CN104388307B - 一种液滴式样品荧光检测系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液滴式样品荧光检测系统和方法，系统包括：激发光模块(1)、激发光探测模块(3)、荧光探测模块(4)以及控制器模块(6)，所述控制器模块(6)连接荧光探测模块(4)和激发光探测模块(3)，且在激发光模块(1)和荧光探测模块(4)之间设有检测通道(32)，所述检测管路中设有待测的液滴样品，所述激发光模块(1)发出的光照射并激发，所述液滴样品中含有荧光染料的液滴发出荧光，所述荧光被所述荧光探测模块(4)接收后转换成数字信号，并发送到控制器模块(6)。

Description

一种液滴式样品荧光检测系统和方法

技术领域

本发明属于一种液滴式样品荧光检测系统和方法，适用于数字PCR技术。

背景技术

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究。数字PCR是近年来发展迅速的新一代定量PCR分析技术，利用微流控技术将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有至少一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统的荧光定量PCR相比，具有高灵敏度、高特异性、无需标准定量曲线等优点。数字PCR技术提出至今，相关技术和产业化发展都非常迅速，迄今为止，数字PCR技术主要有三类:微反应室孔板、大规模集成微流控芯片和液滴数字PCR系统。

早期的数字PCR采用96/384孔板作为反应单元，随着对测试灵敏度和准确度的要求不断提高，反应单元的数目不断增加，使得操作的复杂度和所需试剂量也成倍增加。大规模集成微流控芯片技术的出现为数字PCR分析提供了一个低成本、小体积和高通量平行分析的方案。液滴式数字PCR系统源于乳液PCR技术，通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的PCR反应体系，比微孔板和集成微流控芯片系统更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成本低，因此成为理想的数字PCR技术平台。

目前液滴式数字PCR中的检测方法可分为诱导荧光检测和显微镜成像两种。由于显微镜在实验室中的普遍应用，显微镜成像法在科学研究中使用相当广泛。配备高速摄像机的明场显微镜可以很方便地获得液滴的各种参数，如形状、大小、颜色以及其他肉眼可观察的参数，但其灵敏度却相当有限。荧光显微镜通过使用高灵敏CCD和特殊设计的滤光片，具有良好的弱光捕捉能力，能够捕捉到极其微弱的荧光，可准确区分含有不同数量目标分子的液滴，从而大大提高其检测灵敏度。然而受限于CCD帧速率，显微镜成像技术在高通量、连续测量的商业应用场合使用较少。

诱导荧光检测技术以其高速、高灵敏度的优势在商业化数字PCR设备中获得广泛应用。通常的荧光检测系统包含荧光激发、样品池、荧光探测等功能模块，检测时通过将接收到的荧光强度与事先设定的数值做对比，当荧光强度大于阈值时便视为存在荧光反应。由于激发的荧光强度微弱，易受环境影响，可能为荧光检测过程中引入误差的来源包括光源信号强度、液滴频率、液滴大小等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种液滴式样品荧光检测系统和方法，用以解决现有技术中存在的检测不精准的缺点。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案如下：

一种液滴式样品荧光检测系统，包括：激发光模块1、激发光探测模块3、荧光探测模块4以及控制器模块6，所述控制器模块6连接荧光探测模块4和激发光探测模块3，且在激发光模块1和荧光探测模块4之间设有检测通道32，所述检测通道32中设有待测的液滴样品，所述激发光模块1发出的光照射并激发，所述液滴样品中含有荧光染料的液滴发出荧光，所述荧光被所述荧光探测模块4接收后转换成数字信号，并发送到控制器模块6。

进一步地，优选的结构是，所述液滴样品存放于一储液池10中，所述储液池10连接有样品管道(11)，样品管道11上设一控制阀20，且控制阀后的样片管道连接有稀释机构，所述稀释机构包括与样品管道相连接的第一载流相通道12和第二载流相通道13，其中，用于稀释的连续相液体从第一载流相通道12和第二载流相通道13中通入，并以流路聚焦的方式与样品通道11合成后进入到所述检测通道32，所述第一载流相通道12和第二载流相通道13还分别连接一动力机构5，动力机构5连接所述控制器模块6，所述控制器模块6控制所述第一载流相通道12和第二载流相通道13的连续相液体的滴入速度；其中，经过稀释后的液滴33进入到检测区域16，并在检测区域受所述激发光模块1发出的光激发，并由荧光探测模块4中的光电探测器31接收并产生电信号。

进一步地，优选的结构是，光电探测器31选取光电倍增管。

进一步地，优选的结构是，所述激发光模块1包含：至少一个激发光源21、准直透镜22、滤光片23、分光镜24和聚焦透镜25；由激发光源21发射出的光经过准直镜22后，又通过滤光片23滤除激发光波长范围外的光线，经分光镜24分光，一部分光束作为监测光束进入设于分光镜24一侧的所述激发光检测模块3，另一部分光束被反射后经过聚焦透镜25进入到所述待测芯片的检测区域，并照射检测通道中的液滴后发出荧光。

进一步地，优选的结构是，所述激光光源21设置为多个，所述激发光模块1中还设有合束镜，且每个激光光源21的前方都设置有滤光片23，所述合束镜设于滤光片23和分光镜24之间，多个激光光源21发出的光经过各自对应的滤光片23滤光后，经合束镜将光束合成，并且，各激发光源对应的滤光片23的波长范围互不重叠。

进一步地，优选的结构是，所述荧光检测模块4，具体包含：滤光片29、透镜30和至少一组光电探测器31，检测通道中的液滴后发出的荧光经滤光片29后，又进入至所述透镜30聚焦，并最终进入到光电探测器31，由光电探测器31接收后转换成数字信号。

进一步地，优选的结构是，所述荧光检测模块4的光轴与激发光模块1的光轴不平行，所述荧光检测模块4的光轴与激发光模块1的光轴之间的角度选取60°或垂直。

进一步地，优选的结构是，所述激发光探测模块3，包括：滤光片26、聚焦透镜27和光电探测器28，激发光在经过分光镜后的监测光束经过滤光片26、聚焦透镜27后进入光电探测器28，所述光电探测器28将其转化成电信号，并传给控制模块6。

一种液滴式样品荧光检测方法，基于以上液滴式样品荧光检测系统，包括：

通过激发光检测模块调整光源强度至指定强度I；

将样品从储液池中吸入至充满样品通道，随后吸入载运液滴的分散相，并检测液路稳定后荧光探测模块接收到的光强平均值作为背景荧光，设其强度为F₀；

检测稀释后的样品液滴的荧光强度，在此过程中控制器模块通过激发光探测模块和荧光探测模块收集激发光强度、液滴流速和液滴直径等参数；

根据时间-荧光强度曲线查找峰值，并利用上述参数识别有效液滴并校正测得的荧光强度，根据每个液滴的峰值荧光强度与事先设定或自动调整识别的阈值对比确认液滴是否带有荧光；分别统计荧光液滴与无荧光液滴的个数并根据泊松分布公式：

$\mathrm{\λ}=-\ln (1-\frac{H}{C})$

计算获得样品中所含目标分子个数，其中λ为平均每液滴中目标分子个数，H为荧光反应呈阳性的液滴个数，C为液滴总数。

进一步地，优选的方法是，若液滴直径与过去一段时间内的有效液滴直径平均值之比在0.95-1.05内，则认为是有效液滴，并纳入最终结果统计，否则认为其不是有效液滴。

本发明采取了上述方案以后，克服了目前液滴微流控芯片的荧光检测法具有的仪器误差，其可以通过检测仪器测量过程中各误差源的状态对仪器进行校正，从而改善检测结果的准确性，具有较好的效果。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

下面结合附图对本发明进行详细的描述，以使得本发明的上述优点更加明确。其中，

图1为本发明实施例液滴式样品荧光检测系统的功能单元示意图；

图2为本发明中液滴式样品荧光检测系统的液路示意图；

图3为本发明的液滴式样品荧光检测系统的荧光检测器的一个实施方式中检测光路示意图；

图4是本发明实施例液滴式样品荧光检测系统的进行一次液滴检测的流程示意图；

图5是特征参数提取算法示意图；

图6是特征参数提取算法示意图；

图7是根据液滴荧光强度判别液滴分类的算法流程示意图。

具体实施方式

以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。需要说明的是，只要不构成冲突，本发明中的各个实施例以及各实施例中的各个特征可以相互结合，所形成的技术方案均在本发明的保护范围之内。

另外，在附图的流程图示出的步骤可以在诸如一组计算机可执行指令的计算机系统中执行，并且，虽然在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于此处的顺序执行所示出或描述的步骤。

下面结合附图进一步说明本发明。

图1为本发明所述的液滴式样品荧光检测系统的构成示意图，具体来说，包括激发光模块1、激发光探测模块3、荧光探测模块、动力模块5以及控制器模块6，其中，待测样品2经过芯片中的检测管路或从与待测芯片相连的毛细管被激发模块1发出的光激发后，含有荧光染料的液滴发出荧光，被荧光探测模块4接收后转换成数字信号，发送到控制器模块6。

并且，除荧光探测模块4以外，控制器模块6还与激发光探测模块3、压力泵5相连。

如图2所示，液滴样品存放于一个待测芯片中的储液池10中，经样品通道11、控制阀20后与检测通道32相连。

为了更好地区分液滴，在检测之前需要将液滴进行稀释，用于稀释的连续相液体从第一载流相通道12、第二载流相通道13中通入，并以流路聚焦的方式与样品通道11合成后进入检测通道32。其中，第一载流相通道12、第二载流相通道13连接动力机构5，该动力机构可以是由其他独立的压力泵提供的正压，也可由压力泵提供的负压同时供应。

其中，通过选择合适的压力和通道尺寸，可以将液滴稀释到需要的间隔和流速。经过稀释后的液滴15在特定的检测区域16中被激发光模块1的激光激发后并产生荧光，后者则被荧光探测模块4中的光电探测器31(如光电倍增管等)接收并产生电信号。

如图3所示，其中激发光模块1包含：至少一个激发光源21、准直透镜22、滤光片23、分光镜24和聚焦透镜25等功能组件。

激发光源可以使用特定波长范围的激光或LED。由激发光源21发射出的光经过准直镜22后，又通过滤光片23滤除激发光波长范围外的光线。如存在一个以上激发光源，在经过滤光片滤光后需要再经合束镜将光束合成，为防止干扰，各激发光源对应的滤光片通带波长范围应互不重叠。为监控激发光状态，激发光合束后经分光镜24分光，部分进入激发光检测模块3，大部分则被反射后经过聚焦透镜25进入待测芯片的检测区域激发荧光。

其中，激发光聚焦照射待测芯片检测通道中的液滴后发出荧光，随后在荧光检测模块4中进行检测。

为防止激发光干扰，荧光检测模块4的光轴与激发光模块的光轴并不平行，而是呈现一定的角度如60°或垂直。荧光检测模块4包含滤光片29、透镜30和至少一组光电探测器31，如液滴中发射出超过一种染料波长的荧光，则还需增加相应波长的分光镜。发射光经过通带为各自波长的滤光片29后经透镜30聚焦，随后被PMT所检测。

激发光探测模块3用于监测发射光源的光强值，激发光在经过分光镜后少部分监测光束经过滤光片26、聚焦透镜27后进入光电探测器28。由此，控制器可实时获得激发光强度，校正漂移并根据需要加以调节。

图4为本发明所述检测方法的一种实施例的流程图，

步骤描述如下。打开仪器开关，通过激发光检测模块调整光源强度至指定强度I。将含有样品的待测芯片连接到荧光检测仪器上，打开样品阀20通过负压将样品从储液池中吸入至充满样品通道，随后关闭样品阀从载流通道12、13中吸入载运液滴的分散相，并检测液路稳定后荧光探测模块接收到的光强平均值作为背景荧光，设其强度为F₀。随后打开样品阀开始检测稀释后的样品液滴的荧光强度，在此过程中控制器通过激发光探测模块和荧光探测模块收集激发光强度、液滴流速和液滴直径等参数。根据时间-荧光强度曲线查找峰值，并利用上述参数识别有效液滴并校正测得的荧光强度。根据每个液滴的峰值荧光强度与事先设定或自动调整识别的阈值对比确认液滴是否带有荧光；分别统计荧光液滴与无荧光液滴的个数并根据泊松分布公式

$\mathrm{\λ}=-\ln (1-\frac{H}{C})$

计算获得样品中所含目标分子个数，其中λ为平均每液滴中目标分子个数，H为荧光反应呈阳性的液滴个数，C为液滴总数。

如图5和图6，在其图像中，所示的时间-光强曲线上，50为背景荧光强度，由检测开始时空白载流相的荧光强度获得，51是峰值所在的时间点，强度大于背景荧光的持续时间52表征液滴直径t_d，将液滴直径与过去一段时间内(如过去的10个有效液滴)的有效液滴直径平均值之比作为调整因子α，峰峰值之间的时间间隔53用于表征液滴之间的间隔时间Δt，间隔时间Δt的倒数即为液滴频率。由于待测试芯片中的液滴由固定体积的样品生成，液滴数目可认为是固定的，根据已知的液滴数与液滴频率可计算剩余的测试时间。

如图7所示，在上述检测过程中，由于流路中可能存在合并的液滴或破碎的液滴，表现在光强曲线上即波峰的宽度与普通液滴相比具有明显误差，峰值强度也可能与正常的阳性/阴性液滴光强不同，因此准确的液滴检测和峰值校正对最终结果的准确性和精度都有很大影响。为更准确区分液滴，在液滴检测前需要将待测样品进行稀释。稀释度可通过液滴间隔与液滴尺寸之比进行判断，如稀释度过低(<5)，可通过调整样品与稀释液压力的方式调整。若液滴直径与过去一段时间内的有效液滴直径平均值之比在合法区间范围内(如0.95-1.05)，则认为是有效液滴，并纳入最终结果统计，否则认为其不是有效液滴。

峰值强度由AD采样时获得的局部极大值以及左右各数点强度平均获得，为校正液滴的影响，最终峰值强度54需要乘以调整因子α。为了验证液滴是否含有荧光，将液滴峰值强度与事先设定的阈值55做比较，大于阈值的认为为阳性液滴，小于阈值的为阴性。有效的液滴总数等于阳性液滴加阴性液滴的数目。

系统误差中还包含另一类重要的误差，即由温度漂移引起的误差，为了消除该误差引发的误判，可使用另一种判别液滴属性的方法。考虑使用测得的荧光强度I与一段时间内阴性、阳性液滴的平均强度I1、I2做比较。如图6所示，首先确定两类液滴的个数符合统计数量的要求(如n1>10，n2>10)，分别计算待分类液滴与两类液滴的平均强度之比R1＝I/I1,R2＝I2/I，若R1>R2，则认为是阴性液滴，反之则认为是阳性液滴。若某类型液滴数少于统计所需要求(如n2<10)，则单独计算另一单类的比例R1与预先设定的阈值R1o，若R1<R1o，则认为是阴性液滴，反之则认为是阳性液滴。

本发明采取了上述方案以后，克服了目前液滴微流控芯片的荧光检测法具有的仪器误差，其可以通过检测仪器测量过程中各误差源的状态对仪器进行校正，从而改善检测结果的准确性，具有较好的效果。

需要说明的是，对于上述方法实施例而言，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本申请并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本申请，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和模块并不一定是本申请所必须的。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种液滴式样品荧光检测系统，其特征在于，包括：激发光模块(1)、激发光探测模块(3)、荧光探测模块(4)以及控制器模块(6)，所述控制器模块(6)连接荧光探测模块(4)和激发光探测模块(3)，且在激发光模块(1)和荧光探测模块(4)之间设有检测通道(32)，所述检测通道(32)中设有待测的液滴样品，所述激发光模块(1)发出的光照射并激发，所述液滴样品中含有荧光染料的液滴发出荧光，所述荧光被所述荧光探测模块(4)接收后转换成数字信号，并发送到控制器模块(6)；所述液滴样品存放于一个待测芯片中的一储液池(10)中，所述储液池(10)连接有样品管道(11)，样品管道(11)上设一控制阀(20)，且控制阀后的样片管道连接有稀释机构，所述稀释机构包括与样品管道相连接的第一载流相通道(12)和第二载流相通道(13)，其中，用于稀释的连续相液体从第一载流相通道(12)和第二载流相通道(13)中通入，并以流路聚焦的方式于样品通道(11)合成后进入到所述检测通道(32)，所述第一载流相通道(12)和第二载流相通道(13)还分别连接一动力机构(5)，动力机构(5)连接所述控制器模块(6)，所述控制器模块(6)控制所述第一载流相通道(12)和第二载流相通道(13)的连续相液体的滴入速度；其中，经过稀释后的液滴(33)进入到检测区域(16)，并在检测区域受所述激发光模块(1)发出的光激发，并由荧光探测模块(4)中的光电探测器(31)接收并产生电信号。

2.根据权利要求1所述的液滴式样品荧光检测系统，其特征在于，光电探测器(31)选取光电倍增管。

3.根据权利要求1所述的液滴式样品荧光检测系统，其特征在于，所述激发光模块(1)包含：至少一个激发光源(21)、准直透镜(22)、滤光片(23)、分光镜(24)和聚焦透镜(25)；由激发光源(21)发射出的光经过准直镜(22)后，又通过滤光片(23)滤除激发光波长范围外的光线，经分光镜(24)分光，一部分光束作为监测光束进入设于分光镜(24)一侧的所述激发光检测模块(3)，另一部分光束被反射后经过聚焦透镜(25)进入到所述待测芯片的检测区域，并照射检测通道中的液滴后发出荧光。

4.根据权利要求3所述的液滴式样品荧光检测系统，其特征在于，所述激光光源(21)设置为多个，所述激发光模块(1)中还设有合束镜，且每个激光光源(21)的前方都设置有滤光片(23)，所述合束镜设于滤光片(23)和分光镜(24)之间，多个激光光源(21)发出的光经过各自对应的滤光片(23)滤光后，经合束镜将光束合成，并且，各激发光源对应的滤光片(23)的波长范围互不重叠。

5.根据权利要求3所述的液滴式样品荧光检测系统，其特征在于，所述荧光检测模块(4)，具体包含：滤光片(29)、透镜(30)和至少一组光电探测器(31)，检测通道中的液滴后发出的荧光经滤光片(29)后，又进入至所述透镜(30)聚焦，并最终进入到光电探测器(31)，由光电探测器(31)接收后转换成数字信号。

6.根据权利要求5所述的液滴式样品荧光检测系统，其特征在于，所述荧光检测模块(4)的光轴与激发光模块(1)的光轴不平行，所述荧光检测模块(4)的光轴与激发光模块(1)的光轴之间的角度选取60^o或垂直。

7.根据权利要求6所述的液滴式样品荧光检测系统，其特征在于，所述激发光探测模块(3)，包括：滤光片(26)、聚焦透镜(27)和光电探测器(28)，激发光在经过分光镜后的监测光束经过滤光片(26)、聚焦透镜(27)后进入光电探测器(28)，所述光电探测器(28)将其转化成电信号，并传给控制模块(6)。

8.一种液滴式样品荧光检测方法，基于权利要求1-7任一所述的液滴式样品荧光检测系统，其特征在于，包括：

通过激发光检测模块调整光源强度至指定强度I；

将样品从储液池中吸入至充满样品通道，随后吸入载运液滴的分散相，并检测液路稳定后荧光探测模块接收到的光强平均值作为背景荧光，设其强度为F₀；

检测稀释后的样品液滴的荧光强度，在此过程中控制器模块通过激发光探测模块和荧光探测模块收集激发光强度、液滴流速和液滴直径-参数；

根据时间-荧光强度曲线查找峰值，并利用上述参数识别有效液滴并校正测得的荧光强度，根据每个液滴的峰值荧光强度与事先设定或自动调整识别的阈值对比确认液滴是否带有荧光；分别统计荧光液滴与无荧光液滴的个数并根据泊松分布公式：

$\mathrm{\&lambda;}=-\ln (1-\frac{H}{C})$

计算获得样品中所含目标分子个数，其中λ为平均每液滴中目标分子个数，H为荧光反应呈阳性的液滴个数，C为液滴总数。

9.根据权利要求8所述的液滴式样品荧光检测方法，其特征在于，若液滴直径与过去一段时间内的有效液滴直径平均值之比在0.95-1.05内，则认为是有效液滴，并纳入最终结果统计，否则认为其不是有效液滴。