CN115747039A - 全自动一体化高通量数字核酸检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种全自动一体化高通量数字核酸检测系统，包括高通量扩增芯片；可升降扩增模块，其包括温控子模块及第一升降子模块；进样控制与微滴信号采集集成模块，其包括进样控制子模块、微滴信号采集子模块以及用第二升降子模块；气液模块；以及光学检测模块。本发明提供的核酸检测系统集微滴生成、微滴扩增、微滴检测于一体，能够实现全自动、高通量数字核酸检测，可有效提高检测效率，具备很好的市场应用前景；本发明通过设置可升降扩增模块，能够方便进行进行小位移升降以满足工作过程中高通量扩增芯片与压板的压紧需求，且极大的降低了仪器的高度，且各高通量扩增芯片可独立扩增，方便扩展通量。

Description

全自动一体化高通量数字核酸检测系统

技术领域

本发明涉及数字体外诊断技术领域，特别涉及一种全自动一体化高通量数字核酸检测系统。

背景技术

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段DNA扩增至足够数量，以便进行结构和功能分析的技术，数字PCR(Digital PCR-dPCR)技术是一种新的核酸检测和定量分析技术，具有高灵敏度、高特异性、高稳定性的特点，在基因表达研究、microRNA研究、癌症标志物稀有突变检测等低丰度核酸检测领域应用具有重要的意义。与传统实时荧光定量PCR(Rea l-timeQuantitative PCR-qPCR)技术不同，数字PCR的原理是将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。

微流控芯片检测，所使用的试剂耗材的量少，容易实便携式、小型化、家庭化的。基于微流控芯片的数字PCR检测技术能提高效率、降低样本需求。例如专利CN115155682A公开的基于旋转阀的微流控芯片及检测方法。该微流控芯片的工作流程主要分为三个部分，微滴生成、微滴扩增和回流检测。在油相与样本相入口施加正压，在十字流道处将会形成剪切流，样本将会被分割成体积一致的微滴，微滴生成后将不断流入到末端PCR管中。微滴全部流入PCR管中后，对PCR管中的微滴进行扩增实验。当扩增完成后，通过芯片最左端入口施加正压，将回流油(与生成油性质类似)压入PCR管内，由于微滴密度小于油密度，微滴浮在PCR管上层，率先被压入检测流道(生成流道)，微滴依次通过十字流道，同时对生成油相施加正压，在十字通道后方设置光学检测模块即可完成对微滴的数字核酸检测。

基于该微流控芯片，提供一种高通量、兼具微滴生成、微滴扩增和荧光检测的全自动一体化数字核酸系统将具有重要意义，但现在缺少可靠的方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种全自动一体化高通量数字核酸检测系统。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种全自动一体化高通量数字核酸检测系统，包括高通量扩增芯片，所述高通量扩增芯片上设置有扩增单元，所述扩增单元包括微流道以及设置在所述微流道上的样品口、生成油口、回流油口、旋转阀、扩增载体；该系统还包括：

可升降扩增模块，其包括用于对所述高通量扩增芯片提供扩增所需温度环境的温控子模块以及用于对所述温控子模块提供Z方向位移的第一升降子模块；

进样控制与微滴信号采集集成模块，其包括进样控制子模块、微滴信号采集子模块以及用于为所述进样控制子模块、微滴信号采集头提供Z方向位移的第二升降子模块，所述进样控制子模块包括用于对所述样品口施加正压气体以实现进样的输气通道、用于向所述生成油口中输入生成油的输油通道以及用于对所述旋转阀施加转动驱动力的旋转杆，所述微滴信号采集子模块用于采集微流道中完成扩增后的微滴的荧光信号；

气液模块，其用于为所述进样控制子模块提供气体和生成油，以及为所述高通量扩增芯片的回流油口输送回流油；

以及光学检测模块，其接收所述微滴信号采集子模块采集的荧光信号，实现对微滴的核酸检测。

优选的是，所述第一升降子模块包括X轨道、可沿X方向滑动设置在所述X轨道上的X滑板、设置在所述X滑板上的若干下导向柱、可沿Z方向滑动设置在所述下导向柱上的升降底板、连接在所述升降底板底部的若干升降驱动块、沿Y方向开设在所述升降驱动块上的限位槽、可绕X轴转动设置在所述X滑板上的摇杆、连接在所述摇杆上且插设在所述限位槽内的驱动销以及用于驱动所述摇杆转动的第一升降驱动机构；

所述第一升降驱动机构包括通过轴承座可转动设置在所述X滑板上的两根升降驱动轴、连接在所述升降驱动轴上的升降带轮、驱动连接两根升降驱动轴上的两个升降带轮的升降同步带以及与一根升降驱动轴驱动连接的第一升降电机。

优选的是，所述温控子模块包括设置在所述升降底板上的若干上导向柱、可沿Z方向滑动设置在所述上导向柱上的升降框、连接在所述升降底板和升降框之间的若干弹簧、设置在所述升降底板上的若干风扇、设置在所述升降框上的若干温控箱以及设置在所述温控箱上方的压板。

优选的是，所述温控箱上开设有用于容纳所述高通量扩增芯片的温控腔，所述压板保持位置固定，所述驱动销随摇杆转动而产生Z方向的位移，从而促使所述升降驱动块沿Z方向位移以带动所述升降底板进行升降，最终使得所述温控箱相对所述压板进行Z方向的移动，以使所述温控腔中的高通量扩增芯片压紧或远离所述压板；

所述温控腔的底部设置有帕尔贴，所述帕尔贴的底部设置有散热片，所述散热片处于所述风扇的上方。

优选的是，所述高通量扩增芯片上阵列设置有若干扩增单元组，每个扩增单元组均包括关于Y轴方向对称布置的两个扩增单元，同一个扩增单元组上的两个扩增单元共用一个生成油口，同一个高通量扩增芯片上的所有扩增单元的回流油口均汇集至一个总回流油入口；

所述压板上设置有若干个工作窗口，所述工作窗口包括开设在所述压板上的进样与采集窗口、旋转阀调节窗口及回流油窗口；

所述工作窗口的数量和位置与高通量扩增芯片的数量一一对应，所述高通量扩增芯片压紧所述压板时，该高通量扩增芯片与压板上的一个工作窗口对应匹配，此时该工作窗口的回流油窗口与该高通量扩增芯片的总回流油入口对齐，该高通量扩增芯片上的所有样品口、生成油口均处于该工作窗口的进样与采集窗口内，该高通量扩增芯片上的所有旋转阀均分别匹配对准一个所述旋转阀调节窗口。

优选的是，所述进样控制子模块包括内安装架、设置在所述内安装架上的两个旋转驱动机构以及连接在所述内安装架底部的气液压头；

所述旋转杆包括设置在所述内安装架上且对称布置在所述气液压头两侧的两根，与两个旋转驱动机构一一对应，以通过所述旋转驱动机构带动所述旋转杆旋转，以对旋转阀进行控制；

所述旋转驱动机构包括旋转电机、固定套设在所述旋转电机的输出轴上的主动齿轮以及固定套设在所述旋转杆上且与所述主动齿轮啮合的从动齿轮；

所述旋转电机的输出轴上连接有光耦挡片，所述内安装架上设置有用于与所述光耦挡片配合的槽型光耦。

优选的是，所述气液压头包括连接在所述内安装架底部的安装座以及设置在所述安装座底面的压头块，所述输气通道形成于所述气液压头内部，并在所述安装座的第一侧形成输气入口、在所述压头块的底面形成两个输气出口；

所述输油通道形成于所述气液压头内部，并在所述安装座的第二侧形成输油入口、在所述压头块的底面形成一个输油出口。

优选的是，所述第二升降子模块包括外安装架、沿Z方向设置在所述外安装架上的Z滑轨、连接在所述内安装架上且配合设置在所述Z滑轨上的Z滑块、设置在所述外安装架上的的第二升降电机、与所述第二升降电机的输出轴连接的丝杆以及连接在所述内安装架上且配合套设在所述丝杆上的丝杆螺母。

优选的是，所述进样控制与微滴信号采集集成模块还包括Y位移子模块，所述Y位移子模块包括支撑架、沿Y方向设置在所述支撑架顶部的Y滑轨、配合设置在所述Y滑轨上的Y滑块、设置在所述支撑架上的Y电机、固定套设在所述Y电机的输出轴上的Y主动带轮、可转动连接在所述支撑架上的Y从动带轮以及连接在所述Y主动带轮和Y从动带轮之间的Y同步带；

所述外安装架连接在所述Y滑块上，且所述外安装架与Y同步带固定连接。

优选的是，所述光学检测模块包括激发光子模块、荧光检测子模块以及连接所述激发光子模块和荧光检测子模块的Y型光纤；

所述Y型光纤包括合束光纤部、于所述合束光纤部的近端分叉形成Y型的激光光纤部和荧光收集光纤部；

所述激发光子模块出射的激发光经所述激光光纤部进入所述Y型光纤，并由所述合束光纤部的远端出射到待测微滴上，待测微滴发出的荧光经所述合束光纤部的远端进入所述Y型光纤，然后由所述荧光收集光纤部输出到所述荧光检测子模块中，实现荧光检测；

所述合束光纤部的远端连接至所述微滴信号采集头。

优选的是，所述激发光子模块包括N路激发光单元，用以出射N种波长的激发光，所述激发光单元包括沿激发的出射光路依次设置的激光器、准直镜、光阑和激光二色镜，由所述激光二色镜出射的激光进入所述激光光纤部。

优选的是，所述荧光检测子模块包括N路荧光检测单元，用以实现N种波长的荧光的探测，所述荧光检测单元包括沿荧光的入射光路依次设置第一荧光二色镜、荧光滤光片、荧光聚焦透镜和荧光探测器，所述荧光收集光纤部出射的荧光由所述入射到所述第一荧光二色镜。

优选的是，所述光学检测模块的检测方法包括以下步骤：

设置每个周期内的N路荧光检测单元中的激光器的调制信号的时序；

按照设置的激光器的调制信号的时序开启激光器；

在激光器开启的时间内通过对应的荧光探测器采集荧光信号；

通过每个激光器的调制信号的时序进行荧光信号的分解。

优选的是，当所述调制信号为数字脉冲信号时，根据激光器出射激光的波长，设置每个周期内的激光器的调制信号的占空比；

将设置的激光器的调制信号的占空比同步至对应的荧光探测器；

按照设置的激光器的调制信号的占空比开启激光器；

在激光器开启的时间内通过对应的荧光探测器采集荧光信号。

优选的是，当所述调制信号为TTL电平信号时，固定单位时间周期，设置所述单位时间周期内的激光器的调制信号的时间；

在所述单位时间周期内按照设置的时间逐个开启每个激光器；

对应的荧光探测器在激光器开启的时间内获得荧光信号；

结合各个激光器的调制信号的时序，进行荧光信号的分解，并从中剥离出各个通道的荧光信号值。

优选的是，所述光学检测模块的检测方法包括以下步骤：包括以下步骤：

采用不同频率的调制信号调制不同波长的激光器；

激光器发射的激发光通过光纤合并，分别激发待测微滴中的荧光基团，得到不同波长的荧光信号；

通过荧光探测器接收荧光信号；

通过接收到的荧光信号的频谱特性将荧光信号分离；

通过对分离出的荧光信号进行解调，分离出串扰信号。

本发明的有益效果是：

本发明提供的核酸检测系统集微滴生成、微滴扩增、微滴检测于一体，能够实现全自动、高通量数字核酸检测，可有效提高检测效率，具备很好的市场应用前景；

本发明通过设置可升降扩增模块，能够方便进行进行小位移升降以满足工作过程中高通量扩增芯片与压板的压紧需求，且极大的降低了仪器的高度，且各高通量扩增芯片可独立扩增，方便扩展通量；

本发明的进样控制与微滴信号采集集成模块集样品进样、生成油输入、旋转阀控制、Y方向位移调节、Z方向位移调节等多种功能与一体，能够实现每个高通量扩增芯片微滴生成、微滴检测等过程的自动化操作；基于该模块能够方便扩展系统的通量；

本发明的光学检测模块中通过设置Y型光纤，将激发光路和荧光收集光路用同一根光纤激发与收集，激发光路和荧光收集光路结构的位置布置上将不受限制，可自由放置，能够便于实现设备的小型化。

本上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

图1为现有技术中的一种微流控芯片的结构示意图；

图2为现有技术中的一种微流控芯片的工作原理示意图；

图3为实施例1的全自动一体化高通量数字核酸检测系统的结构示意图；

图4为实施例2的可升降扩增模块的结构示意图；

图5为实施例2的可升降扩增模块的另一个视角的结构示意图；

图6为实施例2的高通量扩增芯片的结构示意图；

图7为实施例2的压板的结构示意图；

图8为实施例2的温控子模块的剖视结构示意图；

图9为实施例3的进样控制与微滴信号采集集成模块的结构示意图；

图10为实施例3的进样控制与微滴信号采集集成模块的另一个视角的结构示意图；

图11为实施例3的进样控制子模块的结构示意图；

图12为实施例3的进样控制子模块的剖视结构示意图；

图13为实施例3的气液压头的结构示意图；

图14为实施例3的气液压头的另一个视角的结构示意图；

图15为实施例4的光学检测模块的结构示意图；

图16为实施例4的光学检测模块的光路图；

图17为实施例4的气液模块的结构示意图；

图18为实施例5的光学检测模块的检测方法的均分周期示意图；

图19为实施例5的光学检测模块的检测方法的非均分周期示意图；

图20为实施例5的光学检测模块的检测方法的调制信号组合示意图；

图21为实施例52的双同轴光路的荧光信号示意图；

图22为实施例5的单个荧光信号的调制曲线拟合示意图；

图23为实施例5的采用TTL电平调制，时间片段周期示意图；

图24为实施例5的多通道荧光信号值示意图；

图25为实施例6的某一探测器探测到的在激光器常亮情况下，微滴运动过程中的荧光信号波形图；

图26为实施例6的激光器1的调制信号示意图；

图27为实施例6的激光器2的调制信号示意图；

图28为实施例6的激光器调制情况下，荧光光信号波形图；

图29为实施例6的荧光光信号频谱图；

图30为实施例6的激光器1的荧光调制信号示意图；

图31为实施例6的激光器2的荧光调制信号示意图；

图32为实施例6的激光器1的荧光原始信号示意图；

图33为实施例6的激光器2的荧光原始信号示意图；

图34为实施例6的采用SPWM法进行信号调制示意图。

附图标记说明：

1—可升降扩增模块；

10—温控子模块；101—上导向柱；102—升降框；103—弹簧；104—风扇；105—温控箱；106—压板；107—温控腔；108—帕尔贴；109—散热片；1060—工作窗口；1061—进样与采集窗口；1062—旋转阀调节窗口；1063—回流油窗口；

11—第一升降子模块；110—X轨道；111—X滑板；112—下导向柱；113—升降底板；114—升降驱动块；115—限位槽；116—摇杆；117—驱动销；118—第一升降驱动机构；1180—轴承座；1181—升降驱动轴；1182—升降带轮；1183—第一升降电机；

2—进样控制与微滴信号采集集成模块；

20—进样控制子模块；201—内安装架；202—旋转驱动机构；203—气液压头；204—旋转杆；2020—旋转电机；2021—主动齿轮；2022—从动齿轮；2023—光耦挡片；2024—槽型光耦；2030—安装座；2031—压头块；2032—第一侧形成输气入口；2033—输气出口；2034—输油入口；2035—输油出口；

21—微滴信号采集子模块；

22—第二升降子模块；220—外安装架；221—Z滑轨；222—Z滑块；223—第二升降电机；224—丝杆；225—丝杆螺母；

23—Y位移子模块；230—支撑架；231—Y滑轨；232—Y滑块；233—Y电机；234—Y主动带轮；235—Y从动带轮；236—Y同步带；

3—气液模块；30—气罐；31—气泵；32—生成油罐；33—回流油罐；

4—光学检测模块；

40—激发光子模块；400—激发光单元；401—激光器；402—准直镜；403—光阑；404—激光二色镜；

41—荧光检测子模块；410—荧光检测单元；411—第一荧光二色镜；412—荧光滤光片；413—荧光聚焦透镜；414—荧光探测器；415—第二荧光二色镜；416—滤激光二色镜；

42—Y型光纤；420—合束光纤部；421—激光光纤部；422—荧光收集光纤部；

5—高通量扩增芯片；50—扩增单元组；51—扩增单元；52—总回流油入口；

01—总回流油入口52；02—扩增载体；03—旋转阀；04—生成油道；05—回流油道；06—样品通道；07—通气通道；08—进样通道；09—出样通道；010—生成油口；011—回流油口；012—样品口；

6—待测微滴。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

数字微滴检测的基本流程包括样品准备、数字化微滴生成、微滴扩增或微滴反应、微滴检测和数据分析等环节。以数字核酸检测为例，样品准备包括将核酸样品、引物、探针、扩增用的预混液、水等按照特定比例混合好以后，放在微滴生成孔的位置，并采用剪切油的方式或其他微滴生成方式，实现将样品分割成数万个微滴。之后在每个微滴中进行复制反应实现核酸的放大。进而，通过流体系统进行微滴的逐个分隔，每个微滴分隔开以后进行微滴荧光信号的检测。最后对每个微滴的荧光信号进行处理，并根据统计学方法最终计算出原始样品的浓度值。以单分子免疫为例进行说明，进行样品准备后，通过一步法或两步法实现微球带荧光标记后，采用微滴分割方式将微球分割到不同的微滴中，之后将微滴依次经过光学检测区域实现每个微球的荧光信号的识别，最终通过泊松分布计算浓度值。

本发明提供的全自动一体化高通量数字核酸检测系统集微滴生成、微滴扩增、微滴检测于一体，其中，用于实现微滴生成的高通量扩增芯片与专利CN115155682A公开的基于旋转阀的微流控芯片的主要结构和原理基本相同，以下对该微流控芯片的工作原理进行简要说明，参照图1，为该微流控芯片的结构示意图，其包括芯片本体，所述芯片本体内设置有生成油道(4)、回流油道(5)、样品通道(6)和通气通道(7)，其中所述生成油道(4)的一端和样品通道(6)侧壁连通，所述生成油道(4)内的生成油进入到样品通道(6)内，对样品进行剪切形成微滴；所述生成油道(4)、回流油道(5)、样品通道(6)背向旋转阀(3)的一端设置为生成油口(10)、回流油口(11)和样品口(12)，所述生成油口(10)、回流油口(11)和样品口(12)和外部连通。当所述旋转阀(3)旋转到生成位时，所述样品通道(6)和进样通道(8)连通，出样通道(9)和通气通道(7)连通，当所述旋转阀(3)旋转到检测位时，所述出样通道(9)和样品通道(6)连通，所述进样通道(8)和回流油道(5)连通，所述扩增载体(2)内的微滴通过出样通道(9)进入到样品通道(6)内，实现回流检测。

参照图2A-2C(图2中的结构为原理示意)，工作流程主要分为三个部分：微滴生成(图2A)、微滴扩增(图2B)和回流检测(图2C)，具体如下：

(1)如图2A，首先控制旋转阀使样品流道与扩增载体连通，在生成油口10与样品口12施加正压，在十字流道处将会形成剪切流，样本将会被分割成体积一致的微滴，微滴生成后将不断流入到末端的扩增载体2中；

(2)微滴全部流入扩增载体2中后，对扩增载体2中的微滴进行扩增；

(3)当扩增完成后，通过芯片最左端的回流油口11施加正压，将回流油(与生成油性质类似)压入扩增载体2内，由于微滴密度小于回流油密度，微滴浮在扩增载体2上层，率先被压入样品通道6，同时对生成油口10相施加正压，微滴依次向左侧通过十字流道后会间隔一定距离排布，在十字通道左侧设置光学检测模块即可完成对微滴的数字核酸检测。

更为详细的结构与原理(尤其是旋转阀的结构与原理)说明参见专利CN115155682A，本发明不再赘述。

实施例1

参照图3，本实施例的一种全自动一体化高通量数字核酸检测系统，包括高通量扩增芯片5，高通量扩增芯片5上设置有扩增单元51，扩增单元51包括微流道以及设置在微流道上的样品口012、生成油口010、回流油口011、旋转阀03、扩增载体；进一步的，该系统还包括：

可升降扩增模块1，其包括用于对高通量扩增芯片5提供扩增所需温度环境的温控子模块10以及用于对温控子模块10提供Z方向位移的第一升降子模块11；

进样控制与微滴信号采集集成模块2，其包括进样控制子模块20、微滴信号采集子模块21以及用于为进样控制子模块20、微滴信号采集头提供Z方向位移的第二升降子模块22，进样控制子模块20包括用于对样品口012施加正压气体以实现进样的输气通道、用于向生成油口010中输入生成油的输油通道以及用于对旋转阀03施加转动驱动力的旋转杆204，微滴信号采集子模块21用于采集微流道中完成扩增后的微滴的荧光信号；

气液模块3，其用于为进样控制子模块20提供气体和生成油，以及为高通量扩增芯片5的回流油口011输送回流油；

以及光学检测模块4，其接收微滴信号采集子模块21采集的荧光信号，实现对微滴的核酸检测。

实施例2

参照图4-8，作为实施例1的基础上的进一步改进，本实施例中，第一升降子模块11包括X轨道110、可沿X方向滑动设置在X轨道110上的X滑板111、设置在X滑板111上的若干下导向柱112、可沿Z方向滑动设置在下导向柱112上的升降底板113、连接在升降底板113底部的若干升降驱动块114、沿Y方向开设在升降驱动块114上的限位槽115、可绕X轴转动设置在X滑板111上的摇杆116、连接在摇杆116上且插设在限位槽115内的驱动销117以及用于驱动摇杆116转动的第一升降驱动机构118；

X滑板111能够在X轨道110上滑动，从而可将X滑板111整体抽出，以便于放置高通量扩增芯片5。

第一升降驱动机构118包括通过轴承座1180可转动设置在X滑板111上的两根升降驱动轴1181、连接在升降驱动轴1181上的升降带轮1182、驱动连接两根升降驱动轴1181上的两个升降带轮1182的升降同步带(图中未示出)以及与一根升降驱动轴1181驱动连接的第一升降电机1183。

本实施例，温控子模块10包括设置在升降底板113上的4根上导向柱、可沿Z方向滑动设置在上导向柱上的升降框102、连接在升降底板113和升降框102之间的若干弹簧103、设置在升降底板113上的若干风扇104、设置在升降框102上的若干温控箱105以及设置在温控箱105上方的压板106。

本实施例，温控箱105上开设有用于容纳高通量扩增芯片5的温控腔107，压板106保持位置固定，驱动销117随摇杆116转动而产生Z方向的位移，驱动销117相对限位槽115同时进行水平方向和垂直方向的移动，在垂直方向上驱动销117与限位槽115内壁接触，从而促使升降驱动块114沿Z方向位移以带动升降底板113进行升降，最终使得温控箱105相对压板106进行Z方向的移动，以使温控腔107中的高通量扩增芯片5压紧或远离压板106；

例如，在高通量扩增芯片5靠近并压紧压板106的过程中，升降驱动块114带动升降底板113上升，升降底板113再通过弹簧103对升降框102施加向上的作用力，使得升降框102上的温控腔107上升，最终使温控腔107中的高通量扩增芯片5上升并以柔性方式压紧压板106，既能保证压紧，又能避免刚性碰撞和过度上升而损坏相关机构。

温控腔107的底部设置有帕尔贴108，帕尔贴108的底部设置有散热片109，散热片109处于风扇104的上方。

参照图2和图6，本实施例中，高通量扩增芯片5上阵列设置有若干扩增单元组50，每个扩增单元组50均包括关于Y轴方向对称布置的两个扩增单元51，同一个扩增单元组50上的两个扩增单元51共用一个生成油口010，同一个高通量扩增芯片5上的所有扩增单元51的回流油口011均汇集至一个总回流油入口52；

即本实施例中的高通量扩增芯片5与专利CN115155682A中的微流控芯片的不同之处主要在于，本实施例中的高通量扩增芯片5上阵列有多个扩增单元组50，且每两个扩增单元51共用一个生成油口010，所有扩增单元51的回流油口011均汇集至一个总回流油入口52。而单个扩增单元51中的流道结果与CN115155682A中的微流控芯片相同。

参照图7，本实施例中，压板106上设置有若干个工作窗口1060，工作窗口1060包括开设在压板106上的进样与采集窗口1061、旋转阀03调节窗口1062及回流油窗口1063；

工作窗口1060的数量和位置与高通量扩增芯片5的数量一一对应，高通量扩增芯片5压紧压板106时，该高通量扩增芯片5与压板106上的一个工作窗口1060对应匹配，此时该工作窗口1060的回流油窗口1063与该高通量扩增芯片5的总回流油入口52对齐，该高通量扩增芯片5上的所有样品口012、生成油口010均处于该工作窗口1060的进样与采集窗口1061内，该高通量扩增芯片5上的所有旋转阀03均分别匹配对准一个旋转阀03调节窗口1062。

本实施例中，温控箱105包括三个，风扇104数量也为与之对应的3个，工作窗口1060的数量也为3个。

本实施例中，高通量扩增芯片5上阵列设置有8组扩增单元组50，共16个扩增单元51，16个旋转阀03，对称分布在两侧，16个样品口012；两个扩增单元51共用一个生成油口010，共8个生成油口010。与之对应的，每个工作窗口1060中，包括16个旋转阀03调节窗口1062，对称分布在两侧，以与旋转阀03对应，从而通过旋转阀03调节窗口1062操作旋转阀03调节窗口1062。16个样品口012和8个生成油口010均处于的进样与采集窗口1061内。

实施例3

参照图9-14，作为实施例1或2的基础上的进一步改进，本实施例中，进样控制子模块20包括内安装架201、设置在内安装架201上的两个旋转驱动机构202以及连接在内安装架201底部的气液压头203；

旋转杆204包括设置在内安装架201上且对称布置在气液压头203两侧的两根，与两个旋转驱动机构202一一对应，以通过旋转驱动机构202带动旋转杆204旋转，以对旋转阀03进行控制；旋转杆204通过轴承可转动连接在安装架上；

旋转驱动机构202包括旋转电机2020、固定套设在旋转电机2020的输出轴上的主动齿轮2021以及固定套设在旋转杆204上且与主动齿轮2021啮合的从动齿轮2022。

旋转电机2020的输出轴通过主动齿轮2021带动从动齿轮2022旋转，从而带动旋转杆204旋转，最终通过旋转杆204伸入旋转阀03，实现旋转阀03的控制。

在优选的实施例中，旋转电机2020的输出轴上连接有光耦挡片2023，内安装架201上设置有用于与光耦挡片2023配合的槽型光耦2024。光耦挡片2023与槽型光耦2024配合以实现旋转电机2020的输出轴的旋转位置的定位，从而实现对旋转杆204的旋转位置的控制。

本实施例中，气液压头203包括连接在内安装架201底部的安装座2030以及设置在安装座2030底面的压头块2031，输气通道(图中未示出)形成于气液压头203内部，并在安装座2030的第一侧形成输气入口2032、在压头块2031的底面形成两个输气出口2033；输油通道(图中未示出)形成于气液压头203内部，并在安装座2030的第二侧形成输油入口2034、在压头块2031的底面形成一个输油出口2035。

本实施例中，第二升降子模块22包括外安装架220、沿Z方向设置在外安装架220上的Z滑轨221、连接在内安装架201上且配合设置在Z滑轨221上的Z滑块222、设置在外安装架220上的的第二升降电机223、与第二升降电机223的输出轴连接的丝杆224以及连接在内安装架201上且配合套设在丝杆224上的丝杆螺母225。第二升降电机223通过驱动丝杆224旋转，配合丝杆螺母225，从而能够带动内安装架201整体进行升降，以调节内安装架201上的气液压头203、旋转杆204以及微滴信号采集头在Z方向的位置。

本实施例中，进样控制与微滴信号采集集成模块2还包括Y位移子模块23，Y位移子模块23包括支撑架230、沿Y方向设置在支撑架230顶部的Y滑轨231、配合设置在Y滑轨231上的Y滑块232、设置在支撑架230上的Y电机233、固定套设在Y电机233的输出轴上的Y主动带轮234、可转动连接在支撑架230上的Y从动带轮235以及连接在Y主动带轮234和Y从动带轮235之间的Y同步带236；外安装架220连接在Y滑块232上，且外安装架220与Y同步带236固定连接。

Y电机233通过Y主动带轮234、Y从动带轮235带动Y同步带236运动，从而能够实现外安装架220整体在Y方向的移动，以调节内安装架201上的气液压头203、旋转杆204以及微滴信号采集头在Y方向的位置。

气液压头203上的两个输气出口2033、一个输油出口2035正好与一组扩增单元51中的两个样品口012、一个生成油口010对应，通过输气出口2033向样品口012中施加正压，使得样品口012中预先加入的样品被挤入到内部的样品通道中，通过输油出口2035向两个扩增单元51共用的一个生成油口010中输入生成油，以进行微滴生成；从而能够单次实现两个扩增单元51的微滴生成操作，提高了效率。而总回流油入口52通过管路直接与气液模块3连通，当高通量扩增芯片5上所有扩增单元51均完成微滴生成、微滴扩增后，提供的回流油经总回流油入口52进入，然后输送至每个扩增单元51的回流油口011中，然后通过微滴信号采集头对每个扩增单元51中的微滴依次进行光学检测；由于微滴信号采集头设置有两个，所以可同时对组扩增单元51进行光学检测。

在上述微滴生成、光学检测过程中，第二升降子模块22实现Z方向的位置调节，Y位移子模块23实现Y方向的位置调节，从而能够保证气液压头203、旋转杆204以及微滴信号采集头工作所需的位移功能。

在一种实施例中，该全自动一体化高通量数字核酸检测系统整体的工作流程为：

1、将X滑板111抽出，将3块高通量扩增芯片5分别放置到3个温控箱105内，再推入X滑板111；第一升降驱动机构118工作，带动3个温控箱105上升，使得高通量扩增芯片5与上方的压板106压紧，总回流油入口52与回流油窗口1063对齐、旋转阀03与旋转阀03调节窗口1062对其；

2、控制气液模块3的外安装架220整体沿Y方向移动到左端，使得气液压头203、旋转杆204与左侧第一个扩增单元51中对应位置对准，控制内安装架201及其上的气液压头203、旋转杆204下降，旋转杆204插入旋转阀03内，气液压头203上的输气出口2033与样品口012对准并压紧，输油出口2035与生成油口010对准并压紧，旋转杆204旋转将旋转阀03调节至生成位，生成油和样本均进入，进行微滴生成，生成的微滴进入扩增载体内；然后外安装架220整体向后移动，重复上述步骤，进行下一个扩增单元51的微滴生成；

3、3块高通量扩增芯片5的所有扩增单元51均完成微滴生成后，温控子模块10工作，进行扩增；

4、左侧第一块高通量扩增芯片5完成扩增后，控制气液模块3的外安装架220整体沿Y方向移动到左端，使得气液压头203、旋转杆204与左侧第一个扩增单元51中对应位置对准，控制内安装架201及其上的气液压头203、旋转杆204以及微滴信号采集头下降，旋转杆204插入旋转阀03内，此时微滴信号采集头聚焦于十字流道左侧的样品通道，将旋转阀03调节至检测位，生成油与回流油同时加入，微滴经过十字流道流入样品通道内，在微滴经过十字流道后，微滴间距被拉开，然后与样品通道中通过微滴信号采集头实现荧光激发与采集，然后通过光学检测模块4实现荧光探测；之后按照此方法完成所有高通量扩增芯片5的扩增单元51的荧光探测。

实施例4

参照图15，作为实施例1或2或3的基础上的进一步改进，本实施例中，光学检测模块4包括激发光子模块40、荧光检测子模块41以及连接激发光子模块40和荧光检测子模块41的Y型光纤42；

Y型光纤42包括合束光纤部420、于合束光纤部420的近端分叉形成Y型的激光光纤部421和荧光收集光纤部422；

激发光子模块40出射的激发光经激光光纤部421进入Y型光纤42，并由合束光纤部420的远端出射到待测微滴6上，待测微滴6发出的荧光经合束光纤部420的远端进入Y型光纤42，然后由荧光收集光纤部422输出到荧光检测子模块41中，实现荧光检测；

合束光纤部420的远端连接至微滴信号采集头。微滴信号采集头用于收集待测微滴6发出的荧光，在一种实施例中，微滴信号采集头可为聚焦透镜。

参照图16，在优选的实施例中，激发光子模块40包括N路激发光单元400，用以出射N种波长的激发光，激发光单元400包括沿激发的出射光路依次设置的激光器401、准直镜402、光阑403和激光二色镜404，由激光二色镜404出射的激光进入激光光纤部421。荧光检测子模块41包括N路荧光检测单元410，用以实现N种波长的荧光的探测，荧光检测单元410包括沿荧光的入射光路依次设置第一荧光二色镜411、荧光滤光片412、荧光聚焦透镜413和荧光探测器414，荧光收集光纤部422出射的荧光由入射到第一荧光二色镜411。本实施例中，以N为4进行了示意。4路荧光检测单元410中最左侧一路中省去第一荧光二色镜411，且右侧的荧光检测单元410的第一荧光二色镜411和Y型光纤42之间还设置有第二荧光二色镜415和滤激光二色镜416；最左侧的激发光单元400中的激光二色镜404可替换为反射镜。

参照图17，气液模块3用于提供气源、生成油和回流油，在优选的实施例中，气液模块3包括若干气罐30、设置在气罐30上的气泵31、生成油罐32和回流油罐33等，生成油罐32和回流油罐33中的油通过气泵31压出到达输油入口2034和总回流油入口52。

实施例5

常用的荧光通道按波长从小到大排列依次为ATTO425、FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5、Cy5.5和Cy7等，当然中间的荧光通道如cy3、德克萨斯红等其他只要可制备对应探针的染料或者其他复合染料都可以。对应合适的激发波长大约分别为420nm、488nm、532nm、590nm、635nm、690nm、740nm左右，通常相邻的两个荧光通道存在一定的荧光串扰，为避免由于激光串扰导致的问题，本实施例提供一种光学检测模块4的检测方法，包括以下步骤：

设置每个周期内的N路荧光检测单元410中的激光器401的调制信号的时序；

按照设置的激光器401的调制信号的时序开启激光器401；

在激光器401开启的时间内通过对应的荧光探测器414采集荧光信号；

通过每个激光器401的调制信号的时序进行荧光信号的分解。

为了降低激光通道的有效占空比，依次进行多个通道的激光开启和关闭操作。

当调制信号为数字脉冲信号时，如图18所示，可设置激光调制高电平T1＝T2＝T3＝T4＝1/4T。

由于不同的波长光源的特性不同，在实际操作过程中可针对不同波长光源的开关时间进行调整，确保每个高电平周期内激光器401可稳定保持1微秒以上。如图19所示，根据激发光源62的波长，设置每个周期内的多通道激发光源62的调制信号的占空比；图18中，ch1、ch2、ch3和ch4分别代表四个不同的荧光通道(如FAM、HEX、ROX和cy5)。

将设置的激光器401调制信号的占空比同步至对应的荧光探测器414；荧光探测器414和激光器401的有效使用时间同步或接近同步。

按照设置的激光器401的调制信号的占空比开启激光器401；

在激光器401开启的时间内通过对应的荧光探测器414采集荧光信号。

从荧光光谱上来看，FAM和ROX的重叠较少，HEX和CY5的重叠较少，为更好地利用硬件资源，综合考虑不同通道间的荧光光谱的重叠情况，进行调制信号的组合激发，能够进一步降低多通道调制的难度，同时也提高有效信号的检出。如图20所示，还包括以下步骤：

将非相邻荧光通道对应的激发光源62的调制信号在同一个周期内进行组合激发。

当检测通道更多的时候，可以按照类似的方法进行组合，可以采用2+2，2+3，3+3，1+2+1等类似的组合方式。

当激光光路和荧光光路组成同轴光路时，还可以包括以下步骤：

将激光光路和荧光光路组成的同轴光路中的激发光源62的调制信号在同一个周期内组合激发。

如图21所示，图21中，ch1对应第一光源161，ch3对应第二光源162，ch2对应第三光源169，ch4对应第四光源1610，从光谱上来看，第一光源161和第二光源162的荧光通道需选择荧光串扰较低的通道，第三光源169和第四光源1610的荧光通道需选择荧光串扰较低的通道，如FAM和ROX，HEX和CY5等，则可按照图17进行微滴信号采集和处理。

当采用单个探测器34进行荧光信号的采集时，常规单个荧光信号的调制曲线拟合如图22所示，将多个光源采用TTL电平调制控制。具体地，包括以下步骤：

当调制信号为TTL电平信号时，固定单位时间周期T，设置单位时间周期内的激光器401的调制信号的时间；

在单位时间周期内按照设置的时间逐个开启每个激光器401；

对应的荧光探测器414在激光器401开启的时间内获得荧光信号，进而实现相应荧光通道的微滴信号的获取；

图23中描述了通道1的荧光信号的获取的过程，其他荧光通道的荧光信号的获取原理类似。

结合各个激光器401的调制信号的时序，进行荧光信号的分解，并从中剥离出各个通道的荧光信号值，如图24所示，从而能够实现同时实现多重荧光信号的采集。

实施例6

对于激发谱不存在重叠的系统中，通过频分复用技术，可以实现单探测器34多路荧光信号的检测。基于此，本实施例提供一种光学检测模块4的检测方法，包括以下步骤：包括以下步骤：

某一荧光探测器414探测到的在激光器401常亮情况下，微滴运动过程中的荧光信号波形如图25所示，此信号为两个激光器401激激发一种荧光基团的荧光信号的叠加，无法分离信号；

采用不同频率的调制信号调制不同波长的激光器401；激光器1的调制信号如图26所示，激光器2的调制信号如图27所示；

激光器401发射的激发光通过光纤合并，分别激发待测微滴中的荧光基团，得到不同波长的荧光信号；

通过荧光探测器414接收荧光信号，如图28所示，该信号的频谱如图29所示，可见f1和f2两个特征峰；

通过接收到的荧光信号的频谱特性将荧光信号分离；得到激光器1的荧光调制信号如图30所示，激光器2的荧光调制信号如图31所示；

通过对分离出的荧光信号进行解调，分离出串扰信号。激光器1的荧光原始信号如图32所示，激光器2的荧光原始信号如图33所示。

在数字系统中，常用SPWM法进行信号的调制，具体如图34所示。

采用频分复用的方法，使得不同波长的激发光可以在同一根光纤中传输，极大地提高了通道的复用率，相对于时分复用而言，采用高频调制，提高了信号采集通道的利用率。

以上，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上而顺畅地实施本发明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种全自动一体化高通量数字核酸检测系统，包括高通量扩增芯片，所述高通量扩增芯片上设置有扩增单元，所述扩增单元包括微流道以及设置在所述微流道上的样品口、生成油口、回流油口、旋转阀、扩增载体；其特征在于，该系统还包括：

可升降扩增模块，其包括用于对所述高通量扩增芯片提供扩增所需温度环境的温控子模块以及用于对所述温控子模块提供Z方向位移的第一升降子模块；

进样控制与微滴信号采集集成模块，其包括进样控制子模块、微滴信号采集子模块以及用于为所述进样控制子模块、微滴信号采集头提供Z方向位移的第二升降子模块，所述进样控制子模块包括用于对所述样品口施加正压气体以实现进样的输气通道、用于向所述生成油口中输入生成油的输油通道以及用于对所述旋转阀施加转动驱动力的旋转杆，所述微滴信号采集子模块用于采集微流道中完成扩增后的微滴的荧光信号；

气液模块，其用于为所述进样控制子模块提供气体和生成油，以及为所述高通量扩增芯片的回流油口输送回流油；

以及光学检测模块，其接收所述微滴信号采集子模块采集的荧光信号，实现对微滴的核酸检测。

2.根据权利要求1所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述第一升降子模块包括X轨道、可沿X方向滑动设置在所述X轨道上的X滑板、设置在所述X滑板上的若干下导向柱、可沿Z方向滑动设置在所述下导向柱上的升降底板、连接在所述升降底板底部的若干升降驱动块、沿Y方向开设在所述升降驱动块上的限位槽、可绕X轴转动设置在所述X滑板上的摇杆、连接在所述摇杆上且插设在所述限位槽内的驱动销以及用于驱动所述摇杆转动的第一升降驱动机构；

所述第一升降驱动机构包括通过轴承座可转动设置在所述X滑板上的两根升降驱动轴、连接在所述升降驱动轴上的升降带轮、驱动连接两根升降驱动轴上的两个升降带轮的升降同步带以及与一根升降驱动轴驱动连接的第一升降电机。

3.根据权利要求2所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述温控子模块包括设置在所述升降底板上的若干上导向柱、可沿Z方向滑动设置在所述上导向柱上的升降框、连接在所述升降底板和升降框之间的若干弹簧、设置在所述升降底板上的若干风扇、设置在所述升降框上的若干温控箱以及设置在所述温控箱上方的压板。

4.根据权利要求3所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述温控箱上开设有用于容纳所述高通量扩增芯片的温控腔，所述压板保持位置固定，所述驱动销随摇杆转动而产生Z方向的位移，从而促使所述升降驱动块沿Z方向位移以带动所述升降底板进行升降，最终使得所述温控箱相对所述压板进行Z方向的移动，以使所述温控腔中的高通量扩增芯片压紧或远离所述压板；

所述温控腔的底部设置有帕尔贴，所述帕尔贴的底部设置有散热片，所述散热片处于所述风扇的上方。

5.根据权利要求4所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述高通量扩增芯片上阵列设置有若干扩增单元组，每个扩增单元组均包括关于Y轴方向对称布置的两个扩增单元，同一个扩增单元组上的两个扩增单元共用一个生成油口，同一个高通量扩增芯片上的所有扩增单元的回流油口均汇集至一个总回流油入口；

所述压板上设置有若干个工作窗口，所述工作窗口包括开设在所述压板上的进样与采集窗口、旋转阀调节窗口及回流油窗口；

所述工作窗口的数量和位置与高通量扩增芯片的数量一一对应，所述高通量扩增芯片压紧所述压板时，该高通量扩增芯片与压板上的一个工作窗口对应匹配，此时该工作窗口的回流油窗口与该高通量扩增芯片的总回流油入口对齐，该高通量扩增芯片上的所有样品口、生成油口均处于该工作窗口的进样与采集窗口内，该高通量扩增芯片上的所有旋转阀均分别匹配对准一个所述旋转阀调节窗口。

6.根据权利要求1所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述进样控制子模块包括内安装架、设置在所述内安装架上的两个旋转驱动机构以及连接在所述内安装架底部的气液压头；

所述旋转杆包括设置在所述内安装架上且对称布置在所述气液压头两侧的两根，与两个旋转驱动机构一一对应，以通过所述旋转驱动机构带动所述旋转杆旋转，以对旋转阀进行控制；

所述旋转驱动机构包括旋转电机、固定套设在所述旋转电机的输出轴上的主动齿轮以及固定套设在所述旋转杆上且与所述主动齿轮啮合的从动齿轮；

所述旋转电机的输出轴上连接有光耦挡片，所述内安装架上设置有用于与所述光耦挡片配合的槽型光耦。

7.根据权利要求6所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述气液压头包括连接在所述内安装架底部的安装座以及设置在所述安装座底面的压头块，所述输气通道形成于所述气液压头内部，并在所述安装座的第一侧形成输气入口、在所述压头块的底面形成两个输气出口；

所述输油通道形成于所述气液压头内部，并在所述安装座的第二侧形成输油入口、在所述压头块的底面形成一个输油出口。

8.根据权利要求7所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述第二升降子模块包括外安装架、沿Z方向设置在所述外安装架上的Z滑轨、连接在所述内安装架上且配合设置在所述Z滑轨上的Z滑块、设置在所述外安装架上的的第二升降电机、与所述第二升降电机的输出轴连接的丝杆以及连接在所述内安装架上且配合套设在所述丝杆上的丝杆螺母。

9.根据权利要求8所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述进样控制与微滴信号采集集成模块还包括Y位移子模块，所述Y位移子模块包括支撑架、沿Y方向设置在所述支撑架顶部的Y滑轨、配合设置在所述Y滑轨上的Y滑块、设置在所述支撑架上的Y电机、固定套设在所述Y电机的输出轴上的Y主动带轮、可转动连接在所述支撑架上的Y从动带轮以及连接在所述Y主动带轮和Y从动带轮之间的Y同步带；

所述外安装架连接在所述Y滑块上，且所述外安装架与Y同步带固定连接。

10.根据权利要求1所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述光学检测模块包括激发光子模块、荧光检测子模块以及连接所述激发光子模块和荧光检测子模块的Y型光纤；

所述Y型光纤包括合束光纤部、于所述合束光纤部的近端分叉形成Y型的激光光纤部和荧光收集光纤部；

所述激发光子模块出射的激发光经所述激光光纤部进入所述Y型光纤，并由所述合束光纤部的远端出射到待测微滴上，待测微滴发出的荧光经所述合束光纤部的远端进入所述Y型光纤，然后由所述荧光收集光纤部输出到所述荧光检测子模块中，实现荧光检测；

所述合束光纤部的远端连接至所述微滴信号采集头。

11.根据权利要求10所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述激发光子模块包括N路激发光单元，用以出射N种波长的激发光，所述激发光单元包括沿激发的出射光路依次设置的激光器、准直镜、光阑和激光二色镜，由所述激光二色镜出射的激光进入所述激光光纤部。

12.根据权利要求11所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述荧光检测子模块包括N路荧光检测单元，用以实现N种波长的荧光的探测，所述荧光检测单元包括沿荧光的入射光路依次设置第一荧光二色镜、荧光滤光片、荧光聚焦透镜和荧光探测器，所述荧光收集光纤部出射的荧光由所述入射到所述第一荧光二色镜。

13.根据权利要求11或12所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述光学检测模块的检测方法包括以下步骤：

设置每个周期内的N路荧光检测单元中的激光器的调制信号的时序；

按照设置的激光器的调制信号的时序开启激光器；

在激光器开启的时间内通过对应的荧光探测器采集荧光信号；

通过每个激光器的调制信号的时序进行荧光信号的分解。

14.根据权利要求13所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，当所述调制信号为数字脉冲信号时，根据激光器出射激光的波长，设置每个周期内的激光器的调制信号的占空比；

将设置的激光器的调制信号的占空比同步至对应的荧光探测器；

按照设置的激光器的调制信号的占空比开启激光器；

在激光器开启的时间内通过对应的荧光探测器采集荧光信号。

15.根据权利要求13所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，当所述调制信号为TTL电平信号时，固定单位时间周期，设置所述单位时间周期内的激光器的调制信号的时间；

在所述单位时间周期内按照设置的时间逐个开启每个激光器；

对应的荧光探测器在激光器开启的时间内获得荧光信号；

结合各个激光器的调制信号的时序，进行荧光信号的分解，并从中剥离出各个通道的荧光信号值。

16.根据权利要求11或12所述的全自动一体化高通量数字核酸检测系统，其特征在于，所述光学检测模块的检测方法包括以下步骤：包括以下步骤：

采用不同频率的调制信号调制不同波长的激光器；

激光器发射的激发光通过光纤合并，分别激发待测微滴中的荧光基团，得到不同波长的荧光信号；

通过荧光探测器接收荧光信号；

通过接收到的荧光信号的频谱特性将荧光信号分离；

通过对分离出的荧光信号进行解调，分离出串扰信号。

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