CN111560310B - 一种随机访问式数字核酸检测装置及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种随机访问式数字核酸检测装置及使用方法,涉及数字核酸检测仪器领域,包括高通量加热模块、低通量光学检测模块和微流控芯片;高通量加热模块包括多个温度控制单元和多个加热槽,低通量光学检测模块包括相机、光源、镜筒和荧光检测槽;多个温度控制单元可独立或同时控制温度和时间;多个加热槽可通过随机访问方式同时处理多个扩增反应。该发明具备较高的检测通量和仪器使用效率。
Description
技术领域
本发明涉及数字核酸检测仪器领域,尤其涉及一种随机访问式数字核酸检测装置及其使用方法。
背景技术
快速准确的定量核酸检测对生物学研究和医学疾病诊断具有非常重要的意义。例如对病人血液中的艾滋病病毒载量的定量分析可以用来判断疾病进展的状态,是否收到控制以及治疗方案是否有效。
通常的核酸定量方法是通过实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time Polymerase Chain Reaction)技术或称为qPCR技术。
首先核酸(例如DNA或者RNA)可以通过不同的方法从样品(例如细胞、血液、植物样本等)提取和纯化。
qPCR体系中包含核酸聚合酶(polymerase)、脱氧核苷三磷酸(Deoxynucleosidetriphosphate(dNTP))、扩增序列特异性的一对扩增引物(primer)、检测的荧光探针、被扩增样品以及其相关试剂例如缓冲液、反应助剂。
qPCR需要通过热循环实现对目标基因序列(或片段)的扩增。其通常包含至少两个反应温度。通常为高温例如95摄氏度对核酸进行变性(denaturing);低温例如55摄氏度进行退火反应(annealing)使引物和被扩增样品进行特异性结合和链合成反应(extensionreaction)。qPCR也可以通过三个反应温度,高温例如95摄氏度对核酸进行变性(denaturing);低温例如55摄氏度进行退火反应(annealing)使引物和被扩增样品进行特异性结合,中等温度例如72摄氏度进行链合成反应(extension reaction)。PCR反应通常循环经过这几个不同的温度(例如35-40个循环),实现对目标基因的扩增。具体温度规则的选择取决于具体的反应体系和反应要求。
在PCR每个循环过后,其中的荧光强度会有所增强。这其中荧光探针的原理主要有两大类:嵌入染料(intercalating dye)例如SYBR Green,在PCR扩增过程中将荧光插入物非特异性的插入DNA中,因此荧光强度增强,可以实时进行测量。另外一类是水解探针(hydrolysis probe),其可以与特定的核酸序列结合,在反应过程中被酶切断从而可以进行荧光检测。在qPCR中,荧光的强度与核酸的浓度有正相关性。所以通过在每一个扩增循环检测反应体系的荧光强度,可以测量反应的动力学,并通过与一系列标准曲线的对比,得到初始反应体系中的目标核酸浓度。
qPCR是一种相对定量的方法,需要标准曲线,对反应环境(例如温度准确性)的要求较高。
数字基因扩增(digital nucleic acid amplification),例如数字PCR(digitalPCR)和数字恒温基因扩增(digital isothermal amplification),通过将反应溶液分散到大量的反应单元中,使得每个反应单元包含单个目标基因或者不包含目标基因。通过进行基因扩增反应,可以检测到反应单元中的荧光信号强度变化。包含目标基因的反应单元会相对于不包含目标基因的反应单元有显著的荧光信号增强。通过有荧光信号增强反应单元的数量,参照总反应单元的数量以及反应单元的体积,可以准确的对初始反应体系内的目标分子进行定量。
微流控芯片为数字PCR提供了理想的技术平台,根据对样本的划分方式的不同,基于微流控技术的数字PCR主要有两种形式:基于微孔板的形式和液滴的形式。目前已有多种成熟的商业化的数字PCR仪器,已经应用于稀有突变检测和基因表达分析等多个领域。灵敏度可达到单分子水平,可实现5个数量级左右的线形动态范围。QuantStudio 3D数字PCR系统采用微孔阵列芯片技术对样品进行均匀的分隔,每个芯片有20000个0.86nl的反应单元。将样品通过自动加样仪加载到数字PCR芯片上后,对芯片执行热循环,热循环仪可同时运行24个芯片,扩增后,QuantStudio 3D阅读仪可读取并分析两个通道的荧光信号。基于微液滴技术的数字PCR系统主要有Bio-Rad公司的QX200微滴式数字PCR系统和Stillatechnologies公司的Naica数字PCR系统。QX200微滴式数字PCR系统采用油包水微滴生成技术,液滴生成卡可同时处理8个样本,将每个样本划分成成20000个0.91nl的液滴。Naica数字PCR系统采用气流吹泡的方式生成液滴,可生成25000个0.43nl的液滴,每个芯片可处理4个样品。
恒温扩增不需要热循环,在恒定温度就可以完成基因扩增反应。例如环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification(LAMP))是通过使用六条引物,在恒温条件下进行的自循环链置换反应,可在1小时内合成大量扩增产物(>109拷贝)。相比于PCR技术,恒温扩增有以下优点:1)反应时间短且不需要精细的温度控制,降低了所需仪器的复杂性。2)具有很好的反应特异性。3)具有更好的抑制剂抵抗力。由于这些优点,恒温扩增反应在近些年得到了广泛的关注并已应用于细菌和病毒的定量检测。
数字基因检测可以对目标基因进行精准的绝对定量分析,但其通量通常受到仪器的限制。数字基因检测仪器系统通常包含至少两个模块:温度控制模块和荧光检测模块。温度控制模块控制反应的温度,实现基因扩增;荧光检测模块检测反应体系的荧光变化。在现有技术中,反应一旦开始,加热模块在反应的全程将被占据。加热模块无法在反应结束前再接纳其他反应。而荧光检测模块所需要的工作时间很短,在加热模块被占用的时间段里,荧光检测模块处于空闲状态。这就限制了一个仪器在特定的时间内只能服务于一个或一套反应。这极大的限制了检测的通量和仪器的使用效率。
因此,本领域的技术人员致力于开发一种随机访问式数字核酸检测装置,以提高检测的通量和仪器的使用效率。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是提高检测通量和仪器使用效率。
为实现上述目的,本发明提供了一种随机访问式数字核酸检测装置。包括高通量加热模块、低通量光学检测模块和微流控芯片;所述高通量加热模块包括多个温度控制单元和多个加热槽,所述低通量光学检测装置包括相机、光源、镜筒和荧光检测槽;多个所述温度控制单元可独立控制温度和时间;多个所述加热槽可通过随机访问方式同时处理多个扩增反应。
进一步地,所述加热槽的数量超过所述荧光检测槽的数量。
进一步地,所述加热槽可以进行随机访问式加热反应,不需要等待所有的反应在同一时间开始。
进一步地,所述加热槽可以同时放入多个所述微流控芯片。
进一步地,所述加热槽的加热方式为电加热、液体加热、气体加热或者光学加热中的一种。
进一步地,所述高通量加热模块和所述低通量光学检测模块之间的所述微流控芯片的传输方式为手动或者自动方式。
进一步地,所述加热槽的插入方向为水平方向或竖直方向或成一定角度。
进一步地,所述微流控芯片可以是恒温滑动式,通过两层的相对位置变化生成和控制大量的微液滴。
进一步地,所述加热槽可以独立对所述微流控芯片进行温度控制,开始反应和停止反应;也可以一组同时进行。
本发明还提供了一种采用随机访问式数字核酸检测方法,采用上述的随机访问式数字核酸检测装置,并包含以下步骤:
步骤1、将需要加热的容纳待检测样品的微流控芯片放置到高通量加热模块的加热槽中;
步骤2、将加热完成的微流控芯片放置到低通量光学检测模块的荧光检测槽中进行检测;
对于多份待检测样品,首先重复执行步骤1,将多份待检测样品放置到加热槽中加热,仅对加热完成的待检测样品执行步骤2。
本发明提出的随机访问式数字核酸检测装置可以有效的提高现有数字核酸检测的通量,无需等待被检测的样品达到一定数量后再进行检测,可以随来随检,提高检测的灵活度。本发明通过多槽(高通量)的加热装置可以配合低通量的(例如单槽)的荧光检测装置,实现高效的数字核酸检测。(荧光检测装置通常需要很短的时间进行芯片的荧光图片采集,小于1分钟;加热通常需要较长时间,例如20分钟;所以一个荧光检测模块可以配合有几十个加热槽的扩增模块)。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的一种随机访问式数字核酸检测装置的模块构成三维示意图;
图2是本发明的高通量加热模块的正视图;
图3是本发明的低通量光学检测模块的正视图;
图4是本发明的低通量光学检测模块的内部结构示意图;
图5是本发明的微流控芯片的结构示意图;
其中,1-高通量加热模块,2-荧光检测模块,3-微流控芯片,4-相机,5-镜筒,6-光源,7-荧光检测槽。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
在附图中,结构相同的部件以相同数字标号表示,各处结构或功能相似的组件以相似数字标号表示。附图所示的每一组件的尺寸和厚度是任意示出的,本发明并没有限定每个组件的尺寸和厚度。为了使图示更清晰,附图中有些地方适当夸大了部件的厚度。
如图1所示,本实施例包括高通量加热模块1、低通量光学检测模块以及微流控芯片3。其中,低通量光学检测模块具体为荧光检测模块2。特别的,如图2所示,高通量加热模块1具备12个相对独立的加热槽(每行有3个加热槽,共4行),每个加热槽可以容纳一个微流控芯片3并为该数字基因扩增反应提供相应的温度控制。该加热槽可以独立对微流控芯片3进行温度控制,开始反应和停止反应;也可以一组同时进行。
特别的,加热槽的设计可以是水平插入,也可以是垂直水平面插入或以一定的角度插入,或以上方式的组合;卡槽的开口可以向同一个方向,也可以是不同的方向。在第一个微流控芯片3插入到高通量加热模块1后,可以将准备好的第二个微流控芯片3插入到高通量加热模块1的空闲的加热槽中,开始加热和基因扩增反应。第三个,第四个,直至第十二个微流控芯片3可以以同样的随机访问的方式插入到高通量加热模块1中进行恒温基因扩增反应。再依次从高通量加热模块1中取出,插入到荧光检测模块2中进行成像检测。
加热槽中通过温度控制模块对其中的微流控芯片3进行独立地温度控制。本实施例中的温度控制模块具体的部件包括:
(1)Raspberry Pi微型计算机
(2)帕尔贴热电半导体制冷器件
(3)热敏电阻PT1000
(4)热敏电阻至数字输出转换器MAX31865
(5)继电器
温度控制模块的工作原理为:Raspberry Pi为整个系统的计算模块,负责接收,处理,发送数据及信号,以维持整个系统的运转,其本质为基于Linux系统的微型电脑。Raspberry Pi在温度控制模块中负责接收温度数值,并计算输出功率。帕尔贴将电源输送的电能转化为热能,负责直接的温度输出,由热敏电阻PT1000探测帕尔贴当前时刻温度,该温度引起PT1000电阻自身阻值变化,变化的阻值由MAX31865模块读取并转换成为Linux系统可辨认的数字信号,Raspberry Pi接收该数字信号,并依据该数字信号,结合PID控制算法计算下一时刻的输出功率,通过控制继电器调节电源供给帕尔贴的功率大小,进而对温度进行控制。金属散热器及风扇负责对整个温度模块进行散热,以保证系统不会因长时间的加热导致其他部件温度升高,从而保证系统的稳定性。
本实施例中采用的荧光检测模块2的外部结构如图1和图3所示。其外表面设置有荧光检测槽7,供微流控芯片3插入检测。荧光检测模块2的内部结构如图4所示,具体的部件包括:
(1)光源6:本实施例中光源6采用带480nm中心波长的滤光片的CREE蓝光LED光源;
(2)镜筒5:本实施例中镜筒5包括520nm中心波长滤光片;
(3)相机4。
荧光检测模块2的工作原理为:一对CREE蓝光LED光源6通过480nm中心波长的滤光片平行照射在芯片样本上,样本受光激发产生绿色荧光,该荧光通过520nm中心波长的滤光片由镜头及相机4成像。滤光片的存在有效滤除不相干的光源对于成像的干扰,保证了图像及数据分析的可靠性。镜头与相机4的成像范围与分辨率分别为4cm*4cm和4384pixel*3288pixel,足够有效分辨整块芯片上的荧光分布情况。
本实施例中,微流控芯片3的结构如图1和图5所示,微流控芯片3支持随机访问式数字LAMP定量检测。
本发明的装置可以普遍适用于多种数字基因检测体系。特别的,以自发液滴生产滑动芯片为例,具体的微流控芯片3的设计及原理,及相关试剂及材料参见文章Biosensorsand Bioelectronics 155(2020)112107“Self-partitioning SlipChip for slip-induced droplet formation and human papillomavirus viral load quantificationwith digital LAMP”。
数字LAMP反应需要在63摄氏度左右进行。LAMP反应溶液按上述文章注入微流控芯片3后,通过一步滑动操作生成数字基因扩增所需要的大量微液滴。随后,可以将微流控芯片3插入高通量加热模块1的任意一个加热槽开始加热进行LAMP反应,同时计时器开始计时。在加热1小时后,将微流控芯片3从加热槽中取出,插入荧光检测模块2进行拍照。拍照的曝光时间和入射光源强度可以做相应的调整以达到最佳的成像效果(通常为0.1秒,通常曝光时间不超过10秒)。照片可以进行分析得到基因定量的结果。相应的计算方法参见文章Analytical Chemistry 2011 83:8158-8168。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种随机访问式数字核酸检测装置,其特征在于,包括高通量加热模块、低通量光学检测模块和微流控芯片;所述高通量加热模块包括多个温度控制单元和多个加热槽,每个所述加热槽容纳一个所述微流控芯片,每个所述加热槽独立对所述微流控芯片进行温度控制,所述低通量光学检测模块包括相机、光源、镜筒和荧光检测槽,所述低通量光学检测模块为荧光检测模块,所述荧光检测模块外表面设置有荧光检测槽,供所述微流控芯片插入检测;多个所述温度控制单元可独立控制温度和时间;多个所述加热槽可通过随机访问方式同时处理多个扩增反应。
2.如权利要求1所述的随机访问式数字核酸检测装置,其特征在于,所述加热槽的数量超过所述荧光检测槽的数量。
3.如权利要求2所述的随机访问式数字核酸检测装置,其特征在于,所述加热槽可以进行随机访问式加热反应,不需要等待所有的反应在同一时间开始。
4.如权利要求3所述的随机访问式数字核酸检测装置,其特征在于,所述加热槽的加热方式为电加热、液体加热、气体加热或者光学加热中的一种。
5.如权利要求4所述的随机访问式数字核酸检测装置,其特征在于,所述高通量加热模块和所述低通量光学检测模块之间的所述微流控芯片的传输方式为手动或者自动方式。
6.如权利要求5所述的随机访问式数字核酸检测装置,其特征在于,所述加热槽的插入方向为水平方向或竖直方向或成一定的倾斜角度。
7.如权利要求6所述的随机访问式数字核酸检测装置,其特征在于,所述微流控芯片为恒温滑动式,通过两层的相对位置变化生成和控制大量的微液滴。
8.如权利要求7所述的随机访问式数字核酸检测装置,其特征在于,所述加热槽通过所述温度控制单元对所述微流控芯片进行独立的温度控制。
9.一种采用随机访问式数字核酸检测方法,其特征在于,采用如权利要求8所述的随机访问式数字核酸检测装置,并包含以下步骤:
步骤1、将需要加热的容纳待检测样品的微流控芯片放置到高通量加热模块的加热槽中;
步骤2、将加热完成的微流控芯片放置到低通量光学检测模块的荧光检测槽中进行检测;
对于多份待检测样品,首先重复执行步骤1,将多份待检测样品放置到加热槽中加热,仅对加热完成的待检测样品执行步骤2。
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