CN104263634B - 一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应循环加热仪及加热方法 - Google Patents

一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应循环加热仪及加热方法 Download PDF

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Abstract

一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应(PCR)循环加热仪及加热方法。该方法采用毛细管循环穿过三个不同恒温区域的方法实现管内样品的链式扩增反应(PCR)，构成了静态温度控制条件下，样品立体流动过程中实现扩增的新过程。在温度循环过程中，毛细管内流体携带着样品微滴从加热装置的一端流入，沿着毛细管穿行于三个温度区域之间，完成预定次数的加热循环之后，流出加热装置，进入检测装置。相比于平面微芯片方法，该加热方法更易于和现有生物检测设备相结合，同时因采用标准批量生产的毛细管，其工作性能可重复性更高，非常适合作为插件，与现有高精度生物检测设备进行联合工作。

Description

一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应循环加热仪及加热方法
技术领域
本发明属于微流温控技术领域，特别涉及一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应(PCR)循环加热仪，及其在该仪器中进行循环加热的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。传统的实现方法是样品固定在温度可变的加热设备内，设备温度按要求往返于三个温度，使样品不断加热和冷却以实现反应。在这样的加热方式下，样品使用量至少数百微升，具有一定的热惯性；设备本身也有热惯性，因此温度切换的频率不能太快。实践表明，每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时才能将待扩目标扩增放大几百万倍。这样的循环速度比理想扩增时间多出一倍多。无论对于科研还是临床，希望扩增时间进一步减少。为此，出现了一种基于微芯片的平面加热装置。在该装置内，样品先经过液滴发生器内变成特征尺寸50um的液滴，然后随该流体一起沿着100-200um的微通道往返于三个温度区间，实现样品内DNA的扩增。该方法的特点是，样品处于流动状态，所体现的优点是换热性能高，温度转换快，而且所采用的试剂量更少(纳升)；其次纳升级试剂量比微升级试剂温度更容易均匀，完成一个周期的时间为1小时左右。但微芯片的制作具有手工艺作品的特点，即个性强而可重复性低；其次，芯片是通过粘接而成，容易出现泄漏；微芯片通道为矩形，现有的检测设备毛细管为圆形，在管道与芯片接口处，液滴与通道壁面接触频繁，经常出现液滴融合和样品污染；最后，这种方式为单面加热，另外一面散热，因此样品受热不均匀。
发明内容
本发明所解决的技术问题：克服现有技术存在的上述不足，提供一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应(PCR)循环加热仪，及其在该仪器中进行循环加热的方法。该方法具有方便简单、可重复性高、试剂更少且受热均匀、更省时间，易于普及。为此，本发明采用毛细管盘绕于三个等温区间的立体加热方法，实现液滴PCR的循环加热。由于内部没有管路接头，不容易出现融合和样品污染。毛细管材用生物检测设备的标准产品，因此容易和现有生物监测设备相连接，加热装置性能可重复性强。整个管路埋在加热介质内，因此管壁均为加热面，样品受热和受力均是对称的。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应循环加热仪，整个装置由支架1，加热板2，恒温槽道3，温度传感器4、毛细管5和温控仪6-1、6-2、6-3构成。支架1为三角形，三角形的三个角为圆角结构1-2，三角形支架1每个侧边有一个槽道1-1；恒温槽道3由两块相同的模块3-1相对扣在一起构成，模块3-1为长方体板状，在模块3-1的一侧刻有一排半圆形毛细管槽道3-2，两块相同的模块3-1相对扣在一起，半圆形毛细管槽道3-2形成圆形毛细管槽道3-3；毛细管5为柔性管道，穿过毛细管槽道3-3；温控仪有三个温控仪6-1，6-2，6-3构成，独立控制每个加热板2的温度；
支架1侧边每个槽道1-1内依次安装加热板2和模块3-1；模块3-1有半圆毛细管槽道3-2的面向外；三角形支架1与加热板2和模块3-1一起构成缠绕毛细管5的缠绕支架；毛细管5从第一层半圆槽道开始缠绕，绕三角形支架一周；再第二层，依次一直到最后一个半圆槽道3-2；毛细管5两端留有足够长度，作为测试流体的进出接口；最后在模块3-1上合上相同的模块3-1，构成完整的恒温槽道3；三块加热板2分别由三个温控仪6-1，6-2，6-3控制温度，温度传感器4位于模块3-1的小孔4-1内；
加热板2与支架1之间用粘胶固定，模块3-1与加热板2之间用导热胶固定，毛细管5与模块3-1之间用导热胶固定，模块3-1与模块3-1用导热胶固定。
三角形支架1具有侧面开槽1-1，三个角具有圆弧状1-2，支架为低导热系数的材料构成；恒温槽道3由两块具有相同结构的模块3-1相对安装而成，模块上具有一列半圆形槽道3-2，两个半圆形槽道3-2合成一个圆形毛细管通道3-3；每个槽道的温度独立控制，模块3-1由导热良好的材料构成；三角形支架1侧面槽道1-1的深度略小于加热板2与单个模块3-1厚度的和减去毛细管槽道3-2的深度之差；柔性毛细管5穿过毛细管槽道3-3，螺旋缠绕在支架1上；加热块2与模块3-1之间用导热胶连接；模块3-1之间用导热胶连接，柔性毛细管5与模块3-1之间用导热胶填充。
毛细管5所盘绕圈数为PCR所设定的加热循环次数；毛细管5内为多相流，负载样品的溶液呈液滴悬浮于传送液体中，传送流体呈连续状，随着流体的流动，样品按设定的次序被循环加热。封装换热器：毛细管5与液滴发生器、检测设备之间通过毛细管接头相连接。
一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应循环加热方法，其特征在于所述三个温度区间的温度分别为65℃、75℃、95℃，温度有5℃波动，最小波动幅度为0.1℃；所述液滴尺寸为50um，液滴通道尺寸为200um，毛细管外径特征尺寸为360um，温度探头采用热敏电阻，温控方式采用PID技术，加热方式为电加热，电风扇冷却。
本发明由于让毛细管在加热介质内三个温度区间之间穿行，呈液滴状试剂在随连续介质沿着毛细管流动过程中，完成各自的温度循环。
(1)将样品离散成纳升级液滴，随流体沿着毛细管流动；
(2)布置毛细管于加热介质内，立体环绕于三个恒温区之间，实现避免均匀受热；
(3)三个加热区采用恒温控制，其热惯性成为有利因素，使热控更精准和稳定；
(4)采用标准的工业产毛细管，工作性能稳定，可重复性好。
本发明与现有技术相比的优点在于：本发明中液体样品是三维流动、均匀加热，不仅能提高样品的换热速率、实现样品的快速温度转换，也有利于实现高精度控制。另外，由于样品液滴为纳升级，温度容易分布均匀，扩增反应效率更高。相比于微芯片加热方式，该流式循环PCR方法不用转移液滴，能够实现与现有高精度生物检测设备一体化，即液滴发生、加热扩增、检测能够在同一台机器里面联线完成，便于制作自动化程度更高的检测系统。
附图说明
图1为本发明的基于毛细管的流式聚合酶链式反应循环加热仪结构示意图及装配图。其中图1a加热仪结构示意图，图1b加热仪结构装配图；
图2为本发明的循环加热仪支架图；
图3为本发明的循环加热仪恒温槽道结构图。其中图3a恒温槽模块结构图，图3b恒温槽道结构图；
图4为本发明的循环加热仪加热块图。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
本发明的一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应螺旋加热仪：
整个装置由支架1，加热板2，恒温槽道3，毛细管5和温控仪6-1、6-2、6-3构成，支架1为三角形，三角形的三个角为圆角，三角形支架1每个侧边有一个槽道1-1；恒温槽道由两块相同的模块3-1相对扣在一起构成，模块3-1为长方体板状，在模块3-1的一侧刻有一排半圆形毛细管槽道3-3，毛细管5为柔性管道，温控仪有三个温控仪6-1，6-2，6-3构成，独立控制每个加热板的温度；
支架1侧边每个槽道1-1内依次安装加热板2和模块3-1；模块3-1有毛细管槽道3-3的面向外；三角形支架1与加热板2和模块3-1一起构成缠绕毛细管5的缠绕支架；毛细管5从第一层半圆槽道开始缠绕，绕三角形支架一周；再第二层，依次一直到最后一个半圆槽道3-3；毛细管5两端留有足够长度，作为测试流体的进出接口；最后在模块3-1上合上模块3-1，构成完整的恒温槽道3；三块加热板2分别由三个温控仪6-1，6-2，6-3控制温度，温度传感器(4)位于模块3-1小孔内；
加热板2与支架1之间用粘胶固定，模块3-1与加热板2之间用导热胶固定，毛细管5与模块3-1之间用导热胶固定，模块3-1与模块3-1用导热胶固定。
如所述的一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应螺旋加热仪，其中三角形支架具有侧面开槽，三个角具有圆弧状，支架为低导热系数的材料构成；恒温槽道由两块具有相同结构的模块相对安装而成，模块上具有一列半圆形槽道，两个半圆形槽道合成一个圆形毛细管通道；每个槽道的温度独立控制，模块由导热良好的材料构成；三角形支架侧面槽道的深度略小于加热板和单个模块厚度的和减去毛细管槽道的深度之差；柔性毛细管穿过毛细管槽道，螺旋缠绕在支架上；加热块与模块之间用导热胶连接；模块之间用导热胶连接，柔性毛细管与模块之间用导热胶填充。
更具体地，本发明的一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应循环加热仪如图1所示，该结构图也是本发明的一个实施流程示意图。三角形支架由塑料加工而成，厚20mm，侧边槽宽80mm，深8mm。加热板采用铜板外缠绝缘电阻丝，供电电源为24V直流电源，功率为15W。恒温槽道单个模块为厚4mm，长80mm，宽20mm的铜块，半圆槽道直径0.8mm，间距0.2mm。毛细管采用外径为0.8mm的硅胶管。温控仪选购REX-C700温控仪。
实施例2：
三角形支架由有机玻璃加工而成，厚20mm，侧边槽宽80mm，深8mm。加热板采用铝板加热器，供电电源为24V直流电源，功率为20W。恒温槽道单个模块为铝块，厚4mm，长80mm，宽20mm，半圆槽道直径0.8mm，间距0.2mm。毛细管采用外径为0.8mm的硅胶管。温控仪选购REX-C700温控仪。三组加热组，两组用于加热；一组用于冷却，即构成两温度PCR。所有部件均集成在一个平板上，最后封在一个机箱内。
实施例3：
三角形支架由塑料加工而成，厚20mm，侧边槽宽80mm，深8mm。加热板采用不锈钢电加热器，供电电源为24V直流电源，功率为20W。恒温槽道单个模块为不锈钢，厚4mm，长80mm，宽20mm，半圆槽道直径0.8mm，间距0.2mm。毛细管采用外径为0.8mm的硅胶管。温控仪选购REX-C700温控仪。每组恒温槽温度由独立PID控制器控制并显示；三组加热组，两个用于加热，分别控制65和95度；余下一组用于冷却(采用风扇)，即构成两温度PCR。所有部件均集成在一个平板上，最后封在一个机箱内。
本发明所提出的基于毛细管的流式聚合酶链式反应(PCR)循环加热方法，具有简单易行的特点，便于与现有高精度生物检测设备结合，进行联线测量。
本发明未详细阐述的部分属于本领域公知技术。

Claims (2)

1.一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应循环加热仪，其特征在于：
整个装置由支架(1)，加热板(2)，恒温槽道(3)，温度传感器(4)、毛细管(5)和温控仪(6-1、6-2、6-3)构成，支架(1)为三角形，三角形的三个角为圆角结构(1-2)，三角形支架(1)每个侧边有一个槽道(1-1)；恒温槽道(3)由两块相同的模块(3-1)相对扣在一起构成，模块(3-1)为长方体板状，在模块(3-1)的一侧刻有一排半圆形毛细管槽道(3-2)，两块相同的模块(3-1)相对扣在一起，两半圆形毛细管槽道(3-2)构成圆形毛细管槽道(3-3)；毛细管(5)为柔性管道，穿过毛细管槽道(3-3)；温控仪有三个温控仪(6-1，6-2，6-3)构成，独立控制每个加热板(2)的温度；
支架(1)侧边每个槽道(1-1)内依次安装加热板(2)和模块(3-1)；模块(3-1)有半圆毛细管槽道(3-2)的面向外；三角形支架(1)与加热板(2)和模块(3-1)一起构成缠绕毛细管(5)的缠绕支架；毛细管(5)从第一层半圆槽道开始缠绕，绕三角形支架一周；再第二层，依次一直到最后一个半圆槽道(3-2)；毛细管(5)两端留有足够长度，作为测试流体的进出接口；最后在模块(3-1)上合上相同的模块(3-1)，构成完整的恒温槽道(3)；三块加热板(2)分别由三个温控仪(6-1，6-2，6-3)控制温度，温度传感器(4)位于模块(3-1)小孔(4-1)内；
加热板(2)与支架(1)之间用粘胶固定，模块(3-1)与加热板(2)之间用导热胶固定，毛细管(5)与模块(3-1)之间用导热胶固定，模块(3-1)与模块(3-1)用导热胶固定；
所述三角形支架(1)具有侧面开槽(1-1)，三个角具有圆弧状(1-2)，支架为低导热系数的材料构成；恒温槽道(3)由两块具有相同结构的模块(3-1)相对安装而成，模块上具有一列半圆形槽道(3-2)，两个半圆形槽道(3-2)合成一个圆形毛细管通道(3-3)；每个槽道的温度独立控制，模块(3-1)由导热良好的材料构成；三角形支架(1)侧面槽道(1-1)的深度略小于加热板(2)与单个模块(3-1)厚度的和减去毛细管槽道(3-2)的深度之差；柔性毛细管(5)穿过毛细管槽道(3-3)，螺旋缠绕在支架(1)上；加热块(2)与模块(3-1)之间用导热胶连接；模块(3-1)之间用导热胶连接，柔性毛细管(5)与模块(3-1)之间用导热胶填充。
2.一种基于毛细管的流式聚合酶链式反应循环加热方法，其特征在于：在权利要求1所述的本发明加热仪中，包括下述步骤：
(1)毛细管(5)所盘绕圈数为PCR所设定的加热循环次数；
(2)毛细管(5)内为多相流，负载样品的溶液呈液滴悬浮于传送液体中，传送流体呈连续状，随着流体的流动，样品按设定的次序被循环加热；
(3)封装换热器：毛细管(5)与液滴发生器、检测设备之间通过毛细管接头相连接；
所述三个温度区间的温度分别为65℃、75℃、95℃，温度有5℃波动，最小波动幅度为0.1℃；所述液滴尺寸为50um，液滴通道尺寸为200um，毛细管外径特征尺寸为360um，温度探头采用热敏电阻，温控方式采用PID技术，加热方式为电加热，电风扇冷却。
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