CN106929408B - 便携式微流控pcr仪及基因样品荧光定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种便携式微流控PCR仪及基因样品荧光定量检测方法，本发明的便携式微流控PCR仪包括控制单元，PCR芯片，以及与所述控制单元联接的温控单元和荧光信号采集单元；PCR芯片包括基体，在基体的一侧端面上形成有反应腔室，并于反应腔室上覆设有密封盖板，反应腔室通过设于基体上的毛细管状的进、出样孔与外部连通；温控单元包括温度检测器，以及构成对所述PCR芯片中基体的加热或制冷的加热部和制冷部；荧光信号采集单元的采集端对应于PCR芯片的密封盖板一侧布置，以形成对反应腔室内荧光图像的采集。本发明的便携式微流控PCR仪可进行聚合酶链式反应，同时通过荧光信号采集单元对反应循环荧光图像的采集，可实现对基因样品的荧光定量检测。

Description

便携式微流控PCR仪及基因样品荧光定量检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种便携式微流控PCR仪，本发明还涉及一种基于该微流控PCR仪的基因样品荧光定量检测方法。

背景技术

PCR(聚合酶链式反应)技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，PCR基本由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。传统的实现方法是样品固定在温度可变的加热设备内，设备温度按要求往返于三个温度，使样品不断加热和冷却以实现反应。在这样的加热方式下，样品使用量至少数百微升，具有一定的热惯性，设备本身也有热惯性，因此温度切换的频率不能太快。实践表明，每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时才能将待扩目标扩增放大几百万倍，这样的循环速度比理想扩增时间多出一倍多，而无论对于科研还是临床，都希望扩增时间进一步减少。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种便携式微流控PCR仪，以能够用于基因样品的荧光定量检测。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种微流控PCR仪，其包括：

控制单元；

PCR芯片，所述PCR芯片包括由导热材质制备的基体，在基体的一侧端面上形成有至少一个反应腔室，并于所述反应腔室上覆设有透光性的密封盖板，所述反应腔室通过设于基体上的毛细管状的进、出样孔与外部连通；

温控单元，与所述控制单元控制联接，所述温控单元包括温度检测器，以及构成对所述PCR芯片中基体的加热或制冷的加热部和制冷部，所述加热部为微加热器，所述微加热器包括半导体衬底，以及形成在所述半导体衬底上的金属图案，所述金属图案包括加热部和温度传感部，所述加热部与外部电源连接，用于通过通电进行加热，所述温度传感部与外部检测电路连接，用于通过检测金属的电阻变化来测量所述微加热器的温度；

荧光信号采集单元，与所述控制单元联接，所述荧光信号采集单元的采集端对应于所述PCR芯片的密封盖板一侧布置，以形成对所述反应腔室内荧光图像的采集。

进一步的，所述PCR芯片的基体为金属、半导体、玻璃或塑料，所述密封盖板为玻璃；或者，所述反应腔室为塑料一体化形成。

进一步的，所述反应腔室的内表面具有亲水层。

进一步的，当所述PCR芯片的基体材料为硅时，所述亲水层的材料为二氧化硅；当所述PCR芯片的基体材料为塑料时，所述亲水层的材料为PVA。

进一步的，所述微加热器的金属图案采用铂金。

进一步的，所述微加热器的加热部的金属图案为由串接于一起、并嵌套布置的至少两个加热环所构成的回旋螺纹状。

进一步的，所述微加热器的加热功率为5-40瓦特，所述微加热器的外部电源为电池。

进一步的，所述制冷部为风扇、半导体制冷器或压缩空气微泵。

进一步的，还包括样品装载单元，所述样品装载单元包括PCR芯片夹持机构，以及因所述PCR芯片夹持机构的固定，而与所述PCR芯片上的进、出样孔分别连通的储液槽和出气口。

进一步的，所述PCR芯片夹持机构包括并排布置以夹置PCR芯片的两个支架板，以及连接于所述两个支架板之间的固定螺杆，所述储液槽和出气口设于其一支架板上，并于该支架板和PCR芯片之间夹设有密封圈。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明的便携式微流控PCR仪，其基于微加热器和微流控芯片的设置，通过PCR芯片对基因样品的装载，在温控单元的调温控温下，可进行聚合酶链式反应，同时通过荧光信号采集单元对反应循环荧光图像的采集，便可实现对基因样品的荧光定量检测。而采用半导体微加热器可以实现PCR反应循环的快速升降温，大大缩短反应时间。同时半导体加热器的功耗也显著降低，为便携化仪器的集成提供了前提。此外，采用微流控结构的PCR芯片作为PCR反应载体，可实现快速的传热，在降低反应的同时，也可提高检测的特异性，而使得根据本发明实施例的PCR仪具有很好的使用效果。

本发明也提出了一种基于如上的便携式微流控PCR仪的基因样品荧光定量检测方法，该方法包括如下的步骤：

步骤a、以待检的基因样品制备PCR反应的预混液；

步骤b、将预混液装载入PCR芯片的反应腔室内；

步骤c、根据设定的PCR反应温度体系，启动加热或制冷，并同步采集各反应循环的荧光图像。

进一步的，在步骤b中还包括：

步骤b1、将PCR芯片夹紧于PCR芯片夹持机构中，使进、出样孔分别与储液槽和出气孔连通；

步骤b2、将预混液倒入储液槽内，以使预混液于毛细力作用下进入反应腔室内；

步骤b3、将PCR芯片由PCR芯片夹持机构中拆下。

本发明的基因样品荧光定量检测方法通过采用上述的各步骤可利用便携式微流控PCR仪实现对基因样品的快速荧光定量检测。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例所述的PCR芯片的结构示意图；

图2为本发明实施例所述的微加热器的结构示意图；

图3为本发明实施例所述的样品装载单元的结构示意图；

图4为本发明实施例所述的便携式微流控PCR仪的结构简图；

附图标记说明：

1-箱体，2-PCR芯片，21-基体，22-反应腔室，23-进样孔，24-出样孔，3-微加热器，31-半导体衬底，32-接线端，33-温度检测端，4-风扇，5-摄像头，6-支架板，7-固定螺杆，8-储液槽，9-出气口，10-密封圈。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本实施例涉及一种便携式微流控PCR仪，其包括控制单元，PCR芯片，及与控制单元相联接的温控单元和荧光信号采集单元，其中，PCR芯片用于装载基因样品，并为基因样品提供反应场所，温控单元则包括温度检测器，以及用于对PCR芯片加热或制冷的加热部和制冷部，荧光信号采集单元的采集端对应于PCR芯片布置，以可形成对PCR芯片内荧光图像的采集。

具体结构上，本实施例中如图1中所示，PCR芯片包括由导热材质制备的基体21，在基体21的一侧端面上形成有至少一个反应腔室22，在反应腔室22上覆设有透光性的图中未示出的密封盖板，基体21和密封盖板构成了PCR芯片的双层结构。该反应腔室22还通过设于基体21上的毛细管状的进样孔23及出样孔24与外部连通，以实现反应腔室22内的样品装载。其中，导热的基体21具体可采用金属、半导体、玻璃或塑料材质，当为半导体材质优选可使用硅材料，如此可利用其快速的热传导性，而实现反应腔室22内的快速传热及升降温。此外，除了设置为双层结构，具有反应腔室22的PCR芯片也可为塑料一体化形成。

在为双层机构时，透光性的密封盖板具体可选用玻璃材质，以可实现对反应腔室22内荧光的有效采集。本实施例中，基体21上的反应腔室22具体可采用光刻和湿法刻蚀制得，且反应腔室22形成类液滴状，而成为布设在基体21上的亲水坑，以此与毛细管状的进样孔23和出样孔24的配合。此外，本实施例中在反应腔室22的内表面也设置有亲水层，特别的在基体21选用半导体材料，如硅时，该亲水层可由二氧化硅形成，而当基体21为塑料时，则亲水层可由PVA材料形成。本实施例中反应腔室22的上述结构设置，可在样品接触到进样孔23时，由于表面亲水层以及在毛细力的驱动下，样品呈微流体状而被自动吸入反应腔室22内，由此可减少对注射泵之类的装置的依赖，并能够达到低功耗、简化仪器结构以及便于携带的效果。而且通过该微流控形式的PCR检测，其动态区间可以达到6个数量级，进而也可实现荧光定量检测，以与目前市面上的实验室级的大型PCR检测仪器在检测的动态区间上相匹配。

本实施例中图1仅给出了在基体21上设置单个反应腔室22时的示例结构，在实际中，可在一块基体21上制作多个反应腔室22用于多通道并行检测，其中，反应腔室的刻蚀深度范围在100-200μm，其面积在5-80mm²，对应的样品体积在0.5-16μL。本实施例中组成所述温控单元的加热部具体为微加热器，该微加热器的结构如图2中所示，其包括半导体衬底31，半导体衬底31可由硅晶圆制成，在半导体衬底31的表面形成有金属图案，该金属图案具体分为分别进行加热和温度检测的加热部和温度传感部，在加热部的金属图案上形成有外延的接线端32，以及在温度传感部的金属图案上形成有温度检测端33，加热部上的接线端32与外部电源连接，而用于通过通电进行加热，温度传感部上的温度检测端33与外部的检测电路连接，用于通过检测金属的电阻变化来测量所述微加热器的温度，前述的温度检测器即由该温度传感部构成。

本实施例中形成于半导体衬底31上的金属图案具体采用铂金，且如图2中所示的，构成微加热器的加热部的金属图案进一步为由串接于一起、并嵌套布置的两个加热环构成的回旋螺纹形状，当然除了为嵌套布置的两个，加热环也可为其它数量。通过该回旋螺纹状的结构设计，可保证加热器表面的热均匀性，以提高加热效果。本实施例中，微加热器3的尺寸可为1.5-7cm，其对应的加热功率为5-40瓦特，因而该微加热器通过输出电压为5-20V的电池供电即可，以能够实现便携性，并为现场检测提供可能。

本实施例中，采用硅基的微加热器可利用硅材料的高热传导特性，而实现PCR仪检测时的快速升降温，其升温速率可以达到35℃/s，降温速率则可达到9℃/s，由此PCR仪反应时间最短可以实现9min，其相比现有基于peltier加热方式的常规PCR仪通常1小时左右的检测时间，可大大缩短检测反应时间，而提升检测效率。此外，本微加热器中作为温度传感部的金属图案可通过铂金的电阻值和温度之间所具有的非常高的线性度，在经过校准后，可非常准确的获知加热器的实时温度，从而也可为精确控制PCR芯片的反应温度提供保证。

本实施例中构成的温控单元的制冷部壳采用风扇、半导体制冷器或是压缩空气微泵，其以满足本PCR仪的微型化设计便可。为了于PCR芯片的反应腔室22内装载样品，如图3中所示，本微流控PCR仪也进一步包括一样品装载单元，该样品装载单元具体包括由并排布置的两个支架板6及连接于两个支架板6之间的固定螺杆7所组成的PCR芯片夹持机构，PCR芯片即夹置在两个支架板6之间，在其中一个支架板6上设置有用于和PCR芯片上的进样孔34及出样孔24分别连通的储液槽8和出气孔9，在该支架板6和PCR芯片之间还设有密封圈10。

当需要于PCR芯片内装载样品时，旋松固定螺杆7，使PCR芯片夹装在两个支架板6之间，对正进样孔23与储液槽8，以及出样孔24与出气孔9，并放置好密封圈10，旋紧固定螺杆7后，将样品倒入储液槽8内，在前述毛细力的驱动下，样品便可自动进入反应腔室22中。样品进入完毕后，旋松固定螺杆7，取下PCR芯片便可。

本实施例中控制单元具体可采用一体式触摸屏，以便于进行参数的设定及检测结果的显示，而微流控PCR仪的整体结构可如图4所示，其中荧光信号采集单元具体采用摄像头5，各部件也可集成于箱体1中，在布置时，摄像头5对应于PCR芯片2的密封盖板一侧，微加热器3和风扇4相对于摄像头5位于另一侧，而PCR芯片2则可插装于形成在微加热器3一侧的卡槽内。当然，除了上述各结构，在箱体1内还可装设电源及稳压设备等其它部件，以使其可称为一个完整的仪器系统。

本微流控PCR仪在使用时，温度采用闭环控制，具体操作中，首先以待检的基因样品制备PCR反应的预混液，然后将预混液装载入PCR芯片2的反应腔室22内，在装入时，先将PCR芯片2夹紧于PCR芯片夹持机构中，使进样孔23、出样孔34分别与储液槽7和出气孔8连通后，再将预混液倒入储液槽7内，使得预混液于毛细力作用下进入反应腔室22内，然后将PCR芯片2由PCR芯片夹持机构中拆下，再把PCR芯片2插入箱体1内，然后控制单元可根据设定的PCR反应温度体系，启动加热或制冷进行反应，并同步采集各反应循环的荧光图像进行记录。检测完毕后，PCR芯片2从箱体1内抽取，按相关规定处理即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种便携式微流控PCR仪，其特征在于包括：

控制单元；

PCR芯片，所述PCR芯片包括由导热材质制备的基体，在基体的一侧端面上形成有至少一个反应腔室，所述反应腔室形成类液滴状、而成为布设在基体上的亲水坑，所述反应腔室的内表面具有亲水层，并于所述反应腔室上覆设有透光性的密封盖板，所述反应腔室通过设于基体上的毛细管状的进、出样孔与外部连通，其中，所述PCR芯片的基体材料为硅，亲水层的材料为二氧化硅或所述PCR芯片的基体材料为塑料，所述亲水层的材料为PVA；

温控单元，与所述控制单元控制联接，所述温控单元包括温度检测器，以及构成对所述PCR芯片中基体的加热或制冷的加热部和制冷部，所述加热部为微加热器，所述微加热器包括半导体衬底，以及形成在所述半导体衬底上的金属图案，所述金属图案包括加热部和温度传感部，所述加热部与外部电源连接，用于通过通电进行加热，所述温度传感部与外部检测电路连接，用于通过检测金属的电阻变化来测量所述微加热器的温度；

荧光信号采集单元，与所述控制单元联接，所述荧光信号采集单元的采集端对应于所述PCR芯片的密封盖板一侧布置，以形成对所述反应腔室内荧光图像的采集；

样品装载单元，所述样品装载单元包括PCR芯片夹持机构，以及因所述PCR芯片夹持机构的固定，而与所述PCR芯片上的进、出样孔分别连通的储液槽和出气口，其中，所述PCR芯片夹持机构包括并排布置以夹置所述PCR芯片的两个支架板，以及连接于所述两个支架板之间的固定螺杆，所述储液槽和出气口设于其一支架板上，并于该支架板和所述PCR芯片之间夹设有密封圈。

2.根据权利要求1所述的便携式微流控PCR仪，其特征在于：所述微加热器的金属图案采用铂金。

3.根据权利要求1或2所述的便携式微流控PCR仪，其特征在于：所述微加热器的加热部的金属图案为由串接于一起、并嵌套布置的至少两个加热环所构成的回旋螺纹状。

4.根据权利要求1所述的便携式微流控PCR仪，其特征在于：所述微加热器的加热功率为5-40瓦特，所述微加热器通过电池供电。

5.根据权利要求1所述的便携式微流控PCR仪，其特征在于：所述制冷部为风扇、半导体制冷器或压缩空气微泵。

6.一种基于如权利要求1-5中任一项所述的便携式微流控PCR仪的非用于诊断的基因样品荧光定量检测方法，其特征在于，该方法包括如下的步骤：

步骤a、以待检的基因样品制备PCR反应的预混液；

步骤b、将预混液装载入PCR芯片的反应腔室内；

步骤c、根据设定的PCR反应温度体系，启动加热或制冷，并同步采集各反应循环的荧光图像。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤b中包括：

步骤b1、将PCR芯片夹紧于PCR芯片夹持机构中，使进、出样孔分别与储液槽和出气孔连通；

步骤b2、将预混液倒入储液槽内，以使预混液于毛细力作用下进入反应腔室内；

步骤b3、将PCR芯片由PCR芯片夹持机构中拆下。