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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betreiben eines Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionssystems (PCR) sowie eine Vorrichtung zum Betreiben des Verfahrens.
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PCR ist eine Technologie zur Amplifizierung von Kopien spezifischer Desoxyribonukleinsäure(DNS)- oder Ribonukleinsäure(RNA)-Fragmente in einer Reaktionskammer. Die PCR-Technologie hat sich als sehr effizient und zuverlässig erwiesen aufgrund einfacher und leichter Verwendung. Es handelt sich um wiederholbare Zyklen, bestehend aus drei Schritten, nämlich einem Denaturierungsschritt, einem Annealingschritt und einem Extensionsschritt. Daher wird diese PCR-Technologie in Medizin, Wissenschaft, Landwirtschaft, Veterinärmedizin, Lebensmittelwissenschaften, Umweltwissenschaften sowie in der molekularen Biologie, Archäologie und Anthropologie eingesetzt.
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Seit einigen Jahren wird die genetische Analyse auch als allgemein verwendete Technik zum Nachweis von Krankheiten sowie deren Krankheitspotenzial genutzt. Blut- oder Gewebeproben, die mittels minimal invasiver Techniken aus lokalisierten Bereichen entnommen werden, können verwendet werden, um eine DNA-Analyse via PCR durchzuführen. Zur Quantifizierung werden normalerweise die Endpunkt-PCR-Produkte mittels eines Agarosegels getrennt und die ungefähre Konzentration wird mit einem Spektralphotometer bestimmt. Allerdings kann eine genaue Messung der Menge an DNA mit dieser Endpunktmethode nicht ermöglicht werden. Um diese Probleme zu überwinden, wurden ein Echtzeit-PCR-Verfahren und ein Fluoreszenzdetektionsverfahren entwickelt, bei denen in jedem PCR-Zyklus die akkumulierten PCR-Produkte gemessen werden. Mit diesen beiden Methoden kann ein Amplifizierungs-Diagramm erhalten werden, welches die Fluoreszenzintensitäten gegen die Zykluszahlen darstellt.
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Die meisten der Analysen werden in Laboratorien durchgeführt, die Systeme verwenden, die für die Hochdurchsatzanalyse konzipiert sind. Außerhalb des Labors entnommene Proben werden zu diesen Laboratorien gesandt, bei denen daraufhin die DNA extrahiert wird und in einem so genannten PCR-Cocktail in einer Kammer angeordnet wird, woraufhin die Analyse ausgeführt wird.
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Es wäre extrem wertvoll, wenn es ein leicht tragbares Echtzeit-PCR-Instrument gäbe, durch welches die DNA-Analyse sofort außerhalb des Labors durchgeführt werden könnte.
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Einige wenige Echtzeit-PCR-Vorrichtungen sind beschrieben worden, die eine integrierte Fluoreszenzerfassungseinheit umfassen.
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Belgrader et al. (P. Belgrader, S. Young, B. Yuan, M. Primeau, LA Christel, F. Pourahmadi und MA Northrup, Anal. Chem. 73, 286–289 (2001)) entwickelten ein kompaktes Echtzeit-PCR-Instrument für eine schnelle Multiplex-Analyse von Nukleinsäuren in einem tragbaren Format durch die Verwendung einer Dünnfilmwiderstandsheizung, einem Ventilator, einer LED sowie Silizium-Photodioden-Detektoren. Das Gerät wiegt 3,3 kg, misst 26 × 22 × 7,5 cm und kann mittels der internen Batterien kontinuierlich für 4 Stunden betrieben werden.
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Obwohl dieses System als tragbares Echtzeit-PCR-Instrument verwendbar ist, wird für die benötigte Reaktionsmischung ein Reaktionsvolumen zwischen 25 und 100 µL benötigt und die Abmessungen und das Gewicht sind eher unhandlich.
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Higginns et al. (JA Higgins, S. Nasarabadi, JS Karns, DR Shelton, M. Cooper, A. Gbakima und RP Koopman, Biosens Bioelectron 18, 1115–.. 1123 (2003)) berichteten über die Verwendung eines neuen handhaltbaren Nukleinsäure-Analysegeräts mit einem Gewicht von weniger als ein Kilogramm, welches in der Lage ist vier Echtzeit-PCR-Reaktionen durchzuführen, wobei Kunststoff-PCR-Röhrchen mit einem Reaktionsvolumen von 25 bis 30 µL verwendet wurden.
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Da-Sheng Lee et al. (DS Lee, MH Wu, U. Ramesh, CW Lin, TM Lee, und PH Chen, ACTUAT. B-Chem. 100, 401–410 (2004b)) entwickelten ein Miniaturspektrometer zur Erfassung der Emission der Fluoreszenz-Intensität von RT-PCR-Gemischen in einer Mikroliter-Volumen-Glaskapillare.
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Obwohl sie ein Miniaturspektrometer entwickelten, sind die Abmessungen des Systems die eines kommerziellen Thermocyclers und daher nicht transportierbar.
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Xiang et al. (Q. Xiang, B. Xu, R. Fu, und D. Li, Biomed. MicroDev. 7, 273–279 (2005)) entwickelten ein On-Chip-Real-Time-PCR-Gerät unter Verwendung eines Miniatur-Thermocyclers, wobei jedoch die Echtzeiterfassung durch ein Desktop-Fluoreszenzmikroskop durchgeführt wird und somit dieses System nicht transportierbar ist.
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Ebenfalls entwickelten Xiang et al. (Q. Xiang, B. Xu, R. Fu, und D. Li, Biomed. MicroDev. (2007)) ein Chip-basiertes Real-Time-PCR-System unter Verwendung eines PDMS-Reaktor-Chips, eines miniaturisierten Thermocyclers und eines faseroptischem Fluoreszenz-Anregungs- und Detektionsmoduls. Jedoch ist dieses System nicht transportierbar.
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Es wäre daher von großem Nutzen, wenn eine Vorrichtung zur direkten Quantifizierung der PCR-Produkte hergestellt werden könnte, die ein oder mehrere der oben genannten Probleme überwindet oder abschwächt.
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Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein neues Verfahren bereitzustellen, das die Herstellung eines kleinen, transportierbaren Echtzeit-PCR-Systems ermöglicht.
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Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Betreiben eines Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-systems gelöst, umfassend ein Kontrollsystem zur kontrollierten Einstellung der Temperatur eines Probenhalters, wobei die kontrollierte Einstellung mittels einer Regelung erfolgt, für mindestens zwei Temperatur-Sollwerte, wobei zu einem ersten Zeitpunkt die Temperaturregelung gestartet wird, und zu einem zweiten Zeitpunkt, der nach dem genannten ersten Zeitpunkt liegt, die Messung der Fluoreszenzintensität und / oder Lumineszenz-Abklingzeit beginnt, wobei zu dem zweiten Zeitpunkt die Komponenten des Systems zur Temperaturregelung zumindest teilweise für die Fluoreszenzintensität und / oder Lumineszenz-Abklingzeit Messungen verwendet werden, wobei zu dem zweiten Zeitpunkt weiterhin die Temperaturregelung für den Messzeitraum unterbrochen wird.
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Somit kann eine Miniaturisierung des Real-Time-PCR-Systems erreicht werden, da nur ein Steuerblock, der ein einzelner Lock-in-Verstärker sein kann, vorhanden ist, der sowohl für die Temperaturregelung als auch für die Signalmessung des Real-Time-PCR-Produkts, verwendet wird. Das PCR-Produkt-Signal kann hierbei ein Fluoreszenzsignal sein, welches von der PCR-Kammer abgegeben wird, und welches bevorzugt als Fluoreszenzintensität oder Lumineszenz-Abklingzeit gemessen wird. Allerdings kann das PCR-Produktsignal ebenfalls durch die Anwendung von Absorption-Erkennungsstrategien gemessen werden.
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Üblicherweise ist bei in Laboren positionierten Hochdurchsatz-PCR-Systemen die Temperaturaufrechterhaltung in den Probengefäßen abhängig von den Thermoblöcken, in denen die Proben angeordnet sind. In diesen Thermoblöcken wird die Wärme in der Regel während des Messzeitraums konstant gehalten, da sie eine geringe Wärmeleitfähigkeit besitzen. Somit wird keine Regelung der Temperatur mittels einer Steuerung gefordert. Kleine Chips wie Mikrofluidik-Chips zusammengesetzt aus Silikon, Glas, Metall oder Kunststoffen, die für die PCR angewendet werden können, haben jedoch eine hohe Wärmeleitfähigkeit und können daher leicht Wärme übertragen.
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Daher ist es im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass die kontrollierte Einstellung der Temperatur in dem Messzeitraum mittels einer Temperatursteuerung erfolgt. Diese Temperatursteuerung hat den Vorteil, dass nur eine geringe Anzahl von Komponenten benötigt wird. Deshalb ist der benötigte Platz für das Steuersystem in der Vorrichtung gering.
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Es ist vorgesehen, dass die Stellgrößen für die Temperatursteuerung abhängig von den Stellgrößen zwischen dem ersten und dem zweiten Zeitpunkt, während der Temperaturregelung bestimmt werden.
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Hierbei werden die Stellgrößen für die Temperatursteuerung abhängig von gemittelten Werten dieser Stellgrößen bestimmt, wobei diese Stellgrößen während einer Zeitdauer bestimmt werden, die vor dem zweiten Zeitpunkt startet und zum zweiten Zeitpunkt endet, unter der weiteren Bedingung, dass dabei der maximale Betrag der Abweichung der gemessenen Temperatur gegenüber dem Temperatur-Sollwert kleiner ist als ein eingestellter Schwellenwert.
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Hierdurch kann die Beeinflussung der Umgebung auf die Temperatur, die in dem Zeitfenster der Temperaturregelung ausgewertet wurde, in dem Zeitfenster der Temperatursteuerung berücksichtigt werden.
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Dies ermöglicht, dass die Temperatur über den durchschnittlichen Arbeitszyklus während der PCR-Produktsignal-Emission und -Aufnahme gesteuert wird.
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Vorteilhaft hierbei ist es, dass die Temperatur zumindest annähernd auf dem eingestellten Wert gehalten wird. Obwohl die Thermoblöcke eine niedrige thermische Leitfähigkeit aufweisen, kann die Temperatur der äußeren Probenvertiefungen unterschiedlich betroffen sein im Vergleich zur Temperatur für die inneren Vertiefungen. Dies kann zu Messunterschieden und damit zu Fehlern führen. Durch die Verwendung einer Temperatursteuerung können jedoch Temperaturdifferenzen für die mindestens eine Probe vermieden werden.
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Weiterhin ist für eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung vorgesehen, dass die Temperatursteuerung unter Verwendung von Komponenten erfolgt, die in dem ersten Zeitfenster, das zwischen dem ersten Zeitpunkt und dem zweiten Zeitpunkt liegt, für die Temperaturregelung verwendet werden und die nicht für die Fluoreszenzintensitäts- und / oder Lumineszenz-Abklingzeitmessung verwendet werden, die ab dem zweiten Zeitpunkt anfängt.
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Das Multiplexen von der Temperaturregelung und den Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Abklingzeitmessungen ist vorteilhaft. Während des PCR-Vorgangs, d.h. Denaturierung, Annealing und bis zum zweiten Zeitpunkt des Verlängerungsschrittes, arbeitet das System mit einer Temperaturregelung, vorzugsweise mit Pulsweitenmodulation (PWM) des Stroms für die Heizung. Während dieser Zeit werden die Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Messungen nicht ausgeführt. Der Zeitpunkt, von dem an die Proben gemessen werden, wurde hierbei als der zweite Zeitpunkt definiert. Normalerweise werden die Messungen, die während der PCR-Zyklen gemacht werden, am Ende der Primer-Extension/Elongation durchgeführt. Im Falle der Verwendung von Thermus aquaticus(Taq)-Polymerase wird die Fluoreszenz üblicherweise bei 72 °C gemessen. Für die Messungen können jedoch auch andere DNA-Polymerasen verwendet werden, die eine optimale Aktivität bei einer Temperatur um 70° C aufweisen.
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Es liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung, dass die Messung mittels mehrerer Detektoren durchgeführt wird, wobei die Detektoren einzeln und einander nachfolgend während der Messungen kontrolliert werden.
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Dies ist vorteilhaft, da es zwar grundsätzlich möglich ist mit lediglich einem Detektor eine Reihe von Probenröhrchen unter Verwendung optischer Fasern zu erfassen, dies jedoch eine teure Lichtquelle voraussetzt, die eine gute Kohärenz aufweist, wie z. B. einen Laser, um einen Anregungsstrahl zur Anregung der Fluoreszenz auf den optischen Fasern zu sammeln.
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Für die bevorzugte Ausführungsform kann jedoch die Erfassungseinheit ein Einkanal- oder Mehrkanal-Fluoreszenzdetektor sein, der die emittierte Fluoreszenzintensität detektiert. Der Detektor könnte auch eine ladungsgekoppelte (CCD)-Kameravorrichtung oder ein Sensor mit optischen Fasern, eine Photodiode oder eine Photovervielfacherröhre (PMT) sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist es schon aus Kostengründen zweckmäßig, dass das PCR-System eine PMT, zusätzlich oder bevorzugt, anstelle einer CCD-Kamera verwendet. Daher kann das PCR-Produktsignal ein elektrisches Signal sein, an das ein Wechselstrom angelegt ist, und die Detektionseinheit kann einen Sensor umfassen, der das Signal erfasst.
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Typische quantitative Echtzeit-PCR-Systeme bestehen aus einem Laser, um die Fluoreszenz zu induzieren und um diese von allen Proben einer Platte zu erfassen. Dabei wird die Platte bewegt und der Laser adressiert individuell jedes Probengefäß der Platte. Jedoch ist ein solches System groß und teuer.
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Um die oben erwähnten Nachteile zu vermeiden, ist es vorteilhaft, dass die Messung mittels mehrerer Sender durchgeführt wird, wobei die Sender einzeln und einander nachfolgend während der Messungen kontrolliert werden.
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Hierbei kann der Sender jede Art von Lichtquelle sein, die eine Fluorophoranregung bewirkt, einschließlich zum Beispiel Laser, Photodioden, Laser-Dioden und Lampen wie blaues Licht emittierende Dioden (LEDs). Vorteilhaft ist es jedoch, einen Sender zu verwenden, der klein, zuverlässig und in der Lage ist, den Farbstoff SYBR® Green I, der vorzugsweise in dem Verfahren verwendet wird, anregen zu können. Es ist weiterhin vorteilhaft, dass die Sender günstig sind. Daher sind blaues Licht emittierende Dioden (LEDs) oder Laserdioden eine bevorzugte Wahl für den Sender.
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Da der Platzbedarf einer LED oder Laserdiode sehr klein ist, ist es ferner denkbar, dass mehrere LEDs oder Laser unterschiedlicher Wellenlänge zu einem einzigen Paket oder zu mehreren LEDs/Lasern gepackt werden, wobei diese sehr eng beabstandet sind und dadurch ein Probengefäß/Probe anregen können.
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Es ist weiterhin im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass der mindestens eine Sender nur dann eingeschaltet ist, wenn die Temperaturregelung inaktiv ist.
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Dies ist vorteilhaft, da die für die Messung verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe lichtempfindlich sind und daher Fotobleichung unterliegen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Proben nur für die benötigte Zeit exponiert, um die Daten zu erhalten.
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Es ist ebenfalls eine Vorrichtung zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens im Rahmen der Erfindung vorgesehen, wobei die Komponenten der Temperaturregelung zumindest einen Lock-in-Verstärker umfassen, wobei erste Eingangssignalmittel dem Lock-in-Verstärker zugeordnet sind, um die Temperaturmesseinrichtung mit dem Lock-in-Verstärker zu verbinden, wobei weitere Eingangssignalmittel dem Lock-in-Verstärker zugeordnet sind, um mindestens einen optischen Detektor zu verbinden und wobei Ausgangssignalmittel dem Lock-in-Verstärker zugeordnet sind, zum Verbinden mindestens einer Heizeinrichtung.
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Es ist von Vorteil, dass die Elektronik, die für die Messung und die Temperaturregelung erforderlich ist, durch dieselbe Lock-in-Verstärker genutzte Elektronik durchgeführt wird. Dies ermöglicht eine vereinfachte Systemsteuerungsarchitektur und damit Miniaturisierung. Das Ergebnis der Miniaturisierung kann ein Handgerät, oder sogar ein Gerät in Taschenformat sein, welches ohne Schwierigkeiten mitgenommen werden kann.
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Infolgedessen ist es im Rahmen der Erfindung vorgesehen, dass die Vorrichtung kleinere Abmessungen als 7,0 cm × 12,0 cm × 19,0 cm aufweist und weniger als 0,5 kg wiegt. Es ist jedoch auch im Rahmen der Erfindung vorgesehen, dass die Vorrichtung gleiche oder kleinere Abmessungen als 3,5 cm × 6,0 cm × 9,5 cm aufweist und weniger als 0,2 kg wiegt.
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Die oben genannten Merkmale, die die Miniaturisierung erlauben, erlauben ebenfalls kleinere Reaktionsvolumen.
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Es liegt daher im Rahmen der Erfindung, dass das Lösungsvolumen (Reaktionsvolumen) kleiner als 1,5 µL ist. Es ist jedoch auch möglich, Reaktionsvolumen im Bereich von 0,1 µL bis 1,0 µL zu verwenden.
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Es ist weiterhin vorteilhaft und vorgesehen, dass das System mittels Akku oder Batterie betrieben wird.
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Ein Instrument, das die genetische Analyse durch die Bereitstellung eines in einer Hand transportierbaren Gerätes außerhalb des Labors ermöglicht ist von Interesse für Feldforschungsstudien, Studien in abgelegenen Gebieten oder für temporäre Laboratorien. Die Vorrichtung kann einen Datenerfassungscomputer zur Analyse der Reaktionen in Echtzeit umfassen, oder die Vorrichtung kann die Daten an ein anderes Gerät über verdrahtete oder drahtlose Kommunikationsschnittstellen kommunizieren. Zusätzlich kann die Vorrichtung, die erfindungsgemäß beschrieben wurde, mit anderen Technologien zur weiteren Analyse der Proben kombiniert werden, wie Kapillar-Gel-Elektrophorese, Massenspektrometrie oder Sequenzierung. Eine weitere Möglichkeit der Anwendung eines solchen Instruments kann die schnelle Identifizierung von Menschen oder das Vorhandensein von Krankheiten sein, wobei dies in militärischem oder zivilem Bereich eingesetzt werden kann. Beispielsweise kann ein solches Instrument auch auf Flughäfen zur Identifizierung von gesuchten Individuen eingesetzt werden. Eine weitere mögliche Anwendung ist die Erkennung von Virus-Infektionen oder anderen Krankheiten bei Menschen, die aus Ausbruchsregionen anreisen. Im Allgemeinen können diese tragbaren Geräte helfen, potenzielle und bestehende Erkrankungen direkt vor Ort zu identifizieren.
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Die obigen und weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden mehr ersichtlich durch die detaillierte Beschreibung einer beispielhaften Ausführungsform des Verfahrens, welches in 1 gezeigt ist, und wobei:
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1 eine Zeitfolge des Verfahrens zur Regelung der Temperatur, gefolgt von Fluoreszenzintensität und / oder Lumineszenz-Abklingzeit Messungen zeigt,
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2 eine tragbare Vorrichtung (System) zum Betreiben einer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion zeigt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet Multiplexsteuerung, was bedeutet, dass es nur einen Steuerblock gibt, der für beide Messungen, die Temperatur sowie die Fluoreszenzintensität und / oder Lumineszenz-Abklingzeit, verwendet wird. Es ist vorgesehen, dass mehrere (Vielfaches von 2) Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Messungen unter Verwendung des vorgeschlagenen Multiplex-Steuerverfahrens durchgeführt werden können. Es ist vorgesehen, dass alle Fluoreszenzmessungen durch die gleiche Lock-in-Verstärker basierende Elektronik durchgeführt werden, wodurch die Notwendigkeit, die gleiche Elektronik mehrfach präsent zu haben, entfällt. Dieses Merkmal, unter anderen, ermöglicht eine sehr kompakte Elektronik, ein wichtiges Merkmal für ein tragbares Echtzeit-PCR-Gerät. Zusätzlich wird die Temperaturmessung ebenfalls durch die gleiche Lock-in-Verstärker basierende Elektronik (Lock-in-Verstärkung) durchgeführt. Somit wird nur ein einziger Lock-in-Verstärker verwendet, um entweder die Temperatur oder die Fluoreszenzintensität und / oder Lumineszenz-Abklingzeit zu messen.
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Eine vorgeschlagene Sequenz zur Messung der Temperatur, gefolgt von der Messung der Fluoreszenz, ist in 1 dargestellt, welche eine Vorrichtung zeigt, die die Fluoreszenzmessung von vier Proben ermöglicht. Wie in 1A gezeigt, ist die Fluoreszenzmessung für die Zeitspanne von n bis n + 8, wobei n jeder Zeitpunkt während des normalen PCR-Betriebs sein kann, OFF (OFF bedeutet, dass keine Fluorophoranregung durch Laser, Photodioden, Laser-Dioden und Lampen, wie blaues Licht emittierende Dioden (LEDs), stattfindet) und der einzige Lock-in-Verstärker wird verwendet, um die Temperatur zu messen (ON). Das System arbeitet mit einem geschlossenen Regelkreis zur Temperaturregelung, vorzugsweise mit Pulsweitenmodulation (PWM) für die Leistung des Heizelementes, wodurch, sobald der zweite Zeitpunkt erreicht ist (hier zum Zeitpunkt n + 8, ) die ausgeführte Temperaturmessung angehalten wird (OFF), wobei jedoch die Temperatur auf einem vorbestimmten Wert eines durchschnittlichen Arbeitszyklusses beibehalten werden kann. In der Regel wird die Fluoreszenz, während der PCR-Zyklen, am Ende von der Primerextensions/Elongationszeit gemessen. So kann n z. B. der Zeitpunkt sein, der die letzten zehn Sekunden des Extensions/Elongations-Zeitraums angibt. Da ein System gezeigt ist, welches die Messung von vier Proben ermöglicht, wird die Fluoreszenz sequentiell in den vier Proben gemessen. Hierzu wird viermal die Fluorophoranregung, vorzugsweise durch blaue Licht emittierende Dioden (LEDs), sequentiell aktiviert; jeweils für ungefähr 0,5 Sekunden (1B bis 1E), wobei die Fluoreszenz gemessen wird. In der 1B bis 1E wird die Messung der Fluoreszenzintensität und/oder Lumineszenzabklingzeit zum Zeitpunkt n + 8 (zweiter Zeitpunkt) eingeschaltet (ON).
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zeigt das erfindungsgemäße tragbare PCR-Gerät. Das Gerät hat die Abmessungen von maximal 3,5 cm × 6,0 cm × 9,5 cm (Breite × Höhe × Länge) und wiegt weniger als 0,2 kg. Es ist somit möglich das Gerät in Taschenformat (1) bei Feldstudien in einer Hand zu tragen, wie es beispielsweise für Feldforschungsstudien, Studien in abgelegenen Gebieten oder für temporäre Laboratorien benötigt wird. Durch die Merkmale des miniaturisierten optischen Systems kann ebenfalls ein Reaktionsvolumen im Bereich von 0,1 µL bis 1,0 µL ermöglicht werden.
