CN106010954B - 新型微滴式数字pcr光学检测系统、装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种新型微滴式数字PCR光学检测系统、荧光检测装置及方法，新型微滴式数字PCR光学检测系统包括激发光光源模块、荧光接收检测模块以及样品传送模块。样品传送模块包括传送通道。激发光光源模块包括至少两个光源和第一光纤耦合器，第一光纤耦合器包括至少两个输入端，第一光纤耦合器的输入端与光源连接，荧光接收检测模块包括至少两个荧光探测器和第二光纤耦合器，第二光纤耦合器包括至少两个输出端，第二光纤耦合器的输出端与荧光探测器连接。第一光纤耦合器的输出端与第二光纤耦合器的输入端相对设置。本发明技术方案使新型微滴式数字PCR光学检测系统的光路结构简单，可降低不同荧光染料之间光谱重叠所产生的干扰。

Description

新型微滴式数字PCR光学检测系统、装置及方法

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，特别涉及一种新型微滴式数字PCR光学检测系统、荧光检测装置及新型微滴式数字PCR光学检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种体外扩增特定核酸的分子生物学技术，具有特异性强、灵敏度高、高效快捷、操作简单等突出优点，广泛的应用于核酸序列分析、微生物检测、疾病诊断等生命科学领域。传统的PCR分析技术具有一定的局限性和不精确性，而新兴发展起来的数字PCR技术能够实现核酸分子的绝对定量分析，具有高精确度、无需标准曲线等优势。近几年，数字PCR相关技术得到迅速发展。

数字PCR是将包含有引物、模板、荧光探针、聚合酶等组分的PCR反应体系分成了众多微小的、独立的反应单元，每个单元尽可能只包含一个或者没有核酸模板，经过PCR扩增反应后，对每个反应单元的荧光信号进行检测并统计分析，实现核酸的绝对定量分析。目前，根据反应单元形成的不同方式，主要有微反应室/孔板、微流控芯片和微滴式等三种数字PCR系统。微滴式数字PCR系统利用微滴发生器生成上万个纳升甚至皮升级别的油包水微反应单元，与其他两种数字PCR系统相比，微滴体积更小，通量更高，系统简单，成本较低，具有非常好的市场发展前景。

目前微滴式数字PCR的荧光检测系统主要由激发光源、传送通道、荧光探测器等几个模块组成。为了满足实际应用需求，通常会用到两种及以上的荧光染料，这就要求系统包含两种及以上的激发光源和相应的荧光探测器。通常，荧光的光谱比较宽，不同种荧光染料的激发光光谱和荧光光谱都会产生重叠，如何避免荧光探测时光谱重叠产生的干扰是一个难题。

目前大部分微滴式数字新型微滴式数字PCR光学检测系统，先对多种光源进行合束及整形，多束激发光同时照射微滴激发荧光，然后收集荧光并分束检测。然而如此会存在以下问题：这种光学系统结构复杂，抗扰动能力差，而且不同荧光染料之间光谱重叠所产生的干扰问题没得到很好的解决。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种新型微滴式数字PCR光学检测系统，旨在使其结构简单，能够适用不同染料，降低不同荧光染料之间光谱重叠所产生的干扰。

为实现上述目的，本发明提出的新型微滴式数字PCR光学检测系统，用于检测微滴样品，包括激发光光源模块、荧光接收检测模块以及样品传送模块；

所述样品传送模块包括传送所述微滴样品的传送通道；

所述激发光光源模块包括至少两个光源和第一光纤耦合器，所述第一光纤耦合器包括至少两个输入端，所述第一光纤耦合器的输入端与所述光源连接，所述第一光纤耦合器的输出端设于所述传送通道的一侧；

所述荧光接收检测模块包括至少两个荧光探测器和第二光纤耦合器，所述第二光纤耦合器包括至少两个输出端，所述第二光纤耦合器的输出端与所述荧光探测器连接，所述第二光纤耦合器的输入端设于所述传送通道的另一侧；

所述第一光纤耦合器的输出端与所述第二光纤耦合器的输入端相对设置，以形成检测空间。

可选地，所述新型微滴式数字PCR光学检测系统还包括控制模块，所述光源为脉冲光源，所述控制模块与激发光光源模块、荧光接收检测模块以及样品传送模块连接。

可选地，所述激发光光源模块还包括光源检测器，所述光源检测器与所述第一光纤耦合器相连接，且与所述控制模块电性连接。

可选地，所述第一光纤耦合器的输出端的光纤直径与所述传送通道的管径保持一致。

可选地，两个所述光源为第一光源和第二光源，两所述荧光探测器为第一荧光探测器和第二荧光探测器；

所述微滴样品中包括第一荧光探针和第二荧光探针，所述第一光源激发所述第一荧光探针，所述第一荧光探测器探测所述第一荧光探针产生的荧光信号；

所述第二光源激发所述第二荧光探针，所述第二荧光探测器探测所述第二荧光探针产生的荧光信号。

可选地，所述第一荧光探测器与所述第二光纤耦合器的一个输出端之间设有第一滤光片，所述第二荧光探测器与所述第二光纤耦合器的另一个输出端之间设有第二滤光片。

可选地，所述光源为激光光源或单色LED光源，所述光源为单色LED光源时，所述光源前设有窄带滤光片。

可选地，所述样品传送模块为微流控芯片，包括传送通道、微滴存储池以及流速控制系统；

所述控制模块与所述流速控制系统连接，用于控制所述流速控制系统的流速控制阀的开闭和所述微滴样品的流动速度。

本发明还提出一种荧光检测装置，包括新型微滴式数字PCR光学检测系统，该新型微滴式数字PCR光学检测系统包括激发光光源模块、荧光接收检测模块以及样品传送模块；

所述样品传送模块包括传送所述微滴样品的传送通道；

所述激发光光源模块包括至少两个光源和第一光纤耦合器，所述第一光纤耦合器包括至少两个输入端，所述第一光纤耦合器的输入端与所述光源连接，所述第一光纤耦合器的输出端设于所述传送通道的一侧；

所述荧光接收检测模块包括至少两个荧光探测器和第二光纤耦合器，所述第二光纤耦合器包括至少两个输出端，所述第二光纤耦合器的输出端与所述荧光探测器连接，所述第二光纤耦合器的输入端设于所述传送通道的另一侧；

所述第一光纤耦合器的输出端与所述第二光纤耦合器的输入端相对设置，以形成检测空间。

本发明还提出一种新型微滴式数字PCR光学检测方法，包括：激发光光源模块的第一光源发出激发光至第一光纤耦合器后，照射到传送通道中的微滴样品；

所述微滴样品中的第一荧光探针经激发后产生的荧光信号，该荧光信号经第二光纤耦合器后，传送到第一荧光探测器中；

在脉冲时间内，所述激发光光源模块的第二光源发出激发光至第一光纤耦合器后，照射到传送通道中的微滴样品；

所述微滴样品的第二荧光探针经激发后产生的荧光信号，该荧光信号经第二光纤耦合器后，传送到第二荧光探测器中。

本发明技术方案通过采用光纤耦合和光纤探测技术，采用了时分复用的光纤传输方法，使整套光学系统的结构便于调整，提高了抗扰动能力，降低了生产成本，同时不同荧光染料的荧光激发和检测分时进行，避免了多种荧光染料激发光和荧光之间光谱重叠所产生的干扰。

在使用时，样品传送模块传送微滴样品，微滴样品在传送通道传送时，经过检测空间。此时，激发光光源模块的一个光源发出探测激光，经过第一光纤耦合器后，在第一光纤耦合器的输出端输出后，照射到微滴样品上，微滴样品中的荧光染料被激发，荧光信号经过第二光纤耦合器的输入端进入，传送到相应的荧光探测器中，该荧光探测器将收集到的荧光信号转化为数字信号，记录分析微滴荧光数据。然后，激发光光源模块的另一个光源发出探测激光，经过第一光纤耦合器后，在第一光纤耦合器的输出端输出后，照射到微滴样品上，微滴样品中的荧光染料被激发，荧光信号经过第二光纤耦合器的输入端进入，传送到另一相应的荧光探测器中，该荧光探测器将收集到的荧光信号转化为数字信号，记录分析微滴荧光数据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明新型微滴式数字PCR光学检测系统一实施例的示意图。

附图标号说明：

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。

另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

本发明提出一种新型微滴式数字PCR光学检测系统100，用于检测微滴样品40中目标核酸的浓度。

参照图1，图1为本发明新型微滴式数字PCR光学检测系统一实施例的示意图。

在本发明实施例中，如图1所示，该新型微滴式数字PCR光学检测系统100包括激发光光源模块10、荧光接收检测模块20、以及样品传送模块(未标示)；

样品传送模块包括传送微滴样品40的传送通道31；

激发光光源模块10包括至少两个光源(11，12)和第一光纤耦合器13，第一光纤耦合器13包括至少两个输入端131，所述第一光纤耦合器13的输入端131与光源连接，第一光纤耦合器13的输出端132设于传送通道31的一侧；

荧光接收检测模块20包括至少两个荧光探测器(21，22)和第二光纤耦合器23，第二光纤耦合器23的两输出端232与两荧光探测器连接，第二光纤耦合器23的输入端231设于传送通道31的另一侧；

第一光纤耦合器13的输出端132与第二光纤耦合器23的输入端231相对设置，以形成检测空间。

其中，光源和荧光探测器是一一对应的关系(如，第一光源11对应第一荧光探测器21，第二光源12对应第二荧光探测器22)。第一光纤耦合器13的输入端131的数量与光源的数量保持一致，第二光纤耦合器23的输出端231的数量与荧光探测器的数量保持一致。

在使用时，样品传送模块传送微滴样品40，微滴样品40在传送通道31传送时，经过检测空间。此时，激发光光源模块10的一个光源发出探测激光，经过第一光纤耦合器13后，在第一光纤耦合器13的输出端132输出后，照射到微滴样品40上，微滴样品40中的荧光染料被激发后产生荧光信号，该荧光信号经过第二光纤耦合器23的输入端231进入，传送到相应的荧光探测器中，该荧光探测器将收集到的荧光信号转化为数字信号。然后在预设时间内(该预设时间满足两光源发出的探测激光均能照射到微滴样品40上，也即采用时分复用的方式进行光源的探测激光的发射)，激发光光源模块10的另一个光源发出探测激光，经过第一光纤耦合器13后，在第一光纤耦合器13的输出端132输出后，照射到微滴样品40上，微滴样品40中的荧光染料被激发后产生荧光信号，该荧光信号经过第二光纤耦合器23的输入端231进入，传送到另一相应的荧光探测器中，该荧光探测器将收集到的荧光信号转化为数字信号。

本发明技术方案通过采用光纤耦合和光纤探测技术，采用了时分复用的光纤传输方法，使整套光学系统的结构便于调整，提高了抗扰动能力，降低了生产成本；同时不同荧光染料的荧光激发和检测分时进行，避免了多种荧光染料激发光和荧光之间光谱重叠所产生的干扰。

可以理解的是，第一光纤耦合器13的输入端131和第二光纤耦合器23的输出端232的个数可随实际情况设定。光源的数目与第一光纤耦合器13的输入端131数目保持一致，荧光探测器的数目与第二光纤耦合器23的输出端232数目保持一致。微滴样品40可采用一种荧光染料，也可以包含两种荧光染料，荧光探测器的检测荧光信号的波长与对应的荧光染料相匹配。

在本实施例中，所述新型微滴式数字PCR光学检测系统100还包括控制模块(未图示)，所述控制模块与激发光光源模块10、荧光接收检测模块20以及样品传送模块连接。

控制模块能够根据样品传送模块统计的微滴样品40数量以及荧光检测模块检测到的数字信号进行运算而得到目标核酸的浓度，同时控制模块可控制激发光光源模块10的光源发出的探测激光的间隔时间。

进一步地，参照图1，激发光光源模块10还包括光源检测器14，光源检测器14与第一光纤耦合器13连接，且与控制模块电性连接。光源检测器14用于监控光源的强度变化，将收集到的信息发送到控制模块，由控制模块反馈调节光源的强度，使其保持稳定。同时，控制模块还将控制调节光源的脉冲频率，微滴样品40的流速以及荧光检测器的电子快门，使它们保持同步协调，实现时分复用的功能。

在本实施例中，第一光纤耦合器13的输出端132的光纤直径与所述传送通道31的管径保持一致。如此，可避免激发光同时照射两个微滴，同时可避免探测激光直接射入到第二光纤耦合器23的输入端231，产生杂光，干扰荧光探测器的检测。

进一步的，第一光纤耦合器13的输出端132的光纤的光轴与第二光纤耦合器23的输入端231的光纤的光轴偏离一个小角度(约为3°)，避开透过微滴样品40的入射光。

参照图1，具体地，两光源为第一光源11和第二光源12，两荧光探测器为第一荧光探测器21和第二荧光探测器22；

微滴样品40中包括第一荧光探针和第二荧光探针，第一光源11激发所述第一荧光探针，第一荧光探测器21探测第一荧光探针产生的荧光信号；

第二光源12激发第二荧光探针，第二荧光探测器22探测第二荧光探针产生的荧光信号。

荧光探测器可采用光电倍增管PMT。该第一荧光探针为FAM染料，第二荧光探针为VIC染料。第一荧光探测器21和第二荧光探测器22分别对应第一光源11和第二光源12。第一荧光探测器21检测FAM染料发出的荧光信号，第二荧光探测器22检测VIC染料发出的荧光信号。

可以理解的是，第一光源11、第一荧光探测器21以及第二光源12、第二荧光探测器22可根据实际检测的荧光染料调换，荧光染料也可根据第一光源11和第二光源12的波长范围进行替换。

参照图1，第一荧光探测器21与第二光纤耦合器23的一个输出端232之间设有第一滤光片211，第二荧光探测器22与所述第二光纤耦合器23的另一个输出端232之间设有第二滤光片221。如此，第一滤光片211和第二滤光片221的设置可以避免激发光的干扰，使得第一荧光探测器21和第二荧光探测器22的测量更为精确。

进一步地，所述光源为激光光源或单色LED光源，所述光源为单色LED光源时，所述光源前设有窄带滤光片。

所述光源发出的探测光均进行准直处理，采用单色LED光源时，设置窄带滤光片能够最大限度的接近染料最佳激发波长，同时避免光源对探测的荧光干扰。

进一步的，样品传送模块为微流控芯片，包括微滴传送通道31、微滴存储池32以及流速控制系统；控制模块与流速控制系统连接，用于控制流速控制系统的流速控制阀33的开闭和微滴样品40的流动速度。

在本发明中，每一微滴样品40依次流经检测空间，微滴样品40的流速和脉冲的频率一致。如此，微滴样品40的流动速度和大小都精确可调，使得测量更加精准。

本发明还提出一种新型微滴式数字PCR光学检测方法，包括：

激发光光源模块10的第一光源11发出激发光至第一光纤耦合器13后，照射到传送通道31中的微滴样品40；

所述微滴样品40中的第一荧光探针经激发后产生的荧光信号，该荧光信号经第二光纤耦合器23后，传送到第一荧光探测器21中；

在脉冲时间内，所述激发光光源模块10的第二光源12发出激发光至第一光纤耦合器13后，照射到传送通道中的微滴样品40；

所述微滴样品40的第二荧光探针经激发后产生的荧光信号，该荧光信号经第二光纤耦合器23后，传送到第二荧光探测器22中。

本方法通过采用光纤耦合和光纤探测技术，采用了时分复用的光纤传输方法，使整套光学系统的结构便于调整，提高了抗扰动能力，降低了生产成本，同时不同荧光染料的荧光激发和检测分时进行，避免了多种荧光染料激发光和荧光之间光谱重叠所产生的干扰。

本发明还提出一种荧光检测装置(未图示)，该荧光检测装置包括新型微滴式数字PCR光学检测系统100，该新型微滴式数字PCR光学检测系统100参照上述实施例，由于本荧光检测装置采用了上述所有实施例的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种新型微滴式数字PCR光学检测系统，用于检测微滴样品，其特征在于，包括激发光光源模块、荧光接收检测模块以及样品传送模块；

所述样品传送模块包括传送所述微滴样品的传送通道；

所述激发光光源模块包括至少两个光源和第一光纤耦合器，所述第一光纤耦合器包括至少两个输入端，所述第一光纤耦合器的输入端与所述光源连接，所述第一光纤耦合器的输出端设于所述传送通道的一侧；

所述荧光接收检测模块包括至少两个荧光探测器和第二光纤耦合器，所述第二光纤耦合器包括至少两个输出端，所述第二光纤耦合器的输出端与所述荧光探测器连接，所述第二光纤耦合器的输入端设于所述传送通道的另一侧；

所述第一光纤耦合器的输出端与所述第二光纤耦合器的输入端相对设置，以形成检测空间。

2.如权利要求1所述的新型微滴式数字PCR光学检测系统，其特征在于，所述新型微滴式数字PCR光学检测系统还包括控制模块，所述光源为脉冲光源，所述控制模块与激发光光源模块、荧光接收检测模块以及样品传送模块连接。

3.如权利要求2所述的新型微滴式数字PCR光学检测系统，其特征在于，所述激发光光源模块还包括光源检测器，所述光源检测器与所述第一光纤耦合器相连接，且与所述控制模块电性连接。

4.如权利要求1至3中任意一项所述的新型微滴式数字PCR光学检测系统，其特征在于，所述第一光纤耦合器的输出端的光纤直径与所述传送通道的管径保持一致。

5.如权利要求4所述的新型微滴式数字PCR光学检测系统，其特征在于，两个所述光源为第一光源和第二光源，两所述荧光探测器为第一荧光探测器和第二荧光探测器；

所述微滴样品中包括第一荧光探针和第二荧光探针，所述第一光源激发所述第一荧光探针，所述第一荧光探测器探测所述第一荧光探针产生的荧光信号；

所述第二光源激发所述第二荧光探针，所述第二荧光探测器探测所述第二荧光探针产生的荧光信号。

6.如权利要求5所述的新型微滴式数字PCR光学检测系统，其特征在于，所述第一荧光探测器与所述第二光纤耦合器的一个输出端之间设有第一滤光片，所述第二荧光探测器与所述第二光纤耦合器的另一个输出端之间设有第二滤光片。

7.如权利要求5所述的新型微滴式数字PCR光学检测系统，其特征在于，所述光源为激光光源或单色LED光源，所述光源为单色LED光源时，所述光源前设有窄带滤光片。

8.如权利要求2所述的新型微滴式数字PCR光学检测系统，其特征在于，所述样品传送模块为微流控芯片，包括传送通道、微滴存储池以及流速控制系统；

所述控制模块与所述流速控制系统连接，用于控制所述流速控制系统的流速控制阀的开闭和所述微滴样品的流动速度。

9.一种荧光检测装置，其特征在于，包括如权利要求1至8任一所述的新型微滴式数字PCR光学检测系统。

10.一种新型微滴式数字PCR光学检测方法，其特征在于，包括：

激发光光源模块的第一光源发出激发光至第一光纤耦合器后，照射到传送通道中的微滴样品；

所述微滴样品中的第一荧光探针经激发后产生的荧光信号，该荧光信号经第二光纤耦合器后，传送到第一荧光探测器中；

在脉冲时间内，所述激发光光源模块的第二光源发出激发光至第一光纤耦合器后，照射到传送通道中的微滴样品；

所述微滴样品的第二荧光探针经激发后产生的荧光信号，该荧光信号经第二光纤耦合器后，传送到第二荧光探测器中。