工技术成功实现了热循环器设备(PCR设备)的微型化，试图减小PCR分析方法的运行成本，并使PCR分析便于携带。便携式PCR设备首次公开于1994年，并且原发明人已对其做出了进一步的改进(Northrup等人，Anal.Chem.，1998，70：918-922)，此外其他组织也对其做 出了进一步的改进(Higgins等人，Biosens.Bioelectron.，2003，18：1115-1123)。 
然而，典型的实时PCR荧光检测系统仍基于用于激发的水银灯或激光和作为检测器的光电倍增管(PMT)或CCD设备，这使便携式PCR设备十分复杂。此外，这样的设备往往相对昂贵，并具有较高的功率需求，并且需要在无光情况下执行PCR扩增，以避免环境光与所检测的荧光信号间的干扰。 
因此，现在还提供了一种微型化热循环器设备，适于执行包括实时RT-PCR在内的实时PCR。该微型化热循环器设备可以是便携式的，并且在某些实施例中，可以是手持热循环器设备。 
如图4所示，在一个实施例中，热循环器设备200包括如上所述的检测系统100。 
热循环器设备200还包括：样品接收端口230，用于接收要在其中执行PCR的样品或混合物。样品接收端口230的尺寸被制成适于接收将在其中或其上执行PCR扩增的合适的容器或表面。举例而言，样品接收端口230可以具有适于接收薄壁试管或载玻片的大小和形状。 
样品接收端口230被布置为，在某一位置接收样品，使从传统反射镜反射来的激发光束透射至样品接收端口230中的样品，从包含于样品中的荧光团发射出的发射光束透射回包含在检测系统100内的传统反射镜。 
热循环器设备200还包括：加热器232，用于在执行实时PCR循环的过程中将样品加热至各种所需温度。加热器232与样品接收端口230相邻，以允许对样品接收端口230所接收的样品进行加热。举例而言，加热器232可以具有加热板或薄膜加热器(如金薄膜)的形式。 
温度检测器234与加热器232耦合，以在PCR循环的各阶段测量加热器232的温度。举例而言，温度检测器234可以是电阻式温度检测器。 
热循环器设备200还包括：荧光信号处理器236，用于接收来自检测系统100的荧光信号，并对该信号进行处理，以输出至用户接口。 
可选地，热循环器设备200还包括：集成控制器238，控制检测系统100、加热器232和温度检测器234，并接收来自荧光信号处理器236的信息。可选地，如果热循环器设备不是手持设备，还可以用远程控制器(例 如未包含在设备中的个人计算机)来控制该设备。 
热循环器设备200还包括：电源240，用于为检测系统100、加热器232、温度检测器234、荧光信号处理器236和控制器238等各个组件提供必要的电源。如果热循环器设备200是手持设备，电源240可以是电池。 
热循环器设备200还包括：用户接口模块242，用于接收来自用户的输入并将数据传送给用户，举例而言，用户接口模块可以是触摸屏或其他用户接口命令输入模块，如键盘和显示屏。 
以下非限制示例中描述了上述检测系统和热循环器设备的各种实施例。 
示例 
示例1 
设计并测试尺寸为30mm×30mm×11mm的微型化荧光系统。 
检测系统的属性是通过测量一系列荧光颜料荧光素稀释来加以确定的。经查检测极限为1.96nmol/L，大于如实时PCR等应用所需的检测极限。 
光学检测系统具有两个部分：激发部分和检测部分。激发部分包括作为光源的青绿色LED型ETG-5CE490-15(ETG公司)。该LED具有490nm的峰值发射波长，发光强度为6cd(堪)，视角为15°。由于光源视角的缘故，在光路上可观察到功率损耗。因此，为了将光准直，通过从LED芯片垂直铣削0.5mm的方式，切去LED塑料罩的顶部。接着，用氧化铝防水砂纸使切割面变平，并用传统的金刚石研膏打磨切割面。 
GELTECHTM模塑非球面透镜(Thorlabs公司)用于对LED光进行准直，并将LED光聚焦在样品上。透镜具有6.35mm的直径、3.1mm的焦距、以及0.68的数值孔径(N.A.)。来自第一透镜的准直的光经过激发器ET470/40x(Chroma技术公司)的滤波，被分色镜T495LP反射，由传统反射镜垂直变向，并由第二透镜聚焦于所关心的样品上，从而形成具有480μm直径的圆形激发光。 
检测路径起始于由第二透镜采集从样品的所射发出的荧光。发射光通过分色镜，由发射滤波器ET525/50m进行滤波，并由硅光电二极管BPW2I(Siemens公司)采集。二极管的辐射敏感面积是7.34mm2，量子产额为0.8， 从而导致10nA/lx(毫微安培每勒克司)的光学灵敏度。用与光电二极管相邻放置的运算放大器处理光电二极管所产生的相应电流(光电流)。 
利用传统的添加外壳的方法，将系统组件以机械方式彼此连接，从而形成稳定紧凑的系统。包括放大器在内的全部光学组件的外壳是在SolidWorks 2006程序(Solid Works公司)中设计的。外壳的尺寸为30mm×30mm×11mm(wxlxh)。接着，利用计算机数控(CNC)垂直铣削方法，用铝合金AA 6060来制造外壳，并以电化学方式将外壳涂黑，以抑制非期望的内部反射。 
图5是装配在金属外壳内的集成检测系统的照片，该照片示出了LED光源、聚焦透镜、和安装了光电二极管检测器的前置放大器的位置。在该照片中滤波器和准直透镜是不可见的。 
表1和表2示出了在激发和发射方向上测量的所有组件的光学功率衰减。 
表1：测量到的荧光检测系统的激发组件的光学特性 
  光学组件(激发)   透射率(％)   相对功率(％)
  LED(蓝光带)   100
  准直透镜   91   91
  蓝光激发滤波器   95   86
  分色镜   99   86
  传统反射镜   94   80
  聚焦透镜   91   73
  光路   69   51
  总计   51
表2：测量到的荧光检测系统的检测组件的光学特性 
  光学组件(检测)   透射率(％)   相对功率(％)
  样品(绿光带)   100
  透镜   91   91
  反射镜   95   86
  分色镜   98   85
[0100] 
  绿光发射滤波器   97   82
  光路   68   56
  总计   56
经查，在激发和发射方向上，荧光检测系统的总的光透射率为51％和56％。多数组件显示出90％或更高的效率。还可以通过将透镜与滤波器组合并将它们直接安装到LED和光电二极管上，以进一步改进系统的光学性能。除了减小光接口的数量之外，这种方法还可以实现更紧凑的设计，提高沿光路的透射率。 
一般而言，光电流的幅度很小，因而实现了改进信噪比的技术。对于先前的检测系统，已公开了一种基于高灵敏设备的直接方法(Rovati和Docchio，Rev.Sci.Iustrum.，1999，70：3759-3764)。此处，使用了“锁定放大器”，锁定放大器对信号处理链中的信号进行调制/解调(参考图2)(参见Scofield，Am.J.Phys.，1994，62：129-133)。首先在频率f处对光源(LED)进行调制。解调器起窄带带通滤波器的作用，只允许频率f的信号通过，从而实现了较高信噪比和对环境光的抗扰性。 
用频率为1kHz、占空比为10％、电流幅度为100mA的电流脉冲向青绿色LED供电。这些脉冲由单个定时器NE555集成电路(STMicroelectronics公司)产生，定时器NE555集成电路之后接着是标准的双极型晶体管，用于获取预期电流以向LED供电。所产生的光通过上述光学系统，并且由光电二极管对所发射出的荧光进行检测。 
使用超低偏置电流运算放大器OPAI29(Burr Brown公司)将光电二极管所产生的光电流转换为电压(I/V)，运算放大器OPAI29的反馈环中具有3.3MΩ的电阻器。运算放大器OPAI29将每1mA的光电流转换为3.3mV的输出电压。 
放大器输出电压经简单的高通滤波器进行处理，并由第二级运算放大器OA2以100倍的增益加以放大。高通滤波器去除信号的直流分量，为了正确实现锁定放大器的功能这是必不可少的。此外，该滤波过程还去除了可能由环境光导致的OA2的饱和。 
接着，解调器AD630(Analog Devices公司)对OA2的输出进行处理，解调器AD630使用为LED供电的脉冲作为参考。解调器输出由4阶的低 通滤波器进行滤波。锁定放大器的这种配置相当于以参考LED信号的频率f附近的带宽为1.5Hz的滤波器。由于窄带带通的缘故，该系统对环境光和其他噪声成分相对不那么敏感。 
为了证明荧光系统的能力，使用不同浓度的荧光素进行了一组实验。荧光素是用于生物和生化应用的最常见的荧光染料之一，并且此处展现了在下述实验所采用的条件下的可以忽略的漂白效应。 
将含有不同浓度荧光素的1μL液滴滴在全氟化玻璃基片上，所述玻璃基片安装在微型化荧光检测系统的焦平面中。作为参考，使用只含有去离子化(DI)的水的对照样品。 
为了估计所探测的体积，起初使用体积在5μL到0.5μL范围内的不同体积的液滴。可以观察到荧光信号的幅度不受液滴大小的影响，因此假定所探测的体积小于0.5μL。 
一系列稀释从50μM下降至5nm。在对数标度下将荧光信号的幅度绘制为浓度的函数(参见图6)。检测系统的背景噪声的值为62.5mV。通过外推，发现荧光素的检测极限(LOD)为1.96nM。 
图6示出通过在25℃的温度处用水执行一系列荧光素稀释得到的检测极限。实心的黑色方形是各浓度的6次独立测量的均值；误差条表示标准偏差；实线是均值的线性回归(r2＝0.999)；水平实线表示62.5+/-1.4mV的背景噪声。3倍信噪比(SNR 3)为4.2mV。线性回归与包括SNR 3的背景噪声的交点表示微型化荧光检测系统的LOD：1.96nM。5.2V处的检测器饱和确定了检测上限，检测上限与6.89mM的浓度相对应。 
可以通过结合雪崩光电二极管来提高检测系统的灵敏度。然而，该解决方案更加昂贵，并且电子装置需要更复杂的设计。基于激光感生荧光(LIF)的确立的基于芯片的毛细管电泳系统通常可以达到1pM LOD。本发明中所描述的设备具有比1pM高1000倍的LOD值。然而其灵敏度足以用于实时PCR应用，因为基于PMT13的典型的商用PCR系统具有约5nM的灵敏度极限。 
为了证明检测系统的适用性，将荧光检测单元与PCR芯片集成，创建微型化实时热循环器，并对1μL体积的PCR产物进行融化曲线分析(melting curve analysis)(参见图7)。为防止挥发，将样品用3μL的矿物 油盖住。 
图7示出了使用EvaGreen(Biotiom公司)作为嵌入剂对禽流感病毒H5N1的HA基因执行实时PCR后得到的融化曲线分析结果。基于S型函数(Sigmoidal函数)对原始数据(开圆)进行非线性拟合(实线)。其负导数(虚线)表示79.5uC的半融化温度，这与商用热循环器测量得到的温度(MJ Research公司的DNA ENGINE OPTICON 2TM测量得到的79.8℃)十分接近。 
示例2 
结合上述光学检测系统，制造由微加工硅制成的微型化经济型实时PCR。 
此处，紧凑式自主实时RT-PCR设备被描述为具有7cm×7cm×3cm的尺寸，75g重，或者在第二实施例中，具有10cm(直径)×6cm(高度)的尺寸，150g重。 
将PCR单元与微型化荧光检测系统以及该系统工作所必需的所有电子装置进行集成。青绿色发光二极管(490mm峰值激发波长)由峰值幅度为100mA的电流脉冲进行供电。由锁定放大器对光电二极管检测到的光电流进行处理，使光学系统独立于环境光。 
由于设备功耗仅为3w，因此可以使用12Ah的电池为热循环器设备供电长达12小时。热循环器设备的紧凑尺寸及其功耗确保了它的便携性。 
图8示出了热循环器设备的照片；箭头(顶部图像)指向其中发生PCR的、以油覆盖的液滴。 
实时PCR系统由三或四个以连接器相连的印刷电路板(PCB)组成。 
顶端的PCB装有微加工的PCR芯片，PCR芯片包含薄膜金加热器和温度传感器。光学检测系统(如上所述)附接在该印刷电路板上的PCR芯片下方。使用峰值发射波长为490nm的发光二极管(LED)作为光源，使用光电二极管作为光检测器。使用异硫氰酸荧光素(FITC)滤波器组在检测系统内对光进行滤波。 
光学检测系统内的LED由电流幅度为100mA、频率为1kHz、占空比为10％的电流脉冲供电。来自光电二极管的荧光信号由高通滤波器进行滤波，放大108倍，并被馈送入锁定放大器。因此，检测系统可以在环境 光下工作。 
图9示出了光学单元的剖面，描述了光学检测系统的剖面。光由490nm波长的LED产生，通过蓝光滤波器，由分色镜变向，并聚焦于PCR样品(如上所述位于液滴内)。由透镜采集样品发射出的荧光，使其通过分色镜和绿光滤波器，并用光电二极管进行检测。 
在第二PCB处执行针对荧光单元的信号处理，第二PCB中包含用于热管理和荧光数据处理的模拟电路。 
使用集成电阻式温度检测器(RTD)类型的传感器来测量PCR系统的温度，所述传感器与交流供电的惠斯通电桥相连。对来自该电桥的信号进行放大和解调，以为温度反馈提供直流值。 
通过使用比例-积分-微分(PID)控制器来对加热器内耗散功率的幅度进行调制，从而控制PCR温度。 
第三PCB连接至单个电池或充电器，并为其他印刷电路板上的模拟和数字模块产生所有必要的能量。 
热循环器设备可以由例如装配了LAB VIEWTM系统的计算机进行控制。 
可选地，可以使用包含单个芯片控制器的第四印刷电路板，单个芯片控制器可以是例如型号MC56F8013(Freescale Electronics公司)，使整个热循环器设备完全自主工作。通过触摸屏显示器与自主控制器进行通信，在触摸屏显示器上还示出各种结果。 
在一次性显微镜盖玻片上执行PCR扩增。通过在15分钟内执行50次PCR扩增来验证设备性能，使该设备能够实际应用于现场使用的PCR分析。 
图10示出了实时PCR数据。为了演示快速实时热循环器设备，执行基于6-FAM水解探针的PCR扩增。在不到15分钟的时间内执行了50次循环反应。 
图10：PCR实时荧光强度数据(红)和热(蓝)特性曲线(顶部图像)。提取的数据(底部图像)示出了22次循环的临界阈值，与从商用热循环器获得的结果相符。 
示例3 
针对传染病的基因分析对便携式热循环器设备进行测试。通过检测使用带有在新加坡分子与细胞生物学研究院开发出的PCR引物的RNAMaster SYBR Green I RT-PCR Kit(Roche公司)从禽流感病毒(H5NI)分离出来的RNA，来验证热循环器设备的RT-PCR性能。 
在61℃的温度下执行2分30秒的反转录，接着执行30秒的热启动。按以下方式执行50次PCR循环的扩增：95℃温度下3秒(变性)，50℃温度下15秒(退火)，72℃温度下20秒(复性)。一旦PCR循环完成，就以1℃s-1转变率来执行融化曲线分析。检测病毒RNA所需的总时间为14分钟。 
图11示出了使用本微型化热循环器设备检测H5N1病毒的实时RT-PCR结果。经查检测的临界阈值为22次循环，对应于14分钟的检测时间。 
示例4 
此处，描述了使用本热循环器设备的PCR扩增。用于这些方法的PCR样品的体积在100nL到5μL之间，通常为1μL。在一次性显微镜盖玻片上执行PCR扩增。本设备能够使用基于SYBR Green I的RT-PCR技术在20分钟内检测出如HPAI(H5N1)病毒等传染性致病原。 
热循环器和热管理：使用上述微加工硅PCR芯片。将薄膜加热器和电阻式温度检测器(RTD)集成入硅结构中。将硅芯片与TSicTM芯片(瑞士的Innovative Sensor Technology)一起焊接至PCB，所述TSicTM芯片用作参考温度传感器(以精度0.05℃进行校准、该参考温度传感器用于校准PCR芯片的RTD传感器)。将用于热管理的所有组件放置在包含PCR芯片的第一PCB下的第二PCB上。 
RTD传感器通过平衡式惠斯通电桥连接。施加幅度为0.25V的内部产生的正弦形交流信号。用增益被设置为500的运算放大器AD8221(Analog Devices公司)对电桥输出进行放大。接着用后接三阶低通滤波器的解调器AD630(Analog Devices公司)对放大器输出信号进行处理。 
由于电桥是由交流信号供电的，因此上述设置产生约30mV/℃的温度灵敏度，并且不导致直流漂移。较低幅度的电桥偏置还将由PCR芯片内的耗散焦耳热引起的自加热效应减小至可接受的0.2mW的水平。 
PCR加热器由PID控制器提供的脉冲宽度调制(PWM)信号供电。功率MOSFET晶体管可以实现从低到高的功率转换。 
图12是热循环器设备的完整系统的方框图。顶部图像表示热管理，中间图像表示光学信号处理装置，底部图像表示控制系统。 
荧光检测系统：金属外壳包含用于荧光信号检测的本光学检测系统，并且被附接至包含PCR芯片的PCB。 
供电和控制：为了简化系统操作，并使其对用户友好，使用包含+12V、-12V、+5V、-5V和+3.3V电压产生器的附加PCB，其中，上述电压均产生于电压在12V和24V间的单个电源。该PCB通过直接连接器与模拟PCB相连接。 
该系统通过运行于个人计算机上的LabView程序进行控制，但该系统还可以被设计为具有基于触摸屏面板以及单个芯片控制器的集成控制系统，例如使用型号MC56F8013(Freescale公司)。 
热循环器设备的性能可以通过实时检测H5N1病毒的体外转录HA片段加以验证。RT-PCR是使用Roche公司的LIGHTCYCLERTM RNA MasterSYBR Green I One-Step RT-PCR Kit建立的。 
样品制备：通过添加1.3μL的50mM Mn(OAc)2、各0.6μL的最终浓度为0.2pM的正向和反向引物、以及7.5μL的LIGHTCYCLERTM RNAMaster SYBR-Green I来制备反应混合物。所述引物是由新加坡基因组研究院(GIS)开发的，并且在2004和2005年HPAI在东南亚爆发期间用HPAI的临床样品进行了验证。所使用的引物的序列为：正向引物5′-TGCATACAAAATTGTCAAGAAAGG-3′(SEQ ID NO.：1)；反向引物5′-GGGTGTATATTGTGGAATGGCAT-3′(SEQ ID NO.：2)。在开始反应前将10μL中的2×106份副本的RNA模板加入反应混合物，达到总体积20μL。最终的模板浓度为105份副本每μL。 
RT-PCR实验方案：将1μL的样品RT-PCR混合物转移至位于热循环器上方的显微镜盖玻片，并覆盖3μL的矿物油，以防止其挥发。 
在61℃的温度下进行5分钟的反转录，接着在95℃的温度下进行20秒的“热启动”。按以下热实验方案执行50次PCR循环：95℃温度下4秒(变性)，50℃温度下20秒(退火)，72℃温度下10秒(复性)。单 次循环所需的总时间为34秒。 
如图13(内嵌图形)所示，从一温度到另一温度的转变时间仅有几秒，并且热特性曲线近似为矩形。最快的基于SYBR Green I的PCR以每次循环14.5秒的速度顺利执行，而使用FAM作为探针的固有地较快的方法基于仅两个温度间的热循环，能够以每次循环8秒的速度执行。 
图13：RT-PCR的荧光信号，接着是融化曲线分析。内嵌图示出了单次PCR循环的温度特性曲线，显示了较快的加热和冷却速率。 
与温度同步地记录来自光学单元的原始荧光信号，并在图13中予以示出。RT-PCR过程的总时间约为35分钟。 
在PCR循环期间，将72℃分段的复性部分的最后5秒的荧光信号的平均幅度记录为循环数的函数，针对背景噪声进行归一化，并将其绘制为如图14所示的图。从对数标度下的差异荧光图形中提取出临界阈值CT。 
图14：在72℃分段内的最后5秒中提取的校正后的平均荧光(红色)以及差异荧光(蓝色)。20μL溶液中的总副本数为2×106，相当于1μL体积中有105个RNA副本。所提取的临界阈值为20次循环，这与使用商用热循环器(Roche LIGHTCYCLERTM 1.5)得到的值很相符。 
一旦完成PCR循环，就以1℃s-1的加热速率执行融化曲线分析。将荧光信号记录为温度的函数(参见图15)。使用以下S型函数对测量得到的数据点进行拟合， 
y = ( A 0 - x ) ( A 1 - A 2 ) 1 + exp ( x - x 0 k ) + A 2 + A 3 x
其中，A1、A2、A3是归一化常数，参数x0表示拐点的位置，k决定该点的最大斜率。对于融化曲线，参数x0表示融化温度。典型地，将融化曲线的一阶导数的负值绘制为温度的函数，以确定融化温度。 
图15：利用1℃s-1的加热速率得到的融化曲线(参见图13)。融化温度定义为一半dsDNA融化/变性时的温度，经测量该温度为75.8℃。这与上升速率为1℃s-1的商用实时PCR(Roche LIGHTCYCLERTM 1.5)测量得到的76℃的期望值得到很好地关联。 
正如所述领域技术人员可以理解的那样，可以对此处说明的示例性实 施例作许多修改。更合理地，本发明应包含由权利要求所限定的发明范围内的所有这样的修改。 
此处提到的所有文献都被完整地合并于此作为参考。 

Claims (36)

1.一种用于检测荧光信号的检测系统，包括：
光源，产生激发光，所述激发光具有足以激发样品中荧光团的波长；
激发滤波器，位于沿所述激发光的路径的第一路线上，所述激发滤波器透射来自所述光源的激发光；
分束器，位于所述第一路线上，所述分束器沿第二路线将所述激发滤波器透射的所述激发光反射向位于所述分束器一侧的反射镜，并且透射沿所述第二路线反射的发射光；
所述反射镜被放置为，沿垂直于所述第一和第二路线的第三路线，将来自所述分束器的所述激发光反射至所述样品中的所述荧光团，其中，所述反射镜还沿所述第二路线将沿所述第三路线发射的发射光反射向所述分束器；
发射滤波器，位于所述第二路线上所述分束器的另一侧；以及
检测器，检测所述发射滤波器透射的所述发射光。
2.根据权利要求1所述的检测系统，其中，所述分束器是分色镜。
3.根据权利要求1所述的检测系统，其中，所述第一路线实质上垂直于所述第二路线。
4.根据权利要求2所述的检测系统，其中，所述第一路线实质上垂直于所述第二路线。
5.一种用于检测荧光信号的检测系统，包括：
光源，产生激发光，所述激发光具有足以激发样品中荧光团的波长；
激发滤波器，位于沿所述激发光的路径的第一路线上，所述激发滤波器将来自所述光源的激发光透射向反射镜；
发射滤波器，位于第二路线上；
所述反射镜被放置为，沿垂直于所述第一和所述第二路线的第三路线，将所述激发光反射至所述样品中的所述荧光团，其中，所述反射镜还沿所述第二路线将沿所述第三路线发射的发射光反射向所述发射滤波器，所述激发光的波长与所述发射光的波长差异足够大，使得所述激发光和所述发射光在光学上不相互干扰；以及
检测器，检测所述发射滤波器透射的所述发射光。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测系统，还包括：第一透镜，位于所述光源和所述激发滤波器之间，用于准直所述激发光。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的检测系统，还包括：第二透镜，被放置为，将由所述反射镜反射的所述激发光聚焦至所述样品。
8.根据权利要求6所述的检测系统，还包括：第二透镜，被放置为，将由所述反射镜反射的所述激发光聚焦至所述样品。
9.根据权利要求1至5和8中任一项所述的检测系统，还包括：放大器，连接至所述检测器，用于放大来自所述检测器的信号。
10.根据权利要求6所述的检测系统，还包括：放大器，连接至所述检测器，用于放大来自所述检测器的信号。
11.根据权利要求7所述的检测系统，还包括：放大器，连接至所述检测器，用于放大来自所述检测器的信号。
12.根据权利要求1至5、8、10和11中任一项所述的检测系统，其中，所述光源是LED。
13.根据权利要求6所述的检测系统，其中，所述光源是LED。
14.根据权利要求7所述的检测系统，其中，所述光源是LED。
15.根据权利要求9所述的检测系统，其中，所述光源是LED。
16.根据权利要求12所述的检测系统，其中，所述LED是单色LED，所述激发滤波器和所述发射滤波器分别是单带通滤波器。
17.根据权利要求13至15中任一项所述的检测系统，其中，所述LED是单色LED，所述激发滤波器和所述发射滤波器分别是单带通滤波器。
18.根据权利要求12所述的检测系统，其中，所述LED是多色LED，所述激发滤波器和所述发射滤波器分别是多带通滤波器。
19.根据权利要求13至15中任一项所述的检测系统，其中，所述LED是多色LED，所述激发滤波器和所述发射滤波器分别是多带通滤波器。
20.根据权利要求12所述的检测系统，还包括：一个或多个附加的单色LED，其中，所述激发滤波器和所述发射滤波器分别是多带通滤波器，并且，对来自每个单色LED的激发光分别进行调制和解调。
21.根据权利要求13至15中任一项所述的检测系统，还包括：一个或多个附加的单色LED，其中，所述激发滤波器和所述发射滤波器分别是多带通滤波器，并且，对来自每个单色LED的激发光分别进行调制和解调。
22.根据权利要求1至5、8、10、11、13至16、18和20中任一项所述的检测系统，其中，所述检测器是光电二极管。
23.根据权利要求6所述的检测系统，其中，所述检测器是光电二极管。
24.根据权利要求7所述的检测系统，其中，所述检测器是光电二极管。
25.根据权利要求9所述的检测系统，其中，所述检测器是光电二极管。
26.根据权利要求12所述的检测系统，其中，所述检测器是光电二极管。
27.根据权利要求17所述的检测系统，其中，所述检测器是光电二极管。
28.根据权利要求19所述的检测系统，其中，所述检测器是光电二极管。
29.一种热循环器设备，包括：
根据权利要求1至28中任一项所限定的检测系统；
样品端口，用于接收包含荧光团的样品，所述样品端口被放置为，使所述样品与从所述检测系统反射的激发光对准；
加热器，被放置为与所述样品接收端口相邻，用于加热所述样品；
温度传感器，连接至所述加热器，用于检测所述加热器的所述温度；
荧光信号处理器，连接至所述检测系统，用于处理所述检测系统所检测的荧光信号；
用户接口模块，用于输入和输出数据；以及
电源，用于为所述设备供电。
30.根据权利要求29所述的热循环器设备，还包括：控制器，所述控制器与所述加热器、所述温度传感器、所述荧光信号处理器、以及所述用户接口模块进行通信。
31.根据权利要求29或30所述的热循环器设备，其中，所述用户接口模块包括触摸屏。
32.根据权利要求29或30所述的热循环器设备，其中，所述热循环器设备是手持设备。
33.根据权利要求31所述的热循环器设备，其中，所述热循环器设备是手持设备。
34.根据权利要求29、30和33中任一项所述的热循环器设备，其中，所述电源是电池。
35.根据权利要求31所述的热循环器设备，其中，所述电源是电池。
36.根据权利要求32所述的热循环器设备，其中，所述电源是电池。
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