CN115901702B - 一种数字微滴定量检测系统及检测方法、介质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及数字微滴定量检测系统及检测方法、设备、介质，该系统包括激发光路和荧光收集光路；激发光路用于生成多通道激光信号并将生成的多通道激光信号聚焦在微流控芯片的微滴检测流道中的待测微滴上；荧光收集光路用于收集微流控芯片的微滴检测流道中的待测微滴上的荧光信号，将收集的荧光信号压缩成光斑被探测器的靶面收集。本发明在荧光收集光路的背侧增加反射元件，能提高荧光收集的效率，通过激发光路和荧光收集光路位置布局设计，有效降低了激发光进入荧光收集光路的比例。采用分光光路，提高了光学模块的集成性。采用光纤光路，光路可自由放置，且能有效提高实现激光激发和荧光收集。采用多通道激光调制技术解决了荧光串扰问题。

Description

一种数字微滴定量检测系统及检测方法、介质

技术领域

本发明涉及数字体外诊断技术领域，特别涉及一种数字微滴定量检测系统及检测方法、介质。

背景技术

随着数字PCR技术的不断成熟，基于泊松分布的统计学原理的绝对定量检测技术在不同应用领域越来越广泛。具体的应用有数字Elisa、数字RPA、数字lamp等，涉及免疫、核酸等不同领域。通过统计学原理，可进一步提高不同检测方法的检测下限和灵敏度，有助于提高精准诊疗技术的发展。

采用微滴作为样品数字化的载体，容易操作实现，且具有很强的可控性和可调性。在进行样品数字化过程中，将样品和反应物均分至数万个微滴中，之后在每个微滴的独立空间内实现样品的反应，再针对每个微滴进行荧光信号的检测。最终通过微滴尺寸、阳性微滴数量、阴性微滴数量计算出原始样品的浓度值。

现有的数字检测中针对微滴检测的方法主要有两种：通过流式荧光检测和相机扫描成像的方式。采用流式荧光检测技术直接检测微滴的信号，具有更好的信噪比。采用相机扫描成像的方式，通过小图像成像、图像拼接、图像矫正、微滴识别等一系列算法处理，非直接获得微滴信号，对于系统装置要求较为严格且需要经常矫正。针对检测方式，相比而言采用流式荧光检测的效果更优。但目前流式荧光检测技术均采用半自动方式，如申请号为CN201610806095.5和申请号为CA2767113A的专利分别描述了微滴数字和微滴检测，其中申请号为CA2767113A的专利中基于毛细管的微滴检测流道进行说明，其所描述的光路系统均为异侧光路实施方式，光路的集成较差，不便于检测系统集成。申请号为CN201480045546.7的专利中公开了一种集成式微流控的微滴生成和反应芯片，但是微滴检测还需要通过吸样针转移出专门的检测系统中进行测试。申请号为CN202210771245.9和申请号为CN202110407419.9的专利中采用微流控技术与微阀装置描述了一种全封闭的微滴生成、扩增和检测技术。

采用微流控芯片方式容易实现全封闭的数字诊断，针对微滴信号的检测而言，微流控芯片大多为多层板式形状，芯片上的流道通常为方形流道，相较于采用毛细管等圆形材质流道，微流控芯片的荧光激发和探测在空间上只有两个方位可以放置，对于光学检测的要求更为苛刻。

发明内容

为了实现根据本发明的上述目的和其他优点，本发明的第一目的是提供一种数字微滴定量检测系统，包括激发光路和荧光收集光路；其中，

所述激发光路用于生成多通道激光信号并将生成的多通道激光信号聚焦在微流控芯片的微滴检测流道中的待测微滴上；

所述荧光收集光路用于收集所述微流控芯片的微滴检测流道中的待测微滴上的荧光信号，将收集的荧光信号压缩成光斑被探测器的靶面收集。

进一步地，还包括反射元件，所述反射元件置于所述微流控芯片的微滴检测流道的外侧。

进一步地，所述激发光路和所述荧光收集光路为同侧光路。

进一步地，所述激发光路包括激发光路底座、多通道激光光路，所述激光光路包括激发光源、反射镜和激光二色镜，所述激发光源、所述反射镜和所述激光二色镜放置在所述激发光路底座上，所述激发光源发射的激光信号照射到所述反射镜或所述激光二色镜上，所述反射镜和所述激光二色镜反射的激光信号聚焦到微流控芯片的微滴检测流道中的待测微滴上。

进一步地，所述激光光路还包括多个准直镜、多个光阑，所述激发光源发射的激光信号经所述准直镜进行光束准直，所述准直镜准直后光束经所述光阑照射到所述反射镜或所述激光二色镜上；

所述激发光路还包括激光聚焦镜，经所述反射镜和所述激光二色镜合束后的激光信号经过所述激光聚焦镜压缩成高密度光斑，且其束腰位置处于微滴的中部。

进一步地，所述荧光收集光路包括荧光光路底座、荧光光路，所述荧光光路包括滤光片和探测器，荧光信号经过滤光片后被探测器收集。

进一步地，所述荧光光路还包括第一荧光二色镜、荧光聚焦透镜，待测微滴的荧光信号经过第一荧光二色镜将不同通道的荧光信号进行分光，然后经过所述荧光聚焦透镜压缩成光斑并被所述探测器的靶面收集。

进一步地，所述荧光收集光路还包括荧光收集透镜、滤激光二色镜，所述荧光收集透镜收集到待测微滴的荧光信号进行准直处理，然后经过所述滤激光二色镜进行过滤。

进一步地，所述荧光光路还包括第二荧光二色镜，经所述滤激光二色镜过滤的信号经过所述第二荧光二色镜过滤最低波长的激光信号；经所述第一荧光二色镜分光后的荧光信号通过所述滤光片进行过滤。

进一步地，还包括前向探测器，所述前向探测器用于识别所述微流控芯片的微滴检测流道中的待测微滴的物理特征。

进一步地，多通道激光光路为平行光路；多通道荧光光路为平行光路或等长的光路。

进一步地，还包括分束镜和聚焦透镜，所述分束镜用于激光光束和荧光光路的同轴合束和分光，所述聚焦透镜用于对多通道激光光路合束的激光光束的光斑进行压缩，同时对待测微滴向空间中发出的荧光信号进行收集并准直成荧光光束。

进一步地，还包括光纤和聚焦透镜，所述激光光路和所述荧光光路分别与所述光纤对应的接口连接，经过所述光纤合束的激光信号经过聚焦透镜压缩后聚焦在待测微滴上，待测微滴的荧光信号通过所述聚焦透镜准直后被光纤收集。

进一步地，若干所述激光光路和若干所述荧光光路组成若干同轴光路。

本发明的第二目的是提供一种数字微滴定量检测系统的检测方法，包括以下步骤：

设置每个周期内的多通道激发光源的调制信号的时序；

按照设置的激发光源的调制信号的时序点亮激发光源；

在激发光源点亮的时间内通过对应的探测器采集荧光信号；

通过每个激发光源的调制信号的时序进行荧光信号的分解。

进一步地，当所述调制信号为数字脉冲信号时，根据激发光源的波长，设置每个周期内的多通道激发光源的调制信号的占空比；

将设置的激发光源调制信号的占空比同步至对应的探测器；

按照设置的激发光源调制信号的占空比点亮激发光源；

在激发光源点亮的时间内通过对应的探测器采集荧光信号。

进一步地，当所述调制信号为TTL电平信号时，固定单位时间周期，设置所述单位时间周期内的多通道激发光源的调制信号的时间；

在所述单位时间周期内按照设置的时间逐个点亮每个激发光源；

对应的探测器在激发光源点亮的时间内获得荧光信号；

结合各个激发光源的调制信号的时序，进行荧光信号的分解，并从中剥离出各个通道的荧光信号值。

进一步地，还包括以下步骤：

将非相邻荧光通道对应的激发光源的调制信号在同一个周期内进行组合激发。

进一步地，还包括以下步骤：

将所述激光光路和所述荧光光路组成的同轴光路中的激发光源的调制信号在同一个周期内组合激发。

本发明的第三目的是提供一种数字微滴定量检测系统的检测方法，包括以下步骤：

采用不同频率的调制信号调制不同波长的激发光源；

激发光源发射的激光信号通过光纤合并，分别激发待测微滴中的荧光基团，得到不同波长的荧光信号；

通过探测器接收荧光信号；

通过接收到的荧光信号的频谱特性将荧光信号分离；

通过对分离出的荧光信号进行解调，分离出串扰信号。

本发明的第四目的是提供一种计算机可读存储介质，其上存储有程序指令，所述程序指令被执行时实现一种数字微滴定量检测系统的检测方法。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种以微流控芯片为载体的微滴信号检测系统及方法，基于微流控芯片的微滴检测流道的微滴荧光探测，在荧光收集光路的背侧增加反射元件，能进一步提高荧光收集的效率。

通过激发光路和荧光收集光路位置布局设计，能有效降低激发光进入荧光收集光路的比例，进一步提高信噪比。

采用分束镜分光光路，通过提高激发光的能量，使用20-40％反射60-80％投射的胶合分束镜，实现激发光路和荧光收集光路的同轴合束和分光，同轴光路可大幅提高光学模块的集成性。

采用Y型光纤，将激发光路和荧光收集光路用同一根光纤激发与收集，激发光路和荧光收集光路结构的位置布置上将不受限制，可自由放置，同时通过光纤设计，可有效提高实现激光激发和荧光收集。双光纤方案也有类似效果。

采用多通道激光调制技术，并给出3种不同的实施方式：单周期内，多通道激光依次点亮；单周期内多通道激光非均匀时长点亮；按照光谱进行组合，并按组合进行控制。

采用延时整合技术方案，保证微滴检测效果的同时，大幅度降低光路设计难度。

基于激光调制技术和多通道滤光片技术，提出采用单个探测器实现多重荧光信号的检测，通过信号处理实现控制信号和荧光信号的对齐和分离。

通过频分复用技术，采用调制技术实现微滴信号的识别和筛选。

基于数字微滴技术，将流式荧光应用到不同的技术领域中，可实现多种指标多重的数字检测。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为数字核酸检测流程图；

图2为数字免疫检测流程图；

图3为微滴检测芯片示意图；

图4为实施例1的数字微滴定量检测系统的光路原理图；

图5为实施例1的带有反射元件的光路原理图；

图6为实施例1的激发光路和荧光收集光路示意图；

图7为实施例1的不同通道等长荧光光路示意图；

图8为实施例1的采用分束镜的激发光路和荧光收集光路示意图；

图9为实施例1的采用Y型光纤的激发光路和荧光收集光路示意图；

图10为实施例1的合束的激光光纤芯内部示意图；

图11为实施例1的采用双光纤的激发光路和荧光收集光路示意图；

图12为实施例1的采用双同轴光路的激发光路和荧光收集光路示意图；

图13为实施例1的采用单探测器的激发光路和荧光收集光路示意图；

图14为实施例2的数字微滴定量检测系统的检测方法的均分周期示意图；

图15为实施例2的数字微滴定量检测系统的检测方法的非均分周期示意图；

图16为实施例2的数字微滴定量检测系统的检测方法的调制信号组合示意图；

图17为实施例2的双同轴光路的荧光信号示意图；

图18为实施例2的单个荧光信号的调制曲线拟合示意图；

图19为实施例2的采用TTL电平调制，时间片段周期示意图；

图20为实施例2的多通道荧光信号值示意图；

图21为实施例3的激发谱存在重叠时的频分复用原理图；

图22为实施例3的激发谱不存在重叠时的频分复用原理图；

图23为实施例3的某一探测器探测到的在激光器常亮情况下，微滴运动过程中的荧光信号波形图；

图24为实施例3的激光器1的调制信号示意图；

图25为实施例3的激光器2的调制信号示意图；

图26为实施例3的激光器调制情况下，荧光光信号波形图；

图27为实施例3的荧光光信号频谱图；

图28为实施例3的激光器1的荧光调制信号示意图；

图29为实施例3的激光器2的荧光调制信号示意图；

图30为实施例3的激光器1的荧光原始信号示意图；

图31为实施例3的激光器2的荧光原始信号示意图；

图32为实施例3的采用SPWM法进行信号调制示意图；

图33为实施例4的计算机可读存储介质示意图。

图中：1、微流控芯片；11、微滴分割流道；12、待检测的微滴流道；2、微滴检测流道；21、微滴检测流道上壁；22、微滴检测流道下壁；3、荧光收集光路；31、荧光光路底座；32、第一荧光二色镜；33、荧光聚焦透镜；34、探测器；35、荧光滤光片；36、第二荧光二色镜；37、滤激光二色镜；38、荧光收集透镜；39、荧光光束；310、多通道滤光片；4、微滴分割液；5、待测微滴；51、第一位置的待测微滴；52、第二位置的待测微滴；16、激发光路；61、激发光路底座；62、激发光源；63、准直镜；64、光阑；65、反射镜；66、激光二色镜；67、激光聚焦镜；68、激光光束；7、反射元件；8、前向探测器；9、分束镜；10、Y型光纤；101、光纤微滴近端接口；1011、激光光纤芯；1012、荧光收集光纤芯；102、光纤荧光接口；103、光纤激发光接口；13、合束荧光光纤；14、合束激光光纤；15、聚焦透镜；151、第一双路同轴光路聚焦透镜；152、第二双路同轴光路聚焦透镜；16、双路同轴光路；161、第一光源；162、第二光源；163、第一多带通二色镜；164、第一探测器；165、第二探测器；166、第三探测器；167、第四探测器；168、第二多带通二色镜；169、第三光源；1610、第四光源。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

如图1所示，数字微滴检测的基本流程包括样品准备，数字化微滴生成，微滴扩增或微滴反应，微滴检测和数据分析等环节。以数字核酸检测为例，样品准备包括将核酸样品、引物、探针、扩增用的预混液、水等按照特定比例混合好以后，放在微滴生成孔的位置，并采用剪切流的方式或其他微滴生成方式，实现将样品分割成数万个微滴。然后在每个微滴中进行复制反应实现核酸的放大。进而，通过流体系统进行微滴的逐个分隔，每个微滴分隔开以后进行微滴荧光信号的检测。最后对每个微滴的荧光信号进行处理，并根据统计学方法最终计算出原始样品的浓度值。

如图2所示，以单分子免疫为例进行说明，进行样品准备后，通过一步法或两步法实现微球带荧光标记后，采用微滴分割方式将微球分割到不同的微滴中，之后将微滴依次经过光学检测区域实现每个微球的荧光信号的识别，最终通过泊松分布计算浓度值。

关于样品反应、微滴生成和微滴扩增部分，不同的技术路线众多，不作为本实施例的重点描述。本实施例中主要基于微流控芯片1的微滴检测和数据分析部分进行说明。其中，微流控芯片1如图3所示，微流控芯片1内设有微滴分割流道11，待检测的微滴流道12内充满微滴，采用微流控芯片1十字结构对微滴检测流道2中的微滴进行检测，应当理解的是，对于微滴分隔方式不局限于十字剪切流，可以是其他形式，如Y型、T型和复合流道结构。

实施例1

微滴检测光路是数字微滴检测的重点，不同的检测方法中，微滴的尺寸差异较大，一般数字核酸检测的微滴尺寸为90-120微米，数字免疫的微滴大小为10-30微米。为实现微滴荧光的激发，通常采用高密度光斑进行荧光激发，采用高NA的荧光收集透镜38对激发出的荧光进行信号收集，微滴光斑尺寸通常是微滴尺寸的0.1倍-2倍范围，光斑最大尺寸不可同时覆盖2个微滴大小。

一种数字微滴定量检测系统，如图4所示，包括激发光路16和荧光收集光路3；其中，

微滴检测流道2内充满微滴分割液4，激发光路16用于生成多通道激光信号并将生成的多通道激光信号聚焦在微流控芯片1的微滴检测流道2中的待测微滴5上；

荧光收集光路3用于收集微流控芯片1的微滴检测流道2中的待测微滴5上的荧光信号，将收集的荧光信号压缩成光斑被探测器34的靶面收集。

本实施例中，激发光路16和荧光收集光路3为同侧光路。即整体光路位于芯片的上方或下方，可最大程度提高光路的集成效果，便于检测系统集成。应当理解的是，所描述的几种光路实现原理中不局限于同侧光路，对应不同部件在异侧光路中也可以实现。

如图5所示，还包括反射元件7，反射元件7置于微流控芯片1的微滴检测流道2的外侧，如微滴检测流道上壁21或微滴检测流道下壁22。其中，反射元件7可以是反射镜如半球镜、平面镜等，或具有反射功能的材料和涂层，也可以是具有激光信号波段通过荧光信号反射的镜片。本实施例中，反射元件7置于微滴检测流道上壁21的外侧，可以将更多的荧光信号向下反射，增加荧光收集的信号的能量。激发信号的激光带有方向性，经过反射层反射后有固定的角度，通过荧光收集光路3的位置的选择可有效降低反射的激光信号进入到荧光收集光路3中。而荧光信号是朝整个空间中漫反射，相对更易于收集。

数字微滴检测常用的荧光通道包括ATTO425、FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5、Cy5.5和Cy7，不同的荧光染料具有不同的激发波长和荧光收集波长范围，通过对照不同染料的光谱图可快速进行选择。以下的光路中，以四通道光路进行光路原理说明，应当理解的是，并不对光路通道具体的数量进行限定。

采用的激发光源62可以是LED、LD和封装准直好的固体激光器，探测器34可以是PMT、APD、MPPC和阵列PMT等。

如图6所示，激发光路16包括激发光路底座61、多通道激光光路，图6中多通道激光光路为平行光路。激光光路包括激发光源62、反射镜65和激光二色镜66，激发光源62、反射镜65和激光二色镜66放置在激发光路底座61上，激发光源62发射的激光信号照射到反射镜65或激光二色镜66上，图6中，最后一个激光光路中采用反射镜65，其余激光光路中采用激光二色镜66。反射镜65和激光二色镜66反射的激光信号聚焦到微流控芯片1的微滴检测流道2中的待测微滴5上。

为了对实际的光束质量进行调整，激光光路还包括多个准直镜63、多个光阑64，激发光源62发射的激光信号经准直镜63进行光束准直，准直镜63准直后光束经光阑64照射到反射镜65或激光二色镜66上；

当激发光路16和荧光收集光路3分别采用聚焦镜形成合束光路时，激发光路16还包括激光聚焦镜67，经反射镜65和激光二色镜66合束后的激光信号经过激光聚焦镜67压缩成高密度光斑，且其束腰位置处于微滴的中部。

四个激发光源62通过准直镜63进行光束准直成接近平行光，后经过光阑64过滤掉杂光，之后通过多个不同波长的激光二色镜66实现激光平行合束，之后合束的激光经过激光聚焦透镜15压缩成高密度光斑，并保证束腰位置处于微滴的中部。若光源为LED，则在准直光路后需要增加激光滤光片。

荧光收集光路3包括荧光光路底座31、荧光光路，荧光光路包括滤光片和探测器34，荧光信号经过滤光片后被探测器34收集。

当荧光光路为多通道荧光光路时，如图6所示，多通道荧光光路可以为平行光路。

当采用单个探测器34实现荧光信号的采集时，如图13所示，滤光片为多通道滤光片310，激光光束68和荧光光束39可以通过光纤或分束镜分光等其他形式实现。

当荧光光路采用多探测器34时，荧光光路还包括第一荧光二色镜32、荧光聚焦透镜33，待测微滴5的荧光信号经过第一荧光二色镜32将不同通道的荧光信号进行分光，然后经过荧光聚焦透镜33压缩成光斑并被探测器34的靶面收集。

当激发光路16和荧光收集光路3分别采用聚焦镜形成合束光路时，荧光收集光路3还包括荧光收集透镜38、滤激光二色镜37，荧光收集透镜38收集到待测微滴5的荧光信号进行准直处理，然后经过滤激光二色镜37进行过滤。

为了对最低波长的激发光进行过滤，荧光光路还包括第二荧光二色镜36，经滤激光二色镜37过滤的信号经过第二荧光二色镜36过滤最低波长的激光信号；经第一荧光二色镜32分光后的荧光信号通过荧光滤光片35进行过滤。

荧光收集透镜38收集到微滴的荧光信号进行准直处理，准直后的荧光经过滤激光二色镜37、第二荧光二色镜36、第一荧光二色镜32，将不同通道的荧光进行分光，分光后的荧光通过荧光滤光片35过滤后，经过荧光聚焦透镜33压缩成小光斑并精准被探测器34的靶面收集。

多通道荧光光路还可以是等长的光路。如图7所示，为实现不同通道荧光光路的等长，也可以考虑将荧光光路进行两路分离后，再进行分光过滤收光。

为了对微滴物理特征的识别，方便后续数据处理过程中进行数据筛选。还包括前向探测器8，前向探测器8用于识别微流控芯片1的微滴检测流道2中的待测微滴5的物理特征。

如图8所示，还包括分束镜9和聚焦透镜15，分束镜9用于激光光束68和荧光光路的同轴合束和分光，聚焦透镜15用于对多通道激光光路合束的激光光束68的光斑进行压缩，同时对待测微滴5向空间中发出的荧光信号进行收集并准直成荧光光束39。其中，聚焦透镜15可采用高NA透镜，有效提高光路光学的利用率，弥补分束镜9简化光路带来的损失。本实施例中，分束镜9选择20-40％反射60-80％透射的分束镜，20％-40％的激光有效激发光效率通过提高激发光的功率来实现，提高激发光的功率，同时60-80％的荧光也可以满足使用要求，可通过提高聚焦透镜15的NA和提高探测器34的灵敏度或增加进行弥补。

如图9所示，还包括光纤和聚焦透镜15，图9中光纤为Y型光纤10，激光光路与光纤激发光接口103连接，荧光收集光路与光纤荧光接口102连接，经过光纤合束的激光信号经过聚焦透镜15压缩后聚焦在待测微滴5上，待测微滴5的荧光信号通过聚焦透镜15准直后被光纤收集。

如图10所示，荧光收集的光纤芯可以有1-32根，甚至更多，实现有效的荧光信号的收集。合束的激光光纤芯1011可以是1根，也可以是由几根光纤芯组成。

通过Y型光纤10，柔性地将激发光路16和荧光收集光路3独立地合束，光纤芯中间为激发光路16，光纤芯周围为荧光收集光纤芯1012，为提高收集效率，荧光收集光纤芯1012也可以是2层及以上。微滴的荧光信号通过高NA的聚焦透镜15实现准直后被光纤收集，实现高效收集。同样合束的激发光从光纤微滴近端接口101经过聚焦透镜15压缩后，也可以高效聚焦在微滴上。

光纤还可以采用双光纤，如图11所示，荧光收集光路与合束荧光光纤13连接，激光光路与合束激光光纤14连接。

如图12所示，若干激光光路和若干荧光光路组成若干同轴光路，采用双同轴光路，分别对第一位置的待测微滴51和第二位置的待测微滴52进行检测。同轴光路的光分别被第一双路同轴光路聚焦透镜151、第二双路同轴光路聚焦透镜152聚焦。同样合束的激发光从光纤微滴近端接口101经过聚焦透镜15压缩后，也可以高效聚焦在微滴上。第一光源161和第二光源162为非相邻荧光通道对应的激发光源62，第三光源169和第四光源1610为非相邻荧光通道对应的激发光源62，第一光源161对应第一探测器164，第二光源162对应第二探测器165，第三光源169对应第三探测器166，第四光源1610对应第四探测器167，第一多带通二色镜163可通过两个通道的荧光，但需要反射第二光源162的波长，第二多带通二色镜168可通过两个通道的荧光，但需要反射第三光源169的波长。

实施例2

常用的荧光通道按波长从小到大排列依次为ATTO425、FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5、Cy5.5和Cy7等，当然中间的荧光通道如cy3、德克萨斯红等其他只要可制备对应探针的染料或者其他复合染料都可以。对应合适的激发波长大约分别为420nm、488nm、532nm、590nm、635nm、690nm、740nm左右，通常相邻的两个荧光通道存在一定的荧光串扰，为避免由于激光串扰导致的问题，实施例1的一种数字微滴定量检测系统的检测方法，包括以下步骤：

设置每个周期内的多通道激发光源62的调制信号的时序；

按照设置的激发光源62的调制信号的时序点亮激发光源62；

在激发光源62点亮的时间内通过对应的探测器34采集荧光信号；

通过每个激发光源62的调制信号的时序进行荧光信号的分解。

为了降低激光通道的有效占空比，依次进行多个通道的激光开启和关闭操作。

当调制信号为数字脉冲信号时，如图14所示，可设置激光调制高电平T1＝T2＝T3＝T4＝1/4T。

由于不同的波长光源的特性不同，在实际操作过程中可针对不同波长光源的开关时间进行调整，确保每个高电平周期内激光器可稳定保持1微秒以上。如图15所示，根据激发光源62的波长，设置每个周期内的多通道激发光源62的调制信号的占空比；图15中，ch1、ch2、ch3和ch4分别代表四个不同的荧光通道(如FAM、HEX、ROX和cy5)。

将设置的激发光源62调制信号的占空比同步至对应的探测器34；探测器34和激发光源62的有效使用时间同步或接近同步。

按照设置的激发光源62调制信号的占空比点亮激发光源62；

在激发光源62点亮的时间内通过对应的探测器34采集荧光信号。

从荧光光谱上来看，FAM和ROX的重叠较少，HEX和CY5的重叠较少，为更好地利用硬件资源，综合考虑不同通道间的荧光光谱的重叠情况，进行调制信号的组合激发，能够进一步降低多通道调制的难度，同时也提高有效信号的检出。如图16所示，还包括以下步骤：

将非相邻荧光通道对应的激发光源62的调制信号在同一个周期内进行组合激发。

当检测通道更多的时候，可以按照类似的方法进行组合，可以采用2+2，2+3，3+3，1+2+1等类似的组合方式。

当激光光路和荧光光路组成同轴光路时，还包括以下步骤：

将激光光路和荧光光路组成的同轴光路中的激发光源62的调制信号在同一个周期内组合激发。

如图17所示，图17中，ch1对应第一光源161，ch3对应第二光源162，ch2对应第三光源169，ch4对应第四光源1610，从光谱上来看，第一光源161和第二光源162的荧光通道需选择荧光串扰较低的通道，第三光源169和第四光源1610的荧光通道需选择荧光串扰较低的通道，如FAM和ROX，HEX和CY5等，则可按照图17进行微滴信号采集和处理。

当采用单个探测器34进行荧光信号的采集时，常规单个荧光信号的调制曲线拟合如图18所示，将多个光源采用TTL电平调制控制。具体地，包括以下步骤：

当调制信号为TTL电平信号时，固定单位时间周期T，设置单位时间周期内的多通道激发光源62的调制信号的时间；

在单位时间周期内按照设置的时间逐个点亮每个激发光源62；

对应的探测器34在激发光源62点亮的时间内获得荧光信号，进行实现相应荧光通道的微滴信号的获取；

图19中描述了通道1的荧光信号的获取的过程，其他荧光通道的荧光信号的获取原理类似。

结合各个激发光源62的调制信号的时序，进行荧光信号的分解，并从中剥离出各个通道的荧光信号值，如图20所示。能够实现同时实现多重荧光信号的采集。

实施例3

本实施例中，采用两种不同频率正弦波调制不同波长的激光，通过调制解调技术，实现荧光信号的分离。

如图21所示，激光1和激光2分别以频率为f1和f2的正弦波调制，激光1和激光2通过光纤合并，分别激发微滴中的两种荧光基团A和B，得到不同波长的荧光信号1A和荧光信号2B。在检测系统中设计中，若激发谱存在重叠，则会出现激光1激发荧光基团B(荧光信号1B)以及激光2激发荧光基团A(荧光信号2A)的现象。经过分光系统，探测器341接收到荧光信号1A和2A，探测器342接收到1B和2B。通过解调可以将探测器34中串扰信号分离。

如图22所示，对于激发谱不存在重叠的系统中，通过频分复用技术，可以实现单探测器34多路荧光信号的检测。

实施例1的一种数字微滴定量检测系统的检测方法，包括以下步骤：

某一探测器34探测到的在激光器常亮情况下，微滴运动过程中的荧光信号波形如图23所示，此信号为两个激光器激激发一种荧光基团的荧光信号的叠加，无法分离信号。

采用不同频率的调制信号调制不同波长的激发光源62；激光器1的调制信号如图24所示，激光器2的调制信号如图25所示。

激发光源62发射的激光信号通过光纤合并，分别激发待测微滴5中的荧光基团，得到不同波长的荧光信号；

通过探测器34接收荧光信号如图26所示，该信号的频谱如图27所示，可见f1和f2两个特征峰。

通过接收到的荧光信号的频谱特性将荧光信号分离；得到激光器1的荧光调制信号如图28所示，激光器2的荧光调制信号如图29所示，

通过对分离出的荧光信号进行解调，分离出串扰信号。激光器1的荧光原始信号如图30所示，激光器2的荧光原始信号如图31所示。

在数字系统中，常用SPWM法进行信号的调制，具体如图32所示。

采用频分复用的方法，使得不同波长的激发光可以在同一根光纤中传输，极大地提高了通道的复用率，相对于时分复用而言，采用高频调制，提高了信号采集通道的利用率。

实施例4

一种计算机可读存储介质，如图33所示，其上存储有程序指令，程序指令被执行时实现的一种数字微滴定量检测系统的检测方法。关于方法的详细描述，可以参照上述方法实施例中的对应描述，在此不再赘述。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、商品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、商品或者设备中还存在另外的相同要素。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。

以上仅为本说明书实施例而已，并不用于限制本说明书一个或多个实施例。对于本领域技术人员来说，本说明书一个或多个实施例可以有各种更改和变换。凡在本说明书一个或多个实施例的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本说明书一个或多个实施例的权利要求范围之内。本说明书一个或多个实施例本说明书一个或多个实施例本说明书一个或多个实施例本说明书一个或多个实施例。

Claims (11)

1.一种数字微滴定量检测系统，其特征在于：包括激发光路和荧光收集光路；其中，

所述激发光路用于生成多通道激光信号并将生成的多通道激光信号聚焦在微流控芯片的微滴检测流道中的待测微滴上；

所述荧光收集光路用于收集所述微流控芯片的微滴检测流道中的待测微滴上的荧光信号，将收集的荧光信号压缩成光斑被探测器的靶面收集；

所述激发光路和所述荧光收集光路为同侧光路；

所述激发光路包括激发光路底座、多通道激光光路，所述激光光路包括激发光源、反射镜和激光二色镜，所述激发光源、所述反射镜和所述激光二色镜放置在所述激发光路底座上，所述激发光源发射的激光信号照射到所述反射镜或所述激光二色镜上，所述反射镜和所述激光二色镜反射的激光信号聚焦到微流控芯片的微滴检测流道中的待测微滴上；

所述激光光路还包括多个准直镜、多个光阑，所述激发光源发射的激光信号经所述准直镜进行光束准直，所述准直镜准直后光束经所述光阑照射到所述反射镜或所述激光二色镜上；

所述激发光路还包括激光聚焦镜，经所述反射镜和所述激光二色镜合束后的激光信号经过所述激光聚焦镜压缩成高密度光斑，且其束腰位置处于微滴的中部；

所述荧光收集光路包括荧光光路底座、荧光光路，所述荧光光路包括滤光片和探测器，荧光信号经过滤光片后被探测器收集；

所述荧光光路还包括第一荧光二色镜与荧光聚焦透镜，和/或，荧光收集透镜与滤激光二色镜；待测微滴的荧光信号经过第一荧光二色镜将不同通道的荧光信号进行分光，然后经过所述荧光聚焦透镜压缩成光斑并被所述探测器的靶面收集；所述荧光收集透镜收集到待测微滴的荧光信号进行准直处理，然后经过所述滤激光二色镜进行过滤；

所述荧光光路还包括第二荧光二色镜，经所述滤激光二色镜过滤的信号经过所述第二荧光二色镜过滤最低波长的激光信号；经所述第一荧光二色镜分光后的荧光信号通过所述滤光片进行过滤；

多通道激光光路为平行光路；多通道荧光光路为平行光路或等长的光路；

还包括分束镜和聚焦透镜，或，光纤和聚焦透镜，所述分束镜用于激光光束和荧光光路的同轴合束和分光，所述聚焦透镜用于对多通道激光光路合束的激光光束的光斑进行压缩，同时对待测微滴向空间中发出的荧光信号进行收集并准直成荧光光束；所述激光光路和所述荧光光路分别与所述光纤对应的接口连接，经过所述光纤合束的激光信号经过聚焦透镜压缩后聚焦在待测微滴上，待测微滴的荧光信号通过所述聚焦透镜准直后被光纤收集。

2.如权利要求1所述的一种数字微滴定量检测系统，其特征在于：还包括反射元件，所述反射元件置于所述微流控芯片的微滴检测流道的外侧。

3.如权利要求1所述的一种数字微滴定量检测系统，其特征在于：还包括前向探测器，所述前向探测器用于识别所述微流控芯片的微滴检测流道中的待测微滴的物理特征。

4.如权利要求1所述的一种数字微滴定量检测系统，其特征在于：若干所述激光光路和若干所述荧光光路组成若干同轴光路。

5.如权利要求1所述的一种数字微滴定量检测系统的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

设置每个周期内的多通道激发光源的调制信号的时序；

按照设置的激发光源的调制信号的时序点亮激发光源；

在激发光源点亮的时间内通过对应的探测器采集荧光信号；

通过每个激发光源的调制信号的时序进行荧光信号的分解。

6.如权利要求5所述的一种数字微滴定量检测系统的检测方法，其特征在于：

当所述调制信号为数字脉冲信号时，根据激发光源的波长，设置每个周期内的多通道激发光源的调制信号的占空比；

将设置的激发光源调制信号的占空比同步至对应的探测器；

按照设置的激发光源调制信号的占空比点亮激发光源；

在激发光源点亮的时间内通过对应的探测器采集荧光信号。

7.如权利要求5所述的一种数字微滴定量检测系统的检测方法，其特征在于：

当所述调制信号为TTL电平信号时，固定单位时间周期，设置所述单位时间周期内的多通道激发光源的调制信号的时间；

在所述单位时间周期内按照设置的时间逐个点亮每个激发光源；

对应的探测器在激发光源点亮的时间内获得荧光信号；

结合各个激发光源的调制信号的时序，进行荧光信号的分解，并从中剥离出各个通道的荧光信号值。

8.如权利要求6所述的一种数字微滴定量检测系统的检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：

将非相邻荧光通道对应的激发光源的调制信号在同一个周期内进行组合激发。

9.如权利要求6所述的一种数字微滴定量检测系统的检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：

将所述激光光路和所述荧光光路组成的同轴光路中的激发光源的调制信号在同一个周期内组合激发。

10.如权利要求1所述的一种数字微滴定量检测系统的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用不同频率的调制信号调制不同波长的激发光源；

激发光源发射的激光信号通过光纤合并，分别激发待测微滴中的荧光基团，得到不同波长的荧光信号；

通过探测器接收荧光信号；

通过接收到的荧光信号的频谱特性将荧光信号分离；

通过对分离出的荧光信号进行解调，分离出串扰信号。

11.一种计算机可读存储介质，其特征在于，其上存储有程序指令，所述程序指令被执行时实现如权利要求5或10所述的方法。