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Die vorliegende Erfindung betrifft ein optisches System, insbesondere ein kompaktes optisches System, zum Erfassen von Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignalen von mindestens zwei Proben.
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PCR ist eine Technologie zur Amplifizierung von Kopien spezifischer Desoxyribonukleinsäure(DNS)- oder Ribonukleinsäure(RNA)-Fragmente in einer Reaktionskammer. Die PCR-Technologie hat sich als sehr effizient und zuverlässig erwiesen aufgrund einfacher und leichter Verwendung, wobei wiederholbare Zyklen, bestehend aus drei Schritten, verwendet werden, nämlich einem Denaturierungsschritt, einem Annealingschritt und einem Extensionsschritt. Daher wird diese PCR-Technologie in Medizin, Wissenschaft, Landwirtschaft, Veterinärmedizin, Lebensmittelwissenschaften, Umweltwissenschaften sowie in der molekularen Biologie, Archäologie und Anthropologie eingesetzt.
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Seit einigen Jahren wird die genetische Analyse auch als allgemein verwendete Technik zum Nachweis von Krankheiten sowie deren Krankheitspotenzial genutzt. Blut- oder Gewebeproben, die mittels minimal invasiver Techniken aus lokalisierten Bereichen entnommen werden, können verwendet werden, um eine DNA-Analyse via PCR durchzuführen.
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Zur Quantifizierung werden normalerweise die Endpunkt-PCR-Produkte mittels eines Agarosegels getrennt und die ungefähre Konzentration wird mit einem Spektralphotometer bestimmt. Allerdings kann eine genaue Messung der Menge an DNA mit dieser Endpunktmethode nicht ermöglicht werden. Um diese Probleme zu überwinden, wurden ein Echtzeit-PCR-Verfahren und ein Fluoreszenzdetektionsverfahren entwickelt, bei denen in jedem PCR-Zyklus die akkumulierten PCR-Produkte gemessen werden. Mit diesen beiden Methoden kann ein Amplifizierungs-Diagramm erhalten werden, welches die Fluoreszenzintensitäten gegen die Zykluszahlen darstellt.
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Die meisten der Analysen werden in Laboratorien durchgeführt, die Systeme verwenden, die für die Hochdurchsatzanalyse konzipiert sind. Außerhalb des Labors genommene Proben werden zu diesen Laboratorien gesandt, bei denen daraufhin die DNA extrahiert wird und in einem so genannten PCR-Cocktail in einer Kammer angeordnet wird, woraufhin die Analyse ausgeführt wird.
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Es wäre extrem wertvoll, wenn es ein leicht tragbares Echtzeit-PCR-Instrument gäbe, durch welches die DNA-Analyse sofort außerhalb des Labors durchgeführt werden könnte.
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Unterschiedliche Detektionstechniken wurden für diese tragbaren Nachweissysteme eingesetzt, einschließlich Massenstrom-, elektrochemische und optische Detektionsverfahren. Optische Detektionsverfahren, wie z. B. Nachweis von Fluoreszenzintensität oder Lumineszenz-Abklingzeit, werden aufgrund ihrer Robustheit, hohem Signal-Rausch-Verhältnis und Empfindlichkeit häufiger verwendet.
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Optische Systeme für den Nachweis von Fluoreszenzsignalen bestehen typischerweise aus den folgenden Komponenten: eine Lichtquelle zum Emittieren von Licht in einem geeigneten Wellenlängenbereich, einem Anregungsfilter, um unerwünschtes Licht zu beseitigen, einem dichroitischen Spiegel für die optische Trennung von Anregungs- und Emissionskanälen, einem Emissionsfilter sowie einem Detektor, der eine Elektronik zur Signalverarbeitung aufweist.
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In den letzten Jahren wurden Fluoreszenz-Systeme auf Basis von Leuchtdioden (LED) auf Grund ihrer niedrigen Kosten und langer Lebensdauer beliebt. LEDs sind mehr als tausend Mal billiger als alternative Lichtquellen und sind auf Grund ihrer langen Lebensdauer auch Laser- und Quecksilberlampen überlegen. Zusätzlich können sowohl der LED-Lichtleistungsoutput als auch der von Halbleiterlasern moduliert werden. Da die LEDs nur wenige mm im Durchmesser und Länge aufweisen, können sie in tragbaren Systemen, wie beispielsweise ein Echtzeit-PCR-System, integriert werden.
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Die bevorzugten Detektoren, die in Fluoreszenz-Detektionssystemen verwendet werden, sind Photomultiplier-Röhren (PMT), Avalanche-Photodioden und Photonenzählermodule (PCM). Auch wenn alle diese Methoden und / oder Geräte eine Miniaturisierung bis zu einem bestimmten Punkt ermöglichen, wird jedoch immer noch jedes Gerät durch ein dazugehöriges Steuersystem geregelt. Dies erfordert gewisse erforderliche Abmaße, welche die Abmaße des Systems erhöhen. Darüber hinaus, wenn sie Miniaturisierung erlauben, sind diese Geräte häufig teuer und / oder erfordern spezielle Betriebsbedingungen, wie z. B. Betrieb bei völliger Dunkelheit und / oder Betrieb bei einer bestimmten Temperatur, die oft unter der Raumtemperatur liegt.
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Es wäre daher vorteilhaft, wenn eine Vorrichtung für die direkte Quantifizierung von PCR-Produkten herstellbar wäre, welche einen einfachen Aufbau aufweist, kompakt ist und ein oder mehr der oben aufgeführten Probleme abschwächt oder löst.
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Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein kompaktes optisches System bereitzustellen, welches die Herstellung eines kleinen, günstigen und tragbaren (handhaltbaren) Echtzeit-PCR-Systems ermöglicht.
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Die Aufgabe wird für ein optisches System zum Erfassen von Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignalen von mindestens zwei Proben, umfassend für jedes Detektionssystem eine Lichtquelle zum Erzeugen von Anregungslicht, ein Anregungsfilter, wobei der Anregungsfilter das Anregungslicht von der Lichtquelle zu einem dichroitischen Spiegel überträgt, wobei der dichroitische Spiegel das Anregungslicht, das von dem Anregungsfilter übertragen wurde, zu einem Fluorophor in einer Probe reflektiert, und wobei das emittierte Licht von jeder der Proben durch den dichroitischen Spiegel und einen Emissionsfilter passiert hin zu einem Detektor, der das emittierte Licht detektiert, dadurch gelöst, dass nur ein Anregungsfilter vor den zumindest zwei nebeneinander angeordneten Lichtquellen angeordnet ist, wobei dieser Anregungsfilter die Anregungslichtstrahlen einer jeden Lichtquelle auf nur einen dichroitischen Spiegel überträgt, wobei dieser dichroitische Spiegel die von dem Anregungsfilter übertragenen Anregungslichtstrahlen zu dem Fluorophor in jeder Probe reflektiert, und wobei das emittierte Licht von jeder der Proben nebeneinander durch den dichroitischen Spiegel und durch nur einen gemeinsamen Emissionsfilter, zu mindestens einem Detektor verläuft.
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Es liegt im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass zwei optische Systeme einander gegenüber angeordnet werden können, wobei nur ein Anregungsfilter vor den zumindest zwei nebeneinander angeordneten Lichtquellen eines jeden optischen Systems angeordnet ist und wobei der Anregungsfilter die Anregungslichtstrahlen jeder Lichtquelle auf nur einen dichroitischen Spiegel für jedes optische System überträgt, wobei der dichroitische Spiegel die Anregungslichtstrahlen, die durch den Anregungsfilter übertragen wurden, zu dem Fluorophor in jeder Probe reflektiert, und wobei das emittierte Licht von jeder der Proben nebeneinander durch den dichroitischen Spiegel der beiden optischen Systeme und nur durch einen von beiden optischen Systemen gemeinsam genutzten Emissionsfilter zu mindestens einem Detektor verläuft.
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Diese Ausgestaltung der gegenüberliegenden optischen Systeme ermöglicht eine platzsparende Anordnung der Probengefäße. So können die Abmessungen des Systems minimiert werden. Es ist jedoch auch vorgesehen, dass mehr als zwei Probengefäße pro optischem System vorhanden sind. Somit können mehrere Proben simultan gemessen werden. Auch wenn jedes optische System getrennt durch Austausch von Filtern erweitert werden kann, ist es bevorzugt, die gegenüberliegenden optischen Systeme gleichzeitig zu erweitern.
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Der Detektor kann eine ladungsgekoppelte Vorrichtungskamera (CCD) oder ein Sensor mit optischen Fasern, eine Avalanche-Photodiode (APD), eine Photodiode oder eine Photovervielfacherröhre (PMT) sein. Jedoch ist für die bevorzugte Ausführungsform als Detektor ein Einkanal- oder ein Mehrkanal-Fluoreszenz-Detektor vorgesehen, der die emittierte Fluoreszenzintensität oder Lumineszenz-Abklingzeit ermittelt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist es sowohl finanziell zweckmäßig als auch platzsparend, dass für das PCR-System eine Photodiode verwendet wird, zusätzlich oder bevorzugt anstelle einer CCD-Kamera. Die bevorzugte Photodiode für diese Ausführungsform kann hierbei eine Silizium-Photodiode sein, wie z. B. BPW21 von Siemens, Inc..
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Es ist weiterhin vorteilhaft, dass die Messung durch mehrere Detektoren durchgeführt wird, wobei die Detektoren während den Messungen einzeln kontrolliert werden.
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Es wird vorausgesetzt, dass die Lichtquelle, die das Anregungslicht erzeugt, eine Wellenlänge erzeugt, die ausreicht, um ein Fluorophor in einer Probe anzuregen.
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Typischerweise bestehen quantitative Echtzeit-PCR-Systeme aus einem Laser, um die Fluoreszenz zu induzieren, wobei die Platte bewegt wird, um alle Proben dieser Platte zu scannen, wobei der Laser individuell jedes Probengefäß in der Platte adressiert. Jedoch ist ein solches System sperrig und teuer.
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Um diese oben beschriebenen Probleme zu vermeiden, ist es vorteilhaft, die Messung mittels günstiger Lichtquellen durchzuführen, welche das Anregungslicht mit einer Wellenlänge erzeugen, die ausreicht, um ein Fluorophor in einer Probe anzuregen.
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Hierfür kann die Lichtquelle, die das Anregungslicht erzeugt, ein Laser, eine Photodiode, eine Laserdiode oder eine Lampe, wie zum Beispiel eine blaues Licht oder türkises Licht emittierende Dioden (LEDs) sein.
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Es ist vorteilhaft, eine Lichtquelle zu verwenden, die klein, zuverlässig und in der Lage ist, den Farbstoff, wie SYBR Green I, der in der Regel für die Echtzeit-PCR-Verfahren verwendet wird, anregen zu können. Es ist weiterhin vorteilhaft, dass die Sender günstig sind. Dementsprechend sind blaues Licht emittierende Dioden (LEDs) oder Laserdioden eine bevorzugte Wahl für die Lichtquelle. Zum Beispiel kann das türkisfarbene LED Modell ETG-5CE490-15 (ETG. Corp) für diese Erfindung verwendet werden. Die LED hat eine Spitzenemissionswellenlänge von 490 nm bei einer Lichtstärke von 6 cd (Candela) und einem Betrachtungswinkel von 15°. Aber auch LEDs mit einer Spitzenemissionswellenlänge von 470 nm sind eine bevorzugte Wahl.
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Für eine Ausführungsform der Erfindung ist es möglich, dass jede Lichtquelle die gleiche Anregungswellenlänge erzeugt und der Anregungsfilter und der Emissionsfilter jeweils ein einzelner Bandpassfilter ist.
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Es ist vorgesehen, dass jeder Probe mindestens eine Lichtquelle, welche mindestens eine Anregungswellenlänge erzeugt, zugeordnet ist.
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Da der Platzbedarf einer LED oder Laserdiode sehr klein ist, ist es ferner denkbar, dass mehrere LEDs oder Laser mit unterschiedlicher Wellenlänge zu einem einzigen Paket oder mehreren LEDs / Laserpacketen gepackt werden, wobei diese sehr eng voneinander beabstandet sein können, so dass sie ein Probengefäß bzw. eine Probe anregen können.
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Infolgedessen liegt es im Rahmen der Erfindung, dass jeder Probe mindestens eine Lichtquelle zugeordnet ist, die mindestens eine Anregungswellenlänge erzeugt, wobei der Anregungsfilter mindestens zwei Filter zum Filtern von wenigstens zwei Lichtstrahlen mit unterschiedlichen Wellenlängen umfasst, um Fluorophore in den Proben anzuregen, und dass der Emissionsfilter mindestens zwei Filter zum Filtern von zumindest zwei Wellenlängen der emittierten Lichtstrahlen von den Proben umfasst.
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Somit kann die Anregungswellenlänge von jeder Lichtquelle individuell moduliert und demoduliert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung kann daher beispielsweise eine türkisene LED durch eine Dreifarben-LED und der einzelne Bandpassfilter durch ein dreifaches Bandpassfilter-Set ersetzt werden. Jede Farbe der LED wird mit einer einzigartigen Frequenz moduliert und hat einen eigenen Demodulator. Dieser Aufbau ermöglicht den Nachweis von bis zu drei verschiedenen Wellenlängen, wobei diese unabhängig voneinander sind. Dies kann zudem auch für Real-Time-PCR-Anwendungen genutzt werden, wodurch interne negative und positive Kontrollen (Multiplexing) ermöglicht werden.
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Weiterhin ist es innerhalb des Umfangs der Erfindung, dass das Anregungslicht gepulst werden kann.
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Dies ist vorteilhaft, weil die Lichtquelle ausgeschaltet ist, wenn der Detektor nicht die Fluoreszenz einer Probe detektiert. Dabei kann die Lichtquelle abkühlen. Dadurch wird der Verbrauch an Energie, gegenüber einem kontinuierlichen Betrieb der Lichtquelle, reduziert. Der Zeitpunkt, wann die gepulste Lichtquelle ein- und ausgeschaltet ist bietet eine Möglichkeit zur Optimierung der Leistungsfähigkeit des optischen Systems unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich, aber nicht einschränkend, Reihentaktung, Probentaktung und hochfrequente Taktung. Darüber hinaus kann aufgrund des gepulsten Anregungslichts die Streuung von den mindestens zwei Lichtquellen eines optischen Systems vermieden werden. Wenn zudem mehrere optische Systeme zum Multiplexen (Diagnose verschiedener fluorogener Sonden der gleichen Probe) verwendet werden, kann Streulicht von dem einem System zu einem gegenüberliegenden System gelangen, was den Hintergrund erhöht sowie die Empfindlichkeit verringert. Pulsing bietet die Möglichkeit, das Licht aus verschiedenen farbigen Quellen, die auf verschiedene Fluorophore abgestimmt sind, zeitlich zu staffeln. Die Planung der Pulse derart, dass nur eine Lichtquelle eingeschaltet ist und somit nur ein Signal zu einem Zeitpunkt erfasst wird, verhindert das Problem von Streulicht und steigert die Kombinationsmöglichkeiten von Fluorophoren, die optische Leistung erreichen können, einschließlich bei Fluorophorenpaaren, bei denen einer des Fluorophorenpaares eine Anregungswellenlänge ähnlich oder gleich der Emissionswellenlänge des anderen des Fluorophorenpaares ist.
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Weiterhin ist das Pulsen von Lichtquellen auch vorteilhaft für die Real-Time-PCR-Anwendungen, da das Pulsen die Möglichkeit der Lock-in-Detektion erlaubt. Lock-in-Detektion verbessert die Empfindlichkeit durch ausschließliches Verstärken von den Signalen mit genau der Pulsfrequenz; Rauschen und / oder Signale mit anderen Frequenzen werden nicht amplifiziert. Dies ermöglicht den Betrieb des Systems in der Außenumgebung, ohne es in eine schwarze Kammer oder einen Kasten stellen zu müssen.
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Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass eine erste Linse zwischen der Lichtquelle und dem Anregungsfilter positioniert ist. Dies hat den Vorteil, dass das Anregungslicht kollimiert werden kann.
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Für eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass eine zweite Linse angeordnet ist, um das Anregungslicht zu fokussieren, das von dem dichroitischen Spiegel in Richtung der Probe reflektiert wird.
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Für weitere Miniaturisierungszwecke ist vorgesehen, dass die Filter und Linsen an der Lichtquelle und/oder dem Detektor angebracht sind. Dies ist vorteilhaft, da keine Halterung oder Befestigungseinrichtung in dem optischen System installiert werden muss, was wiederum eine Miniaturisierung ermöglicht.
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Es ist im Rahmen der Erfindung vorgesehen, dass die optische Leistung des Systems durch Filterbildung (hergestellt mittels Verdampfung von Mehrfachschichten) direkt auf der Oberfläche der Linsen verbessert werden kann. Diese Technik, zusammen mit der Anbringung der Linsen direkt auf der LED und der Photodiode, verringert die Anzahl der optischen Grenzflächen. Es ermöglicht ferner, das optische System noch kompakter zu gestalten, wobei die Übertragung entlang des optischen Weges gesteigert wird.
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Weiterhin ist im Rahmen der Erfindung vorgesehen, den leeren Raum des optischen Systems mit optisch passenden Materialien auszufüllen, wie beispielsweise mit Epoxid, welches einen übereinstimmenden Brechungsindex aufweist, um alle Oberflächenreflexionen zu eliminieren und somit die Notwendigkeit der Antireflexbeschichtungen auf allen Elementen zu eliminieren.
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Das vorliegende optische Erfassungssystem kann in tragbaren Geräten, bei denen Miniaturisierung wünschenswert ist, einschließlich Geräten zur quantitativen Real-Time-PCR oder für reverse Transkription(RT)-PCR, in Echtzeit Biolumineszenz- und Chemilumineszenzassays oder anderen fluoreszenz-basierten Nachweisassays verwendet werden.
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Die obigen und weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden mehr ersichtlich durch die detaillierte Beschreibung beispielhafter Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
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1 ein tragbares Gerät zum Betreiben einer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion in einer perspektivischen Ansicht zeigt,
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2 einen Schnitt durch das tragbare Gerät zeigt, wobei das optische System dargestellt ist,
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3 einen Schnitt durch die tragbare Vorrichtung in Perspektivansicht zur Darstellung des optischen Systems und eine vergrößerte Ansicht des Abschnitts zeigt und
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4 einen Zweifachschnitt durch die tragbare Vorrichtung in Perspektivansicht zur Darstellung des optischen Systems und eine vergrößerte Ansicht des Zweifachschnittes zeigt.
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1 zeigt eine tragbare PCR Vorrichtung (1), die aufgrund des kleinen miniaturisierten optischen Systems zusammengebaut werden kann. Das Gerät (1) hat die Abmessungen von maximal 3,5 cm × 6,0 cm × 9,5 cm (Breite (x)·Höhe (y)·Länge (z)) und wiegt weniger als 0,2 kg. Es ist somit möglich, das Gerät in Taschenformat (1) bei Feldstudien in einer Hand zu tragen, wie es beispielsweise für Feldforschungsstudien, Studien in abgelegenen Gebieten oder für temporäre Laboratorien benötigt wird. Es liegt ferner im Rahmen der Erfindung, dass das Lösungsvolumen (Reaktionsvolumen) der Probe (6), die in einer Reaktionskammer angeordnet ist, kleiner als 1,5 µL ist. Durch die Merkmale des miniaturisierten optischen Systems kann ebenfalls ein Reaktionsvolumen im Bereich von 0,1 µL bis 1,0 µL ermöglicht werden. Des Weiteren sind in 1 die Vertikalschnitte für die Abschnitte, die in den 2 bis 4 dargestellt sind, gezeigt. Der erste Schnitt (L1) ist ein vertikaler Schnitt entlang der z-Achse, der zu einer parallelen Schnittebene der gegebenen x-y-Ebene führt. Der zweite Schnitt (L2) ist ein vertikaler Schnitt entlang der x-Achse, die zu einer parallelen Schnittebene der gegebenen y-z-Ebene führt.
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2 zeigt einen Schnitt durch die tragbare PCR-Vorrichtung (1), welche entlang des ersten Schnittes (L1) geschnitten ist. Gezeigt sind zwei optische Systeme, die gegenüber voneinander angeordnet sind. Das optische System zum Erfassen von Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignalen von mindestens zwei Proben (6), umfasst für jedes Detektionssystem eine Lichtquelle (2) zum Erzeugen von Anregungslicht (9). Ein Anregungsfilter (3) ist vor der Lichtquelle (2) angeordnet, woraufhin der Anregungsfilter (3) das Anregungslicht (9) von der Lichtquelle (2) zu einem dichroitischen Spiegel (4) überträgt, woraufhin der dichroitische Spiegel (4) das Anregungslicht (9), das von dem Anregungsfilter (3) übertragen wurde, zu einem Fluorophor in einer Probe (6) reflektiert. Das emittierte Licht (10) von jeder der Proben (6) passiert durch den dichroitischen Spiegel (4) und einen Emissionsfilter (7) hin zu einem Detektor (8), der das emittierte Licht (10) detektiert. Das emittierte Licht (10) verläuft von jeder der Proben (6) nebeneinander durch den dichroitischen Spiegel (4) der beiden optischen Systeme und nur durch einen von beiden optischen Systemen gemeinsam genutzten Emissionsfilter (7) zu mindestens einem Detektor (8).
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Die 3A und B zeigen einen Schnitt durch die tragbare PCR-Vorrichtung (1), welche entlang des zweiten Schnittes (L2) geschnitten ist. 3B ist eine vergrößerte Ansicht von 3A, dargestellt durch den gestrichelten Rahmen in 3A. Es ist ein optisches System zum Erfassen von Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignalen von mindestens zwei Proben (6) dargestellt. Wie in der vergrößerten Ansicht (3B) dargestellt ist, ist nur ein Anregungsfilter (3) vor den zumindest zwei nebeneinander angeordneten Lichtquellen (2) eines jeden optischen Systems angeordnet, wobei der Anregungsfilter (3) die Anregungslichtstrahlen (9) jeder Lichtquelle (2) auf nur einen dichroitischen Spiegel (4) für jedes optische System überträgt, wobei der dichroitische Spiegel (4) die Anregungslichtstrahlen (9), die durch den Anregungsfilter (3) übertragen wurden, zu dem Fluorophor in jeder Probe (6) reflektiert, und wobei das emittierte Licht (10) von jeder der Proben (6) nebeneinander durch den dichroitischen Spiegel (4) der beiden optischen Systeme und nur durch einen von beiden optischen Systemen gemeinsam genutzten Emissionsfilter (7) zu mindestens einem Detektor (8) verläuft.
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Die 4A und B zeigen einen Zweifachschnitt durch die tragbare PCR-Vorrichtung (1), welche entlang des ersten und des zweiten Schnittes (L1, L2) geschnitten ist. 4B ist eine vergrößerte Ansicht des optischen Systems, dargestellt durch den gestrichelten Rahmen in 4A. Es ist ein optisches System zum Erfassen von Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignalen von mindestens zwei Proben (6) dargestellt. Wie in der vergrößerten Ansicht (4B) dargestellt ist, ist nur ein Anregungsfilter (3) vor den zumindest zwei nebeneinander angeordneten Lichtquellen (2) angeordnet, wobei dieser Anregungsfilter (3) die Anregungslichtstrahlen (9) einer jeden Lichtquelle (2) auf nur einen dichroitischen Spiegel (4) überträgt, wobei dieser dichroitische Spiegel (4) die von dem Anregungsfilter (3) übertragenen Anregungslichtstrahlen (9) zu dem Fluorophor in jeder Probe (6) reflektiert, und wobei das emittierte Licht (10) von jeder der Proben (6) nebeneinander durch den dichroitischen Spiegel (4) und durch nur einen gemeinsamen Emissionsfilter (7), zu mindestens einem Detektor (8) verläuft.
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Für die Herstellung des optischen Systems können viele Materialien (Linsen, Detektoren, Filter, ...) verwendet werden. Für ein hergestelltes System wurden blaue oder türkisene LEDs (bevorzugt Peakemissionswellenlänge zwischen 470 nm und 490 nm) als Lichtquelle (2) verwendet, deren Anregunglicht (9) von einem Excitor (3) (ET470/40x Chroma, Inc.) gefiltert wurde, welches daraufhin von dem dichroitischen Spiegel (4) (T495LP, Chroma, Inc.) reflektiert und auf die Probe von Interesse (6) durch eine GeltechTM asphärische Linse (5) aus geformten Glas mit einem Durchmesser von 6,35 mm, Brennweite 3,1 mm, und numerischer Apertur (NA) von 0,68 (Thorlabs, Inc.) fokussiert wurde, wodurch ein kreisförmiges Anregungslicht (9) gebildet wurde. Der dichroitische Spiegel weist vorzugsweise eine Abschirmung bei 505 nm auf. Auch ein Filter-Set, bestehend aus drei Filtern, nämlich Anregungsfilter, dichroitischer Spiegel und Detektionsfilter, wurde erfolgreich eingesetzt (Chroma Optische, Modell 49002). Das emittierte Licht (10) wurde durch eine zweite Linse gesammelt. Das emittierte Licht (10) wurde durch den dichroitischen Spiegel geleitet, von einem Emitter (7) (ET525/50 m) gefiltert und durch eine Silizium-Photodiode (8) (BPW21, Siemens, Inc.) gesammelt. Die Silizium-Photodioden-Diodensensitivitätsfläche betrug 7,34 mm2 mit einer Quantenausbeute von 0,8, was in einer optischen Empfindlichkeit von 10 nA lx21 (Nanoampere pro Lux) resultierte.
