CN114585904A - 收集微小颗粒的方法、分选微小颗粒的微芯片、收集微小颗粒的装置、制备乳剂的方法和乳剂 - Google Patents

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Abstract

提供了一种更有效地产生各自包含一个微小颗粒的乳剂微粒的新技术。本技术提供了一种在微小颗粒分选机构中使用的微小颗粒收集方法，其中，微小颗粒分选机构具有流道结构，该流道结构包括：主流道，微小颗粒流过主流道；收集流道，微小颗粒的收集对象颗粒被收集在收集流道中；连接流道，连接主流道和收集流道；以及液体供应流道，连接至连接流道以便供应液体，该方法包括：流动步骤，使包含微小颗粒的第一液体流过主流道；确定步骤，确定流过主流道的微小颗粒是否是收集对象颗粒；以及收集步骤，将收集对象颗粒收集到收集流道中。在收集步骤中，将收集对象颗粒以收集对象颗粒包含在第一液体中的方式收集到收集流道中的第二液体中，第二液体与第一液体不混溶。

Description

收集微小颗粒的方法、分选微小颗粒的微芯片、收集微小颗粒 的装置、制备乳剂的方法和乳剂
技术领域
本技术涉及收集微小颗粒的方法、分选微小颗粒的微芯片、收集微小颗粒的装置、制备乳剂的方法以及乳剂。更具体地，本技术涉及用于将微小颗粒收集到乳剂中的收集微小颗粒的方法、分选微小颗粒的微芯片、以及收集微小颗粒的装置，包括在收集方法中执行的步骤的制备乳剂的方法、以及乳剂。
背景技术
为了进行单个细胞分析，已经研究使用其中每个乳剂颗粒包含一个细胞的乳剂。迄今为止，已经开发了数种用于形成这种乳剂的技术。
例如，以下引用的非专利文献1公开了随机捕获乳剂中的颗粒的方法。在该方法中，将含有细胞的溶液稀释至100细胞/μl或更少，使得一种乳剂含有一个细胞。在此方法中，产生各自包含一个细胞的乳剂颗粒的效率遵循泊松分布，并且因此空乳剂颗粒(不包含细胞的乳剂颗粒)的比率高，这是低效的。鉴于此，为了增加包含细胞的乳剂颗粒与空乳剂颗粒的比率，以下引用的非专利文献1提出了通过例如电场、介电电泳、局部加热等控制颗粒或流体来分选乳剂。此外，为了增加在产生的乳剂中均包含一个细胞的乳剂颗粒的比率，例如，以下引用的非专利文献1提出了使用由细胞诱导的高原-瑞利不稳定性或使用在高密度悬浮物质快速通过微流道时发生的自组织。
引用列表
非专利文献
非专利文献1：Agata Rakszewska et al.，One drop at a drop microfluidicsas a versatile tool for single-cell analysis，NPG Asia Materials(2014)6，e133
非专利文献2：Linas Mazutis et al.，Single-cell analysis and sortingusing droplet-based microfluidic，Nat Protoc.2013May；8(5)：870-891
发明内容
本发明要解决的问题
为了使用乳剂进行单个细胞分析，希望增加乳剂中各自包含一个细胞的乳剂颗粒的比率。本技术的目的是提供用于更有效地产生各自包含一种微小颗粒的乳剂颗粒的新方法。
问题的解决方案
本技术的发明人发现上述问题可以通过收集微小颗粒的具体方法来解决。
即，本技术提供了一种收集微小颗粒的方法，其中，在具有流道结构的微小颗粒分选机构中，流道结构包括：主流道，微小颗粒通过主流道流动，收集流道，微小颗粒中的收集对象颗粒收集在收集流道中，连接流道，连接主流道和收集流道，以及液体供应流道，连接至连接流道以便供应液体，该方法包括：流动步骤，使含有微小颗粒的第一液体流过主流道；确定步骤，确定流过主流道的微小颗粒是否是收集对象颗粒；以及收集步骤，将收集对象颗粒收集至收集流道中，以及在收集步骤中，包含在第一液体中的收集对象颗粒收集到在收集流道中的第二液体中，第二液体与第一液体不混溶。
通过执行收集微小颗粒的方法，可以在收集流道中形成包含作为分散介质的第二液体和作为分散体的第一液体的乳剂。
乳剂可以通过执行收集微小颗粒的方法形成，并且形成乳剂的液滴的至少一部分可以包含一个收集对象颗粒。
第一液体可以是亲水性的并且第二液体可以是疏水性的。
第二液体的运动粘度可以是第一液体的运动粘度的1/100倍至100倍。
流动步骤、确定步骤和收集步骤可在从液体供应流道向连接流道供应第二液体时执行。
主流道可分叉到连接流道和至少一个废物流道，收集对象颗粒除外的微小颗粒流过至少一个废物流道，并且液体供应流道可将液体供应至连接流道。用于防止第一液体进入收集流道的阀门可设置在连接流道中。
在流动步骤中，微小颗粒可以通过主流道基本成行地流向连接流道。
微小颗粒分选机构可具有流道结构，在流道结构中，包含微小颗粒的液体流动通过的样本流道和不包含微小颗粒的液体流动通过的鞘液流道在合流部处连接至主流道，使得微小颗粒在合流部之后基本上成行地流动通过主流道，以及流道结构可以形成包含基本上成行流动的微小颗粒的层流。
在确定步骤中，可用光照射流过主流道的微小颗粒，并且可基于通过照射产生的光确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。
在收集步骤中，由于收集流道中的压力波动，可以通过连接流道将收集对象颗粒收集到收集流道中。
主流道、连接流道和收集流道可线性排列。
微小颗粒可以是细胞或细胞聚合体，并且第一液体可以是微小颗粒的培养液。
微小颗粒可以是细胞、细胞聚合体或合成颗粒，并且微小颗粒可在收集步骤之后被破坏。
被收集到收集流道中的微小颗粒可以经过进一步的微小颗粒分选处理。
用于分选微小颗粒的微芯片可具有一个或两个流道结构。
此外，本技术还提供了一种用于分选微小颗粒的微芯片，其中，微芯片具有流道结构，流道结构包括：主流道，微小颗粒流动通过主流道；收集流道，微小颗粒中的收集对象颗粒被收集至收集流道中；连接流道，连接主流道和收集流道，以及液体供应流道，连接至连接流道以便供应液体，主流道具有确定区域，确定区域用于确定包含在第一液体中的流动的微小颗粒是否是收集对象颗粒，并且被确定为收集对象颗粒的微小颗粒在包含在该第一液体中的同时收集到收集流道中的第二液体中，第二液体与第一液体不混溶。
此外，本技术还提供了一种用于收集微小颗粒的装置，包括：用于分选具有流道结构的微小颗粒的微芯片，该流道结构包括：主流道，微小颗粒流动通过主流道；收集流道，微小颗粒中的收集对象颗粒被收集至收集流道中；连接流道，连接主流道和收集流道；以及液体供应流道，连接至连接流道以便供应液体；
第一液体供应单元，其向主流道供应含有微小颗粒的第一液体；
第二液体供应单元，其向液体供应流道供应与第一液体不混溶的第二液体；以及
确定单元，确定流过主流道的微小颗粒是否是收集对象颗粒。用于分选微小颗粒的微芯片从用于收集微小颗粒的装置是可拆卸的。
此外，本技术还提供了一种制备包含含有微小颗粒的乳剂颗粒的乳剂的方法，其中，在具有流道结构的微小颗粒分选机构中，流道结构包括：主流道，微小颗粒流动通过主流道；收集流道，微小颗粒中的收集对象颗粒被收集至收集流道中；连接流道，连接主流道和收集流道；以及液体供应流道，连接至连接流道以便供应液体；该方法包括：
流动步骤，使含有微小颗粒的第一液体流过主流道；
确定步骤，确定流过主流道的微小颗粒是否是收集对象颗粒；以及
收集步骤，将收集对象颗粒收集至收集流道中，以及
在收集步骤中，收集对象颗粒在包含在第一液体中的同时被收集到收集流道中的第二液体中，第二液体与第一液体不混溶。
此外，本技术还提供了一种包含含有微小颗粒的乳剂颗粒的乳剂，其中，各自包含一个微小颗粒的乳剂颗粒的数目与乳剂颗粒的总数的比率为70％以上。
附图说明
图1示出了在根据本技术的收集微小颗粒的方法中使用的用于分选微小颗粒的微芯片的配置示例。
图2示出了根据本技术的收集微小颗粒的方法的流程的示例。
图3是微小颗粒分选部的示例的放大图。
图4是控制单元的示例的框图。
图5示出了容器连接至的用于分选微小颗粒的微芯片的配置示例。
图6A是连接流道部的放大图。
图6B是连接流道部的放大图。
图7A是连接流道部的放大图。
图7B是连接流道部的放大图。
图8A是示出包含一个微小颗粒的乳剂颗粒形成在收集流道中的照片。
图8B是示出在压电元件的不同驱动条件下形成具有不同尺寸的乳剂颗粒的照片。
图9是用于分选微小颗粒的微芯片的示例的示意图。
图10是用于分选微小颗粒的微芯片的示例的示意图。
图11是用于分选微小颗粒的微芯片的示例的示意图。
具体实施例
在下文中，将描述执行本技术的优选方式。要注意的是，下面描述的实施例是本技术的典型实施例，并且本技术的范围不限于这些实施例。应注意，将按以下顺序描述本技术。
1.第一实施例(收集微小颗粒的方法)
(1)第一实施例的描述
(2)第一实施例的第一示例
(2-1)流动步骤
(2-2)确定步骤
(2-3)收集步骤
(2-4)其他步骤
(2-4-1)培养步骤
(2-4-2)破坏步骤
(2-4-3)检测步骤
(2-4-4)合成步骤
(2-5)微小颗粒分选机构和微小颗粒
(3)流道结构的其他示例
(3-1)主流道与废物流道呈线性排列的流道结构
(3-2)具有多个收集流道的流道结构
2.第二实施例(用于分选微小颗粒的微芯片)
3.第三实施例(用于收集微小颗粒的装置)
4.第四实施例(制备乳剂的方法)
5.第五实施例(乳剂)
1.第一实施例(收集微小颗粒的方法)
(1)第一实施例的描述
根据本技术的收集微小颗粒的方法通过使用具有流道结构的微小颗粒分选机构执行，该流道结构包括：主流道，微小颗粒流动通过主流道；收集流道，微小颗粒中的收集对象颗粒收集在收集流道中；连接流道，连接主流道和收集流道；以及液体供应流道，连接至连接流道以便供应液体。根据本技术的收集微小颗粒的方法包括：在微小颗粒分选机构中，流动步骤，使含有微小颗粒的第一液体流动通过主流道；确定步骤，确定流过主流道的微小颗粒是否是收集对象颗粒；以及收集步骤，将收集对象颗粒收集到收集流道中，并且，在收集步骤中，将包含在第一液体中的收集对象颗粒收集到收集流道中的第二液体中，第二液体与第一液体不混溶。
根据本技术，收集对象颗粒在包含在第一液体中的同时收集在收集流道中的第二液体中，第二液体与第一液体不混溶。因此，例如，可以在收集流道中形成包含收集对象颗粒的乳剂颗粒。
此外，在本技术中，待收集到收集流道中的微小颗粒是在确定步骤中被确定为收集对象颗粒的颗粒，并且在适当的定时执行收集操作。此外，当没有微小颗粒流动或当在确定步骤中微小颗粒未被确定为收集对象颗粒流动时，不执行收集操作。因此，在收集流道中不形成不含微小颗粒的乳剂颗粒或含有收集对象颗粒之外的颗粒的乳剂颗粒。因此，每个乳剂颗粒含有一个收集对象颗粒概率极高。例如，根据本技术的方法可以以例如70％或更多、具体是80％或更多、更具体是90％或更多、进一步具体是95％或更多的成功率生成每个包含一个微小颗粒(特别是收集对象颗粒)的乳剂颗粒。在本技术中，收集对象颗粒是指在确定步骤中被确定为待收集的微小颗粒。
在使用乳剂的单个细胞分析中，提高乳剂中每个含有一个细胞的乳剂颗粒的含量比率是很重要的。在对包含少量细胞的样本进行单个细胞分析的情况下，增加含量比特别重要。
然而，例如，如上面引用的非专利文献2所公开的，认为在一个乳剂颗粒中含有一定数量的细胞的概率服从泊松分布。在传统的乳剂形成技术中，据知，一个乳剂颗粒中含有一个细胞的概率最大约为65％。
此外，可以考虑增加样本中的细胞数以增加比率。然而，例如，在某些情况下，临床样本中所包含的待分析细胞数量很少。例如，一个样本中待分析的细胞数可以是104到105个。此外，例如，在分析诸如循环肿瘤细胞(CTC)之类的稀有细胞的情况下，可用细胞的数量是有限的。
如上所述，本技术可以增加每个包含一个微小颗粒(例如，细胞)的乳剂颗粒的比率。因此，本技术在使用乳剂进行单个细胞分析中是非常有效的。
此外，在使用每个乳剂颗粒包含一个细胞的乳剂进行单个细胞分析中，通常通过使用细胞分选装置(例如细胞分选器)来分选用于单个细胞分析的目标细胞组，以在形成乳剂之前纯化目标细胞。因此，为了进行单个细胞分析，除了乳化装置之外，还需要细胞分选器。例如，考虑到成本，要使用的设备数量的增加是不可取的。此外，为了形成乳剂，除了乳剂形成步骤之外，还需要细胞分选步骤。例如，考虑到时间和成本，增加步骤的数量是不可取的。
存在一种通过使用细胞分选器基于检测信号将单个细胞分选到孔板的技术。然而，孔板中的孔数多是384个，因此分析规模和吞吐量较低。此外，分选喷嘴在孔间移动时不能分选细胞，因此在此期间流动的目标细胞丢失。
在本技术的方法中，在确定步骤中被确定为收集对象颗粒的微小颗粒可以以乳剂状态收集。因此，本技术不需要单独进行细胞分选步骤就可以形成乳剂。此外，本技术的方法可以提高收集对象颗粒的收集率。
在本技术的优选实施例中，通过执行收集微小颗粒的方法来形成乳剂，并且形成乳剂(以下也称为“乳剂颗粒”)的液滴的至少一部分包含一个收集对象颗粒。更优选地，在形成乳剂的所有液滴中，优选70％或更多，更优选80％或更多，再优选90％或更多的液滴含有一个收集对象颗粒。根据本技术的微小颗粒的收集方法可以形成以高比率包含乳剂颗粒的乳剂，每个乳剂颗粒包含一个收集对象颗粒，如上所述。
因此，本技术还提供了一种制备乳剂的方法，其中每个乳剂颗粒包含一个微小颗粒。制备方法中包括的步骤可以与收集微小颗粒的方法的步骤相同。
此外，本技术还提供了一种乳剂，其中每个含有一个细胞的乳剂颗粒的数量与乳剂颗粒总数的比率为70％以上。该比率可优选为75％或更多，更优选为80％或更多，85％或更多，或90％或更多。如上所述，本技术提供了一种乳剂，该乳剂以极高的含量比含有一个乳剂颗粒。
在本技术方法所使用的微小颗粒分选机构的流道结构中，主流道和收集流道通过连接流道连接，连接流道连接到液体供应流道。通过从液体供应流道向连接流道供给第二液体，可以防止流经主流道的第一液体进入收集流道，并且还可以根据需要将第一液体引入收集流道。例如，只有在收集对象颗粒到达连接流道附近的情况下，才将第一液体引入收集流道。因此，收集对象颗粒可以在包含在第一液体中的同时被引入收集流道。
通过执行根据本技术的优选实施例的根据本技术的收集微小颗粒的方法，在收集流道中形成含有作为分散介质的第二液体和作为分散体的第一液体的乳剂。根据本技术的收集微小颗粒的方法形成的乳剂以相对于乳剂颗粒总量的高含量比包含含有一个收集对象颗粒的乳剂颗粒。因此，本技术即使在要分析的细胞数量较少的情况下也是适用的。
第二液体的运动粘度优选为第一液体的运动粘度的1/1000倍至1000倍，更优选为1/100倍至100倍，再优选为1/10倍至10倍，进一步优选为1/5倍至5倍，特别优选为1/2倍至2倍。在本技术中，第一液体和第二液体优选具有基本相同的运动粘度。这样很容易形成乳剂。
在25℃下，第一液体和第二液体的密度可以为例如0.5g/cm3至5g/cm3，优选0.6g/cm3至4g/cm3，更优选0.7g/cm3至3g/cm3。
此外，第二液体的密度优选为第一液体的1/100倍至100倍，更优选为1/10倍至10倍，再优选为1/5倍至5倍，特别优选为1/2倍至2倍。在本技术中，第一液体和第二液体优选具有基本相同的密度。这样很容易形成乳剂。
第一液体和第二液体在25℃下的运动粘度可以是例如0.3cSt至5cSt，优选0.4cSt至4cSt，更优选0.5cSt至3cSt。
由于第一液体和第二液体具有上述物理性质，所以在收集流道中容易形成乳剂。此外，这样的物理性质使这些液体更容易流经微流道。
在本技术的一个实施例中，第一液体可以是亲水性液体，第二液体可以是疏水性液体。在本实施例中，可以在收集流道中形成含有作为分散介质的水性液体和作为分散体的亲水性液体的乳剂。例如，希望诸如细胞的生物颗粒存在于诸如缓冲液或培养液的亲水液体中。因此，本实施例适合于收集希望存在于亲水液体中的微小颗粒，特别是生物颗粒，更特别是细胞。
亲水性液体包含例如水和可与水混溶的液体。例如，亲水性液体可以是含有选自水、亲水性醇、亲水性醚、酮、腈溶剂、二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺的一种或两种以上的混合物作为主要成分的液体。在本说明书中，主要成分是指占液体的例如质量50％或更多、特别是质量60％或更多、更特别是质量70％或更多、再特别是质量80％或更多、质量85％或更多、或质量90％或更多的成分。亲水性醇的实例包括乙醇、甲醇、丙醇和甘油。亲水性醚的实例包括四氢呋喃、聚环氧乙烷和1，4-二氧六环。酮的实例包括丙酮和甲乙基酮。腈溶剂的实例包括乙腈。
亲水性液体优选地可以是以水为主要成分的液体，并且可以是例如水、水溶液或水分散体。亲水性液体可以是例如鞘液和/或样本液体。亲水性液体优选为不会对微小颗粒(例如，生物颗粒，特别是细胞)产生不利影响的亲水性液体。
亲水性液体可以是例如含有生物分子的液体。生物分子可以是例如选自氨基酸、肽和蛋白质的一种或两种以上的组合。
此外，亲水性液体可以包含例如表面活性剂，特别是非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的示例包括：例如，聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的三嵌段共聚物，该三嵌段共聚物也称为“泊洛沙姆”或“普兰尼克表面活性剂”。普兰尼克表面活性剂的更具体示例是Pluronic(商标)F68。
该亲水性液体的示例包括培养液和缓冲液，但不限于此。该缓冲液优选为Good的缓冲液。
通过将培养液用作亲水性液体，作为收集对象颗粒收集的细胞可以在保持在乳剂颗粒中的同时进行培养。
此外，在亲水性液体(特别是鞘液)含有细胞刺激成分的情况下，作为收集对象颗粒收集的细胞可以在保持在乳剂颗粒中的同时被刺激。此外，可以通过使用显微镜等观察受刺激细胞的特征(例如，形态等)。
此外，亲水性液体(例如，鞘液或样本液)可以具有允许对待观察的细胞刺激响应的检测系统。该检测系统可以例如在将细胞保持在乳剂颗粒中时，光学检测来自作为收集对象颗粒收集的细胞的响应。该检测系统优选为免洗检测系统，并且优选为例如使用荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)等的系统。
如上所述，在本技术中，在微小颗粒是生物颗粒(特别是细胞)的情况下，可以执行单个生物颗粒的各种分析(特别是单个细胞分析，例如单个细胞成像)。
该亲水性液体在25℃下的密度可为例如0.5g/cm3至5g/cm3，优选0.6g/cm3至4g/cm3，更优选0.7g/cm3至3g/cm3。
该亲水性液体在25℃下的运动粘度可以是例如0.3cSt至5cSt，优选0.4cSt至4cSt，更优选0.5cSt至3cSt。
亲水性液体具有上述物理性质，因此容易流过微流道。此外，在收集流道中容易形成乳剂。
疏水性液体可以是选自与亲水性液体不混溶的液体中的任何液体。疏水性液体可以是含有选自例如脂肪族烃、氟基油、含氟原子的单体或聚合物、硅油、芳香烃、脂肪族一元醇(例如，正辛醇等)和氟化物多糖的一种或两种以上的混合物作为主要成分的液体。
脂肪族烃优选为具有7个或更多以及30个或更少碳原子的脂肪族烃。由于碳原子数为7个或更多以及30个或更少，所以疏水性液体的运动粘度适合流过微流道。脂肪烃的示例包括：矿物油；来自动植物的油，如角鲨烷油和橄榄油；具有10至20个碳原子的石蜡烃，如癸烷和十六烷；和具有10至20个碳原子的烯烃。
在本技术中，考虑到与亲水性液体的良好不混溶性，疏水性液体优选为氟基油。氟基油的示例包括全氟化碳(PFC)、全氟聚醚(PFPE)和氢氟醚(HFE)。全氟化碳的示例包括氟惰性(商标)FC40和氟惰性FC-770(3M制造)。全氟聚醚的示例包括Krytox(杜邦公司制备)。氢氟醚的示例包括HFE7500(3M制造)。
该疏水液体在25℃下的密度可为例如0.5g/cm3至5g/cm3，优选0.6g/cm3至4g/cm3，更优选0.7g/cm3至3g/cm3。
疏水性液体在25℃下的运动粘度可以是，例如0.3cSt至5cSt，优选0.4cSt至4cSt，更优选0.5cSt至3cSt。
由于疏水性液体具有上述物理性质，在收集流道中容易形成乳剂。例如，在密度或运动粘度过高的情况下，液体可能不平滑地流过连接流道的可能性增加。
在本技术的优选实施例中，第一液体和第二液体中的一种或两者可以含有表面活性剂。特别地，疏水性液体和亲水性液体中的一种或两种含有表面活性剂，更具体地，疏水性液体含有表面活性剂。该表面活性剂使乳剂颗粒更容易形成，也使能够稳定地保持乳剂颗粒。表面活性剂的示例包括非离子表面活性剂和氟基表面活性剂。非离子表面活性剂的示例包括Span80和Abil EM，但不限于此。表面活性剂的种类可由本领域技术人员适当选择。氟基表面活性剂的示例包括全氟聚醚基表面活性剂和假表面活性剂。前一种表面活性剂的示例包括Krytox(杜邦公司制备)，后一种表面活性剂的示例包括全氟辛醇。
表面活性剂可以以等于或大于表面活性剂的临界胶束浓度的浓度存在于例如疏水性液体中。临界胶束浓度可以是例如1μM到1000μM，特别是10μm到100mM。此外，表面活性剂的界面张力可以是例如40mN/m或更小，特别是20mN/m或更小。
在本技术的另一实施例中，第一液体可以是疏水性液体，第二液体可以是亲水性液体。
在本实施例中，可以在收集流道中形成含有作为分散介质的亲水性液体和作为分散体的疏水性液体的乳剂。本技术可用于将微小颗粒收集到乳剂中。疏水性液体和亲水性液体的示例如上所述。
此外，本实施例适用于例如仅从其中疏水性液体和亲水性液体分别用作分散介质和分散体的乳剂中收集目标微小颗粒，并且乳剂颗粒中含有微小颗粒。
此外，可用于本技术的检测系统不仅可以是微小颗粒发荧光的系统，还可以是乳剂颗粒发荧光的系统。因此，为了收集含有微小颗粒的乳剂颗粒，可以在确定步骤中对微小颗粒、乳剂颗粒或微小颗粒和乳剂颗粒两者进行确定。如上所述，在本技术中，可以基于从微小颗粒和/或乳剂颗粒获得的信息来确定微小颗粒或乳剂颗粒是否是收集对象颗粒。
根据本技术的优选实施例，在从液体供应流道向连接流道供应第二液体时进行流动步骤、确定步骤和收集步骤。因此，连接流道中充满第二液体。这使得可以防止第一液体不必要地进入收集流道。
(2)第一实施例的第一示例
根据本技术收集微小颗粒的方法是通过使用微小颗粒分选机构来执行的。下面，将参考图1描述根据本技术的收集微小颗粒的方法的一个实施例的示例，图1示出了用于分选微小颗粒的微芯片，该微芯片是在根据本技术和图2的方法中使用的微小颗粒分选机构的配置示例，图2给出了根据本技术收集微小颗粒的方法流程的示例。
如图1所示，在本技术的方法中使用的用于分选微小颗粒的微芯片150具有主流道155，微小颗粒流经主流道155；和收集流道159，微小颗粒中的收集对象颗粒收集到收集流道159。用于分选微小颗粒的微芯片150具有颗粒分选部157。图3示出了颗粒分选部157的放大视图。如图3中的A所示，颗粒分选部157具有连接主流道155和收集流道159的连接流道170。连接流道170连接到能够向连接流道170供应液体的液体供应流道161。如上所述，用于分选微小颗粒的微芯片150具有包括主流道155、收集流道159、连接流道170和液体供应流道161的流道结构。
此外，如图1所示，用于分选微小颗粒的微芯片150形成用于收集微小颗粒的装置100的一部分，该装置除了微芯片之外，还包括光照射单元101、检测单元102和控制单元103。如图4所示，控制单元103可以包括信号处理单元104、确定单元105和分选控制单元106。
如图2所示，本技术的方法包括：在用于分选微小颗粒的微芯片150中，使含有微小颗粒的第一液体流经主流道155的流动步骤S101、确定流经主流道155的微小颗粒是否为收集对象颗粒的确定步骤S102、以及将收集对象颗粒收集到收集流道159的收集步骤S103。
下面将描述每个步骤。
(2-1)流动步骤
在流动步骤S101中，包含微小颗粒的第一液体流过主流道155。第一液体通过主流道155从合流部162流向颗粒分选部157。第一液体可以是包含微小颗粒的样本液体和鞘液的层流，并且特别可以是样本液体被鞘液包围的层流。下面将描述用于形成层流的流道结构。
用于分选微小颗粒的微芯片150具有样本液体入口151和鞘液入口153。包含微小颗粒的样本液体和不包含微小颗粒的鞘液分别从这些入口引入样本液体流道152和鞘液流道154。
用于分选微小颗粒的微芯片150具有流道结构，在流道结构中，样本液体流经的样本流道142和鞘液流经的鞘液流道154在合流部162处连接，以形成主流道155。样本液体和鞘液在合流部162处合流以形成例如层流，在层流中样本液体被鞘液包围。微小颗粒优选地在层流中基本上排列成一行。如上所述，在本技术中，流道结构形成包含基本上成行流动的微小颗粒的层流。
层流通过主流道155流向颗粒分选部157。微小颗粒优选成行流过主流道155。这使得在下面描述的检测区域156中的光照射中，容易区分由针对单个微小颗粒的光照射产生的光和由针对其他微小颗粒的光照射产生的光。
(2-2)确定步骤
在确定步骤S102中，确定流过主流道155的每个微小颗粒是否是收集对象颗粒。可以由确定单元105进行确定。确定单元105可以基于由光照射单元101对微小颗粒的光照射所产生的光来进行确定。下面将更详细地描述确定步骤S102的示例。
在确定步骤S102中，光照射单元101用光(例如，激发光等)照射流过用于分选微小颗粒的微芯片150中的主流道155(特别是检测区域156)的每个微小颗粒，并且检测单元102检测由光照射产生的光。根据由检测单元102检测的光的特性，控制单元103中包括的确定单元105确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。例如，确定单元105可以基于散射光、荧光或图像(例如，暗场图像、明场图像和/或类似的图像)进行确定。在下面描述的收集步骤S103中，控制单元103控制用于分选微小颗粒的微芯片150中的流量，因此收集对象颗粒被收集到收集流道159中。
光照射单元101用光(例如，激发光等)照射流过用于分选微小颗粒的微芯片150中的流道的微小颗粒。光照射单元101可以包括发射光的光源和对在检测区域中流动的微小颗粒的激发光进行会聚的物镜。本领域技术人员可以根据分析的目的适当地选择光源，并且光源可以是例如激光二极管、SHG激光器、固态激光器、气体激光器、高强度LED或卤素灯，或者可以是其两种或多种的组合。光照射单元不仅可以包括光源和物镜，还可以根据需要包括其他光学元件。
(基于荧光信号和/或散射光信号对分选目标的确定)
在本技术的一个实施例中，检测单元102检测通过光照射单元101的光照射从微小颗粒产生的散射光和/或荧光。检测单元102可以包括检测器和会聚透镜，会聚透镜对从微小颗粒产生的荧光和/或散射光进行会聚。检测器可以是PMT、光电二极管、CCD、CMOS等，但不限于此。检测单元102不仅可以包括会聚透镜和检测器，还可以根据需要包括其他光学元件。检测单元102可以进一步包括例如衍射单元。包括在衍射单元中的光学部件的示例包括光栅、棱镜和滤光片。衍射单元可以检测例如与具有其他波长的光分离的具有待检测波长的光。检测单元102可以通过光电转换将检测到的光转换为模拟电信号。检测单元102还可以通过AD转换将模拟电信号转换为数字电信号。
控制单元103中包括的信号处理单元104可以处理由检测单元102获得的数字电信号的波形，以生成关于用于由确定单元105进行确定的光的特性的信息(数据)。信号处理单元104可以从数字电信号的波形中获取例如波形的宽度、波形的高度和波形的面积中的一者、两者或三者作为关于光的特性的信息。此外，关于光的特性的信息可以包括例如检测到光的时间。特别是在检测散射光和/或荧光的实施例中，可以执行信号处理单元104的上述处理。
控制单元103中包括的确定单元105基于通过用光照射流过流道的微小颗粒而产生的光，来确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。
在检测散射光和/或荧光的实施例中，由控制单元103处理由检测单元102获得的数字电信号的波形，并且基于通过处理生成的关于光的特性的信息，确定单元105确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。例如，可以在基于散射光的确定中指定微小颗粒的外部形状和/或内部结构的特征，并且可以基于该特征来确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。此外，在诸如细胞之类的微小颗粒被预先预处理的情况下，也可以根据与流式细胞术中使用的特征相似的特征来确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。此外，在例如用抗体或染料(特别是荧光染料)标记细胞等微小颗粒的情况下，也可以根据微小颗粒的表面抗原的特性来确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。
(基于明场图像对分选目标的确定)
在本技术的另一实施例中，检测单元102可以获取由光照射单元101的光照射产生的明场图像。在本实施例中，光照射单元101可以包括例如卤素灯，并且检测单元102可以包括CCD或CMOS。例如，卤素灯可以用光照射微小颗粒，CCD或CMOS可以获得被照射的微小颗粒的明场图像。
在获取明场图像的实施例中，控制单元103中包括的确定单元105基于获取的明场图像来确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。例如，可以根据微小颗粒(特别是细胞)的形态、尺寸和颜色中的一者或两者以上的组合来确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。
(基于暗场图像对分选目标的确定)
在本技术的又一实施例中，检测单元102可以获取由光照射单元101的光照射产生的暗场图像。在本实施例中，光照射单元101可以包括例如激光光源，并且检测单元102可以包括CCD或CMOS。例如，激光器可以用光照射微小颗粒，并且CCD或CMOS可以获取被照射的微小颗粒的暗场图像(例如，荧光图像)。
在获取暗场图像的实施例中，控制单元103中包括的确定单元105基于获取的暗场图像来确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。例如，可以根据微小颗粒(特别是细胞)的形态、尺寸和颜色中的一者或两者以上的组合来确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。
在上述的“基于荧光信号和/或散射光信号对分选目标的确定”、“基于明场图像对分选目标的确定”和“基于暗场图像对分选目标的确定”中的任一个中，检测单元102可以是例如层叠了其中包含CMOS传感器的基板和其中包含数字信号处理器(DSP)的基板的成像元件。在成像元件的DSP操作作为机器学习单元的情况下，成像元件可以作为所谓的AI传感器操作。包括成像元件的检测单元102可以基于例如学习模型来确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。此外，在执行根据本技术的方法时，可以实时更新学习模型。例如，DSP可以在CMOS传感器中的像素阵列单元的重置期间、在像素阵列单元的曝光期间、或者在从像素阵列单元的每个单位像素读取像素信号期间执行机器学习处理。作为AI传感器操作的成像元件的示例例如是WO 2018/051809中公开的成像装置。在AI传感器被用作成像元件的情况下，从图像阵列获取的原始数据被原样学习，因此以高速执行分选确定处理。
例如，可以根据关于光的特性的信息是否满足预先指定的标准来进行确定。该标准可以是指示微小颗粒是收集对象颗粒的标准。该标准可以由本领域技术人员适当地设置，并且可以是关于光的特性的标准，例如在诸如流式细胞术的技术领域中使用的标准。
可以分别用光线照射检测区域156中的一个位置，或者用光线照射检测区域156中的多个位置。例如，微芯片150可以被配置为用光照射检测区域156中的两个不同位置中的每一个(即，用光照射检测区域156中的两个位置)。在这种情况下，例如，可以基于通过用光照射一个位置的微小颗粒而产生的光(例如，荧光、散射光和/或类似的光)来确定微小颗粒是否是收集对象颗粒。此外，还可以基于在一个位置处的光照射产生的光的检测时间与在另一位置处的光照射产生的光的检测时间之间的差来计算流道中的微小颗粒的速度。为了进行计算，可以预先确定两个照射位置之间的距离，并且可以根据两个检测时间之间的差值和距离来确定微小颗粒的速度。此外，基于速度，可以准确地预测到达颗粒分选部157的时间如下面描述。因为准确地预测到达时间，所以可以优化形成进入收集流道159的流的定时。此外，在某一微小颗粒到达颗粒分选部157的时间与该某一微小颗粒之前或之后的微小颗粒到达颗粒分选部157的时间之间的差等于或小于预定阈值的情况下，也可以确定不收集该某一微小颗粒。在某一微小颗粒与该某一微小颗粒前后的微小颗粒距离较小的情况下，在吸取该某一微小颗粒时将该某一微小颗粒前后的微小颗粒与该某一微小颗粒一起收集的可能性增大。在微小颗粒一起被收集的可能性很大的情况下，确定不收集该某一微小颗粒。这使得能够防止在该某一微小颗粒之前或之后的微小颗粒被收集。因此，可以提高所收集的微小颗粒中的目标微小颗粒的纯度。例如，在日本专利申请公开No.2014-202573中公开了其中分别用光线照射检测区域156中的两个不同位置的微芯片和包括该微芯片的装置的具体示例。
注意，控制单元103可以控制光照射单元101的光照射和/或检测单元102的光检测。此外，控制单元103可以控制用于将流体供应到微芯片150中以分选微小颗粒的泵的驱动。控制单元103可以包括：例如，硬盘、CPU、和存储器，其中用于使用于收集微小颗粒的装置执行根据本技术的收集微小颗粒的方法的程序和OS存储在硬盘中。例如，控制单元103的功能可以由通用计算机实现。程序可以记录在记录介质上，例如微SD存储卡、SD存储卡或闪存。包括在用于收集微小颗粒的装置100中的驱动器(未示出)可以读取记录在记录介质上的程序，并且控制单元103可以使用于收集微小颗粒的装置100根据读取的程序执行根据本技术的收集微小颗粒的方法。
(2-3)收集步骤
在收集步骤S103中，将在确定步骤S102中确定为收集对象颗粒的微小颗粒收集到收集流道159中。在收集步骤S103中，收集对象颗粒在包含在第一液体中的同时被收集到收集流道中与第一液体不混溶的第二液体中。因此，可以在收集流道159中形成包含作为分散介质的第二液体和作为分散体的第一液体的乳剂，并且乳剂的每个乳剂颗粒包含一个收集对象颗粒。因此，该乳剂适用于单个细胞分析。
下面将更详细地描述收集步骤。
收集步骤S103在微芯片150中的颗粒分选部157中执行。在颗粒分选部157中，已经流过主流道155的层流分别流入两个废物流道158。图1中所示的颗粒分选部157具有两个废物流道158，但是分叉流道的数目不限于两个。颗粒分选部157可以设置有例如一个或多个(例如，两个、三个、四个等)分叉流道。分叉流道可以被配置成在平面上以Y形状分叉，如图1所示，或可配置成三维分叉。
在颗粒分选部157中，仅在收集对象颗粒流动的情况下才形成从主流道155通过连接流道170进入收集流道159的流，并且收集对象颗粒被收集到收集流道159中。图3示出了颗粒分选部157的放大视图。如图3的A所示，主流道155和收集流道159经由与主流道155同轴的连接流道170彼此连通。如图3的B所示，收集对象颗粒通过连接流道170流入收集流道159。如图3的C所示，不是收集对象颗粒的微小颗粒流入废物流道158之一。
图6A和图6B示出了连接流道170及其附近的放大视图。图6A是连接流道170及其附近的示意性透视图。图6B是在穿过液体供应流道161的中心线和连接流道170的中心线的平面中的示意性截面图。连接流道170具有位于检测区域156侧的流道170a(以下，也称为“上游连接流道170a”)、位于收集流道159侧的流道170b(以下，也称为“下游连接流道170b”)以及连接流道170与液体供应流道161之间的连接部170c。液体供应流道161设置成基本上垂直于连接流道170的流道的轴线。在图6A和图6B中，两个液体供应流道161设置成在连接流道170的大体中心位置处彼此面对。然而，可以只提供一个液体供应流道。
上游连接流道170a的横截面的形状和尺寸可以与下游连接流道170b的形状和尺寸相同。例如，如图6A和图6B所示，上游连接流道120a的横截面和下游连接流道120b的横截面都可以具有拥有相同尺寸的大致圆形形状。或者，这两个横截面都可以具有拥有相同尺寸的矩形形状(例如，正方形、矩形等)。
第二液体从两个液体供应流道161供应到连接流道170，如图6B中的箭头所示。第二液体从连接部170c流向上游连接流道170a和下游连接流道170b。
在不执行收集步骤的情况下，第二液体如下流动。
流入上游连接流道170a的第二液体从连接流道170和主流道155之间的连接面流出，然后分别流入两个废物流道158。由于如上所述，第二液体从连接面流出，所以可以防止第一液体和不需要被收集到收集流道159中的微小颗粒通过连接流道170进入收集流道159。
流入下游连接流道170b的第二液体流入收集流道159。因此，收集流道159的内部充满第二液体，并且第二液体用作例如用于形成乳剂的分散介质。
此外，在执行收集步骤的情况下，可以从两个液体供应流道161向连接流道170供应第二液体。然而，由于收集流道159中的压力波动，特别是通过在收集流道159中产生负压，形成通过连接流道170从主流道155流入收集流道159的流。即，形成从主流道155依次通过上游连接流道170a、连接部170c和下游连接流道170b流入收集流道159的流。因此，收集对象颗粒在被第一液体包围的同时被收集到收集流道159中的第二液体中。通过执行收集步骤，可以例如在收集流道159中或例如在经由流道连接到收集流道的端部163的容器中形成乳剂。
上游连接流道120a的横截面的形状和/或尺寸可以不同于下游连接流道120b的形状和/或尺寸。具有不同尺寸的这两个流道的示例在图7A和图7B中示出。如图7A和图7B所示，连接流道180包括位于检测区域156侧的流道180a(以下，也称为“上游连接流道180a”)、位于收集流道159侧的流道180b(以下，也称为“下游连接流道180b”)以及连接流道180与液体供应流道161之间的连接部180c。上游连接流道180a的横截面和下游连接流道180b的横截面都具有大致圆形，但是后一横截面的直径大于前一横截面的直径。在后一截面的直径比前一截面的直径大的情况下，与两个横截面具有相同直径的情况相比，可以更有效地防止已经在收集流道159中分选的收集对象颗粒在使用负压进行上述微小颗粒分选操作后立即通过连接流道180释放到主流道155。
例如，在上游连接流道180a的横截面和下游连接流道180b的横截面都具有矩形形状的情况下，使后一横截面的面积大于前一横截面的面积。因此，如上所述，可以更有效地防止已经收集的微小颗粒通过连接流道180释放到主流道155。
在收集步骤S103中，由于收集流道159中的压力波动，收集对象颗粒通过连接流道被收集到收集流道中。可以通过例如如上所述在收集流道159中产生负压来执行收集。当例如附接到微芯片150外部的致动器107(特别是压电致动器)使限定收集流道159的壁变形时，可以产生负压。负压可以形成进入收集流道159的流。致动器107可附接到微芯片150的外部，以便产生负压，例如，以便使收集流道159的壁变形。壁的变形可以改变收集流道159的内部空间并产生负压。致动器107可以是例如压电致动器。当收集对象颗粒被吸入收集流道159中时，形成层流的样本液体或形成层流的样本液体和鞘液也可以流入收集流道159。以这种方式，收集对象颗粒在颗粒分选部157中被分选，并被收集到收集流道159中。
收集对象颗粒在被第一液体包围的同时被收集到收集流道159中与第一液体不混溶的第二液体中。因此，如上所述，在收集流道159中形成含有作为分散介质的第二液体和作为分散体的第一液体的乳剂。
连接流道170设置有液体供应流道161，以防止不是收集对象颗粒的微小颗粒通过连接流道170进入收集流道159。与流过主流道155的液体(样本液体和鞘液)不混溶的第二液体从液体供应流道161引入连接流道170。
引入到连接流道170中的第二液体的一部分形成从连接流道170朝向主流道155的流。这防止除了收集对象颗粒之外的微小颗粒进入收集流道159。由于第一液体的流通过主流道155流向废物流道158，形成从连接流道170流向主流道155的流的第二液体以与第一液体相似的方式流经废物流道158，而不流经主流道155。
注意，引入到连接流道170中的第二液体的其余部分流入收集流道159。因此，收集流道159的内部可以充满第二液体。
收集流道159可以充满与第一液体不混溶的第二液体。为了用第二液体填充收集流道159的内部，可以从液体供应流道161向连接流道170供应第二液体。通过供应，第二液体可以从连接流道170流入收集流道159，因此收集流道159的内部可以充满第二液体。
已经流入废物流道158的层流可以在废物流道的端部160处被排放到微芯片的外部。此外，收集到收集流道159中的收集对象颗粒可以在收集流道的端部161处被排放到微芯片的外部。
例如，如图5所示，容器171可以通过诸如管172的流道连接到收集流道的端部163。如图5所示，将作为分散体含有收集对象颗粒的第一液体和作为分散介质的第二液体的乳剂收集到容器171中。如上所述，根据本技术的一个实施例，用于收集微小颗粒的装置100可以具有用于将包含收集对象颗粒的乳剂收集到容器中的流道。
此外，当关闭收集流道的端部163并执行收集操作时，可以在收集流道159中保持多个乳剂颗粒。在收集操作完成之后，可以在收集流道159中连续地执行诸如例如单个细胞分析的检测。
如上所述，在本技术中，主流道可以分叉成连接流道和至少一个废物流道。至少一个废物流道是收集对象颗粒除外的微小颗粒流经的流道。
此外，如图1和图2所示，主流道、连接流道和收集流道可以线性地排列在本技术的方法中所使用的用于微小颗粒分选的微芯片中。在这三个流道线性排列(特别是在同一轴上)的情况下，与例如连接流道和收集流道相对于主流道成一角度排列的情况相比，可以更有效地执行收集步骤。例如，可以减少将收集对象颗粒引入连接流道所需的抽吸量。
此外，如图1和图2所示，在本技术的方法中使用的用于分选微小颗粒的微芯片中，微小颗粒在主流道中大致成行排列，并向连接流道流动。因此，也可以减少收集步骤中的抽吸量。
此外，在本技术的方法中，液体供应流道向连接流道供应液体(具体是第二液体)。因此，在连接流道中形成从液体供应流道和连接流道之间的连接位置向主流道流动的流。这使得能够防止流过主流道的液体进入连接流道，并且还能够防止除了收集对象颗粒之外的微小颗粒通过连接流道流入收集流道。当执行收集步骤时，如上所述，包含一个收集对象颗粒的第一液体流过连接流道，并由于例如在收集流道中产生的负压而被收集到收集流道中的第二液体中。因此，在第二液体中形成含有一个收集对象颗粒的乳剂颗粒。
此外，在本技术中，例如，在适当的定时(例如，当微小颗粒到达颗粒分选部157时)驱动压电致动器，因此，在确定步骤中确定为收集对象颗粒的微小颗粒和含有收集对象颗粒的亲水性溶液被收集到收集流道159中，以形成乳剂颗粒。在确定步骤中，例如，在通过使用峰值信号和面积信号确定微小颗粒是否是收集对象颗粒的情况下，也可以确定颗粒是单个微小颗粒(单线态)、两个结合微小颗粒(双线态)还是三个结合微小颗粒(三线态)。这使得可以避免形成每个含有两个或更多微小颗粒的乳剂颗粒。因此，可以高概率和高效率地形成每个含有一个微小颗粒的乳剂颗粒。此外，由于可以避免形成如上所述的每个含有两个或更多个结合的微小颗粒的乳剂颗粒，所以可以省略在乳剂形成操作之前通过使用例如细胞分选器等去除两个或更多个微小颗粒的结合物质的操作。
相反，可以确定两个或多个微小颗粒中的每一个的特性，这些微小颗粒足够接近而可以在一次收集操作中同时被拉入连接流道。例如，可以将具有相同特性的两个微小颗粒封闭在一个乳剂颗粒中，或者还可以将具有不同特定特性的微小颗粒的组合封闭在一个乳剂颗粒中。
(示例)
一种用于分选微小颗粒的微芯片，其具有与图1所示的用于分选微小颗粒的微芯片150相同的流道结构，用于形成如下所述的成含有一个微小颗粒的乳剂颗粒。以下，将参考图1描述形成乳剂颗粒的操作。
将压电元件(压电致动器)附接到用于分选微小颗粒的微芯片150的外表面(特别是与膨胀部分相对应的外表面，该膨胀部分靠近收集流道159中至连接流道170的连接部)上，从而改变收集流道159的体积。
从样本液体入口151向样本液体流道152中引入含有直径为10μm的珠粒的亲水性样本液体，从鞘液入口153向鞘液流道154中引入亲水性鞘液。引入的亲水性样本液体和亲水性鞘液在合流部162处合流以形成层流，在层流中，亲水性样本液体被亲水性鞘液包围。层流包含基本上排列成行的珠粒，并通过主流道155流向连接流道170。
此外，在引入亲水性样本液体和亲水性鞘液的同时，从液体供应流道161向连接流道170并行地供应疏水性液体。从液体供应流道161向连接流道170供应疏水性液体防止层流通过连接流道170进入收集流道159，并且收集流道159充满疏水性液体。
当每个珠粒通过照射主流道155的检测区域156的激光的照射位置时，珠粒被激光照射，从而产生光。检测所产生的光，并根据检测到的光的特性确定是否收集每个珠粒。
在确定为收集的珠粒到达连接流道170附近的定时驱动压电元件，以使收集流道159的腔体变形。因此，珠粒通过连接流道170被收集到收集流道159中。收集的操作如下：(i)使收集流道159变形10μs，以向收集流道159的内部施加负压；(ii)保持变形状态10μs；以及(iii)释放负压10μs，以恢复变形。通过重复上述操作(i)至(iii)，在收集流道159中形成在疏水性液体中包含各含有一个珠粒的乳剂颗粒的乳剂。该乳剂包含作为分散介质的疏水性液体和含亲水性液体的乳剂颗粒作为分散体。
图8A示出了通过执行上述操作(i)至(iii)在收集流道159中形成含有一个珠粒的乳剂颗粒。将在下文中描述图8A。
图8A的(a)是示出珠粒(由白色箭头指示)流向连接流道170的状态的照片。在图8A的(a)中的点上，亲水性液体通过主流道155流向颗粒分选部157，然后流入从主流道155分叉的两个废物流道158，而不流入连接流道170。疏水性液体从液体供应流道161供应到连接流道170，并流入主流道155和收集流道159。由于亲水性液体的流动(在图8A的(a)所示的部分附近沿着废物流道158的壁流动)，已经流入主流道155的疏水性液体在从连接流道170流出后立即分别流入两个废物流道158。
图8A的(b)是表示珠粒变得更接近连接流道的点的照片。此时，开始了收集珠粒的操作。即，驱动压电元件以开始收集流道159的腔体的变形。
图8A的(c)是示出亲水性液体流入收集流道159的状态的照片。从照片上可以看出，在图8A的(c)的点上，珠粒被亲水性液体包围，亲水性液体进一步被疏水性液体包围。即形成含有一个珠粒的乳剂颗粒P。
图8A的(d)是示出乳剂颗粒P从连接流道170进入收集流道159之前的状态的照片。
图8A的(e)是示出乳剂颗粒P进入收集流道159后的状态的照片。可以确定在乳剂颗粒P中含有一个珠粒。
图8A的(f)是示出乳剂颗粒P进一步在收集流道159中的下游流动的照片。
如上所述，通过根据本技术的方法形成含有一个珠粒的乳剂颗粒。
通过控制上述操作(i)至(iii)中的每一个的时间段和变形量，可以调节乳剂颗粒的尺寸。即，可以通过使收集流道变形而扩大的流道体积来控制收集流道中的乳剂颗粒的尺寸。因此，可以通过压电元件的变形量，即压电元件的电驱动波形，容易地控制乳剂颗粒的尺寸。
例如，在通过压电元件增加收集流道的腔体的变形量的情况下，要吸入到收集流道159中的亲水性液体的量增加，这使得能够增大乳剂颗粒的尺寸。同时，在变形量减小的情况下，要吸入到收集流道159中的亲水性液体的量减小，这使得能够减小乳剂颗粒的尺寸。
此外，通过进一步增加或减少上述操作(ii)的保持时间，可以进一步增大或减小乳剂颗粒的尺寸。这在如图8B中示出。图8B是示出在上述操作(ii)的保持时间为10μsc、15μsc、25μsc和35μs的情况下的乳剂颗粒大小的照片。从这些照片中可以看出，可以通过改变上述操作(ii)中的保持时间来调节乳剂颗粒的大小。
此外，还可以通过调节连接流道170的体积(具体的，上游连接流道170a、连接部170c和下游连接流道170b的每一个的体积)来调节乳剂颗粒的拉伸(drawing)。
在上述示例中，通过将第二液体从液体供应流道供应到连接流道，防止流过主流道的第一液体进入连接流道。在本技术中，为了防止流过主流道的第一液体进入连接流道，可以在连接流道中设置防止第一液体进入收集流道的阀门。只有当执行收集步骤时，阀门才能被释放，第一液体才能通过连接流道流入收集流道。
(2-4)其他步骤
除了上述流动步骤、确定步骤和收集步骤之外，根据本技术收集微小颗粒的方法还可以包括其他步骤。下面将描述其他步骤的示例。
(2-4-1)培养步骤
根据本技术的一个优选实施例，微小颗粒是细胞或细胞聚合体，第一液体是微小颗粒的培养液。在本实施例中，可以形成包含作为分散体的培养液和作为分散介质的与培养液不混溶的第二液体的乳剂。分散体形成的每个乳剂颗粒可以包含一个细胞或细胞聚合体。因此，在每个乳剂颗粒中培养一个细胞或细胞聚合体是可能的。如上所述，在本实施例中，收集微小颗粒的方法还可以包括培养步骤，将在收集步骤中收集的收集对象颗粒(即，细胞或细胞聚合体)培养在由培养液形成的乳剂颗粒中。本领域技术人员可以根据待培养的细胞适当地选择培养液的种类。该实施例适用于例如在单个细胞分析中需要单独培养每个细胞或细胞聚合体的情况。
(2-4-2)破坏步骤
根据本技术的一个优选实施方案，微小颗粒可以是细胞、细胞聚合体或合成颗粒，并且微小颗粒可以在收集步骤之后被破坏。在该实施例中，可以在收集步骤中形成乳剂，并且可以破坏形成乳剂的每个乳剂颗粒中的细胞、细胞聚合体或合成颗粒。如上所述，根据本技术的收集微小颗粒的方法可以包括在收集步骤之后破坏收集的微小颗粒的破坏步骤。
根据本技术的其他优选实施例，除细胞、细胞聚合体或合成颗粒之外的颗粒可以被破坏。即，根据本技术的收集微小颗粒的方法可以包括在收集步骤之后将收集的收集对象颗粒破坏的破坏步骤。
优选地，可以在保持乳剂颗粒的同时进行破坏。因此，例如，细胞成分(例如，细胞内成分、细胞膜成分、细胞壁成分等)或合成颗粒中包含的成分可以释放到乳剂颗粒中，并且细胞成分或该成分可以与其他微小颗粒的成分分开处理。该处理可以是例如细胞成分或成分的分析、分离或扩增。细胞成分或成分的示例包括DNA、RNA、蛋白质、肽、氨基酸、脂类、糖类和细胞器，但不限于此。例如，在细胞成分或成分为DNA的情况下，可以通过执行破坏步骤或通过进一步处理在破坏步骤中获得的乳剂颗粒来制备用于DNA条形码的样本。
(2-4-3)检测步骤
根据本技术的一个优选实施例，可以在收集步骤之后执行对包含在收集对象颗粒中的成分或包含在收集对象颗粒中的成分与另一成分之间的反应的检测或分析。
例如，为了进行检测或反应，可以将根据本技术形成的乳剂颗粒与另一乳剂颗粒合并。然后，在合并后，在合并后的乳剂颗粒中可以对收集对象颗粒中所含的成分或该成分与另一成分之间的反应进行检测或分析。
例如，这种合并使得通过测序(也称为CITE-seq)来执行转录体和表位的细胞索引成为可能。例如，存在这样的情况，其中收集对象颗粒是结合到抗体上的细胞，具有poly-A序列的寡核苷酸条形码结合到该抗体上。在收集步骤中形成含有该细胞的乳剂颗粒。然后，在此之后，将乳剂颗粒与含有具有条形码序列的珠粒或凝胶的乳剂颗粒合并。这种合并使得检测细胞表面蛋白或细胞内mRNA成为可能。
此外，乳化的细胞或细胞聚合体(例如，球体、有机物等)可以与化学试剂反应。这使得检测或分析细胞或细胞聚合体对化学试剂的反应成为可能。
此外，可以在检测中检测生物分子。生物分子可以通过例如免洗检测来检测。例如，在免洗检测(wash free assay)中，可以使用LOCI法、FRET法、BRET法或FlimPIA法。
(2-4-4)合成步骤
根据本技术的一个优选实施方案，可以通过在收集步骤之后通过收集对象颗粒合成化学物质。例如，可以在收集步骤中形成的乳剂颗粒中进行合成。例如，可以通过将无细胞表达试剂注射到乳剂颗粒中来制备体外抗体。无细胞表达试剂的示例包括线性DNA和针对线性DNA的大肠杆菌S30提取系统(promega)。此外，例如，蛋白质合成可以通过乳剂颗粒中的无细胞蛋白质合成系统进行。
(2-5)微小颗粒分选机构与微小颗粒
在根据本技术的分选微小颗粒的方法中使用的微小颗粒分选机构可以是具有上述流道结构的结构或装置，例如，可以是具有微流道的芯片，特别是用于分选微小颗粒的微芯片。
在本技术中，“微”一词是指包括在用于分选微小颗粒的微芯片中的流道的至少一部分具有μm级的尺寸，特别是μm级的横截面尺寸。即，在本技术中，“微芯片”一词是指具有μm级流道的芯片，特别是具有横截面尺寸为μm级流道的芯片。例如，具有由具有μm级横截面尺寸的流道形成的微小颗粒分选部的芯片可以被称为根据本技术的微芯片。例如，在颗粒分选部157中，主流道155可以具有例如矩形的横截面，并且颗粒分选部157中的主流道155的宽度可以是例如100μm至500μm，特别是100μm至300μm。从主流道155分叉的分叉流道的宽度可以小于主流道155的宽度。连接流道170可以具有例如圆形横截面，并且连接流道170在连接流道170和主流道155之间的连接部处的直径可以是例如10μm至60μm，特别是20μm至50μm。这些关于流道的尺寸可以根据微小颗粒的尺寸，特别是收集对象颗粒的尺寸适当地改变。
可通过本领域已知的方法制造用于分选微小颗粒的微芯片150。例如，用于分选生物颗粒的微芯片150可以通过层压其中形成预定流道的两个或更多个基板来制造。流道可以在例如所有两个或更多个基板(特别是两个基板)中形成，或者可以仅在两个或更多个基板的一部分上(特别是两个基板中的一个)形成。为了在基板接合时容易地调整位置，流道优选地仅形成在一个基板上。
用于分选微小颗粒的微芯片150可以由本领域已知的材料制成。其示例包括聚碳酸酯、环烯烃聚合物、聚丙烯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚苯乙烯、玻璃和硅，但不限于此。特别地，例如聚碳酸酯、环烯烃聚合物和聚丙烯等聚合物材料是特别优选的，因为这些聚合物材料的加工性优异，并且可以通过使用模塑装置廉价地制造微芯片。
用于分选微小颗粒的微芯片150优选是透明的。例如，光(激光和散射光)通过的用于分选微小颗粒的微芯片150的至少一部分可以是透明的，并且例如检测区域可以是透明的。用于分选微小颗粒的整个微芯片150可以是透明的。
注意，虽然上面已经描述了在用于分选微小颗粒的一次性微芯片150中形成上述流道组的实施例，但在本技术中，可以不在微芯片150中形成流道组。例如，上述流道组可以形成在例如塑料、玻璃或其他材料基板中。此外，上述流道组可以具有二维或三维结构。
在本技术中，微小颗粒可以是具有尺寸的颗粒，其中颗粒可以流过微小颗粒分选机构(例如，用于分选微小颗粒的微芯片)中的流道。在本技术中，本领域技术人员可以适当地选择微小颗粒。在本技术中，微小颗粒可以包括生物微小颗粒，如细胞、细胞聚合体、微生物和脂质体，以及合成微小颗粒，如凝胶颗粒、珠粒、乳胶颗粒、聚合物颗粒和工业颗粒。
生物微小颗粒(也称为生物颗粒)可以包含形成各种细胞的染色体、脂质体、线粒体、细胞器等。细胞可以包括动物细胞(例如，造血细胞)和植物细胞。特别地，细胞可以是造血细胞或组织细胞。造血细胞可以是例如漂浮细胞，例如T细胞或B细胞。组织细胞可以是例如贴壁培养细胞或从组织分离的贴壁细胞。细胞聚合体可以包括例如球体、有机体等。微生物可以包括细菌，如大肠杆菌；病毒，如烟草花叶病毒；和真菌，如酵母。此外，生物微小颗粒还可以包括生物聚合物，如核酸、蛋白质及其复合物。例如，这些生物聚合物可以从细胞中提取，或者可以包含在血液样本或其他液体样本中。
合成的微小颗粒可以是例如由有机或无机聚合物材料、金属等制成的微小颗粒。有机聚合物材料可以包括聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯等。无机聚合物材料可以包括玻璃、二氧化硅、磁性材料等。金属可以包括胶体金、铝等。合成的微小颗粒可以是例如，凝胶颗粒或珠粒，更具体地说，凝胶微小颗粒或珠粒与选自寡核苷酸、肽、蛋白质和酶的一种或两种或多种的组合结合。
微小颗粒可以具有球形形状、大体的球形或非球形形状。微小颗粒的尺寸和质量可以由本领域技术人员根据微芯片的流道的尺寸适当地选择。同时，也可以根据微小颗粒的尺寸和质量来适当地选择微芯片的流道尺寸。在本技术中，例如，如荧光染料或荧光蛋白的化学或生物标记可以根据需要附着到微小颗粒上。标记使微小颗粒更容易检测出来。本领域技术人员可以适当地选择要附上的标记。标记可以结合到与微小颗粒特异性反应的分子(例如，抗体、适体、DNA、RNA等)上。
根据本技术的一个实施例，微小颗粒可以是生物颗粒，特别是细胞。
在本技术中，收集到收集流道中的微小颗粒可以经过进一步的微小颗粒分选处理。进一步的微小颗粒分选处理可以通过使用例如上述用于分选微小颗粒的微芯片150或用于分选微小颗粒的其他微芯片来执行。
例如，可以在进一步的微小颗粒分选处理中执行上述部分(2-1)至(2-4)中描述的步骤中的任意一个或两个以上的组合。例如，在进一步的微小颗粒分选处理中执行上述部分(2-2)中描述的确定步骤的情况下，为了收集含有微小颗粒的乳剂颗粒，可以在确定步骤中对微小颗粒、乳剂颗粒或微小颗粒和乳剂颗粒两者进行确定。如上所述，在进一步的微小颗粒分选处理中，也可以基于从微小颗粒和/或乳剂颗粒获得的信息来确定微小颗粒或乳剂颗粒是否是收集对象颗粒。
此外，在进一步的微小颗粒分选处理中，可以对包含含有微小颗粒的乳剂颗粒的乳剂进行分选处理。
(3)流道结构的其他示例
(3-1)主流道与废物流道呈线性排列的流道结构
在本技术的一个实施例中，连接流道和收集流道可以不与主流道线性排列。下面将参考图9描述本实施例中用于分选微小颗粒的微芯片的示例。
图9示出了根据本技术的用于分选微小颗粒的微芯片中的检测区域和包括微小颗粒分选部的区域的示意图。用于分选微小颗粒的微芯片350，如图9所示，以及参考图1描述的用于分选微小颗粒的微芯片150具有流道结构，在该流道结构中，样本液体流道352和鞘液流道354在连接部362处连接以形成主流道355，并且在主流道355中设置检测区域356。含有微小颗粒P的样本液体被鞘液包围的层流流过主流道355。
用于分选微小颗粒的微芯片350不仅包括主流道355，还包括收集收集对象颗粒的收集流道359、连接主流道355和收集流道359的连接流道370、以及连接到连接流道370以供应液体的液体供应流道361。
主流道355还包括废物流道358，不是收集对象颗粒的微小颗粒流经废物流道358。在参考图1描述的用于分选微小颗粒的微芯片150中，两个废物流道158从主流道155分叉，并与连接流道170、收集流道159和主流道155线性排列。另一方面，图9中用于分选微小颗粒的微芯片350具有这样的流道结构，其中主流道355和废物流道358线性地排列，并且连接流道370和收集流道359从主流道355分叉。
如上所述，在根据本技术的收集微小颗粒的方法中使用的用于分选微小颗粒的微芯片中，连接流道和收集流道可以不与主流道线性排列。例如，微芯片可以具有这样的流道结构，其中主流道和废物流道线性地排列，并且连接流道和收集流道从主流道分叉。
(3-2)具有多个收集流道的流道结构
在本技术的另一个实施例中，用于分选微小颗粒的微芯片可以具有一个或两个或更多个流道结构，每个流道结构包括：主流道，微小颗粒通过主流道流动；收集流道，在微小颗粒中的收集对象颗粒收集到收集流道中；连接主流道和收集流道的连接流道；以及连接到连接流道以供应液体的液体供应流道。上面参考图1所述的用于分选微小颗粒的微芯片具有一个流道结构。然而，如下文参考图10和图11所述，根据本技术的用于收集微小颗粒的方法中使用的用于分选微小颗粒的微芯片可以具有两个或多于两个的流道结构。
图10示出了根据本技术的用于分选微小颗粒的微芯片中的检测区域和包括微小颗粒分选部的区域的示意图。图10中所示的用于分选微小颗粒的微芯片450以及参考图1所述的用于分选微小颗粒的微芯片150具有流道结构，其中样本液体流道452和鞘液流道454在合流部462处接合以形成主流道455，并且在主流道455中设置检测区域456。含有微小颗粒P的样本液体被鞘液包围的层流流过主流道455。
用于分选微小颗粒的微芯片450不仅包括主流道455，还包括收集收集对象颗粒的收集流道459-1、连接主流道455和收集流道459-1的连接流道470-1、以及连接到连接流道470-1以供应液体的液体供应流道461-1。用于分选微小颗粒的微芯片450还包括收集收集对象颗粒的收集流道459-2、连接主流道455和收集流道459-2的连接流道470-2、以及连接到连接流道470-2以供应液体的液体供应流道461-2。即，用于分选微小颗粒的微芯片450具有两个流道结构。在用于分选微小颗粒的微芯片450中，主流道455由这两个流道结构共享。此外，连接流道470-1连接到连接流道470-2下游的主流道455。
用于分选微小颗粒的微芯片450可以形成例如包含不同的收集对象颗粒的两种乳剂。
在这种情况下，在确定步骤中确定微小颗粒是例如两种收集对象颗粒A和B中的任一种还是非两种收集对象颗粒。用户可以适当地选择关于微小颗粒是属于收集对象颗粒A还是B的标准。
在收集步骤中，在微小颗粒是收集对象颗粒A的情况下，通过连接流道470-1将微小颗粒收集到收集流道459-1中。作为收集对象颗粒A的微小颗粒在被包含在第一液体中的同时收集到收集流道459-1的第二液体中。
在收集步骤中，在微小颗粒是收集对象颗粒B的情况下，通过连接流道470-2将微小颗粒收集到收集流道459-2中。作为收集对象颗粒B的微小颗粒在被包含在第一液体中时被收集到收集流道459-2的第二液体中。
在收集步骤中，在微小颗粒不是收集对象颗粒A和B的情况下，微小颗粒流入废物流道458。
如上所述，形成含有收集对象颗粒A的乳剂和含有收集对象颗粒B的乳剂。
图11示出了根据本技术的用于分选微小颗粒的微芯片中的检测区域和包括微小颗粒分选部的区域的示意图。如图11中所示的用于分选微小颗粒的微芯片550与参考图10描述的用于分选微小颗粒的微芯片450相同，除了两个连接流道570-1和570-2连接在主流道555的相同位置之外。即，用于分选微小颗粒的微芯片550具有两个流道结构，并且主流道555由这两个流道结构共享。
用于分选微小颗粒的微芯片550还可以形成含有待收集的不同微小颗粒的两种乳剂。
此外，在这种情况下，在确定步骤中确定微小颗粒是例如两种收集对象颗粒A和B中的任何一种，或者并非是两种收集对象颗粒。用户可以适当地选择关于微小颗粒是否属于收集对象颗粒A或者B的标准。
在收集步骤中，在微小颗粒是收集对象颗粒A的情况下，通过连接流道570-1将微小颗粒收集到收集流道559-1中。作为收集对象颗粒A的微小颗粒在被包含在第一液体中时被收集到收集流道559-1的第二液体中。
在收集步骤中，在微小颗粒是收集对象颗粒B的情况下，通过连接流道570-2将微小颗粒收集到收集流道559-2中。作为收集对象颗粒B的微小颗粒在被包含在第一液体中时被收集到收集流道559-2的第二液体中。
在收集步骤中，在微小颗粒不是收集对象颗粒A和B的情况下，微小颗粒流入废物流道558。
如上所述，形成含有收集对象颗粒A的乳剂和含有收集对象颗粒B的乳剂。
2.第二实施例(用于分选微小颗粒的微芯片)
本技术还提供了一种用于分选微小颗粒的微芯片，微芯片具有流道结构，该流道结构包括：主流道，微小颗粒通过主流道流动；收集流道，微小颗粒中的收集对象颗粒收集到该收集流道中；连接主流道和收集流道的连接流道；以及连接到连接流道以供应液体的液体供应流道。微芯片中的主流道具有确定区域，用于确定包含在第一液体中的流动的微小颗粒是否是收集对象颗粒，并且确定为收集对象颗粒的微小颗粒在包含在第一液体中时被收集到与收集流道中与第一液体不可混溶的第二液体中。用于微小颗粒分选的微芯片与上述部分1所述的用于微小颗粒分选的微芯片相同，其说明也适用于本实施例。
3.第三实施例(用于收集微小颗粒的装置)
本发明还提供了一种用于收集微小颗粒的装置，包括：用于分选微小颗粒的微芯片，微芯片具有流道结构，流道结构包括：主流道，微小颗粒通过主流道流动；收集流道，微小颗粒中的收集对象颗粒收集在收集流道中；连接主流道和收集流道的连接流道；以及连接到连接流道以供应液体的液体供应流道；第一液体供应单元，向主流道供应含有微小颗粒的第一液体；第二液体供应单元，将与第一液体不可混溶的第二液体供应到液体供应流道；以及确定单元，确定流过主流道的微小颗粒是否是收集对象颗粒。用于收集微小颗粒的装置与上述部分1所述的用于收集微小颗粒的装置相同，其说明也适用于本实施例。
用于分选颗粒的微芯片也与在以上部分1中描述的用于分选颗粒的微芯片相同，并且其描述也适用于本实施方式。
第一液体供给单元例如可以是上述部分1中的(2)中描述的用于形成层流的至少一个部件。并且可具有例如样本液体流道152和鞘液流道154。此外，第一液体供应单元还可包括：流道(例如，管)，分别连接到样本液体入口151和鞘流体入口153，以将样本液体和鞘液引入这些入口；以及样本液体容纳容器和鞘液容纳容器，样本液体容纳容器和鞘液容纳容器连接到流道。
第二液体供给单元可以是例如上述部分1中的(2)中描述的用于将第二液体供给至液体供给流道161的至少一个组件，并且可以包括例如用于容纳待供给至液体供给流道161的第二液体的容器和连接容器和液体供给流道的流道(例如，连接芯片和容器的管等)。
确定单元与上述部分1中描述的确定单元相同，并且其描述也适用于本实施例。
此外，用于分选微小颗粒的微芯片可从用于收集微小颗粒的装置拆卸。因为用于分选微小颗粒的微芯片可从装置上拆卸，所以可针对每个样本使用用于分选微小颗粒的新微芯片。这使得可以防止样本的污染。
4.第四实施方式(制备乳剂的方法)
本技术还提供了一种制备乳剂的方法，该方法包括在上述部分“1.第一实施例(收集微小颗粒的方法)”中描述的流动步骤、确定步骤和收集步骤。制备方法可以包括在上述部分“(2-4)其他步骤”中描述的其他步骤。以上部分“1.第一实施例(收集微小颗粒的方法)”中的描述也适用于制备根据本技术的乳剂的方法。
通过根据本技术的制备乳剂的方法，可以制备以高含量比包含各自包含一个微小颗粒(具体地，收集对象颗粒)的乳剂颗粒的乳剂。例如，根据本技术的制备方法，可以制备一种乳剂，其中各自包含一个微小颗粒的乳剂颗粒的数目与乳剂颗粒的总数的比率是例如70％以上，优选80％以上，更优选90％以上，和进一步优选95％以上。在使用乳剂的单个细胞分析中，增加各自包含一个细胞的乳剂的含量比是重要的，并且在存在少量待分析的细胞的情况下，增加含量比是尤其重要的。本技术的制备方法对于单个细胞分析是极其有用的，因为可以制备其中均包含一个微小颗粒的乳剂颗粒的数目的比率高的乳剂。
5.第五实施例(乳剂)
本发明还提供了一种包含含有微小颗粒的乳剂颗粒的乳剂，其中每个含有一个微小颗粒的乳剂颗粒数与乳剂颗粒总数之比为70％以上。该比率优选为80％或更大，更优选为90％或更大，再优选为95％或更大。由于本技术的乳剂以如此高的含量比包含每个含有一个微小颗粒的乳剂颗粒，因此该乳剂适合于例如单个细胞分析。
每个含有一个微小颗粒的乳剂颗粒可按上述部分“1.第一实施例(收集微小颗粒的方法)”所述形成。此外，该乳剂可以如上面的部分“1.第一实施例(收集微小颗粒的方法)”或部分“4.第四实施例(制备乳剂的方法)”所述制备。
乳剂可以是例如含有作为分散介质的第二液体和作为分散体的第一液体的乳剂。以上部分“1.第一实施例(收集微小颗粒的方法)”适用于这些液体。以上部分“1.第一实施例(收集微小颗粒的方法)”也适用于包含在乳剂颗粒中的微小颗粒，微小颗粒可以是例如细胞、细胞聚合体、合成颗粒等。
注意，本技术也可以具有以下配置。
[1]一种收集微小颗粒的方法，其中，
在具有流道结构的微小颗粒分选机构中，所述流道结构包括：
主流道，所述微小颗粒通过所述主流道流动，
收集流道，所述微小颗粒中的收集对象颗粒被收集至所述收集流道中，连接流道，连接所述主流道和所述收集流道，以及
液体供应流道，连接至所述连接流道以便供应液体，
所述方法包括：
流动步骤，使含有微小颗粒的第一液体流过所述主流道；
确定步骤，确定流过所述主流道的所述微小颗粒是否是收集对象颗粒；以及
收集步骤，将所述收集对象颗粒收集至所述收集流道中，以及
在所述收集步骤中，所述收集对象颗粒在包含在所述第一液体中的同时被收集到所述收集流道中的第二液体中，所述第二液体与所述第一液体不混溶。
[2]根据[1]所述的收集微小颗粒的方法，其中，通过执行所述收集微小颗粒的方法，在所述收集流道中形成包含所述第二液体作为分散介质和所述第一液体作为分散体的乳剂。
[3]根据[1]或[2]所述的收集微小颗粒的方法，其中，通过执行收集微小颗粒的方法形成乳剂，并且形成所述乳剂的液滴的至少一部分包含一个所述收集对象颗粒。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述第一液体是亲水性的并且所述第二液体是疏水性的。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述第二液体的运动粘度是所述第一液体的运动粘度的1/100倍至100倍。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，在将所述第二液体从所述液体供应流道供应至所述连接流道时，执行所述流动步骤、所述确定步骤以及所述收集步骤。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，
所述主流道分叉为所述连接流道和至少一个废物流道，所述收集对象颗粒除外的微小颗粒流过所述至少一个废物流道，并且
所述液体供应流道将所述液体供应至所述连接流道。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，用于防止所述第一液体进入所述收集流道的阀门设置在所述连接流道中。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，在所述流动步骤中，所述微小颗粒通过所述主流道基本成行地流向所述连接流道。
[10]根据[1]至[9]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，
所述微小颗粒分选机构具有流道结构，在所述流道结构中，包含所述微小颗粒的液体流动通过的样本流道和不包含微小颗粒的液体流动通过的鞘层流道在合流部处连接至所述主流道，使得所述微小颗粒在所述合流部之后基本成行地流动通过所述主流道，以及
所述流道结构形成包含基本上成行流动的所述微小颗粒的层流。
[11]根据[1]至[10]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，在所述确定步骤中，利用光照射流过所述主流道的所述微小颗粒，并且基于通过所述照射产生的光确定所述微小颗粒是否是所述收集对象颗粒。
[12]根据[1]至[11]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，在所述收集步骤中，由于所述收集流道中的压力波动，通过所述连接流道将所述收集对象颗粒收集到所述收集流道中。
[13]根据[1]至[12]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述主流道、所述连接流道和所述收集流道线性排列。
[14]根据[1]至[13]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述微小颗粒是细胞或细胞聚合体，并且所述第一液体是所述微小颗粒的培养液。
[15]根据[1]至[14]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述微小颗粒是细胞、细胞聚合体或合成颗粒，并且在所述收集步骤之后，所述微小颗粒被破坏。
[16]根据[1]至[13]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，在所述收集流道中收集的所述微小颗粒经过进一步的微小颗粒分选处理。
[17]根据[1]至[6]中任一项所述的收集微小颗粒的方法，其中，用于分选微小颗粒的机构具有一个或多个流道结构。
[18]一种用于分选微小颗粒的微芯片，其中
所述微芯片具有流道结构，所述流道结构包括：
主流道，所述微小颗粒通过所述主流道流动，
收集流道，将所述微小颗粒中的收集对象颗粒收集至所述收集流道中，
连接流道，连接所述主流道和所述收集流道，以及
液体供应流道，连接至所述连接流道以便供应液体，
所述主流道具有确定区域，所述确定区域用于确定包含在第一液体中的同时流动的所述微小颗粒是否是所述收集对象颗粒，并且
被确定为收集对象颗粒的所述微小颗粒在包含在所述第一液体中的同时被收集到所述收集流道中的第二液体中，所述第二液体与所述第一液体不混溶。
[19]一种用于收集微小颗粒的装置，包括：
用于分选微小颗粒的微芯片，所述微芯片具有流道结构的，所述流道结构包括：
主流道，所述微小颗粒通过所述主流道流动，
收集流道，所述微小颗粒中的收集对象颗粒被收集至所述收集流道中，
连接流道，连接所述主流道和所述收集流道，以及
液体供应流道，连接至所述连接流道以便供应液体；
第一液体供应单元，向所述主流道供应含有所述微小颗粒的第一液体；
第二液体供应单元，向所述液体供应流道供应与所述第一液体不混溶的第二液体；以及
确定单元，确定流过所述主流道的所述微小颗粒是否是所述收集对象颗粒。
[20]根据[19]所述的用于收集微小颗粒的装置，其中，用于分选微小颗粒的所述微芯片能够从用于收集微小颗粒的所述装置拆卸。
[21]一种制备包含含有微小颗粒的乳剂颗粒的乳剂的方法，其中，
在具有流道结构的微小颗粒分选机构中，所述流道结构包括：
主流道，所述微小颗粒通过所述主流道流动，
收集流道，所述微小颗粒中的收集对象颗粒被收集至所述收集流道中，
连接流道，连接所述主流道和所述收集流道，以及
液体供应流道，连接至所述连接流道以便供应液体，
所述方法包括：
流动步骤，使含有所述微小颗粒的第一液体流过主流道；
确定步骤，确定流过所述主流道的所述微小颗粒是否是所述收集对象颗粒；以及
收集步骤，将所述收集对象颗粒收集至所述收集流道中，以及
在所述收集步骤中，包含在所述第一液体中的所述收集对象颗粒被收集到所述收集流道中的第二液体中，所述第二液体与所述第一液体不混溶。
[22]一种包含含有微小颗粒的乳剂颗粒的乳剂，其中，各自含有一个微小颗粒的乳剂颗粒的数目与所述乳剂颗粒的总数的比率为70％以上。
参考符号列表
100 用于收集微小颗粒的装置
150 用于分选微小颗粒的微芯片
155 主流道
159 收集流道
161 液体供应流道
170 连接流道

Claims (22)

1.一种收集微小颗粒的方法，其中，
在具有流道结构的微小颗粒分选机构中，所述流道结构包括：
主流道，所述微小颗粒通过所述主流道流动，
收集流道，所述微小颗粒中的收集对象颗粒被收集至所述收集流道中，
连接流道，连接所述主流道和所述收集流道，以及
液体供应流道，连接至所述连接流道以便供应液体，
所述方法包括：
流动步骤，使含有所述微小颗粒的第一液体流过所述主流道；
确定步骤，确定流过所述主流道的所述微小颗粒是否是收集对象颗粒；以及
收集步骤，将所述收集对象颗粒收集至所述收集流道中，以及
在所述收集步骤中，所述收集对象颗粒在包含在所述第一液体中的同时被收集到所述收集流道中的第二液体中，所述第二液体与所述第一液体不混溶。
2.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，通过执行所述收集微小颗粒的方法，在所述收集流道中形成包含所述第二液体作为分散介质和所述第一液体作为分散体的乳剂。
3.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，通过执行所述收集微小颗粒的方法形成乳剂，并且形成所述乳剂的液滴的至少一部分包含一个所述收集对象颗粒。
4.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述第一液体是亲水性的，并且所述第二液体是疏水性的。
5.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述第二液体的运动粘度是所述第一液体的运动粘度的1/100倍至100倍。
6.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，在将所述第二液体从所述液体供应流道供应至所述连接流道时，执行所述流动步骤、所述确定步骤以及所述收集步骤。
7.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，
所述主流道分叉到所述连接流道和至少一个废物流道，所述收集对象颗粒除外的微小颗粒流过所述至少一个废物流道，并且
所述液体供应流道将所述液体供应至所述连接流道。
8.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，用于防止所述第一液体进入所述收集流道的阀门设置在所述连接流道中。
9.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，在所述流动步骤中，所述微小颗粒通过所述主流道基本成行地流向所述连接流道。
10.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，
所述微小颗粒分选机构具有流道结构，在该流道结构中，包含所述微小颗粒的液体流动通过的样本流道和不包含微小颗粒的液体流动通过的鞘液流道在合流部处连接至所述主流道，使得所述微小颗粒在所述合流部之后基本成行地流动通过所述主流道，以及
所述流道结构形成包含基本上成行流动的所述微小颗粒的层流。
11.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，在所述确定步骤中，利用光照射流过所述主流道的所述微小颗粒，并且基于通过所述照射产生的光确定所述微小颗粒是否是所述收集对象颗粒。
12.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，在所述收集步骤中，由于所述收集流道中的压力波动，通过所述连接流道将所述收集对象颗粒收集到所述收集流道中。
13.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述主流道、所述连接流道和所述收集流道线性排列。
14.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述微小颗粒是细胞或细胞聚合体，并且所述第一液体是所述微小颗粒的培养液。
15.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述微小颗粒是细胞、细胞聚合体或合成颗粒，并且在所述收集步骤之后，所述微小颗粒被破坏。
16.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，在所述收集流道中收集的所述微小颗粒经过进一步的微小颗粒分选处理。
17.根据权利要求1所述的收集微小颗粒的方法，其中，所述微小颗粒分选机构具有一个或多个流道结构。
18.一种用于分选微小颗粒的微芯片，其中，
所述微芯片具有流道结构，所述流道结构包括：
主流道，所述微小颗粒通过所述主流道流动；
收集流道，所述微小颗粒中的收集对象颗粒被收集至所述收集流道中；
连接流道，连接所述主流道和所述收集流道，以及
液体供应流道，连接至所述连接流道以便供应液体，
所述主流道具有确定区域，所述确定区域用于确定在包含在第一液体中的同时流动的所述微小颗粒是否是所述收集对象颗粒，并且
被确定为所述收集对象颗粒的所述微小颗粒在包含在所述第一液体中的同时被收集到所述收集流道中的第二液体中，所述第二液体与所述第一液体不混溶。
19.一种用于收集微小颗粒的装置，包括：
用于分选微小颗粒的微芯片，具有流道结构，所述流道结构包括：
主流道，所述微小颗粒通过所述主流道流动；
收集流道，所述微小颗粒中的收集对象颗粒被收集至所述收集流道中；
连接流道，连接所述主流道和所述收集流道；以及
液体供应流道，连接至所述连接流道以便供应液体；
第一液体供应单元，向所述主流道供应含有所述微小颗粒的第一液体；
第二液体供应单元，向所述液体供应流道供应与所述第一液体不混溶的第二液体；以及
确定单元，确定流过所述主流道的所述微小颗粒是否是所述收集对象颗粒。
20.根据权利要求19所述的用于收集微小颗粒的装置，其中，用于分选微小颗粒的所述微芯片能够从用于收集微小颗粒的所述装置拆卸。
21.一种制备包含含有微小颗粒的乳剂微粒的乳剂的方法，其中，
在具有流道结构的微小颗粒分选机构中，所述流道结构包括：
主流道，所述微小颗粒通过所述主流道流动；
收集流道，所述微小颗粒中的收集对象颗粒被收集至所述收集流道中；
连接流道，连接所述主流道和所述收集流道；以及
液体供应流道，连接至所述连接流道以便供应液体，
所述方法包括：
流动步骤，使含有所述微小颗粒的第一液体流过所述主流道；
确定步骤，确定流过所述主流道的所述微小颗粒是否是所述收集对象颗粒；以及
收集步骤，将所述收集对象颗粒收集至所述收集流道中，以及
在所述收集步骤中，所述收集对象颗粒在包含在所述第一液体中的同时被收集到所述收集流道中的第二液体中，所述第二液体与所述第一液体不混溶。
22.一种包含含有微小颗粒的乳剂微粒的乳剂，其中，各自含有一个微小颗粒的乳剂微粒的数目与所述乳剂微粒的总数的比率为70％或大于70％。
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