CN100376683C - 聚合酶链式反应芯片微系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微型聚合酶链式反应(PCR)芯片系统及其制备方法，涉及生物微机电系统技术领域。该PCR芯片包括若干个用于DNA扩增的阱式反应池，反应池通过若干流道与进出液口连接。在芯片上集成微加热器和微传感器，通过温度循环控制系统进行DNA扩增。可以在该芯片上设置微泵，在反应池入口处设置微阀，用于DNA引物的导入及反应池间的隔离。也可以在上述系统中设置荧光激发光源、荧光探测装置及荧光信号检测分析系统进行PCR产物的荧光在位检测。采用MEMS技术加工技术或微模型制备该芯片系统，该生物芯片系统提供了高通量和快速的DNA扩增手段，并具有便于携带、成本低和性能可靠的优点。

Description

聚合酶链式反应芯片微系统

技术领域

本发明涉及微型生物芯片系统技术领域，特别涉及一种聚合酶链式反应芯片微系统的设计及其制作方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)技术是一种扩增DNA的常用技术，也是微量/痕量级检测生物分子必不可少的手段。PCR是在特定的温度下进行变性、退火和延伸的三温循环过程，每完成一次温度循环，DNA分子的数量翻一番，即DNA以2ⁿ形式递增，经过20-30次温度循环，DNA将被扩增上百万倍。传统的PCR在反应室体积为几十到几百微升的96孔板上完成，PCR后的DNA样品需再经过电泳、荧光检测、数据分析等过程，约耗费几个小时的时间，且整个系统庞大，操作复杂。荧光定量PCR反应是近年来发展的一类新的核酸定量检测技术，该技术在设计的PCR芯片上应用荧光标记DNA探针，根据荧光淬灭的原理，通过直接对反应中荧光变化量的检测来分析反应的结果。它不仅具有普通PCR反应的高敏感性，而且由于荧光探针的应用，可以通过荧光检测系统直接探测PCR扩增反应过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。

生物分析仪器和过程的小型化和集成化已成为21世纪生命科学、微电子学、化学等研究领域的重要方向之一，芯片微系统具有高通量、高灵敏度、成本低、实验结果可靠、易于操作等优点。操作简单的微型分析系统可以快速侦检空气、食物、水及工作环境安全。医生可以在办公室内用手掌般大小的芯片，数分钟内诊断出病人的疾病，对症下药。阵列式分析实验室可以快速且大量合成及筛选新药，加速新药的开发。便携式荧光定量PCR芯片微系统适用于多种病毒、细菌的实时监测和人类、动物和植物等各种生物的多种基因重排、突变和缺损的鉴定，在国防预警、灾害预防、临床疾病诊断、人类基因组分析、基因多态性鉴定、动、植物基因变异筛选等有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量的用于微量/痕量生物分子监测的聚合酶链式反应芯片微系统，该芯片系统可同时进行上千种样品的扩增，且集成荧光信号检测分析系统，直接进行PCR扩增产物的荧光在位检测。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种聚合酶链式反应芯片微系统，包括用于DNA扩增的聚合酶链式反应(PCR)芯片、热循环系统和荧光在位检测系统，聚合酶链式反应芯片包含衬底芯片和芯片封盖，芯片上有进液口、出液口、流道和阵列排列的多个反应池，进、出液口通过流道和每一个反应池连接；热循环系统包括微加热器、微传感器和控温系统，微加热器和微传感器制备在衬底芯片或芯片封盖上，可以采用溅射、蒸发、电子束淀积方法制备铂、铝、金材料的微加热器和微传感器。控制系统以单片机为核心并与微加热器和微传感器相连，控制系统包括A/D转换、PWM电路、线性放大电路、外围电路、数据存储器等电路及其相应软件设计，荧光在位检测系统包括点阵型激发光源、点阵型光电探测器和荧光信号数据处理系统。激发光源和光电探测器点阵位置与上述反应池一一对应。所述激发光源可以是蓝光LED或其它类型激发光源，所述光电探测器可以是硅或化合物半导体光电二极管或光电倍增管，荧光信号数据处理系统以单片机为核心。

在上述的PCR芯片微系统上可以设置用于导入DNA引物的微泵，微泵可以是有阀机械泵、无阀微泵，采用压电、静电、电磁、气热、气动、双金属、电化学方式驱动微泵，微泵可以采用驱动气体而引入液体或直接驱动液体两种方式工作。还可以在上述的PCR芯片的每个反应池入口处设置微阀，用于隔离各个反应池，微阀可以是机械微阀或非机械微阀，采用压电、静电、电磁、气热、气动、双金属、电化学等方式驱动机械微阀。

芯片可以采用硅和玻璃为芯片材料，所述芯片可选择微机械加工技术制备，所述制备方法包括在衬底材料上加工三维反应池、流道、进出液口、微泵和微阀机构，采用透明的聚合物或玻璃作为芯片封盖，在芯片封盖或衬底芯片上开进出液孔，芯片封盖与衬底芯片对准键合封装。

芯片还可以采用聚合物材料利用微模型技术加工制备，所述制备方法包括制备一个负模具，然后在模具上成形三维聚合物芯片结构，方法包括模塑法、热压法、注塑法。采用透明的聚合物或玻璃作为芯片封盖，在芯片封盖或衬底芯片上开进进出液口，芯片封盖与衬底芯片对准键合封装。

上述PCR芯片微系统需进行整合封装，通过接口与计算机相连，通过分析软件控制整个系统，所述芯片微系统可选用Taqman和SYBR Green分子探针进行DNA的扩增。

聚合酶链式反应阵列式芯片微系统的制备方法一，其步骤包括：

(1)在衬底芯片上淀积复合掩膜，掩膜材料可以为氧化硅、氮化硅、光刻胶、金属等；

(2)利用掩膜板在掩膜上进行光刻，形成包括进出液口、反应池、流道、微泵、微阀等结构的转移图形，根据结构的深浅情况选择掩膜板的数量；

(3)湿法腐蚀或干法刻蚀硅或玻璃芯片，形成进出液口、反应池、流道、微泵、微阀等图形的三维结构；

(4)腐蚀或刻蚀掉衬底芯片上剩余的掩膜，在芯片上沉积一层不抑制PCR反应的薄膜材料，如SiO₂；

(5)在衬底芯片或芯片盖片上沉积金属电极，形成微加热器和微传感器，并在芯片上开进出液口孔，将完成的芯片与芯片封盖对准键合，键合方法包括阳极键合和聚合物键合等。

微型聚合酶链式反应芯片系统的制备方法二，其步骤包括：

(1)制作负模具，形成衬底芯片的互补结构，模具材料包括SU-8胶、聚合物、硅、金属等，采用微机械加工技术、LIGA技术、厚胶光刻技术制备模具；

(2)在模具上生长一层脱模材料，以塑料、聚二甲基硅氧烷等聚合物为芯片材料，采用聚合物材料的三维成型方法形成所需形状，如模塑法、热压法、注塑法，剥离芯片得到所需芯片；

(3)采用聚合物或玻璃作为芯片封盖，在衬底芯片或芯片封盖上溅射金属形成微加热器和微传感器，在芯片上开进出液口；

(4)衬底芯片与芯片封盖对准键合，可借助反应离子刻蚀技术活化聚合物及玻璃表面，实现芯片的密封封装，并提高芯片表面的亲水性。还可采用和聚合物键合技术实现芯片封装。

本发明的技术效果：该芯片系统通过阵列式反应池的设计与制备、集成微型热循环系统、集成微泵和微阀及荧光在位检测系统实现，系统工作的基本过程是：荧光标记的不同DNA探针点样在芯片上的反应池内，可以根据需要设计反应池的数量；运行微泵，驱动取样引物进入芯片反应池内；温度循环系统工作，通过程序设定进行PCR反应；反应结束后，荧光检测系统检测反应产物，系统根据荧光的位置和强弱判断反应结果。

该集成微系统可以在60分钟内完成生物种类的检测与鉴别，体现了系统快速的特点。在一个芯片上可设计上千个反应池，体现了芯片系统高通量的特点。集成后的系统比一台笔记本电脑略大，体现了系统的便携式。该芯片系统适用于Taqman、SYBR Green、分子信标等荧光探针，系统本身即构成一个检验科室，可广泛用于各种微量/痕量DNA、蛋白质、病毒、细菌的实时定量监测。

附图说明

图1微型聚合酶链式反应芯片系统的集成方式示意图；

图2微型聚合酶链式反应芯片系统的另一集成方式示意图；

图3硅或玻璃微机械加工技术制备芯片的工艺流程示意图；

图4硅片上加工的阵列式芯片的扫描电子显微镜照片；

图5微模型技术制备芯片的工艺流程示意图；

图6微模型技术制备阵列式聚二甲基硅氧烷芯片的扫描电子显微镜照片；

图7PIN光电探测器的结构抛面示意图。

具体实施方式

本发明的PCR芯片微系统包括用于DNA扩增的聚合酶链式反应芯片和热循环系统，聚合酶链式反应芯片包含进出液口、流道和几个至上千个阱式反应池，进、出液口通过流道和每一个反应池连接。在一个几平方厘米的芯片上可以设计几千个纳升体积的反应池，利用生物分子的寡核柑酸多态性理论在反应池内进行不同PCR反应。上述反应池数量依据需要确定，反应池体积在纳升(nL)与毫升(mL)之间，反应池可以是正方形、矩形、圆形、梯形等形状，流道横截面可以是正方形、矩形、半圆形、梯形等形状。。

热循环系统包括微加热器、微传感器和控温系统，微加热器和微传感器可以是Pt、Al、Au等电阻性材料，采用溅射、蒸发、电子束淀积方法制备，微加热器和微传感器制备在芯片背面或芯片封盖上，微加热器的尺寸及阻值依加热功率决定，加热功率在10mW以上。微加热器和微传感器连接于外部温度控制系统，用于控制芯片上温度的快速转换过程。控制系统以单片机为核心，包括A/D转换、PWM电路、线性放大电路、外围电路、数据存储器等电路及其相应软件设计，通过计算机程序及算法控制单片机和脉宽调制(PWM)电路，功率电路调节加热器加热电压，对芯片进行加热和制冷控制，实现PCR反应过程的集成化。热循环系统还可以采用半导体制冷器及在芯片上设计散热片进行系统降温。最终系统升温速率在1-15℃/s之间，降温速率在1-10℃/s之间。

在芯片上集成微泵和微阀，微泵用于驱动DNA引物流入芯片，避免在芯片内形成气泡及死区，微泵可以是有阀机械泵和微型无阀泵，微型无阀泵可以包括微型射流泵和微型扩散泵。在芯片每个反应池的入口设置微阀，用于防止反应池内液体外泻，避免各反应池内液体混和，微型阀可以是微机械阀或非机械微阀，非机械阀包括无源阀和疏水阀。微泵和微阀可以采用压电、静电、电磁、气热、气动、双金属、电化学等方式驱动。微泵可以直接驱动液体流入反应池，也可以驱动气体在芯片内形成负压而导入液体。

本发明的微型聚合酶链式反应芯片可以通过以下制作实施例实现：

方案一：硅微机械加工工艺，加工流程见示意图3

(1)如图3-a所示，衬底硅片1上淀积复合掩膜，分别为掩膜一12和为掩膜二13，掩膜材料可以为氧化硅、氮化硅或其它材料，如光刻胶、金属掩膜等。

(2)如图3-b所示，利用掩膜板1在掩膜二13上光刻，形成包括反应室5和微泵6的结构图形。

(3)如图3-c所示，利用掩膜板2在掩膜一12上光刻，形成包括流道、扩散阀结构图形。

(4)如图3-d所示，湿法或干法刻蚀硅片，形成反应室5和微泵6结构，具体腐蚀深度根据性能指标确定。

(5)如图3-e所示，将硅片上剩余的掩膜二13除去，湿法或干法刻蚀硅片，刻蚀出流道和扩散阀结构，具体的刻蚀深度根据性能指标确定。

(6)如图3-f所示，将硅片上剩余的掩膜腐蚀掉，并在硅衬底1或玻璃盖片2上溅射金属电极，形成加热器7和传感器8，。

(7)如图3-g所示在芯片封盖上开进出液口孔，可以采用激光打孔、超声打孔或腐蚀的方法。

(8)图3-h所示将刻蚀完的硅片与封盖对准键合，键合方法包括阳极键合和聚合物键合等。

图4给出在硅片上加工出的阵列式芯片结构扫描电子显微镜的照片。

方案二：微模型技术加工阵列式芯片，加工流程见图5，具体步骤是：

(1)如图5-a所示，首先是制作负模具14，其工艺过程为在硅片上光刻并腐蚀出芯片的互补结构，具体步骤与方案一中加工硅基PCR芯片的过程相同。模具14也可以采用其它材料(如SU-8、金属等)利用厚胶光刻、LIGA技术制得。

(2)如图5-b所示，以聚合物材料(如PDMS、PF、PE、PMMA等)为芯片材料15，采用聚合物材料的三维成型方法，如模塑法、热压法、LIGA技术等加工方法在模具上制得聚合物材料的PCR芯片15。

(3)模塑法制备芯片方法包括：首先在模具14长生长和涂覆一层脱模剂，以便于聚合物芯片易于从模具上剥离；将聚合物及其固化剂充分混合14，并在一定真空条件下脱气，去掉混合物内的空气；模具放置于浅盘中，盘的厚度与所需芯片厚度一致；混合的聚合物浇注在模具上，并作进一步脱气；在一定温度和时间条件下固化聚合物，固化温度和时间依据材料性质决定(如图5-b)；从模具上剥离聚合物，得到与负模具图案互补的芯片结构15(如图5-c所示)；

(4)热压法制备芯片需要配备热压装置，其关键的制备方法是：制备一个模具14(金属、硅等材料)(图5-a)；在热压装置中将聚合物基片加热到软化温度；通过在模具上施加一定压力，并保持一定时间，即可在聚合物基片上压制出与模具凹凸互补的芯片结构(图5-b)；在加压的条件下，将模具与基片一起冷却后脱模，得到所需微结构15(图5-c)，在芯片上溅射加热器7和传感器8；

(5)采用聚合物或玻璃作为芯片封盖2，并开进出液口孔，可以采用激光打孔、超声打孔或腐蚀的方法(图5-d)。

(6)芯片与封盖对准键合(图5-e)，键合可借助反应离子刻蚀系统活化聚合物及玻璃表面，实现芯片的密封封装。还可采用聚合物键合实现芯片的封装。。

图6给出微模型技术加工阵列式芯片的扫描电子显微镜照片。

在微型聚合酶链式反应阵列式芯片系统上集成封装荧光在位检测系统，荧光在位检测系统包括荧光激发光源、光电探测器和荧光信号数据处理系统。用于荧光激发的光源可以是蓝光LED或其它类型激发光源，蓝光LED可采用GaN/InGaN LED，也可采用其它类型化合物半导体LED，LED发光波长为400nm-500nm，激发光源位置与上述反应池一一对应。采用金属有机物化学汽相沉积(MOCVD)方法在蓝宝石衬底上异质生长GaN/InGaNLED。GaN/InGaN LED也可采用倒装工艺制备，使光从蓝宝石面发出。用于荧光检测的器件可以是光电探测器或其它类型荧光扫描系统，光电探测器可以是硅或化合物半导体光电二极管或光电倍增管，硅基光电探测器包括PIN、PINN⁺光电二极管、雪崩光电二级光，芯片扫描仪可以是激光共聚焦芯片扫描仪或CCD芯片扫描仪，光电探测器的位置与反应池位置一一对应。荧光信号的数据处理系统以单片机为核心并与光电探测装置相连，，系统包括数据处理数据库、信号采集系统、图象分析及数据处理系统、图象处理和数据提取软件等、输出信号放大、抗混频、滤波等荧光信号采集电路或多通道荧光信号逻辑识别系统。

参考图1的芯片系统整合封装方式1，整个PCR芯片微系统包括衬底芯片1、封盖芯片2、光电探测器3、荧光激发光源4、反应池5、微泵6、微加热器7、微传感器8、控温系统9、荧光信号处理系统10、计算机处理控制系统11。系统也可采用图2的形式整合，衬底芯片为光电探测器3，封盖芯片2上设置反应池5和微泵6，微加热器7和微传感器8设置于光电探测器芯片3上，系统在控温系统9、荧光信号处理系统10和计算机处理控制系统11的控制下完成检测任务。

芯片整合封装方式1：即在衬底芯片正面制备反应室、流道、进出液口、微泵和微阀，在衬底芯片背面制备微加热器和微传感器，在蓝宝石衬底上制备蓝光LED并兼作芯片封盖，另一芯片制备光电探测器，低温键合封装各芯片。芯片整合封装方式2“在衬底上制备微加热器、微传感器和光电探测器，在另一透明芯片上加工反应室、流道、进出液口、微泵和微阀，蓝光LED键合在封盖上表面。在封装进行前，芯片内表面涂镀有不抑止PCR反应的材料，然后采用阳极键合、聚合物键合、热压等技术实现封装，该封装应满足液体密封的要求。聚合物键合中的介质材料可以是环氧树脂、苯环丁烷(BCB)、聚酰亚胺、光刻胶等粘和材料。

上述发明的用于荧光信号检测的方式之一为采用硅制备PIN光电探测器，图7为PIN光电探测器的结构抛面示意图，其基本制备步骤是：

(1)采用高阻单晶硅衬底片，设计光电二极管阵列与芯片反应池的位置与数量一一对应，光敏直径与反应池大小一致。

(2)通过p(n)型的场注入形成耗尽区和n(p)型离子注入形成p/n结。

(3)用背面吸杂技术减少PIN器件内的杂质与缺陷，提高载流子寿命，减小器件暗电流。

(4)淀积金属16，通过腐蚀方法形成金属引线，并与二极管结区构成欧姆接触。

(5)生长钝化膜18及滤光、增透多层复合膜17，复合膜结构可有效阻挡激发光干扰，增加待测荧光强度，减小光损耗。

上述发明提出的用于荧光激发方式之一是采用蓝光GaN/InGaN LED，其制备的基本方法是：

(1)选用蓝宝石作为衬底材料，并采用金属有机物化学汽相沉积(MOCVD)方法淀积所需异质结材料。

(2)采用MOCVD生长1-2μm非掺杂GaN薄膜。

(3)MOCVD生长掺杂的InGaN/GaN周期性的超晶格异质结构，控制In浓度使LED发光波长为400nm-500nm(荧光激发波长)。

(4)芯片上淀积金属并腐蚀形成电极。

(5)采用倒装工艺制备GaN基LED，使光从蓝宝石面发出，从而在工艺上更容易实现系统集成。

本发明的芯片微系统具有纳升体积的阵列式反应室，集成于芯片上的微加热器和微传感器在控温系统的控制下构成一个较完整的集成芯片。集成的微泵和微阀提高了系统的可靠性和可操作性，而系统级集成的荧光在位检测系统真正实现了便携式、高通量、高速、低成本和智能化的生物检测微系统。

本发明涉及微电子学、光电子学、自动控制、计算机、生物医学等领域，是一个多学科交叉的研究成果，该检测系统在生物医学、环境监控、食品质量检测、突发应急事件及国防领域具有广泛的应用前景。

Claims (6)

1.一种聚合酶链式反应芯片微系统，其特征在于：包括：

一聚合酶链式反应芯片，该芯片包含衬底芯片和芯片封盖，芯片上有进液口、出液口、流道和阵列排列的多个反应池，进、出液口通过流道和每一个反应池连接；

一热循环系统，该热循环系统包括微加热器、微传感器和控温系统，所述微加热器和所述微传感器制备在衬底芯片或芯片封盖上；

一荧光在位检测系统，该荧光在位检测系统包括点阵型激发光源、点阵型光电探测器和荧光信号数据处理系统，激发光源和光电探测器的点阵位置与上述反应池一一对应；

所述热循环系统和所述荧光在位检测系统分别通过接口与计算机相连，通过分析软件控制整个系统。

2.如权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片微系统，其特征在于：在芯片上采用溅射、蒸发、电子束淀积的方法制备铂、铝、金材料的微加热器和微传感器。

3.如权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片微系统，其特征在于：控制系统以单片机为核心，与微加热器和传感器相连，控制系统包括A/D转换、PWM电路、线性放大电路、外围电路、数据存储器及其相应软件设计。

4.如权利要求1所述的聚合酶链式反应芯片微系统，其特征在于：在聚合酶链式反应芯片上设置用于导入DNA引物的微泵，微泵是有阀机械泵和无阀微泵，采用压电、静电、电磁、气热、气动、双金属或电化学方式驱动微泵，微泵采用驱动气体而引入液体或直接驱动液体两种方式工作。

5.如权利要求4所述的聚合酶链式反应芯片微系统，其特征在于：在聚合酶链式反应芯片的每个反应池入口处设置微阀，用于隔离各个反应池，微阀是机械微阀或非机械微阀，采用压电、静电、电磁、气热、气动、双金属或电化学方式驱动机械微阀。

6.如权利要求1、4、5所述的聚合酶链式反应芯片微系统，其特征在于：激发光源是蓝光LED或其它类型激发光源，所述光电探测器是硅或化合物半导体光电二极管或光电倍增管。

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