CN111886074A - 用于高通量单细胞分析的设备，系统和方法 - Google Patents

Abstract

本公开包括用于将细胞组织成阵列，通过基于图像的分析在短或长的持续时间内对它们进行表型化，以及利用每个细胞旁边存在的DNA条形码进行大规模平行条形码基因组分析的装置、系统和方法。

Description

用于高通量单细胞分析的设备，系统和方法

交叉引用

本申请要求于2017年10月20日提交的美国临时申请号62/574，865的优先权，该申请通过引用合并于此。

关于联邦资助研究的声明

本发明得到美国政府的支持，由美国国家卫生研究院授予的联邦资助号R2GM111584和R01GM123542。联邦政府对本发明享有某些权利。

技术背景

单细胞分析技术可以在各种基础研究和临床应用中取得突破性进展。例如，在常规细胞培养技术需要数周或数月实验的情况下，单细胞分析有可能快速鉴定罕见的耐药细胞。但是，现有的单细胞分析平台在细胞捕获架构中均无法提供高捕获效率，该细胞捕获架构兼容长期细胞培养、高通量显微镜、自动图像处理、生化分析和基因组分析技术，从而让大型数据集被有效地分析。因此，需要捕获和分隔单细胞的改进方法，用于随后的表型、生化、生理、遗传、基因组和/或蛋白质组学的分析。

发明内容

本文公开的是微流控装置，其包括：a)布置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与之流体连通的多个堰阱，其中每个堰阱被构造成保持物体悬浮在通过微流控装置的流体中，并且其中：i)每个堰阱在至少一个维度上具有收缩区，该收缩区小于物体最小尺寸约1/3；ii)绕过堰阱的流体流路的流体阻力与穿过堰阱的流体流路的流体阻力之比至少为0.4。

在一些实施例中，流体阻力之比至少为0.5。在一些实施例中，流体阻力之比至少为0.75。在一些实施例中，流体阻力之比至少为1.0。在一些实施例中，流体阻力之比至少为1.25。

本文还公开的是微流控装置，其包括：a)布置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与之流体连通的多个堰阱，其中每个堰阱被构造成保持物体悬浮在通过微流控装置的流体中，并且其中：i)每个堰阱包括入口区域、内部区域和出口区域，它们共同构成通过堰阱的内部流体流路，该路径具有流体阻力RT；ii)多数堰阱中的每个堰阱与一个长旁路流体通道和一个或两个短旁路流体通道流体连通，长旁路流体通道具有流体阻力RA，每个短旁路流体通道的流体阻力比RA小，其中每个旁路流体流动通道将堰阱的出口区域连接到另一个堰阱的入口区域；iii)RA/RT的比至少为1.0。

另外，本文公开的是微流控装置，其包括：a)布置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与它们流体连通的多个堰阱，其中每个堰阱被构造成保持物体悬浮在通过微流控装置的流体中，并且其中：i)每个堰阱包括入口区域、内部区域和出口区域，它们共同构成穿过堰阱的内部流体流路，该路径具有流体阻力RT；ii)多数堰阱中的每个堰阱与一个具有流体阻力RA的长旁路流体通道和一个或两个短旁路流体通道流体连通，每个短旁路流体通道的流体阻力比RA小，其中每个旁路流体流动通道将堰阱的出口区域连接到另一个堰阱的入口区域；iii)如果堰阱不被占用，则流体沿第一方向流过相邻的短旁路通道，并且如果堰阱被物体占用，则流体沿第二方向流过。

在一些实施例中，RA/RT之比至少为1.1。在一些实施例中，RA/RT之比至少为1.2。在一些实施例中，RA/RT之比至少为1.3。在一些实施例中，RA/RT之比至少为1.4。在一些实施例中，RA/RT之比至少为1.45。在一些实施例中，每个堰阱包括至少一个收缩区，该收缩区的空间尺寸小于物体最小尺寸约一半。在一些实施例中，每个堰阱包括至少一个收缩区，该收缩区的空间尺寸小于悬浮物最小尺寸约三分之一。在一些实施例中，每个堰阱包括至少一个收缩区，该收缩区的空间尺寸在约1.5μm至约6μm的范围内。在一些实施例中，RA/RT之比至少为1.2，并且单个堰阱将悬浮物保持在第一接触上的捕获概率至少为0.36。在一些实施例中，RA/RT之比至少为1.45，并且单个堰阱将悬浮物保持在第一接触上的捕获概率至少为0.60。在一些实施例中，每个堰阱在出口区域内包括玻璃料结构，并且其中玻璃料结构包括一个或多个收缩区，该收缩区的空间尺寸小于悬浮物的最小尺寸。在一些实施例中，多个堰阱包括至少100个堰阱。在一些实施例中，多个堰阱包括至少1000个堰阱。在一些实施例中，多个堰阱包括至少10000个堰阱。在一些实施例中，用于捕获悬浮物的预饱和捕获效率至少为20％。在一些实施例中，多个堰阱包括至少100000个堰阱。在一些实施例中，用于捕获悬浮物的预饱和捕获效率至少为50％。在一些实施例中，用于捕获悬浮物的预饱和捕获效率至少为80％。在一些实施例中，用于捕获悬浮物的预饱和捕获效率至少为90％。在一些实施例中，用于捕获悬浮物的预饱和捕获效率至少为95％。在一些实施例中，用于捕获悬浮物的预饱和捕获效率至少为98％。在一些实施例中，微流控装置还包括：b)可移除的盖子。在一些实施例中，一个或多个堰阱的内部区域包括唯一的分子标识符(或条形码)，当在堰阱内部区域中的细胞裂解时，其可以与细胞的分子成分结合或杂交。

本文公开了用于捕获悬浮在流体中的物体的方法，该方法包括：a)提供本文所述的任何实施例的微流控装置；b)使包含物体的流体流过微流控装置，以在多个堰阱中的一个或多个中捕获物体。

在一些实施例中，每个堰阱在出口区域内包括玻璃料结构，并且其中玻璃料结构包括一个或多个收缩区，该收缩区的空间尺寸小于物体的最小尺寸。在一些实施例中，(b)中的流入是在第一流体动力压力下进行的，从而在一个或多个堰阱的入口区域的收缩区中将物体捕获。在一些实施例中，所述物体包括可变形物体，并且其中该方法还包括使被一个或多个堰阱的入口区域中的收缩区中捕获的物体经受高于第一流体动力压力的第二流体动力压力，从而迫使可变形物体穿过入口区域中的收缩区并进入一个或多个堰阱的内部区域。在一些实施例中，第一流体动力压力在大约1至大约100mbar的范围内。在一些实施例中，第二流体动力压力在约100mbar至约1000mbar的范围内。在一些实施例中，第二流体动力压力与第一流体动力压力之比在约10倍到约20倍的范围内。在一些实施例中，物体是细胞或小球。在一些实施例中，(b)中的流入至少重复一次，从而使至少两个物体被限制在一个或多个堰阱的内部区域内。在一些实施例中，使用包括与第一实例中使用的物体相同物体的流体，使(b)中的流入至少重复一次。在一些实施例中，使用包括与第一实例中使用的物体不同物体的流体，使(b)中的流入至少重复一次。在一些实施例中，被限制在一个或多个堰阱的内部区域内的至少两个物体包括至少两个相同的细胞，至少两个不同的细胞，至少两个相同的小球，至少两个不同的小球，或至少一个细胞和一个小球。在一些实施例中，该方法进一步包括通过使不混溶的流体流过微流控装置来密封多个堰阱。在一些实施例中，不混溶的流体是油或空气。在一些实施例中，物体是细胞，并且将细胞在一个或多个堰阱的内部区域中培养一天或多天的时间。在一些实施例中，将细胞在一个或多个堰阱的内部区域中培养一个或多个星期的时间。在一些实施例中，将细胞在一个或多个堰阱的内部区域中培养一个或多个月的时间。在一些实施例中，物体是细胞，并且其中该方法进一步包括使用成像技术对一个或多个堰阱的内部区域内的细胞进行表型化。在一些实施例中，成像技术选自明场成像、荧光成像、双光子荧光成像或其任何组合。在一些实施例中，多个堰阱的内部区域均包括唯一的分子识别符，其在堰阱的内部区域中的细胞裂解后可结合或杂交至细胞的分子组分中。在一些实施例中，分子组分包括蛋白质、肽、DNA分子、RNA分子、mRNA分子或其任何组合。在一些实施例中，唯一的分子标识符(或条形码)用于进行DNA测序，基因表达分析或染色质分析。在一些实施例中，使用外部施加的电场来促进核酸分子组分与唯一的分子标识符的杂交。在一些实施例中，微流控装置还包括可移动的盖子。在一些实施例中，可变形物体是细胞，及在一个或多个堰阱的内部区域中捕获的细胞，将生物相容性水凝胶注入到微流控装置中并使其聚合。在一些实施例中，在水凝胶聚合之后，除去微流控装置的盖子以允许获得被捕获的细胞。在一些实施例中，生物相容性水凝胶用于在细胞裂解后限制所捕获细胞的基因组材料。

通过引用的合并

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其整体并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被特别地和单独地指示通过引用以其整体并入本文的程度相同。在本文中的术语与并入的参考文献中的术语之间发生冲突的情况下，以本文中的术语为准。

附图说明

在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考下面的详细说明，可以更好地理解本发明的特征和优点，以下详细说明阐述了说明性实施例，在这些说明性实施例中利用了本发明的原理及其附图，其中：

图1示出了微流控装置，其包括捕获部件(收缩区)和互连旁路流体通道的梯状网络。

图2A和图2B示出了类似设计的微流控装置中的两种不同的流动方式，该装置包括捕获部件以及互连的流体旁路通道的梯形网络。在该非限制性示例中，捕获部件在其出口区域中包括玻璃料。图2A示出了当通过捕获部件的内部流路具有比蛇形旁路流体通道更高的流体动力学流动阻力时，通过装置的流体。图2B示出了当通过捕获部件的内部流路具有比蛇形旁路流体通道更低的流体动力学流动阻力时，通过装置的流体。

图3示出了用于图1和图2A和图2B所示的捕获部件和互连流体通道的梯状网络的等效阻力回路。

图4A和图4B示出了类似设计的微流控装置中的两种不同的流动方式，该装置包括捕获部件和互连流体通道的网状网络。图4A示出了当通过捕获部件的内部流路具有比蛇形旁路流体通道更高的流体动力学流动阻力时，通过装置的流体。图4B示出了当通过捕获部件的内部流路具有比蛇形旁路流体通道更低的流体动力学流动阻力时，通过装置的流体。

图5示出了用于图4A和图4B所示的捕获部件和互连流体通道的网状网络的等效阻力回路。

图6示出了网状网络捕获几何结构，其捕获率近似计算为：RA/RT＝0.42。

图7示出了网状网络捕获几何结构，其捕获率近似计算为：RA/RT＝1.2。

图8示出了梯形网络捕获几何结构，其捕获率近似计算为：RA/RT＝1.2。

图9示出了网状网络捕获几何结构，其捕获率近似计算为：RA/RT＝1.45。

图10示出了梯形网络捕获几何结构，其捕获率近似计算为：RA/RT＝1.45。

图11示出了网状网络捕获几何结构，其中，堰阱包括具有小体积的内部流路(即，堰阱不具有明显的“内部区域”)。

图12示出了梯形网络捕获几何结构的一个非限制性示例，其具有内部流路，该内部流路在背面不具有玻璃料。

图13示出了网状网络捕获几何结构的一个非限制性示例，该具有内部流路，该内部流路在背面不具有玻璃料。

图14提供了人工神经网络的示意图。

图15提供了人工神经网络的层内节点功能的示意图。

图16A-图16D示出了四个不同的微流控装置的捕获百分比对行数的曲线图，该四个不同的微流控装置包括通过捕获部件和蛇形旁路流体通道的通过内部流路的流动阻力的不同比率。图16A：微流控装置的曲线图，其中通过蛇形旁路通道的流体动力流阻与通过捕获部件的流路的流体动力流阻之比(RA/RT)＝0.25。图16B：对于RA/RT＝0.42的微流控装置的曲线图。图16C：对于RA/RT＝1.20的微流控装置的曲线图。图16D：对于RA/RT＝1.45的微流控装置的曲线图。

图17A至图17D示出了四个微流控装置的占据的阱的分布热图，其示出了图16A至图16D所示的捕获百分比曲线。图17A：RA/RT＝0.25时的微流控装置的热图。图17B：RA/RT＝0.42时的微流控装置的热图。图17C：RA/RT＝1.20时的微流控装置的热图。图17D：RA/RT＝1.45时的微流控装置的热图。

图18示出了在微流控腔室内生长的单细胞菌落的一系列时间推移图像。使用基于机器学习的图像处理算法识别细胞的中心，并将其描绘为小点。

图19提供了生长曲线的非限制性实例，生长曲线使用本公开的微流控装置内生长的细胞图像的基于机器学习的分析获得的。

图20示出了在本公开的微流控装置中生长的K562细胞的生长速率数据的图，包括对照的数据以及在0.1uM，0.3uM和0.5uM伊马替尼(Imatinib)存在下生长的细胞数据。

图21示出了在相邻微流控腔室内部生长的四个细胞菌落的一系列时间流逝图像。

图22A和图22B显示了在奎扎替尼(Quizartinib)(图22A)或对照培养基(图22B)存在下生长的MOLM 13细胞图像。观察到单个克隆在药物存在下生长。

图23A和图23B示出了基于图像分割的机器学习算法的使用，以识别单细胞以及微流控芯片上的标识符和标记。图23A：明场成像。图23B：将计算机生成的彩色图像叠加在明场成像上，并显示芯片上标记的标识，使用基于机器学习的分析方法对细胞进行分类的不同实例，各个细胞的边界，预测检测到的物体是否为细胞的置信度的质量得分。

图24示出了在微流控腔室内捕获的单细胞的阵列图像，然后将空气吹过流体通道以密封腔室。

图25示出了荧光和明场成像的叠加，其示出了荧光标记的靶探针与在微流控芯片内构图的寡核苷酸捕获探针的杂交。

图26A至图26C示出了用于形成单细胞阵列的过程。通过将细胞与可固化的水凝胶一起流入阵列中来形成单细胞阵列(图26A)，此后可以将盖子剥离(图26B)以提供进入样品的途径(图26C)。

图27A和图27B提供了包括多个捕获部件的微流控装置的非限制性示例，该捕获部件用于捕获悬浮在流体中的单细胞或其他物体。图27A：微流控装置的照片，其包括100×100的捕获部件和微流控腔室的阵列。图27B：本公开的微流控装置内的捕获部件和流体腔室的显微照片。

图28A-图28D提供了用于低效率捕获装置的通过阱的流动曲线的实例，低效率捕获装置用于原理验证工作，以及单细胞捕获效率的数据。图28A：通过装置的单个阱的计算流体流率。图28B：显示该装置的单个阱的显微照片。图28C：示出装置内10000个隔室的单细胞捕获效率的热图。图28D：显示其中捕获了0、1、2或3个或更多个细胞的微流控腔室的分布饼图。

图29示出了细胞阵列的缝合荧光图像(细胞用FITC细胞追踪染料标记)。插图：荧光和明场成像的放大叠加图，其显示在装置中捕获的单细胞。

图30A至图30C示出了图像的非限制性示例，该图像示出了将化学物质印制至阵列中的特定细胞的能力，这是通过微流控装置的开放式结构实现的。图30A：使用荧光标记在单细胞阵列中印制的两个并排图案。图30B：使用荧光标记印到细胞阵列内特定细胞的图案。图30C：使用荧光标记印到细胞阵列内特定细胞的图案。

具体实施方式

本公开基于细胞捕获部件和互连流体通道的网状网络，提供了新颖的微流控装置设计，其能够高效捕获悬浮在流体中的单细胞或其他物体，并且与芯片上细胞分区及培养技术、高通量显微镜及自动图像处理技术以及生化检验或基因组分析技术兼容。

一方面，所公开的微流控装置通过采用利用梯形和网状流体网络的先前无法识别的特征的设计，使得能够高效捕获单细胞或其他物体。通过调节流体力学流体回路中流路的相对流体阻力，该流体力学流体回路包括多个捕获部件和至少两种不同类型的互连旁路通道，最近的旁路通道内的流体流动方向朝向(而不是远离)细胞捕获阱，这样每个细胞或物体都会被迫进入它遇到的第一个捕获阱。

另一方面，所公开的微流控装置通过采用包括入口区域，可选的内部区域和出口区域的堰阱设计，这些区域共同构成通过堰阱的内部流体流路，使单细胞的隔室化以及短期或长期的芯片上细胞培养成为可能。在一些方面，内部区域的尺寸和/或体积大于要捕获的细胞或物体，因此可以用于单细胞的隔室化和/或培养。还描述了用于在多个捕获阱的入口区域内捕获细胞或物体的方法(例如，使用跨装置的相对较低的流体动力学压降来驱动流体流动)，然后将捕获的细胞或物体强制进入多个捕获阱的内部区域(例如，使用相对较高的流体动力压力的脉冲)。

在本公开的一些方面，通过使不混溶的流体(例如，油或空气)流过，可以通过捕获步骤之后的装置，将被困在堰阱的入口区域或内部区域内的单细胞或物体进一步隔离或分隔。在一些方面，这样的隔离步骤可以用于进一步促进所捕获细胞的后续生化、生理、遗传、基因组和/或蛋白质组学的分析。

在本公开的一些方面，所公开的微流控单细胞捕获装置可包括可移动的盖子，并且通过使形成半孔水凝胶所需的可溶性组分流入该装置中，然后触发聚合步骤，已经被捕获在堰阱的入口区域或内部区域内的单细胞或物体可被进一步隔离或分离。然后，移除盖子可以直接获得捕获阱阵列内的单细胞(或其他物体)，以利于后续的生化、生理、遗传、基因组和/或蛋白质组学的分析。在一些方面，移除盖子以使得能够直接获得捕获阱阵列内的单细胞(或其他物体)可以用于促进从阵列中移除所选择的细胞(或其他物体)。

在本公开的一些方面，基于机器学习的图像分析可以用于识别和分类基于表型性状的已被捕获在堰阱阵列内的单细胞。

在本公开的一些方面，微流控单细胞捕获装置中的堰阱的内部区域可以包括一组预先选择的捕获或检测试剂(例如，针对特定细胞表面抗原的抗体)或已在堰阱内拴系、固定、合成或印制的条形码试剂(例如，寡核苷酸条形码)。例如，在某些方面，所公开的微流控装置可以通过在每个细胞旁边印制DNA条形码来实现大规模并行条形码编码，以对单细胞进行基因组分析，这将在下面更详细地讨论。

因此，本文提供的微流控装置以及相关的方法和系统允许在每个步骤进行平行单细胞分析，包括但不限于：(1)高密度地组织细胞阵列(和/或其他物体)，并捕获转移到装置中的大多数细胞的方法；(2)将单细胞分隔在不透性或半透性容器中或将其捕获在半孔水凝胶中的方法；(3)通过基于高分辨率图像的分析在短期或长期内对细胞进行表型分析的方法；以及(4)进行后续生化、生理、遗传、基因组和/或蛋白质组学分析的方法。所公开的方法、装置和系统使得能够进行各种基础研究和临床应用。例如，它们可能潜在地用于实施验证药物安全性和功效的新方法，或用于选择更好的专利疗法的新方法。所公开的方法、装置和系统可用于进行高度平行的实验，这对于鉴定和分析细胞行为的异质性是必要的，特别是鉴定具有临床相关性的罕见的异常值。例如，对一种药物具有抗性的细胞的罕见部分是该药物治疗趋势的有力指标，其使抗药性克隆的生长能够导致肿瘤复发。同样，所公开的方法、装置和系统可用于研究在暴露于不同生化信号分子和其他化学试剂期间干细胞分化的异质性。所公开的方法、装置和系统还可以用于研究不同类型的细胞之间的相互作用，例如在检查点抑制剂存在下与癌细胞相互作用的免疫细胞以及其他抗体疗法。所公开的方法、装置和系统还可以用于快速鉴定特别擅长于产生所需蛋白质、酶或其他生物产物的细胞。所公开的方法、装置和系统还可以用于建立多参数数据集，其包括上述功能测量结果，并与来自那些相同细胞或单细胞衍生菌落的基因组测量结果链接。可以在这些细胞上进行的基因组测量类型包括mRNA表达分析、抗体受体分析、DNA突变分析、剪接变体分析、基于染色质限制的表观遗传学检测、甲基化状态以及更高阶的染色体排列。

本文描述的方法、装置和系统的各个方面可以应用于以下阐述的任何特定应用，或用于任何其他类型的单细胞分析应用。应当理解，可以单独地，共同地或彼此结合地理解本公开的不同方面。

定义：除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语具有与本公开所属领域的本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。

在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用，除非上下文另外明确说明。除非另有说明，否则本文中对“或”的任何引用旨在涵盖“和/或”。

如本文所用，术语数字的“约”是指该数字加上或减去该数字的10％。当在上下文中使用范围时，术语“约”是指该范围减去其最低值的10％，以及加上其最大值的10％。

如本文所用，术语“捕获阱”、“捕获部件”、“细胞捕获阱”和“堰阱”可互换使用，并且可指代包括流体通道中一维或二维收缩的部件，该流体通道用于保留或捕获悬浮在流体中的细胞或其他物体。在一些情况下，捕获阱可包括入口区域，可选地，内部区域和出口区域，其中至少一个包括收缩区。在一些情况下，捕获阱的内部区域在至少一维或二维上可以比入口区域和/或出口区域大得多，并且可以被配置为分隔已被捕获的单细胞。

如本文所用，术语“物体”通常是指细胞或其片段(例如，细胞器，例如细胞核、线粒体或外来体)、生物(例如，细菌)、小球、颗粒，液滴(例如水滴)或多种形式，可以指其任何组合。

如本文所用，术语“细胞”通常是指本领域技术人员已知的多种细胞中的任何一种。在一些方面，术语“细胞”可以指任何粘附的和非粘附的真核细胞、哺乳动物细胞、原代或永生化的人细胞或细胞系、原代或永生化的啮齿动物细胞或细胞系、癌细胞、来自各种不同器官或组织类型(例如白细胞、红细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、肌肉细胞、配子或心脏、肺、脑、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、胸腺、膀胱、胃、结肠、小肠)的正常或患病人类细胞、不同的细胞亚群，例如免疫细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞，CD44high/CD24low癌症干细胞、Lgr5/6+干细胞，未分化的人类干细胞、已被诱导分化的人类干细胞、罕见细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC)、循环上皮细胞、循环内皮细胞、循环子宫内膜细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞或滋养细胞)、动物细胞(例如小鼠、大鼠、猪、狗、牛或马)、植物细胞、酵母细胞、真菌细胞、细菌细胞、藻类细胞、贴壁或非贴壁原核细胞或其复数形式的任何它们的组合。在一些方面、术语“细胞”可以指免疫细胞，例如T细胞、细胞毒性(杀伤性)T细胞、辅助性T细胞、αβT细胞、γδT细胞、T细胞祖细胞、B细胞、B细胞祖细胞、淋巴干细胞、骨髓祖细胞、淋巴细胞、粒细胞、天然杀伤细胞、浆细胞、记忆细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞和/或巨噬细胞，或其复数形式，或其任何组合。

如本文所用，术语“小球”通常是指由玻璃、塑料、陶瓷、金属、聚合材料或它们的任何组合制成的任何类型的固体、多孔或中空球形、非球形或不规则形状的物体。在一些方面，术语“小球”可以指二氧化硅小球、硅胶小球、可控孔玻璃小球、磁性小球(例如Dynabead)、Wang树脂小球、Merrifield树脂小球、琼脂聚糖小球、琼脂糖小球、纤维素小球、聚苯乙烯小球等，或其复数形式可以指其任何组合。在一些方面，小球可以包含拴系或固定的捕获、检测或条形码试剂，例如，抗体、细胞因子特异性抗体、趋化因子特异性抗体、生长因子特异性抗体、酶、酶底物、抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、蛋白A、蛋白G、其他蛋白、小分子、糖蛋白、药物分子、多糖、荧光团、寡核苷酸、寡核苷酸适体、寡核苷酸条形码或其任何组合。在一些情况下，小球可以是细胞因子感应小球，例如Thermo Fischer(Waltham，马塞诸塞州MA)出售的多重Luminex

免疫测定小球，可用于检测3至30种不同的细胞因子和生长因子。在一些方面，小球的直径或平均直径可以至少为0.5μm，至少1μm，至少5μm，至少100μm，至少15μm，至少20μm，至少25μm，至少30μm，至少35μm，至少40μm，至少45μm或至少50μm。

用于有效捕获单细胞的微流控装置设计：如上所述，在一个方面，本发明提供了微流控装置，其通过采用利用网状流体网络先前无法识别的特征的设计，而能够高效捕获单细胞或其他物体。调整流体力学流体回路中流体路径的相对流体阻力，流体力学流体回路包括多个捕获部件和至少两种不同类型的互连旁路通道，可确保所有流体流线都通过捕获阱，从而确保每个细胞都被迫进入第一个遇到的捕获阱。这种现象是通过调节通过捕获阱的流体动力阻力RT(即整个捕获阱几何结构的流体阻力，整个捕获阱几何结构横跨单个捕获阱的入口点到出口点的距离)，相对于通过一个或多个短旁路通道部分的流体阻力RB，公用长旁路通道部分RA，要求RT<RA而实现的。捕获细胞后，流体阻力的局部比率会以某种方式发生变化，以使相邻旁路通道中的流体流动方向与细胞捕获阱相反，并从细胞捕获阱流出，从而导致下一个接近的细胞向下一个可用细胞移动捕获阱。以这种方式，以引入细胞的顺序顺序地填充阵列内的捕获阱，这原则上允许所公开的装置在捕获单细胞方面实现接近完美的效率。因此，所公开的装置理想地适合于处理其中高捕获效率至关重要的小细胞样品。

所公开的装置设计基于流体通道的网状网络。在一些方面，该装置包括：a)具有至少一个入口和至少一个出口的微流控网络；b)多个微流控收缩区(或“捕获阱”)，其中收缩区的尺寸小于流体中所含悬浮物的尺寸，并被布置以捕获流入收缩区中的悬浮物；c)每个包括入口点或区域和出口点或区域以及可选地内部区域的微流控收缩区，d)所述微流控收缩区的出口点与至少两个另外的微流控收缩区直接流体连接；e)当所述微流控收缩区尚未捕获到悬浮物时，所述微流控收缩区的出口点的压力高于任一下游微流控收缩区入口点的压力；以及f)当所述微流控收缩区已经捕获到悬浮物时，所述微流控收缩区的出口点的压力低于至少一个下游微流控收缩区中的入口点的压力。在一些方面，收缩区或捕获阱的出口区域可以包括玻璃料，例如一系列柱状部件，其间隔足够小以防止细胞或其他物体离开收缩区或捕获阱的内部区域。

图1示出了一种微流控装置，该微流控装置包括捕获部件的“无限”梯状网络(每个都包括狭窄的入口点(或入口区域)，内部区域和出口点)和一组互连旁路流体通道。图2A和图2B示出了类似的梯状流体网络，其中每个捕获部件都在出口点(或出口区域)内包括玻璃料。穿过捕获阱的流路RT的流体阻力包括整个捕获阱几何结构的流体阻力，该捕获阱几何结构跨越从入口点到通过捕获阱内部区域到捕获阱出口点的距离。图1和图2A-图2B中示出了两种类型的旁路流体通道，包括流体阻力RA的长公共旁路通道(其中，可选地，旁路通道具有蛇形布局)和包括流体阻力RB的短互连旁路通道。包括流体阻力RA的长旁路通道通常与通过装置的净流方向对齐，而包括流体阻力RB的短旁路通道通常垂直于通过装置的净流方向。在一些情况下，可能存在不止一种类型的短旁路通道，其包括流体阻力RB1，RB2……，其中RB1，RB2…可以彼此不同，但是每个都小于RA。图3示出了与图1、图2A-图2B所示的流体装置的等效阻力回路，其包括由流体阻力RT，RA和RB链接的一系列压力节点Pi，j。

对于图3中描绘的无限梯形流体阻力网络，其流路连续性的方程为：

其中，ΔP是跨阶梯的一个周期的压力降(从Pi-1，1到Pi+1，1或从Pi-1，0到Pi+1，0)。

该方程的解以点Pi-1，0处的压力给出：

该方程组具有两种流体流动状态。有一种状态，其中所有流线都通过长通道部分(包含流体阻力RA)，一部分流线通过微流控收缩区(包含流体阻力RT)，其余流过短通道部分(包含流体阻力RB)，其流向远离微流控收缩区的方向(图2A)。当RA<RT时出现时，微流控收缩区入口点(Pi，0)的压力高于Pi，i的压力就发生，便达到了此条件。

在RA>RT的另一种状态下，情况发生了逆转，所有流线都通过了微流控收缩区(RT)，流经短通道部分(RB)的流体流向了微流控收缩区(图2B)。因此，通过调节捕获阱和旁路通道的相对阻力，可以确保细胞将被移入收缩区并被捕获，而不会像通常是现有方法所得到的部分或细胞沿旁路流失。

对二维网状网络设计的分析(例如，如图4A-图4B所示，其可以由图5所示的等效阻力回路表示)类似于此处所讨论的无限梯状网络，将在下面的示例1中进行详细说明。相同的条件，RA>RT，可确保所有流线均通过微流控收缩区。这种见解表明，流经阵列的第一个细胞将被第一个可用捕获阱捕获，而下一个细胞将填充下一个可用捕获阱，依此类推。细胞永远不会错过空置的捕获阱，所有捕获阱将按顺序填充。

为了确保每个捕获阱仅捕获单细胞，了解捕获阱一旦被一个细胞占据就会如何改变其阻力，以及下一个接近的细胞将经历哪种类型的流体平衡也很重要。理想情况下，被占用的捕获阱将提供一种流体曲线，其中通过短旁路(RB)的流体现在大于通过捕获阱的流体。

流体比产生一个条件：

RT≥2RA+2RB

如果短通道部分的阻力很小，则很容易实现，而被捕获的悬浮物的存在会使捕获阻力(RT)增大一倍以上。该见解暗示通道的深度不应显着大于细胞直径，以使被捕获的细胞阻塞微流控收缩区显着的横截面积百分比，并导致捕获阻力的最大变化。

所公开的梯状和网状流体网络设计构成了对现有的基于微流控的细胞捕获装置的新颖且非显而易见的改进。公认的是，良好的细胞捕获装置将具有通过捕获阱的高体积流体，以及围绕捕获阱的低体积流体，但是，与先前发布的设计相比，我们已经认识到，重要的设计考虑因素不是跨捕获阱的总压降，而是调整相对流体阻力，以通过公共旁路通道和流过捕获阱，以维持条件RA>RT。

图2A、图2B、图4A、图4B和图6-图13提供了本公开的梯状和网状流体网络设计的几个不同的非限制性示例。如上所述，图2A和图2B示出了堰阱以及互连旁路流体通道的梯状网络(在出口区域中包括玻璃料)。当通过堰阱的内部流路的阻力高于旁路通道的阻力(RT>RA；流动状态1)时，流量在堰阱的入口处分流(图2A)。这种几何结构的捕获效率低于流动状态2的捕获效率，在这种情况下，通过堰阱内部流路的阻力小于通过旁路通道的流路(RA>RT)，其中，所有流体都流过堰阱(图2B)。

图4A和图4B示出了堰阱和互连旁路流体通道的网状网络。同样，当通过堰阱内部流路的阻力高于旁路通道的阻力(RT>RA，流动状态1)时，流体在堰阱的入口处分流(图4A)。当穿过堰阱内部流路的阻力小于穿过旁路通道的流路(RA>RT；流动状态2)时，所有流体都流过堰阱(图4B)。

图6示出了网状网络捕获几何结构，其捕获率近似计算为：RA/RT＝0.42。在该示例中，每个堰阱的出口区域包括形成内部区域边界的玻璃料，并且与入口区域相比，堰阱的内部区域非常大，入口区域包括用于捕获悬浮在流体中的细胞或物体的收缩区。

图7示出了网状网络捕获几何结构，其捕获率近似计算为：RA/RT＝1.2。在该示例中，堰阱再次在捕获阱的出口区域内包括玻璃料。

图8示出了梯形网络捕获几何结构，其捕获率近似计算为：RA/RT＝1.2。在该示例中，堰阱再次在捕获阱的出口区域内包括玻璃料。

图9示出了网状网络捕获几何结构，其捕获率近似计算为：RA/RT＝1.45。在该示例中，堰阱再次在捕获阱的出口区域内包括玻璃料。

图10示出了梯形网络捕获几何结构，其捕获率近似计算为：RA/RT＝1.45。在此示例中，堰阱再次在捕获阱的出口区域内包括玻璃料。

图11示出了网状网络捕获几何结构，其中堰阱包括具有小体积的内部流路(即，捕获阱没有明显的“内部区域”)，并且堰阱在捕获阱的出口区域中没有玻璃料。

图12示出了梯形网络捕获几何结构的一个非限制性示例，其具有内部流路，该内部流路在出口或出口区域处没有玻璃料。

图13示出了网状网络捕获几何结构的一个非限制性示例，该网状网络捕获几何结构的内部流路在出口或出口区域不具有玻璃料。

在一些情况下，所公开的微流控装置可以包括：a)布置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与之流体连通的多个堰阱，其中每个堰阱被配置为用以保持悬浮在通过微流控装置的流体中的物体，其中：i)每个堰阱包括共同构成通过堰阱内部流体流路的入口区域，可选的内部区域和出口区域；ii)大部分堰阱中的每个堰阱(即除最接近至少一个流体入口或至少一个流体出口的那些之外的所有堰阱)与两个或三个外部流体流路(旁路流体通道)流体连通，该外部流体流路(旁路流体通道)将堰阱的出口区域连接到另一个堰阱的入口区域的流体；以及iii)一个外部流体流路(例如，更长的公共流体旁路通道)与通过该捕获阱的内部流体流路(即，RA/RT)的流体阻力之比至少为0.4。在一些实施例中，所有或一部分堰阱的出口区域可以包括玻璃料，以防止细胞或其他物体从捕获阱的内部区域(或腔室)流出。在一些实施例中，两个或三个外部流体流路(旁路流体通道)可包括一个或两个较短流体旁路通道，该较短流体旁路通道的流体阻力RB小于RA。在存在两个较短流体旁路通道的情况下，它们的流体阻力可以彼此相同或彼此不同，但在任一种情况下均小于RA。

在一些实施例中，RA/RT之比可以在约0.2至约2.0的范围内。在一些实施例中，RA/RT之比可以是至少0.2，至少0.3，至少0.4，至少0.5，至少0.6，至少0.7，至少0.8，至少0.9，至少1.0，至少1.1，至少1.2，至少1.3，至少1.4，至少1.5，至少1.6，至少1.7，至少1.8，至少1.9或至少2.0。在一些实施例中，RA/RT之比可以为至多2.0，至多1.9，至多1.8，至多1.7，至多1.6，至多1.5，至多1.4，至多1.3，至多1.2，至多1.1，至多1.0，至多0.9，至多0.8，至多0.7，至多0.6，至多0.5，至多0.4，至多0.3或至多0.2。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，RA/RT之比可以在约0.4至约1.6的范围内。本领域技术人员将认识到，RA/RT之比可以具有在该范围内的任何值，例如约为1.25。

所公开的微流控装置的堰阱通常将包括至少一个尺寸的收缩区，例如，一个入口点或入口区域包括收缩区，其小于要捕获的细胞或物体的最小尺寸。在一些实施例中，在至少一个维度上的收缩区的尺寸范围可以是被捕获的细胞或物体的最小尺寸的约10％至约90％。在一些实施例中，收缩区可为要捕获的细胞或物体最小尺寸的至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。在一些实施例中，收缩区可为捕获的细胞或物体最小尺寸的至多90％，至多80％，至多70％，至多60％，至多50％，至多40％，至多30％，至多20％或至多10％。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，收缩区的尺寸范围可以是要捕获的细胞或物体最小尺寸的约20％至约70％。本领域技术人员将认识到，该收缩区可以具有该范围内的任何值，例如大约是要捕获的细胞或物体最小尺寸的33％。

所公开微流控装置的堰阱通常将包括至少一个尺寸的收缩区，例如，一个入口点或入口区域包括收缩区，其小于要捕获的细胞或物体的最小尺寸。在一些实施例中，至少一个尺寸中的收缩区的尺寸范围可以从约1μm至约100μm。例如，在一些实施例中，在至少一个维度上的收缩区的尺寸可以至少为1μm，至少2μm，至少3μm，至少4μm，至少5μm，至少6μm。至少7μm，至少8μm，至少9μm，至少10μm，至少20μm，至少30μm，至少40μm，至少50μm，至少60μm，至少70μm至少80μm，至少90μm或至少100μm。在一些实施例中，收缩区的至少一维的尺寸可以为至多100μm，至多90μm，至多80μm，至多70μm，至多60μm，至多50μm，至多40μm。至多30μm，至多20μm，至多10μm，至多9μm，至多8μm，至多7μm，至多6μm，至多5μm，至多4μm，至多3μm，至多2μm，至多1μm。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，至少一维的收缩区尺寸范围可以从约3μm至约6μm。本领域技术人员将认识到，收缩区可以具有在该范围内的任何尺寸，例如约4.5μm。

在一些情况下，所公开的微流控装置可以包括：a)布置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与之流体连通的多个堰阱，其中，每个堰阱被构造成保持悬浮在通过微流控装置的流体中的物体，其中：i)每个堰阱包括入口区域，内部区域和出口区域，它们共同构成穿过堰阱的内部流体流路；以及ii)堰阱内部区域的体积大于入口区域或出口区域的体积。

在一些情况下，所公开的微流控装置可以包括：a)布置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与之流体连通的多个堰阱，其中每个堰阱被配置为保持悬浮在通过微流控装置的流体中的物体，其中：i)每个堰阱包括入口区域，内部区域和出口区域，它们共同构成穿过堰阱的内部流体流路；ii)内部区域具有至少两个大于物体最大尺寸的尺寸。

所公开的微流控装置的堰阱设计可以包括入口区域(或入口点)，可选的内部区域(或腔室)和出口区域(或出口点)。内部区域(或腔室)，如果存在的话，可以在微流控装置的平面内具有各种横截面形状中的任何一种。例如，内部区域可以具有大体上圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、六边形、不规则形状或其任意组合。在一些情况下，所有或一部分堰阱的出口区域可以包括玻璃料。

在一些情况下，内部区域相对于捕获阱的入口和/或出口区域的尺寸或体积可以忽略不计。在一些实施例中，内部区域(或腔室)可包括为入口区域，出口区域或将被捕获的细胞或物体的体积的1倍至约1000倍的体积。例如，在一些实施例中，内部区域可包括的体积为入口区域，出口区域或要捕获的细胞或物体的至少为1倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少60倍，至少70倍，至少80倍，至少90倍，至少100倍，至少200倍，至少300倍，至少400倍，至少500倍，至少600倍，至少700倍，至少800倍，至少900倍或至少1000倍。在一些实施例中，内部区域可以包括的体积为入口区域、出口区域或要捕获的细胞或物体的至多1000倍，至多900倍，至多800倍，至多700倍，至多600倍，至多500倍，至多400倍，至多300倍，至多200倍，至多100倍，至多90倍，至多80倍，至多70倍，至多60倍，至多50倍，至多40倍，至多30倍，至多20倍，至多10倍或至多1倍。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如内部区域可以包括体积，该体积的大小范围是入口区域，出口区域或要捕获的细胞或物体的大约50倍至大约200倍。本领域的技术人员将认识到，内部区域可以包括具有在该范围内的任何值的体积，例如，约为入口区域，出口区域或要捕获的细胞或物体的250倍。

在一些实施例中，内部区域(或腔室)可包括至少一个或至少两个尺寸，该尺寸的范围是要捕获的细胞或物体最大尺寸的约1倍至约1000倍。例如，在一些实施例中，内部区域可以包括至少一个或至少两个尺寸，该至少一个或至少两个维度是被捕获的细胞或物体最大尺寸的至少1倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少60倍，至少70倍，至少80倍，至少90倍，至少100倍，至少200倍，至少300倍，至少400倍，至少500倍，至少600倍，至少700倍，至少800倍，至少900倍或至少1000倍。在一些实施例中，内部区域可以包括至少一个或至少两个尺寸，该尺寸为要捕获的细胞或物体最大尺寸的至多1000倍，至多900倍，至多800倍，至多700倍，至多600倍，至多500倍，至多400倍，至多300倍，至多200倍，至多100倍，至多90倍，至多80倍，至多70倍，至多60倍，至多50倍，至多40倍，至多30倍，至多20倍，至多10倍或至多1倍。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如内部区域可以包括至少一个或至少两个尺寸，在被捕获的细胞或物体的最大尺寸的大约50倍至大约200倍的范围内。本领域技术人员将认识到，内部区域可包括具有该范围内的任何值的至少一个或至少两个尺寸，例如，大约是要捕获的细胞或物体最大尺寸的125倍。

所公开的装置的单个堰阱在第一次接触时保持悬浮的细胞或物体的捕获概率(即，细胞或物体第一次在装置内遇到堰阱)的范围为约0.05至约0.99。例如，在一些实施例中，捕获概率可以是至少0.05，至少0.1，至少0.2，至少0.3，至少0.4，至少0.5，至少0.6，至少0.7，至少0.8，至少0.9，至少0.95或至少0.99。在一些实施例中，捕获概率可以是至多0.99，至多0.95，至多0.9，至多0.8，至多0.7，至多0.6，至多0.5，至多0.4，至多0.3，至多0.2，至多0.1或至多0.05。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中包括的范围，例如捕获概率可以在约0.2至约0.8的范围内。本领域技术人员将认识到，捕获概率可以具有在该范围内的任何值，例如，约为0.66。

用于捕获悬浮在通过所公开的堰阱阵列装置的流体中的细胞或其他物体的预饱和捕获效率可以在大约10％至大约100％的范围内。例如，在一些实施例中，所公开装置的预饱和捕获效率可以为至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％。在一些实施例中，预饱和捕获效率可以是至多99％，至多98％，至多95％，至多90％，至多80％，至多70％，至多60％，至多50％，至多40％，至多30％，至多20％或至多10％。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，预饱和捕获效率可以在约40％至约99％的范围内。本领域技术人员将认识到，预饱和捕获效率可以具有在该范围内的任何值，例如，约97％。

在一些情况下，所公开的微流控装置可以包括：a)布置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与之流体连通的多个堰阱，其中每个堰阱被构造成保持悬浮在通过微流控装置的流体中的物体，其中：i)每个堰阱在至少一个维度上具有收缩区，该收缩区小于物体的最小尺寸；ii)通过堰阱的流体流路的流体阻力与穿过堰阱的流体流路的流体阻力之比至少为0.4。在一些情况下，如上所述，在至少一个维度上的收缩区的尺寸范围可以是被捕获的细胞或物体的最小尺寸的约10％至约90％。对于其中至少一个维度上的收缩区域大小介于要捕获的细胞或物体的最小维度的大约10％至大约90％的任何情况，通过堰阱的流体流路的阻力对有通过堰阱(RA/RT)的流体流路的范围可以从约0.4到约2.0。包括在本公开中的收缩区尺寸(以被捕获的细胞或物体的最小尺寸百分比来指定)和阻力比(RA/RT)的非限制性示例为(10％，0.5)，(10％，0.6)，(10％，0.7)，(10％，0.8)，(10％，0.9)，(10％，1.0)，(10％，1.1)，(10％，1.2)，(10％，1.3)，(10％，1.4)，(10％，1.5)，(10％，1.6)，(10％，1.7)，(10％，1.8)，(10％，1.9)，(10％，2.0)，(20％，0.5)，(20％，0.6)，(20％，0.7)，(20％，0.8)，(20％，0.9)，(20％1.0)，(20％，1.1)，(20％，1.2)，(20％，1.3)，(20％，1.4)，(20％，1.5)，(20％，1.6)，(20％，1.7)，(20％，1.8)(20％，1.9)，(20％，2.0)，(30％，0.5)，(30％，0.6)，(30％，0.7)，(30％，0.8)，(30％，0.9)，(30％，1.0)，(30％1.1)，(30％，1.2)，(30％，1.3)，(30％，1.4)，(30％，1.5)，(30％，1.6)，(30％，1.7)，(30％，1.8)，(30％，1.9)(30％，2.0)，(40％，0.5)，(40％，0.6)，(40％，0.7)，(40％，0.8)，(40％，0.9)，(40％，1.0)，(40％，1.1)，(40％1.2)，(40％，1.3)，(40％，1.4)，(40％，1.5)，(40％，1.6)，(40％，1.7)，(40％，1.8)，(40％，1.9)，(40％，2.0)(50％，0.5)，(50％，0.6)，(50％，0.7)，(50％，0.8)，(50％，0.9)，(50％，1.0)，(50％，1.1)，(50％，1.2)，(50％1.3)，(50％，1.4)，(50％，1.5)，(50％，1.6)，(50％，1.7)，(50％，1.8)，(50％，1.9)，(50％，2.0)，(60％，0.5)(60％，0.6)，(60％，0.7)，(60％，0.8)，(60％，0.9)，(60％，1.0)，(60％，1.1)，(60％，1.2)，(60％，1.3)，(60％1.4)，(60％，1.5)，(60％，1.6)，(60％，1.7)，(60％，1.8)，(60％，1.9)，(60％，2.0)，(70％，0.5)，(70％，0.6)(70％，0.7)，(70％，0.8)，(70％，0.9)，(70％，1.0)，(70％，1.1)，(70％，1.2)，(70％，1.3)，(70％，1.4)，(70％1.5)，(70％，1.6)，(70％，1.7)，(70％，1.8)，(70％，1.9)，(70％，2.0)，(80％，0.5)，(80％，0.6)，(80％，0.7)(80％，0.8)，(80％，0.9)，(80％，1.0)，(80％，1.1)，(80％，1.2)，(80％，1.3)，(80％，1.4)，(80％，1.5)，(80％1.6)，(80％，1.7)，(80％，1.8)，(80％，1.9)，(80％，2.0)，(90％，0.5)，(90％，0.6)，(90％，0.7)，(90％，0.8)(90％，0.9)，(90％，1.0)，(90％，1.1)，(90％，1.2)，(90％，1.3)，(90％，1.4)，(90％，1.5)，(90％，1.6)，(90％1.7)，(90％，1.8)，(90％，1.9)，以及(90％，2.0)。

在一些情况下，所公开的微流控装置可以包括：a)布置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与之流体连通的多个堰阱，其中每个堰阱被配置为保留悬浮在通过微流控装置的液体中的物体，其中：i)单个堰阱在第一次接触时保持悬浮细胞或物体的捕获概率至少为0.05；ii)绕过堰阱的流体流路的流体阻力与通过堰阱的流体流路的流体阻力之比至少为0.4。在一些情况下，如上所述，捕获概率可以在约0.05至约0.99的范围内。对于捕获概率在大约0.05到大约0.99之间的一些情况，通过堰阱的流体流路的阻力与穿过堰阱的流体流路的阻力(RA/RT)可以在约0.4至约2.0。通常，由于捕获概率是阻力比率的函数，因此捕获概率和阻力比率的某些组合可能无法实现。包括在本公开的捕获概率及阻力比率(RA/RT)的非限制性示例为：(0.05，0.4)，(0.05，0.5)，(0.05，0.6)，(0.05，0.7)，(0.05，0.8)，(0.05，0.9)，(0.05，1.0)，(0.05，1.1)，(0.05，1.2)，(0.05，1.3)，(0.05，1.4)，(0.05，1.5)，(0.05，1.6)，(0.05，1.7)，(0.05，1.8)，(0.05，1.9)，(0.05，2.0)，(0.1，0.4)，(0.1，0.5)，(0.1，0.6)，(0.1，0.7)，(0.1，0.8)，(0.1，0.9)，(0.1，1.0)，(0.1，1.1)，(0.1，1.2)，(0.1，1.3)，(0.1，1.4)，(0.1，1.5)，(0.1，1.6)，(0.1，1.7)，(0.1，1.8)，(0.1，1.9)，(0.1，2.0)，(0.2，0.4)，(0.2，0.5)，(0.2，0.6)，(0.2，0.7)，(0.2，0.8)，(0.2，0.9)，(0.2，1.0)，(0.2，1.1)，(0.2，1.2)，(0.2，1.3)，(0.2，1.4)，(0.2，1.5)，(0.2，1.6)，(0.2，1.7)，(0.2，1.8)，(0.2，1.9)，(0.2，2.0)，(0.3，0.4)，(0.3，0.5)，(0.3，0.6)，(0.3，0.7)，(0.3，0.8)，(0.3，0.9)，(0.3，1.0)，(0.3，1.1)，(0.3，1.2)，(0.3，1.3)，(0.3，1.4)，(0.3，1.5)，(0.3，1.6)，(0.3，1.7)，(0.3，1.8)，(0.3，1.9)，(0.3，2.0)，(0.4，0.4)，(0.4，0.5)，(0.4，0.6)，(0.4，0.7)，(0.4，0.8)，(0.4，0.9)，(0.4，1.0)，(0.4，1.1)，(0.4，1.2)，(0.4，1.3)，(0.4，1.4)，(0.4，1.5)，(0.4，1.6)，(0.4，1.7)，(0.4，1.8)，(0.4，1.9)，(0.4，2.0)，(0.5，0.4)，(0.5，0.5)，(0.5，0.6)，(0.5，0.7)，(0.5，0.8)，(0.5，0.9)，(0.5，1.0)，(0.5，1.1)，(0.5，1.2)，(0.5，1.3)，(0.5，1.4)，(0.5，1.5)，(0.5，1.6)，(0.5，1.7)，(0.5，1.8)，(0.5，1.9)，(0.5，2.0)，(0.6，0.4)，(0.6，0.5)，(0.6，0.6)，(0.6，0.7)，(0.6，0.8)，(0.6，0.9)，(0.6，1.0)，(0.6，1.1)，(0.6，1.2)，(0.6，1.3)，(0.6，1.4)，(0.6，1.5)，(0.6，1.6)，(0.6，1.7)，(0.6，1.8)，(0.6，1.9)，(0.6，2.0)，(0.7，0.4)，(0.7，0.5)，(0.7，0.6)，(0.7，0.7)，(0.7，0.8)，(0.7，0.9)，(0.7，1.0)，(0.7，1.1)，(0.7，1.2)，(0.7，1.3)，(0.7，1.4)，(0.7，1.5)，(0.7，1.6)，(0.7，1.7)，(0.7，1.8)，(0.7，1.9)，(0.7，2.0)，(0.8，0.4)，(0.8，0.5)，(0.8，0.6)，(0.8，0.7)，(0.8，0.8)，(0.8，0.9)，(0.8，1.0)，(0.8，1.1)，(0.8，1.2)，(0.8，1.3)，(0.8，1.4)，(0.8，1.5)，(0.8，1.6)，(0.8，1.7)，(0.8，1.8)，(0.8，1.9)，(0.8，2.0)，(0.9，0.4)，(0.9，0.5)，(0.9，0.6)，(0.9，0.7)，(0.9，0.8)，(0.9，0.9)，(0.9，1.0)，(0.9，1.1)，(0.9，1.2)，(0.9，1.3)，(0.9，1.4)，(0.9，1.5)，(0.9，1.6)，(0.9，1.7)，(0.9，1.8)，(0.9，1.9)，(0.9，2.0)，(0.95，0.4)，(0.95，0.5)，(0.95，0.6)，(0.95，0.7)，(0.95，0.8)，(0.95，0.9)，(0.95，1.0)，(0.95，1.1)，(0.95，1.2)，(0.95，1.3)，(0.95，1.4)，(0.95，1.5)，(0.95，1.6)，(0.95，1.7)，(0.95，1.8)，(0.95，1.9)，(0.95，2.0)，(0.99，0.4)，(0.99，0.5)，(0.99，0.6)，(0.99，0.7)，(0.99，0.8)，(0.99，0.9)，(0.99，1.0)，(0.99，1.1)，(0.99，1.2)，(0.99，1.3)，(0.99，1.4)，(0.99，1.5)，(0.99，1.6)，(0.99，1.7)，(0.99，1.8)，(0.99，1.9)，以及(0.99，2.0)。

微流控装置制造：在一些实施例中，本文公开的微流控装置可包括至少两个分开制造的部分。(例如，(i)结合了蚀刻、压花或烧蚀流体通道的基板，以及(ii)遮盖物或盖子)，随后将它们机械夹紧在一起，暂时粘合在一起或永久粘合在一起。在一些实施例中，本文公开的微流控装置可包括三个或更多个单独制造的部件(例如，(i)基板，(ii)流体通道层和(iii)遮盖物或盖子)，其随后被机械地夹紧在一起，临时粘合在一起或永久粘合在一起。在一些实施例中，本文公开的微流控装置可包括可移除的遮盖物或盖子。合适的制造技术的示例包括但不限于常规加工、CNC加工、注塑、3D打印、激光切割或模切聚合物薄膜的一层或多层的对准和层压，或许多微加工技术，诸如光刻和湿法化学蚀刻、干法蚀刻、深反应离子蚀刻(DRIE)或激光微加工等技术，中的任何一种。在一些实施例中，全部或一部分微流控装置可以由弹性体材料3D打印。

可以使用本领域技术人员已知的多种材料中的任何一种来制造本文公开的微流控装置。通常，所用材料的选择将取决于制造技术的选择，反之亦然。合适的材料的示例包括但不限于硅、熔融石英、玻璃，多种聚合物中的任何一种、例如聚二甲基硅氧烷(PDMS，弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、环氧树脂、不粘材料(例如聚四氟乙烯(PTFE))、各种光刻胶(例如SU8)或任何其他厚膜光刻胶，或这些材料的任意组合。

在一些实施例中，微流控装置的全部或一部分(例如，遮盖物或盖子)可以由光学透明材料制成，以促进观察和监测截留在装置内的细胞或物体。在一些实施例中，包括多层的微流控装置中的不同层可以由不同的材料制成，例如，流体通道层可以由弹性体材料制成，而装置基板和遮盖物板可以由玻璃或另一种合适的材料制成。

在一些实施例中，微流控装置可以包括三层结构，该三层结构包括基板，包括多个堰阱的流体通道层以及遮盖物板，由此，微流控腔室(即，捕获阱的内部空间)的容积由腔室的横截面积和流体通道层的厚度确定。在一些实施例中，微流控装置可总共包括两层、三层、四层、五层或多于五层。

如上所述，在一些实施例中，流体通道层的厚度将确定装置内部的流体通道和微流控腔室(例如，“微腔室”，“捕获腔室”，或捕获阱的内部区域)的深度，因此将影响捕获腔室的容积。在一些实施例中，例如，在将流体通道和捕获部件蚀刻，压花或烧蚀到基板中的情况下，装置内的流体通道和捕获腔的深度将取决于蚀刻深度，压花深度或烧蚀深度，从而影响捕获阱的体。在一些实施例中，例如，在将流体通道和捕获部件蚀刻，压花或烧蚀到基板中的情况下，流体通道和捕获室可以具有相同的深度或不同的深度。

通常，所公开的装置内的流体通道和/或捕获室的深度可以在大约1μm至大约1mm的范围内。在一些实施例中，流体通道和/或捕获室的深度可以是至少1μm，至少5μm，至少10μm，至少20μm，至少30μm，至少40μm，至少50μm，至少100μm，至少200μm，至少300μm，至少400μm，至少500μm，至少600μm，至少700μm，至少800μm，至少900μm或至少1毫米。在一些实施例中，流体通道和/或捕获室的深度可以是至多1mm，至多900μm，至多800μm，至多700μm，至多600μm，至多500μm，至多400μm，至多300μm，至多200μm，至多100μm，至多50μm，至多40μm，至多30μm，至多20μm，至多10μm，至多5μm或至多1μm。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，流体通道和/或捕获室的深度可以在约50μm至约100μm的范围内。本领域技术人员将认识到，流体通道和/或捕获室的深度可以具有在该范围内的任何值，例如，约95μm。

通常，将对所公开的装置设计中的流体通道和微流控腔室的尺寸进行优化，以(i)提供均匀有效的递送和捕获悬浮在通过装置的流体中的细胞或其他物体，和(ii)以最大程度地减少细胞样品和/或测定试剂的消耗。通常，流体通道或微流控腔室的宽度可以在约10μm至约2mm之间。在一些实施例中，流体通道或微流控腔室的宽度可以是至少10μm，至少25μm，至少50μm，至少100μm，至少200μm，至少300μm，至少400μm，至少500μm，至少750μm，至少1mm，至少1.5mm或至少2mm。在其他实施例中，流体通道或微流控腔室的宽度可以是至多2mm，至多1.5mm，至多1mm，至多750μm，至多500μm，至多400μm，至多300μm，至多200μm，至多100μm，至多50μm，至多25μm或至多10μm。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，流体通道的宽度可以在约100μm至约1mm的范围内。本领域技术人员将认识到，流体通道的宽度可以具有在该范围内的任何值，例如，大约80μm。

通常，在所公开的装置中使用的微流控腔室(例如，捕获腔室)的体积可以在大约1000μm3至大约1mm3的范围内。在一些实施例中，微流控腔室体积可以是至少1000μm3，至少10000μm3，至少100000μm3，至少1000000μm3，至少0.2mm3，至少0.5mm3或至少1mm3。在一些实施例中，微流控腔室体积为至多1mm3，至多0.5mm3，至多0.2mm3，至多1000000μm3，至多100000μm3，至多10000μm3或至多1000μm3。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，微流控腔室体积的范围可以从约100000μm3至约0.2mm3。本领域技术人员将认识到，腔室容积可以具有在该范围内的任何值，例如，约8000μm3。

在一些实施例中，本公开的装置内所包含的多个捕获阱和/或腔室中的堰阱和/或微流控腔室的数量可以在大约1至大约106或更多的范围内。在一些实施例中，装置内的捕获阱和/或腔室的数量可以是至少1，至少10，至少100，至少1000，至少104，至少105或至少106。装置内的捕获阱和/或腔室的数量可能最多为106个，最多105个，最多104个，最多1000个，最多100个或最多1个。合并为了形成本公开中包括的范围，例如，装置内的阱和/或腔室的数量可以在大约100至大约10000的范围内。本领域技术人员将认识到，装置内的阱和/或腔室的数量可以具有在该范围内的任何值，例如，大约1200。

在一些实施例中，堰阱之间的间距(或间隔)可以在大约100μm至大约1000μm的范围内，或者更大。在一些实施例中，堰阱之间的间距可以至少为100μm，至少200μm，至少300μm，至少400μm，至少500μm，至少600μm，至少700μm，至少800μm，至少900μm或至少1000μm。在一些实施例中，堰阱之间的间距可以是至多1000μm，至多900μm，至多800μm，至多700μm，至多600μm，至多500μm，至多400μm，至多300μm，至多200μm，或至多100μm。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，堰阱之间的间距可以在约200μm至约400μm的范围内。本领域技术人员将认识到，堰阱之间的间距可以具有在该范围内的任何值，例如，约220μm。

如果被制造为一组分离的部件，则所公开的微流控装置可以被机械地组装，例如通过使用适当的固定装置和紧固件将两个或多个零件夹紧在一起(使用或不使用垫圈)，或者可以使用本领域技术人员已知的多种技术(取决于所用材料的选择)中的任何一种将零件组装并粘结在一起，例如通过使用阳极结合、热结合或多种粘合剂或粘合剂膜中的任何一种，包括基于环氧的、基于丙烯酸的、基于有机硅的、可UV固化的、基于聚氨酯的或基于氰基丙烯酸酯的粘合剂。

包括泵或阀的微流控装置：在许多实施例中，所公开的微流控装置可以与外部泵一起使用，以控制流过该装置的流体。在一些实施例中，所公开的微流控装置可以进一步包括有源流体部件，诸如泵(例如，微型泵)或阀(例如，微型阀)，以提供对流体流动的额外控制，例如，以实现对向特定流体隔室的流体输送的可寻址控制和/或使得能够隔离特定流体隔室内的细胞、小球或其他物体。在一些实施例中，一个或多个微型泵或微型阀可在微型流体装置本身内制造或直接与微型流体装置本身集成(例如，在微型流体装置还包含预包装的测定缓冲液、测定试剂、捕获抗体或与磁性小球偶联的捕获探针的实施例中等，或装置操作中使用的其他液体)。在一些实施例中，如上所述，一个或多个传统的泵或阀可以位于装置的外部，例如，作为仪器模块中包含的组件，微流控装置可与之交互，并通过适当的管道连接到装置。用于本公开的装置的合适微型泵(或流体致动机构)的示例包括但不限于机电致动或气动致动的微型注射器或柱塞机构、气动或由外部活塞致动的膜片泵、气动致动试剂和缓冲袋或气囊、或电渗泵。用于本公开的装置的合适微型阀的例子包括但不限于使用可变形膜或管以及气动，电磁，电磁或机电(电磁)致动的单向阀构造的夹管阀。使用可变形的单向阀，微型止回阀和闸阀构造；使用可以熔化或溶解的蜡或聚合物塞子或可以被刺破的聚合物膜等制成的单次“阀”。在所公开的微流控装置的一些实施例中，借助于位于每个微腔(一个或多个)入口和/或(一个或多个)出口上的一个或多个微阀，装置内的多个微腔中的每个将可分别寻址和隔离，从而允许以可寻址方式可逆地密封各个微腔。在一些实施例中，借助于位于一个或多个子集的一个或多个公共入口和/或出口的一个或多个微型阀，多个微腔的一个或多个子集将成组地可寻址和可分离。在一些实施例中，装置的入口和出口或其中的流体通道可以包括用于控制流体流动的方向性的止回阀。

包括传感器的微流控装置：在一些实施例中，本公开的微流控装置或其中所包含的多个腔室中的一个或多个单独的腔室可进一步包括一个或多个另外的组件，用于调节装置内的细胞或其他物体的微环境并维持细胞生存力。示例包括但不限于加热元件、冷却元件、温度传感器、pH传感器、气体传感器(例如O2传感器，CO2传感器)，电极等或其任意组合。在一些实施例中，本公开的微流控装置可以进一步包括附加的组件或部件，例如，透明的光学窗口，以促进显微镜观察，显微镜成像和/或光谱监测技术；用于连接到灌注系统的入口和出口，用于将电极或传感器连接到外部处理器或电源的电气连接等。

微流控装置内的细胞和/或小球的区室化：对于以下将更详细讨论的一些单细胞分析方法，一旦它们已经被所公开装置的捕获部件的阵列所捕获，就可能需要对细胞进行区室化。本文公开了使用第一相对较低的流体动力压力将细胞，小球或其他物体捕获在装置内全部或部分堰阱的入口狭窄区域内的方法，随后迫使细胞，小球或其他物体(假设它们至少在某种程度上是可变形的)通过使用较高流体动力压力的脉冲穿过入口收缩区并进入捕获阱的内部区域(或腔室)。迫使细胞，小球或其他物体通过捕获阱的入口收缩区所需的压力大小可能会有所不同，具体取决于多种实验参数，包括但不限于细胞类型，细胞生长阶段(即细胞周期阶段)，小球的类型(大小和组成)，收缩区的尺寸，细胞捕获装置的流体布局等。请参照图2A与图2B。图4A和4B以及在图6-10，其显示了适用于此方法的合适装置的示例。在一些情况下，所使用的堰阱设计可在捕获阱的出口区域内包括玻璃料，以促进将被捕获的细胞或物体容纳在捕获阱的内部区域内，其中玻璃料结构包括一个或多个收缩区，其空间尺寸小于被捕获细胞或物体的最小尺寸。

在公开方法的一些实施例中，第一流体动力压力(或捕获压力)的范围可以从大约1mbar到大约200mbar。在一些实施例中，第一流体动力压力(或捕获压力)可以是至少1mbar，至少5mbar，至少10mbar，至少20mbar，至少30mbar，至少40mbar，至少50mbar，至少60mbar，至少70mbar，至少80mbar，至少90mbar，至少100mbar，至少150mbar或至少200mbar。在一些实施例中，第一流体动力压力(或捕获压力)可以是至多200mbar，至多150mbar，至多100mbar，至多90mbar，至多80mbar，至多70mbar，至多60mbar，至多50mbar，至多40mbar，至多30mbar，至多20mbar，至多10mbar，至多5mbar或至多1mbar。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些实施例中，第一流体动力压力可以在约10mbar至约80mbar的范围内。本领域技术人员将认识到，第一流体动力压力可以具有在该范围内的任何值，例如，大约92mbar。

在所公开方法的一些实施例中，第二流体动力压力(或分隔压力)可以在大约50mbar至大约1000mbar的范围内。在一些实施例中，第二流体动力压力(或分隔压力)可以是至少50mbar，至少100mbar，至少200mbar，至少300mbar，至少400mbar，至少500mbar，至少600mbar，至少700mbar，至少800mbar，至少900mbar或至少1000mbar。在一些实施例中，第二流体动力压力(或分隔压力)可以是至多1000mbar，至多900mbar，至多800mbar，至多700mbar，至多600mbar，至多500mbar，至多400mbar，至多300mbar，至多200mbar，至多100mbar或至多50mbar。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些实施例中，第二流体动力压力的范围可以从约200mbar至约800mbar。本领域技术人员将认识到，第一流体动力压力可以具有在该范围内的任何值，例如，大约860mbar。

在所公开方法的一些实施例中，第二流体动力压力(或隔室压力)与第一流体动力压力(或捕获压力)之比可以在约5倍至约20倍的范围内。在一些实施例中，第二流体动力压力与第一流体动力压力之比可以是至少5倍，至少10倍，至少12倍，至少14倍，至少16倍，至少18倍或至少20倍。在一些实施例中，第二流体动力压力与第一流体动力压力之比可以是至多20倍，至多18倍，至多16倍，至多14倍，至多12倍，至多10倍或至多5倍。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些实施例中，第二流体动力压力与第一流体动力压力的比值可以在大约12倍至大约16倍的范围内。本领域技术人员将认识到，第二流体动力压力与第一流体动力压力之比可以具有在该范围内的任何值，例如，大约13.5倍。

在一些实施例中，可以将捕获和分隔细胞、小球或其他物体的方法至少重复一次，两次，三次，四此或更多次，从而允许两个或多个细胞，小球或物体被限制在一个或多个堰阱的内部区域内。在一些情况下，使用包含与第一次使用相同的细胞，小球或其他物体的流体，至少重复一次低压捕获和高压分隔步骤。在一些情况下，使用包含与第一次使用的流体，小珠或其他物体不同的流体的流体至少重复一次低压捕获和高压分隔步骤，以使得被限制在内部区域内一个或多个堰阱的至少两个物体包括至少两个相同的细胞，至少两个不同的细胞，至少两个相同的小珠，至少两个不同的小珠，或至少一个细胞和一个小珠，或任何细胞，小球或其他物体的其他组合。

在微流控装置中培养细胞：在一些实施例中，一旦它们在装置内的全部或部分堰阱内捕获并隔离，则可以使用所公开的方法，装置和系统来培养单细胞(或一组细胞)。例如，在捕获和隔离步骤之后，微流控装置的入口可以连接到灌注系统，该灌注系统连续地或周期性地向隔离的细胞提供生长培养基，同时使用集成的或外部的加热/冷却机构来维持指定的温度。温度、pH、O2浓度、CO2浓度等可以使用集成或外部传感器进行监控。

在一些情况下，捕获的和分隔的细胞可以在公开的装置中培养一天到几个月的时间。在一些情况下，可将装置内的细胞培养至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至少1周，至少2周，至少3周，至少1个月，至少2个月，至少3个月，至少4个月，至少5个月或至少6个月。在一些情况下，装置中的细胞最多可培养6个月，最多5个月，最多4个月，最多3个月，最多2个月，最多1个月，最多3周，最多2周，最多1周，最多6天，最多5天，最多4天，最多3天，最多2天或最多1天。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些实施方式中，可以将带有该装置的细胞培养1周至1个月的时间段。本领域技术人员将认识到，可以将具有该装置的细胞培养一段在该范围内的任何值的时间，例如约2.5周。

在微流控装置中分离细胞和/或小球：对于下面将要详细讨论的某些单细胞分析方法，可能希望在被所公开装置内的捕获部件的阵列捕获后，既对细胞进行分隔又对它们进行隔离。因此，本文还公开了用于隔离单细胞，小球或其他物体或其组合的方法，一旦它们在装置内的堰阱的全部或一部分的入口区域内或内部区域内被捕获，分隔和/或培养。例如，在一些情况下，可以通过使不混溶的流体流过装置来密封堰阱(或其内部区域)，以防止分离细胞裂解后释放的组分扩散或杂交。在一些情况下，不混溶的流体可以包括油。在一些情况下，不混溶的流体可以包括空气。

使用不混溶的流体：由于迫使流体流过微流控通道所需的压力主要由通道的最小尺寸决定，因此可以使用不混溶的流体(例如油)隔离捕获和/或分隔的细胞。较小的尺寸需要较高的压力才能引起流体流动。此外，由于公开的装置内的微流控通道通常是亲水的，因此需要更大的外部压力以迫使疏水性油进入通道。当外部压力超过克服毛细管压力所需的临界值时，油将流动：

P_ext＝γ(w^-1+h^-1)

其中γ是油/水界面的表面张力，w和h是流体通道的宽度和高度。假设油/水界面的γ～50mJ/m2，并且旁路通道的宽度和高度分别为25μm和20μm，则在旁路通道中引起流动所需的临界压力约为4.5kPa(45mbar)。相反地，促使流体通过流体阱的5μm收缩区的临界压力为约12.5kPa(125mbar)。这表明对于类似于图6所示的装置，密封油中的微孔的最佳压力在5-10kPa(50-100mbar)的范围内。空气密封可能会使用更高的压差。因此，可以确定与装置设计有关的压力范围，其中诸如油或空气之类的不混溶流体将流过旁路通道，但不流过堰阱。该过程允许捕获在装置内的每个分隔的细胞或细胞组被密封在由油或空气界面围绕的水性液滴中。

调节微流控装置的流体动力学阻力的能力，以通过捕获部件实现亲水性流体的高流率，从而使细胞或其他物体高效地捕获在微流控收缩区内，同时防止疏水性流体的流动，从而允许通过防止杂交和污染的介质分离捕获的细胞，并使得能够大规模平行制备例如单细胞cDNA库的有效技术构成本公开的新颖特征。本文公开的高捕获效率装置与细胞分离和条形码方法(后文将在下文讨论)的结合克服了依赖随机泊松统计的单细胞分析技术细胞沉降效率低的问题，例如沉降到微孔或封装成被油包围的水滴。当前公开的方法和装置还克服了现有的低通量技术的问题，其技术基于使用流式细胞仪进行细胞分选，或现有的基于微流控的单细胞捕获和条形码方法，例如富鲁达仪器科技有限公司(Fluidigm Corp，加拿大南圣弗朗西斯科)，它使用泵和阀将分散在液相中的条形码传递到每个细胞阱。

水凝胶的用途：本文公开的另一种用于分离单细胞，小球或其他物体或它们的组合的方法，一旦它们在装置内的堰阱的全部或部分入口区域或内部区域内被捕获，分隔和/或培养。装置包括使用半透性，生物相容性水凝胶。在一些情况下，所公开的微流控装置可以包括可移动的盖子，该盖子被机械地夹持或以其他方式粘附到装置的流体通道层上(即，具有足够的力以承受将细胞或其他物体引入装置中堰阱的阵列所需的中等流体动力压力)。然后，可以例如通过在可交联溶液中流过该装置，然后将其聚合以将流体层转化为水凝胶，将已被捕获或分隔在所公开装置中的细胞，小球或其他物体密封在半透性水凝胶中，之后可以取下微流控装置的盖子，以允许进入被捕获的细胞，小球或其他物体。可以使用的凝胶的例子包括但不限于聚乙二醇凝胶、透明质酸凝胶、甲基丙烯酸明胶、可UV固化的凝胶、可硫醇可交联的凝胶、藻酸盐凝胶、琼脂糖凝胶等。

这种方法的一个显着优势是能够利用水凝胶的半渗透性，从而允许小分子(例如短DNA或RNA链，裂解化学物，酶和其他逆转录试剂)的快速扩散，同时阻碍长DNA或RNA分子，病毒颗粒，大蛋白，抗体或其他大分子的扩散。该功能使，例如细胞裂解物在随后的DNA条形码步骤中仍被困在水凝胶中，这将在下文中详细讨论，从而使细胞成分与唯一的分子标识符相关联，该标识符可以在随后的核酸测序分析过程中追溯到特定的单细胞。在一些情况下，在引入并密封在水凝胶中之后，移除装置的盖子并直接进入固定在水凝胶中的细胞(或其他物体)的能力允许人们打印DNA条形码，细胞裂解缓冲液和/或其他试剂(例如，使用喷墨打印或浸笔式纳米光刻技术)到细胞中。

单细胞和细胞成分的分子条形码：本文还公开了使用所公开的高效细胞捕获装置对衍生自单细胞的细胞成分，例如分子生物学的分子条形码进行编码的方法，其使用Fan等人(2015)描述的方法：“用于基因表达细胞计数的单细胞的组合标记”，(《科学》347(6222)：1258367)。目前有几种方法可以将单个细胞裂解物和DNA条形码分隔在封装在油中的水滴中。这些主要基于基于泊松统计的细胞和条形码分子的随机分布，其中细胞和条形码被随机封装在油/水滴中(称为Drop-Seq及其变体)，或者细胞和条形码被随机沉积在微流控模板上并在油中密封(称为Seq-Well及其变体)。这些方法均不能先验地确定哪个液滴(或微孔)包含哪个DNA条形码，因此这些技术不能将基于图像的表型数据与每个细胞的基因组数据联系起来。

还有其他一些有意将DNA条形码放置在已知位置的平台，例如WaferGen(加拿大弗里蒙特)平台，该平台将唯一的DNA条形码沉积在铝板上加工的微孔阵列的底部，并且还有Becton Dickinson Resolve^TM平台，该平台可在96或384孔微量滴定板的每个孔底部放置一个唯一的DNA条码，然后将单细胞分选到每个孔中。最后，如上所述，Fluidigm平台使用气动泵将流体分散液中的DNA条码递送到每个微流控阱中。但是，这些系统无法实现基于泊松的方法或当前公开的方法和装置的捕获细胞密度。

本文公开了用于组织上述新型微流控装置内单细胞阵列的方法，该方法可包括：(1)使水性悬浮液中的细胞流过微流控装置，该微流控装置包括一系列捕获部件并互连旁路通道，从而允许将单细胞捕获在阵列中；(2)用裂解缓冲液和其他生化试剂代替流体；(3)通过使不混溶的流体(例如油或空气)流过微流控装置来分离捕获的细胞或细胞裂解物，以及(4)将细胞裂解物成分附着到唯一的分子条形码上，从而使它们在使用常规或下一代测序技术或其任意组合进行汇总和分析后可以被追踪。可以使用本领域技术人员已知的多种细胞裂解技术中的任何一种，其将在下面更详细地讨论。

在一些情况下，唯一的分子条形码包括模式化的DNA条形码，该条形码既可以对捕获的细胞进行基于图像的表型分析，又可以通过将单细胞裂解物的mRNA转化为附加到每个捕获阱中的DNA条形码上的cDNA，基于分子转录本对每个捕获的细胞进行基因分型。

在一些情况下，唯一的分子条形码的多个副本可以在装置的每个堰阱内原位合成(例如，使用诸如Fodor等(1991)所述的光导合成技术：“光导的，空间可寻址的平行化学合成”，《科学》251(4995)：767-773或McGall等人(1996)的“使用半导体光刻胶的高密度寡核苷酸阵列的光导合成”，美国国家科学院学报(Acad.Sci.USA 93(24)：13555-13560))，然后再组装该装置以及将其用于细胞捕获之前。在一些情况下，唯一的分子条形码，例如可以使用本领域技术人员公知的任何一种光可裂解的或化学可裂解的连接子，将在每个堰阱内合成的寡核苷酸条形码共价拴系到堰阱内的表面(例如，堰阱内部区域内的基质表面)。

在一些情况下，可以在装置组装之前和在细胞阱使用之前，将唯一的分子条形码的多个副本打印到装置的每个堰阱中(例如，使用喷墨打印或浸笔式纳米光刻技术)。在一些情况下，唯一的分子条形码(例如寡核苷酸条形码)在堰阱中印制有一个或多个，可通过本领域技术人员已知多种光可裂解或化学裂解连接子的任一种，将其非特异性地吸附到堰阱的表面上，或可与堰阱共价拴在表面上。

所公开的方法包括在引入细胞之前直接在微流控装置内打印或合成DNA条形码的方法，以及在细胞被引入及密封在水凝胶中之后，将DNA条形码，细胞裂解缓冲液和/或其他试剂打印到特定细胞的方法。第一种技术的优势(在组织细胞之前先打印条形码)是每个细胞将具有已经定位在正确位置的唯一条形码。第二种技术的优点(在细胞组织后打印条形码)是可以将DNA条形码限制为那些表现出令人感兴趣的细胞表型的细胞，例如可以通过使用基于高含量图像的检测方法进行鉴定。

在一些情况下，唯一的分子条形码的多个副本可以被束缚在小球库中的每个小球上。小球可以被所公开的装置内的细胞捕获和分隔，例如每个细胞一个小球，从而在裂解后，可以用分子条形码标记细胞裂解物的每个组分，所述分子条形码在下游测序分析之后识别起源的细胞。在一些情况下，小球可以是磁性小球。

在一些情况下，例如，通过与mRNA分子的poly(A)尾部杂交，分子条形码可包含与特定分子组分杂交或结合的靶标识序列或元件。在一些情况下，条形码可以包括与抗体或其他与抗原或其他分子成分特异性结合的其他分子识别元件偶联的寡核苷酸条形码。

在一些情况下，编码单细胞身份的唯一的分子条形码(总条形码库多样性在～106或更大的数量级上，以确保每个细胞与唯一条形码配对)也可以包括分子计数区域，分子计数区域包括约105或更大数量级的多样性，因此细胞内的每个单个mRNA分子(或其他寡核苷酸靶分子，蛋白质靶等，如分子条形码的靶标识部分所定义)都被特异性标记，并可以根据其唯一的分子计数进行计数。细胞裂解后，例如，通过将合适的裂解缓冲液引入捕获室阵列，释放的mRNA分子(或其他靶分子)与分子条形码杂交(或结合到分子条形码上)(可以在捕获室中的表面与分子条形码或分子束缚在一起，或者可能已经释放到溶液中)，然后可以进行后续的逆转录，扩增和/或测序反应。在一些情况下，分子条形码仍束缚在小球上，随后从阵列中取回小球，并汇集起来用于逆转录，扩增和测序。对于单细胞基因表达谱研究，源自每个单细胞的所有聚腺苷酸转录物的互补DNA链(cDNA)共价存储在每个单个小球的表面，因此可以分析任何基因选择。当将条形码转录物分配给起源细胞并进行计数时，将重建每个细胞的基因表达谱。在一些实施例中，可以在细胞捕获阵列的腔室内进行逆转录反应，例如在取回小球之前。在一些实施例中，还可以在细胞捕获阵列的腔室内进行扩增反应(例如PCR扩增或等温扩增反应)和/或测序反应(例如通过合成反应的循环测序)。在一些实施例中，多个腔室或小球内的每个单独的腔室或小球可包含两个或更多个靶分子识别序列或元件。在一些实施例中，两个或更多个小球可与阵列中的每个单细胞共隔室，其中不同的小球包含针对不同的寡核苷酸或蛋白质靶分子(例如mRNA分子、tRNA分子、基因组DNA片段、特定受体蛋白或酶等)。小球的检索然后将允许分子条形码的下游处理，以对与每个单细胞相关的不同类型的靶分子进行计数。在一些实施例中，一个或多个分子感测小球，例如细胞因子感测珠，以及分子条形编码的小球可以与单细胞共隔室(同时或相继)以监测，例如，细胞因子分泌方式或细胞因子的变化暴露于化学刺激下后的分泌模式，随后细胞裂解和释放的mRNA分子的分子条形码将基因表达谱的变化与分泌模式的变化相关联。

本文还公开了在上述新型微流控装置中组织单细胞阵列的方法，该方法可包括：(1)使水性悬浮液中的细胞流过微流控装置，该微流控装置包括捕获部件和互连旁路通道，从而使单细胞被捕获在阵列内，(2)使可交联溶液流过微流控装置，从而将流体层转化为水凝胶，从而分离出阵列内被捕获的细胞，(3)去除微流控装置的盖子，以能够直接进入水凝胶中捕获的细胞(或其他物体)阵列的装置，以及(4)将细胞裂解物附着到唯一的条形码上，从而可以在使用常规或下一代测序技术或其任何组合对其进行汇总和分析后，对其进行追踪。这种方法可以利用水凝胶的天然孔隙度来捕获大分子，例如mRNA转录物，长DNA链，大蛋白，病毒颗粒等，同时允许小分子进入凝胶，包括裂解剂、酶、短DNA链(例如，短于100-200bp的那些)，以及分子生物学规程中通常使用的其他试剂。

如上所述，一旦捕获了细胞，可以使用多种技术中的任何一种来裂解细胞。实例包括但不限于使用热、声能、光学激光脉冲、电场脉冲、冻结/解冻循环和化学试剂。在一些情况下，细胞裂解可通过在对捕获室进行油或空气密封之前，在水溶液中注入裂解缓冲液，或将裂解缓冲液溶解在油密封介质中来实现。

我们还证明，在实验结束时可以将装置内的捕获腔室打开，该实验允许，例如从细胞捕获装置中回收小球或条形码化的cDNA。

本领域技术人员已知的多种核酸测序方法和平台中的任何一种均可与本文公开的分子条形码方法一起使用。例子包括但不限于配对末端测序、纳米孔测序、高通量测序、鸟枪法测序、染料终止剂测序、多引物DNA测序、引物步移、桑格双脱氧测序、Maxim-Gilbert测序、焦磷酸测序、真正单分子测序，或其任何组合。

在一些实施例中，高通量测序方法可以使用，例如使用平台，如Roche 454、Illumina Solexa、ABI-SOLiD、ION Torrent、Complete Genomics、Pacific Bioscience、Helicos或Polonator平台的循环阵列测序。在一些实施例中，测序可包括使用IlluminaMiSeq，HiSeq或其他测序平台。在一些实施例中，测序可包括使用由牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore)商业化的Minion或相关测序装置，使用来自Genapsys的Genius系统或来自Nanostring的Hyb&SeqTM单分子直接数字测序技术。在一些实施例中，测序可以包括使用诸如可从Nanostring获得的数字空间分析(DSP)技术。

基于成像的表型分析和与基因组数据的相关性：所公开的用于捕获细胞和其他物体的微流控装置旨在促进高分辨率，基于成像的细胞表型性状的分析，在一些情况下，其可能与如上所述获得的基因组数据相关。

本领域技术人员已知的多种成像技术中的任何一种都可以用于对公开的微流控装置内捕获的细胞进行表型分析。例子包括但不限于：明场成像、暗场成像、荧光成像、发光成像、化学发光成像、磷光成像、相差成像、定量相衬成像、共聚焦显微镜成像、超分辨率显微镜成像、或时间分辨荧光成像。在一些实施例中，可以执行双波长激发和发射(或多波长激发或发射)荧光成像。在一些实施例中，可以执行双光子荧光成像。在一些实施例中，可以执行相干拉曼成像。

在一些情况下，可以对使用高通量显微镜成像系统获取的一系列一个或多个图像进行预处理以，例如校正图像对比度和亮度、校正不均匀照明、校正光学图像像差(例如，球差、色差等)、消除噪声、识别每个图像内的物体(例如细胞或亚细胞结构)、分割每个图像以隔离所识别的物体、平铺分割的图像以创建合成图像、执行特征提取(例如对物体属性进行识别和/或定量化，例如可观察到的细胞表型特征)或其任意组合。在一些情况下，装置内的多个腔室可以在单个图像中成像。在一些情况下，一系列图像可以被“平铺”以创建装置内多个腔室的全部或一部分的高分辨率图像。

在一些情况下，可以利用自动或半自动图像处理来识别和计数捕获室内的细胞或小球，监测捕获室内的细胞或小球以鉴定特定的细胞或小球集，例如，死细胞、活细胞、成对的细胞、活跃分裂的细胞、表现出特定细胞表面标记的细胞、用荧光标记物标记的内部细胞蛋白、荧光化学传感小球等。可用于实现所公开方法的图像处理算法示例包括但不限于Canny边缘检测方法、Canny-Deriche边缘检测方法、一阶梯度边缘检测方法(例如Sobel算子)、二阶微分边缘检测方法、相位一致性(相位相干性)边缘检测方法、其他图像分割算法(例如强度阈值、强度聚类方法、基于强度直方图的方法等)、特征和模式识别算法(例如用于检测任意形状的广义Hough变换、圆形Hough变换)等)和数学分析算法(例如，傅立叶变换、快速傅立叶变换、小波分析、自相关性等)，或其任意组合。

用于细胞表型的基于机器学习的图像处理：在一些优选的实施例中，基于机器学习的方法可以用于实施所公开的全部或部分方法，以检测和计数各个细胞，分析细胞表型特征，与基因组数据的相关性。在一些情况下，可以使用基于机器学习的图像处理方法，例如，使用较大的图像通过微流控装置自动对齐并裁剪单个捕获室的图像，确定每个室的特定行和列的地址，识别在每个时间点的每个小室中的细胞，分析每个细胞的荧光特征以确定报告基因、蛋白质或其他分子特征的存在，和/或然后绘制每个小室或菌落内的细胞数(可选其分子特征列表)。在一些情况下，基于机器学习的图像处理可用于根据细胞的表型特征，根据预先指定的一组分类标准对细胞进行分类。在一些情况下，基于机器学习的图像处理可用于根据细胞的表型特征，根据由机器学习算法得出的一组分类标准对细胞进行分类。

本领域技术人员已知的多种机器学习算法中的任何一种都可以适用于所公开的方法。示例包括但不限于监督学习算法、非监督学习算法、半监督学习算法、强化学习算法、深度学习算法或其任意组合。

监督学习算法：在本公开的上下文中，监督学习算法是依赖于使用一组标记的训练数据(例如，细胞表型特征和相应的已知细胞分类类型)来推断关系的算法，该关系是给定细胞或细胞样品的表型性状集与细胞或细胞样品的分类之间的关系。训练数据包括一组成对的训练实例，例如，其中每个实例包括一组表型特征数据和根据常规方法的给定细胞的所得分类。

非监督学习算法：在本公开的上下文中，非监督学习算法是用于从训练数据集得出推论的算法，所述训练数据集由未与标记的细胞分类数据配对的细胞表型特征数据集组成。最常用的非监督学习算法是聚类分析，它通常用于探索性数据分析，以查找过程数据中的隐藏模式或分组。

半监督学习算法：在本公开的上下文中，半监督学习算法是利用标记的和未标记的细胞分类数据两者进行训练的算法(通常使用相对少量的标记数据和大量的未标记数据)。

强化学习算法：在本公开的上下文中，强化学习算法是用于，例如确定应该采取的一组细胞表型数据处理步骤的算法，以便最大化细胞分类奖励功能。强化学习算法通常用于优化Markov决策过程(即用于研究各种优化问题的数学模型，其中无法仅根据过去的行为准确预测未来的行为，而是取决于随机的机会或概率)。Q-学习是一类强化学习算法的示例。强化学习算法与监督学习算法的区别在于，永远不会显示正确的训练数据输入/输出对，也不会明确纠正次优动作。通过在基于更新的输入数据的可能结果与过去培训探索的利用之间找到平衡，倾向于以实时性能为重点来实现这些算法。

深度学习算法：在本公开的上下文中，深度学习算法是受人脑的结构和功能启发的算法，称为人工神经网络(ANN)，尤其是包括多个隐藏层的大型神经网络，它们是用于映射输入数据集(例如细胞表型性状数据集)输出到(例如细胞类型)分类决策。人工神经网络将在下面更详细地讨论。

人工神经网络和深度学习算法：在一个优选实施例中，在所公开的方法中采用的机器学习算法可以是人工神经网络(ANN)或深度学习算法。传统图像处理方法中使用的一个或多个图像处理步骤可以通过使用一个或多个人工神经网络或深度学习算法来增强或替换。人工神经网络可以包括任何类型的神经网络模型，例如前馈神经网络、径向基函数网络、递归神经网络或卷积神经网络等。在一些实施例中，所公开的方法可以采用预训练的ANN或深度学习架构。在一些实施例中，公开的方法可以采用ANN或深度学习架构，其中训练数据集用来自单个本地细胞分析系统(即，运行包括公开的数据处理方法的软件程序的计算机系统或处理器)的实时细胞分类数据连续更新，多个本地细胞分析系统或多个通过Internet连接的地理分布的细胞分析系统。

人工神经网络通常包括组织成多层节点的互连节点组(图14)。例如，ANN架构可以包括至少一个输入层，一个或多个隐藏层以及一个输出层。ANN可以包括任何总数的层以及任何数目的隐藏层，其中隐藏层用作可训练特征提取器，其允许将一组输入数据映射到输出值或一组输出值。如本文所使用的，深度学习算法是包括多个隐藏层(例如，两个或更多隐藏层)的ANN。神经网络的每一层都包含多个节点(或“神经元”)。节点接收直接来自输入数据(例如，细胞表型数据)的输入或来自先前层中节点的输出的输入，并执行特定操作，例如，求和运算。在一些情况下，从输入到节点的连接与加权(或加权因子)相关联。在一些情况下，节点可以将所有输入对xi的乘积及其相关加权相加(图15)。在一些情况下，如图15所示，加权和偏置为b。在一些情况下，节点或神经元的输出可以使用阈值或激活函数f进行门控，该函数可以是线性或非线性函数。激活函数可以是，例如，整流线性单元(ReLU)激活函数，泄漏ReLU激活函数或其他函数，例如饱和双曲线正切、恒等、二元阶跃、逻辑、反正切(arcTan)、软符号(softsign)、参数化整流线性单元、指数线性单元、softPlus、弯曲恒等、softExponential、正弦函数、正弦、高斯函数或S形函数或其任意组合。

神经网络的加权因子、偏差值和阈值或其他计算参数可以在训练阶段使用一组或多组训练数据“教导”或“学习”。例如，可以使用来自训练数据集的输入数据以及梯度下降或后向传播方法来训练参数，以使ANN计算出的输出值(例如，细胞分类结果)与训练数据集中包含的示例一致。可以从反向传播神经网络训练过程获得参数，该反向传播神经网络训练过程可以或可以不使用与用于执行本文公开的细胞分析方法的计算机系统硬件相同的计算机系统硬件来执行。

其他特定类型的深度机器学习算法，例如所公开的方法和系统也可以使用卷积神经网络(CNNs)(例如，经常用于处理来自机器视觉系统的图像数据)。CNNs通常由不同类型的层组成：卷积层、池化层、扩展层和完全连接的节点层。在一些情况下，可以在某些层中使用激活功能，例如整流线性细胞。在CNN架构中，每种执行的操作可以有一层或多层。CNN架构总共可以包括任意数量的层，以及用于执行的不同类型的操作的任意数量的层。最简单的卷积神经网络架构始于输入层，然后是一系列卷积层和池化层，其中每个卷积层还可以包含一个或多个滤波器，这些滤波器又可以包含一个或多个加权因子或其他可调参数。在一些情况下，参数可以包括偏差(即，允许激活函数改变的参数)。在一些情况下，卷积层后面是ReLU激活功能层。也可以使用其他激活函数，例如饱和双曲正切、恒等式、二元阶跃、逻辑、反正切(arcTan)、软符号(softsign)、参数化整流线性单元、指数线性单位、softPlus、弯曲恒等、softExponential、正弦曲线、正弦、高斯、S形函数和其他各种函数。卷积、池化和ReLU层可以充当可学习的特征提取器，而完全连接的层则可以充当基于机器学习的分类器。

与其他人工神经网络一样，CNN架构的卷积层和完全连接层通常包括各种计算参数，例如，在如上所述的训练阶段中进行训练的加权，偏差值和阈值。

通常，在ANN的输入层中使用的节点数(确定输入数据集的大小)可以在大约10到大约100000个节点的范围内。在一些情况下，在输入层中使用的节点的数量可以是至少10个，至少50个，至少100，至少200个，至少300个，至少400个，至少500个，至少600个，至少700个，至少800个，至少900个，至少1000个，至少5000个，至少10000个，至少20000个，至少30000个，至少40000个，至少50000个，至少60000个，至少70000个，至少80000个，至少90000个或至少100000个。在一些情况下，输入层中使用的节点数可能最多为100000，最多为90000，最多为80000，最多为70000，最多为60000，最多为50000，最多为40000，最多为30000，最多为20000，最多10000，最多5000，最多4000，最多3000，最多2000，最多1000，最多900，最多800，最多700，最多600，最多500，最多400，最多300，最多200，最多100，最多50或最多10。可以将本段中所述的下限值和上限值中的任何一个结合起来以形成本公开中包括的范围，例如，在一些实施方式中，输入层中使用的节点数范围可以从500到2000个。本领域技术人员将认识到，在输入层中使用的节点数可以具有该范围内的任何值，例如，大约512个节点。

在一些情况下，在ANN中使用的层总数(包括输入层和输出层)可以在大约3到大约20的范围内。在一些情况下，层的总数可以是至少3，至少4。至少5个，至少10个，至少15个或至少20个。在一些情况下，层的总数可以最多20个，最多15个，最多10个，最多5个，最多4个或至少20个，至少3个。此段落中描述的下限值和上限值中的任何一个都可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在某些实施例中，层的总数可以在约5到约15的范围内。本领域技术人员将认识到，在ANN中使用的层的总数可以具有在该范围内的任何值，例如8层。

在一些情况下，在ANN中使用的可学习或可训练参数的总数，例如加权因子、偏差或阈值，可以在大约1至大约10000的范围内。在一些情况下，可学习参数的总数可以是至少1，至少10，至少100，至少500，至少1000，至少2000，至少3000，至少4000，至少5000，至少6000，至少7000，至少8000，至少9000或至少10000。备选地，可学习参数的总数可以是小于100的任何数字，介于100到10000之间的任何数字或大于10000的数字。在一些情况下，可学习参数的总数可能最多为10000，最多9000，最多8000，最多7000，最多6000，最多5000，最多4000，最多3000，最多2000，最多1000，最多500，最多100，最多10或最多1。可以将本段中所述的下限值和上限值中的任何一个组合起来以形成本公开内容所包括的范围，例如，在某些实施方式中，可学习或可训练的参数总数的范围可以从大约100到大约5000。本领域技术人员将认识到，所使用的可学习参数的总数可以具有该范围内的任何值，例如，大约2200个参数。

训练数据集：如上所述，用于训练ANN或深度学习算法的输入数据可以包括各种输入值，这取决于替换常规图像处理方法的哪个步骤。通常，用于训练ANN或深度学习算法的输入数据将是包括与用于确定实际测试细胞样本的细胞分类结果的输入值相同或输入值相似的一组数据。输入数据值可以包括数值(例如，整数值、实数值、浮点数、图像中单个像素或合并像素的RGB或灰度强度值)、字母数字值、ascii值等或其任意组合。通常，可以使用一个或多个训练数据集来训练ANN或深度学习算法，所述训练数据集包括相同或不同组的输入(例如，表型性状)数据和成对的输出(例如，细胞分类)数据。

仪器系统：本文还公开了仪器系统，该仪器系统可包括：如本文所述的微流控细胞捕获装置、光源、图像传感器、流体流量控制器、温度控制器、气体和pH控制器以及处理器或其任何组合。

光源：可以使用多种光源中的任何一种来提供激发光和/或成像光，包括但不限于钨丝灯、钨卤素灯、弧光灯、激光器、发光二极管(LED)或激光二极管。在一些情况下，一个或多个光源与附加的光学组件的组合，附加的光学组件例如透镜、滤光器、光圈、光阑、反射镜等，将包括照明子系统或模块。

图像传感器：各种图像传感器均可用于成像，包括但不限于光电二极管阵列、电荷耦合器件(CCD)相机或CMOS图像传感器、微透镜阵列、扫描仪，或其他光学检测手段。成像传感器可以是一维(线性)或二维阵列传感器。在一些情况下，一个或多个图像传感器与附加光学组件的组合，例如透镜、滤光器、光圈、光阑、反射镜等，将包括成像子系统或模块。

成像模块通常将包括用于引导、整形、滤波或聚焦光束的各种光学组件。合适的光学组件的例子包括但不限于透镜、反射镜、棱镜、衍射光栅、有色玻璃滤光片、窄带干涉滤光片、宽带干涉滤光片、二向色反射器、光纤、光波导等。在一些情况下，成像模块可以进一步包括一个或多个平移台或其他运动控制机构，以相对于照明和/或成像子系统移动微流控装置，反之亦然。

流体流量控制器：在一些情况下，所公开的仪器系统(或细胞分析平台)可以包括流体流量控制器或灌注系统，其提供用于驱动微流控装置中的流体流动的一个或多个流体致动机构的可编程控制器。用于所公开的方法，装置和系统中的合适流体致动机构的示例包括向连接到一个或多个装置入口或出口的流体容器施加正压或负压、电动势、电润湿力、被动毛细作用、促进通过使用膜和/或芯吸垫的毛细作用等。

通过使用所公开的微流控装置的流体流动的控制通常将通过使用一个或多个泵(或其他流体致动机构)和一个或多个阀来执行，在一些实施例中，该阀将被容纳在用户控制的仪器模块中装置的外部。合适的泵的例子包括但不限于注射泵、可编程注射泵、蠕动泵、隔膜泵等。在一些情况下，通过系统的流体流动可以通过在连接至微流控装置的外部试剂和缓冲容器的一个或多个入口处，或通过微流控装置本身的一个或多个入口处施加正气压来控制。在一些情况下，可以通过在连接到该装置的废物容器的一个或多个出口处，或在该装置的一个或多个出口处抽真空来控制流过该装置的流体。合适的阀的例子包括但不限于止回阀、机电两通或三通阀、气动两通和三通阀等。

可以在微流控装置操作顺序的不同点处利用不同的流体流率。例如，在所公开的方法，装置和系统的一些实例中，通过全部或部分微流控装置的体积流率可以在约-10ml/秒至约+10ml/秒的范围内变化。在一些实施例中，体积流率的绝对值可以至少为0.00001ml/秒，至少0.0001ml/秒，至少0.001ml/秒，至少0.01ml/秒，至少0.1ml/秒，至少1毫升/秒，或至少10毫升/秒，或更高。在一些实施例中，体积流率的绝对值可以是最高10ml/秒，最高1ml/秒，最高0.1ml/秒，最高0.01ml/秒，最高0.001ml/秒，最高0.0001毫升/秒，或最高0.00001毫升/秒。给定时间点的体积流率可以具有该范围内的任何值，例如正向流量为1.2毫升/秒，反向流量为-0.07毫升/秒，或值为0毫升/秒(即停止流量)。

在一些实施例中，所公开的细胞分析平台可以进一步包括温度控制器，用于维持微流控装置内用户指定的温度，例如，以使细胞能够在连续的显微镜观察下进行长时间的培养和维持，或者在两个或多个指定的时间间隔内在两个或多个指定温度之间逐渐升高温度。可以合并到微流控装置或仪器系统中的温度控制组件的示例包括但不限于阻力加热元件(例如，氧化铟锡阻力加热元件)、珀耳帖加热或冷却装置、散热器、热敏阻力器、热电偶、红外光源等，它们使用电子反馈回路进行调节。

在一些情况下，温度控制器可以在执行特定的装置操作步骤之前，在一个或多个指定的可调节时间段提供可编程的温度变化。在一些情况下，温度控制器可以在指定的时间间隔内提供可编程的温度变化。在一些实施例中，温度控制器可以进一步以指定的频率和斜率提供两个或多个设定温度之间的温度循环，从而可以执行用于扩增反应的热循环。

气体和pH控制器：在一些实施例中，所公开的细胞分析平台可以包括气体和pH控制器以及相关的组件(例如，传感器)，用于维持用户指定的气体百分比，例如，缓冲液，生长培养基或其他被输送至微流控装置的流体中的CO2或用户指定的pH值。合适的传感器的示例包括非分散红外(NDIR)CO2传感器(与溶解的全内反射(ATR)光学器件结合使用，用于溶解的CO2传感)、金属绝缘体半导体场效应晶体管(MOSFET)型传感器，用于溶解的CO2传感(例如，将Pt-NiO薄膜作为活性CO2感测材料沉积在栅电极上)、CC敏感电极(例如MettlerToledo的InPro 5000i溶解CO2传感器系列)、pH敏感电极、浸入流体中的焊盘，其产生对应于流体中溶解的CO2或pH值的颜色变化，例如那些以商品名

传感器点[德国雷根斯堡PreSens Precision Sensing，GmbH]出售的流体等。为了控制CO2和pH，在反馈回路中使用了合适的传感器来控制酸/碱滴定和CO2注入。在一些实施例中，可以直接在装置内包含的流体中监测CO2或其他气体浓度或pH。在一些实施例中，可以在与装置内的流体平衡的气体或气氛中监测CO2或其他气体浓度。

处理器和计算机系统：在许多情况下，公开的仪器系统(细胞分析平台)将包括计算机(或处理器)以及计算机可读介质，该介质包括用于提供用户界面以及手动、半自动化或全自动控制全系统功能，例如控制流体流量控制子系统，温度和气体控制子系统，成像子系统以及运动控制子系统(如果包括翻译阶段)。在许多情况下，如上所述，所公开的仪器系统还将包括计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于执行常规和/或基于机器学习的图像处理的代码。在一些实施例中，系统计算机或处理器可以是仪器系统的集成组件(例如，微处理器，现场可编程门阵列(FPGA)或嵌入仪器内的主板)。在一些实施例中，系统计算机或处理器可以是独立模块，例如，个人计算机或膝上型计算机。在一些情况下，图像数据，传感器数据和/或其他系统数据可以存储在本地。在一些情况下，图像数据，传感器数据和/或其他系统数据的全部或一部分可以存储在基于云的数据库中。在一些情况下，全部或部分图像处理可以在本地或在云中执行。

仪器控制软件提供的流体控制功能的例子包括但不限于体积流体流率、流体流速、细胞样品和/或小球样品引入的时间和持续时间、测定试剂添加、化学或物理刺激物的输送、阀门切换和冲洗步骤。

仪器控制软件提供的温度控制功能的示例包括但不限于指定温度设定点以及控制温度变化的时间，持续时间和升温速率。

仪器控制软件提供的气体控制功能的示例包括但不限于CO2浓度控制。

仪器控制软件提供的成像系统控制功能的示例包括但不限于自动聚焦功能、照明或激发光曝光时间和强度的控制、图像采集速率、曝光时间的控制以及数据存储选项。

仪器控制软件提供的平移台系统控制功能的示例包括但不限于对台位置，方向及其定时和持续时间的控制。

在一些实施例中，使用包括多个可独立控制的流动通道和集成的流体阀的微流控控制系统可以提供对捕获阵列内单细胞微环境的更好控制，并使人能够控制时间和阵列细胞对不同刺激性化合物的暴露水平。在一些实施例中，细胞分析平台可以根据需要，利用微细阀系统来打开和关闭微流控腔室，例如以控制基于小球的传感试剂对细胞分泌物的暴露。

应用：所公开的细胞分析平台实现了基于图像的表型鉴定和单细胞的分子条形码编码，与基于流体的分类和现有的流体捕获方法相比，其流通量提高了100倍以上。此外，使用Drop-Seq或其他基于泊松的库制备方法不能实现所公开系统的基于成像的表型能力。所公开的细胞分析平台与小样品(例如肿瘤活检)兼容，并且可以在未来的临床应用中用于对肿瘤反应的精确药物筛选。在某些应用中，所公开的细胞分析平台可以用于染色质分析。

在一些情况下，在所公开的方法，装置和系统中，可以实现用于制备基于单细胞的cDNA文库的强大，大规模并行的工作流程，例如，通过将已固定在水凝胶中的单细胞暴露于裂解化学品中以及逆转录试剂，同时依靠水凝胶的小孔径来局部限制单细胞裂解物中的mRNA，然后将mRNA分子附加到局部放置的DNA条码上。在一些情况下，DNA条形码可以直接在微流控装置中打印或合成，每个单细胞捕获阱都有一个唯一的细胞识别条形码，并且该方法依赖于mRNA分子向捕获阱内表面短距离扩散的能力。在一些情况下，DNA条形码可以在使用前直接在微流控装置中打印或合成，然后从装置内的表面释放出来，例如，通过裂解可光裂解或化学裂解的连接子，将其连接到表面。在其他情况下，可以使用包括可移动盖子的微流控装置将单细胞捕获并固定在水凝胶中，然后可以将DNA条形码直接打印在目标细胞上，并通过基于图像的表型鉴定。在又一应用中，可以将单细胞捕获并固定在水凝胶中，并在取下盖子后将其暴露于药物以鉴定单细胞的表型反应。可以观察到的表型反应的例子包括但不限于细胞因子的释放、病毒颗粒的脱落、生长周期的改变或细胞的增殖。水凝胶的小孔径可有效固定细胞和分泌的任何大分子，同时允许每个细胞随时间推移出现一个单向表型变化。此方法适用于贴壁细胞和悬浮细胞。结合所公开的方法和装置使用分子条形码技术允许人们将表型性状或其变化与单细胞内的基因组数据(例如，基因表达谱的变化)相关联。

示例

提供这些示例仅出于说明性目的，并不限制本文提供的权利要求的范围。

示例1-预测网状流体网络中两个唯一的流动状态由梯形和网状网络组成的流体力学系统可以像电路一样建模，其中的压力、流率和流体力学阻力类似于电压、电流和电阻。如上所述，本公开的网状流体网络的示例在图4A和图4B示出。等效阻力回路如图5所示。

网状网络由两种类型的阻力件组成，包括与主流路平行排列的阻力，即RA和RT，以及与主流路径垂直排列的阻力，即RB。可以通过在阵列的每个分支点处设置连续性方程来解决流量分布。从那里开始，我们在每个阵列周期内应用与流动方向垂直的周期性边界条件和平行于流动方向的恒定压降ΔP。因此，该方程组简化为求解最小单位细胞中四个节点处的压力，它们由下式给出：

其中Pi，j，Pi，j+1，Pi+1，j和Pi+1，j+1是单位细胞中的四个唯一节点。通过将“2”的所有实例替换为“1”，并将j分配给0，将j+1分配给1，可以类似地对无限梯形网络进行建模。

每个节点的压力可以通过将方程式(3)取反来解决，以在任意点的压力产生通用解，在这种情况下选择为Pi，j：

然后，我们可以确定沿着两个横向路径QB的流量相对于通过捕获阱QT的流量的比率，其比率为：

因为溶液符号的变化是RA和RT相对幅度的函数，所以该结果表明存在两种流体流动状态。当RT>RA，这是先前研究的捕获阱设计的典型方案时，当RT几乎等于RA时，流量比为正，并且接近奇异性。这种奇异性定义了一个临界点，在该临界点处，流经横向分支RB的流量为零，并且所有流量仅沿RA和RT路径(实际上是直线)移动。考虑这种现象的另一种方法是，当RA和RT具有相等的阻力时，相邻节点Pi，j和Pi+1，j的压力相等，从而导致横向分支中的流量为零。

当RT<RA时，会发生另一种流动状态，这以前未曾报道过，这导致了方程式(5)中的比率变得负。该符号反转指示通过横向分支QB的流量实际上分配方向错误。因此，在这种流动状态下，所有的流体分支都汇合在一起流过捕获阱，这在理论上应导致近乎完美的捕获效率。

示例2-当细胞被引入到包括多个捕获部件的网状流体网络中时，填充过程的模拟在微流控网状网络中捕获的细胞分布可以建模为条件概率树，该条件概率树描述了m个捕获阱中n个细胞的捕获，并具有以下附加约束：

1)每个捕获阱只能容纳一个细胞

2)每个细胞都永久捕获在该捕获阱中

3)细胞从入口到出口的方向移动(即，增加行数)

我们假设每次尝试都有一个成功率q＝[0，1]，它描述了一个空的捕获阱捕获一个细胞的概率，而一个空的捕获阱捕获了第二个细胞的概率为零(在至少出于此一阶模型的目的)。假定捕获阱阵列中的每一行都有N个行排列的M个捕获阱，捕获阱阵列的尺寸为W*M。最后，我们假设第1行中捕获细胞的概率与该行占据的概率关联，Ci＝[0，1]，其中Ci＝1表示完全饱和的行，Ci＝0表示为空的行。为了便于表示，我们还将使用表示法：

现在假设Pi是第1行捕获一个细胞的概率，而由于该细胞未首先被前i行捕获概率，第(i+1)行捕获该细胞的概率被降低了，即1-∑Pi。然后可以将每一行的捕获概率建模为：

可以通过近似速率方程来求解阵列中的填充过程。例如，假设在离散时间间隔内以恒定速率γ将n个细胞投入到阵列中，使得在短时间间隔Δt内，添加到阵列中的细胞数量为n＝γΔt。此过程引起第一行的一阶速率方程由下式给出：

其中，M是每行中捕获阱的数量。其他行的浓度Ci变化(i>1)类似地由下式给出：

基于上面得出的捕获概率。可以使用有限差分技术对这些速率方程进行数值求解，以及积分如下：

或

迭代地求解该方程组，首先在t＝1的时间步长找到解，然后更新阵列所有行中的浓度。然后迭代确定时间步长t＝2处每个位置的浓度。时间步长应保持足够小以避免数值伪影。

实施例3-定量化细胞捕获效率与阻力比

通过设计和制造具有在0.25>RA/RT>1.5范围内的不同阻力比的各种微流控阱结构来测试这些预测。

微流控装置的制造：使用深反应离子蚀刻(DRIE)在6英寸的晶片上制造微流控芯片以形成通道壁。将光刻胶(Shipley 1813)以500rpm的速度旋转5秒，以4000rpm的速度旋转60秒，于115℃烘烤60s，在Karl Suss MA6掩模对准器中暴露于80-100mJ/cm2，然后在Microposit MF319显影剂中显影30s。然后彻底清洗晶片并将其在DRIE(SPTS PegasusDeep Silicon Etcher，深硅蚀刻装置)中蚀刻至15-20μm的深度，然后剥离光刻胶掩模并在食人鱼溶液(200℃下，硫酸与过氧化氢的比3：1)中清洗。随后，将层厚10μm的AZ9260光刻胶以500rpm的速度执行5秒和以1800rpm的速度执行60秒纺在晶片背面上，在110℃烘烤60秒，暴露于4000mJ/cm2，并在AZ400K 1：4显影剂中显影300秒。这一层是用来创建通过硅过孔建立的入口和出口并切成小片，然后剥去光刻胶并如前所述彻底清洁。最后，我们在300℃下阳极氧化硼硅酸盐玻璃到硅微通道3小时。总共每个晶片产生了36个尺寸为30mm*25mm的器件(芯片)。

微流控装置：定制的芯片座以铝(Protolabs，MN)加工，并包括底部座和顶部观察窗。底部有1/4寸-28mm螺纹孔，可通过旋入式鲁尔锁(以色列森林湖Lake Forest的Idex)与芯片连接。芯片座也经过阳极氧化处理(Surtronics，北卡罗来纳州罗利)，使得可以将它们长期放置在细胞培养箱中，并将芯片座固定在3D打印平台适配器上，该适配器安装在固定到莱卡DMI 6000-B倒置荧光显微镜内的电机控制X-Y平台(ASI Instruments，俄勒冈州尤金)中，莱卡DMI 6000-B倒置荧光显微镜包括一个自动聚焦驱动器，物镜转换器和滤光片转换器，通过安装在出口处的Elvesys MK3压力控制器(法国巴黎)将流体引入芯片，并通过真空控制来驱动。

高通量显微镜：我们已经开发了自定义的Micro-Manager(开放源代码显微镜软件)代码，以快速拍摄微流控装置中每个腔室的图像。该算法首先识别阵列中的3个角以建立平面方程，然后创建一个载物台位置列表，其中包含每个腔室的X-Y位置和最佳焦平面，然后使用Retiga 2000-R摄像头拍摄每个腔室的图像，最后以自定义格式保存和命名图像，以使其与基于机器学习的图像处理算法兼容。

结果：在我们的实验中，我们引入了足够数量的细胞，使得阵列将保持部分填充状态，从而能够分析填充率与行数的关系。每个捕获阱的占用情况均通过定制的计算机视觉软件进行识别。然后将实验数据拟合为方程式(9)，其具有两个拟合参数，即捕获效率q和引入的细胞总数。对于每种微流控装置设计，来自一个试验的结果被绘制在图16A-图16D中，其是四个阻力率不断增加的不同芯片的捕获效率与行数的关系，以及最适合方程式(9)的覆盖子图。q的最佳拟合值记录在图17A-图17D的每个图中，提供了用于每种设计的捕获分布的相应热图的图。对于低阻力比的RA/RT＝0.25或0.42，捕获效率分别确定为6％和16％。另一方面，当阻力比超过1时，捕获效率急剧增大，在这些实验中高达70％。

实施例4-微流控捕获阱阵列中的长期细胞培养

接下来，我们证明了以足够大的规模生长单个菌落以鉴定稀有细胞表型的能力。将细胞引入阵列并通过柔和的捕获阱和转移技术转移到内部腔室，该技术类似于先前报道的方法(Dura等人(2014))的“基于可变形性的微流控细胞配对和融合”，实验室芯片Lab.Chip14：2783)。具体来说，我们首先在捕获阱的入口处捕获了细胞，然后以短暂的压力爆发将细胞转移到腔室中，导致细胞通过狭窄的收缩区挤压并进入内部腔室。收缩区的宽度在3-6微米的范围内调整，具体取决于装置旨在捕获的细胞类型。一般而言，我们发现捕获区域的宽度与细胞的直径之比为1：3是理想的，并且可以可靠地捕获细胞，并且不会在低压(～20mbar)下挤压细胞，但在较高的压力(-300mbar)下迅速转移到内部腔室。通过调节出口处的负压来实现流量控制，从而可以将细胞直接吸到入口储液器中，而死体积损失最小。此外，这种方法使我们能够在阵列完全装满后从入口储液器中冲洗细胞。填充阵列所需的时间取决于细胞浓度和芯片中的行数。但是大多数设计都有-50行，并且使用106个细胞/mL的细胞浓度，使我们能够在5分钟内完全填充阵列。

排列好细胞后，我们使用用Micro-Manager编写的自动成像算法对阵列中每个腔室进行高分辨率的明场成像。此后，将芯片与显微镜和流量控制装置断开连接，并转移到标准细胞培养箱中，在那里将细胞维持7天或更长时间。在培养箱内时，通过重力驱动的流动或在培养箱内装有压力控制器的情况下，芯片中会不断地灌注流体。在重力流的情况下，我们将入口连接到装有培养基的5mL注射器上，而出口则连接到未填充的注射器上，我们通过芯片始终达到每天0.25-0.50mL的流率，这是由～5mbar由压头产生。在其他实验中，我们使用压力控制器来刷新细胞培养基，这使我们能够每10分钟定期冲洗一次芯片。

每天将细胞成像两次，并在每个成像周期后立即返回培养箱，每个芯片大约需要5-10分钟。7天后，使用预先训练的Mask_RCNN图像分割模型，通过使用Python编写的定制计算机视觉软件分析成像数据集。我们开发了基于Tensorflow(机器学习)的图像分割算法，可自动从较大图像中对齐并裁剪各个腔室，然后确定每个腔室的特定行和列的地址，在每个时间点挑选腔室中的每个细胞，然后绘制每个菌落的细胞数。

在对照载体中的4天中，来自K562单细胞克隆的增殖时间推移图像如图18所示，红点表示使用计算机视觉算法识别的细胞。平均倍增时间为13.5小时，比整个人口的平均-20小时倍增时间快。几个较快生长的克隆的生长速率数据显示在图19中。

通过这种方法，我们能够自动输出每个菌落的生长速度分布，并以热图或生长直方图的形式绘制它们。作为一个证明，我们进行了一项实验，其中K562细胞在不同浓度的伊马替尼[0.1μM，0.3μM，0.5μM]或对照存在下生长。图20中绘制了生长速率分布，显示了随着药物浓度的增加，增长率下降的预期趋势。对于每个分布，可以从这些数据集中清楚地选择异常的耐药细胞。

图21示出了在相邻腔室内生长的四个菌落的一系列时间流逝图像。

图22A和图22B显示了在Quizardinib(一种小分子酪氨酸激酶受体抑制剂，目前正在开发用于治疗急性髓系白血病)(图22A)或对照培养基(图22B)存在下生长的MOLM13细胞的图像。观察到单个克隆在药物存在下生长。

示例5-其他示例

图23A和图23B示出了使用通过机器学习算法进行的图像分割来识别单细胞以及微流控芯片上的标识符和标记物的用途。图23A：明场成像。图23B：将计算机生成的彩色图像叠加在明场成像上，并显示芯片上标记的标识，以及使用基于机器学习的分析对细胞进行分类的，各个细胞的边界，预测检测到的物体是否为细胞的置信度质量得分的不同实例。

图24示出了捕获在微流控腔室内的单细胞的阵列图像，然后将空气吹过流体通道以密封腔室。

图25示出了荧光和明场成像的叠加，其示出了荧光标记的靶探针与在微流控芯片内构图的寡核苷酸捕获探针的杂交。

图26A至图26C示出了用于形成单细胞阵列的过程。通过将细胞与可固化的水凝胶一起流入阵列中来形成单细胞阵列(图26A)，此后可以将盖子剥离(图26B)以提供进入样品的通道(图26C)。

图27A和图27B提供了包括多个捕获部件的微流控装置的非限制性示例，该捕获部件用于捕获悬浮在流体中的单细胞或其他物体。图27A：微流控装置的照片，其包括100×100的捕获部件和微流控腔室的阵列。图27B：本公开的微流控装置内的捕获部件和流体腔室的显微照片。

图28A-图28D提供了通过在原理证明工作中使用的用于低效率捕获装置的捕获阱的流动曲线的示例，以及用于单细胞捕获效率的数据。图28A：计算出的通过装置的单个阱的流体流速。图28B：显示该装置单个阱的显微照片。图28C：示出了装置内10000个隔室的单细胞捕获效率的热图。图28D：显示了其中捕获了0、1、2或3个或更多个细胞的微流控腔室的分布饼图。

图29示出了细胞阵列的缝合荧光图像(细胞用FITC细胞追踪染料标记)。插图：示出被捕获在装置中的各个细胞的荧光和明场成像的放大叠加图。

图30A至图30C示出了图像的非限制性示例，该图像示出了将化学物质打印至阵列中特定细胞的能力，这是通过微流控装置的开放式架构而实现的。图30A：使用荧光标记在单细胞阵列中打印的两个并排图案。图30B：使用荧光标记印到细胞阵列内特定细胞的图案。图30C：使用荧光标记印到细胞阵列内特定细胞的图案。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施例仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本发明时，可以以任何组合采用本文所述的本发明实施例的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，以及由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (55)

1.一种微流控装置，包括：

a）设置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与之流体连通的多个堰阱，其中每个堰阱被构造为保持悬浮在通过所述微流控装置的流体中的物体，其中：

i）每个堰阱在至少一个维度上包括收缩区，该收缩区小于所述物体最小尺寸约三分之一；以及

ii）绕过堰阱的流体流路的流体阻力与穿过堰阱的流体流路的流体阻力之比至少为0.4。

2.根据权利要求1所述的微流控装置，其中，所述流体阻力之比至少为0.75。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的微流控装置，其中，所述流体阻力之比至少为1.0。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的微流控装置，其中，所述流体阻力之比至少为1.25。

5.一种微流控装置，包括：

a）设置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与之流体连通的多个堰阱，其中每个堰阱被构造成保持悬浮在通过所述微流控装置的流体中的物体，其中：

i）每个堰阱包括入口区域，内部区域和出口区域，它们共同构成穿过所述堰阱的内部流体流路，该内部流体流路具有流体阻力R_T；

ii）多数堰阱中的每个堰阱与一个具有流体阻力R_A的长旁路流体通道和一个或两个短旁路流体通道流体连通，每个短旁路流体通道的流体阻力小于R_A，其中每个旁路流体流动通道将堰阱的出口区域连接到另一个堰阱的入口区域；以及

iii）R_A / R_T之比至少为1.0。

6.一种微流控装置，包括：

a）设置在至少一个流体入口和至少一个流体出口之间并与之流体连通的多个堰阱，其中每个堰阱被构造为保持悬浮在通过所述微流控装置的流体中的物体，其中：

i）每个堰阱包括入口区域，内部区域和出口区域，它们共同构成穿过所述堰阱的内部流体流路，该内部流体流路具有流体阻力R_T；

ii）多数堰阱中的每个堰阱与一个具有流体阻力R_A的长旁路流体通道和一个或两个短旁路流体通道流体连通，每个短旁路流体通道的流体阻力小于R_A，其中每个旁路流体流动通道将堰阱的出口区域连接到另一个堰阱的入口区域；以及

iii）如果未占用堰阱，则流体沿第一方向流过相邻的短旁路通道；如果堰阱被物体占用，则流体沿第二方向流过。

7.根据权利要求5或6所述的微流控装置，其中，R_A / R_T之比至少为1.1。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的微流控装置，其中，R_A / R_T之比至少为1.2。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的微流控装置，其中，R_A / R_T之比至少为1.3。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的微流控装置，其中，R_A / R_T之比至少为1.4。

11.根据权利要求5至10中任一项所述的微流控装置，其中，R_A / R_T之比至少为1.45。

12.根据权利要求5至11中任一项所述的微流控装置，其中，每个堰阱包括至少一个收缩区，该收缩区的空间尺寸小于所述物体最小尺寸的约一半。

13.根据权利要求5至12中任一项所述的微流控装置，其中，每个堰阱包括至少一个收缩区，所述收缩区的空间尺寸小于所述悬浮物最小尺寸的约三分之一。

14.根据权利要求5至13中任一项所述的微流控装置，其中，每个堰阱包括至少一个收缩区，所述收缩区的空间尺寸在约1.5μm至约6μm的范围内。

15.根据权利要求5至14中任一项所述的微流控装置，其中，R_A / R_T之比至少为1.2，并且各个堰阱将悬浮物保持在第一接触上的捕获概率至少为0.36。

16.根据权利要求5至15中任一项所述的微流控装置，其中，R_A / R_T之比至少为1.45，并且各个堰阱将悬浮物保持在第一接触上的捕获概率至少为0.60。

17.根据权利要求5至16中任一项所述的微流控装置，其中，每个堰阱在所述出口区域内包括玻璃料结构，并且其中，所述玻璃料结构包括一个或多个收缩区，该收缩区的空间尺寸小于所述悬浮物的最小尺寸。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的微流控装置，其中，所述多个堰阱包括至少100个堰阱。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的微流控装置，其中，所述多个堰阱包括至少1000个堰阱。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的微流控装置，其中，所述多个堰阱包括至少10000个堰阱。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的微流控装置，其中，所述多个堰阱包括至少100000个堰阱。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的微流控装置，其中，用于捕获所述悬浮物的预饱和捕获效率至少为20％。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的微流控装置，其中，用于捕获所述悬浮物的预饱和捕获效率至少为50％。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的微流控装置，其中，用于捕获所述悬浮物的预饱和捕获效率至少为80％。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的微流控装置，其中，用于捕获所述悬浮物的预饱和捕获效率至少为90％。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的微流控装置，其中，用于捕获所述悬浮物的预饱和捕获效率至少为95％。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的微流控装置，还包括：b）可移除的盖子。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的微流控装置，其中一个或多个堰阱的内部区域包括唯一的分子识别符，当在堰阱的所述内部区域内的细胞裂解时，所述唯一的分子识别符可以与细胞的分子组分结合或杂交。

29.一种用于捕获悬浮在流体中的物体的方法，该方法包括：

a）提供权利要求1至27中任一项所述的微流控装置；以及

b）使包含所述物体的流体流过所述微流控装置，以将物体捕获在多个堰阱中的一个或多个中。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，每个堰阱在出口区域内包括玻璃料结构，并且其中，所述玻璃料结构包括一个或多个收缩区，该收缩区的空间尺寸小于所述物体的最小尺寸。

31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中，在第一流体动力压力下执行流入步骤（b），从而将物体捕获在一个或多个堰阱入口区域的收缩区中。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述物体包括可变形物体，并且其中，所述方法还包括：使被捕获在一个或多个堰阱入口区域中的收缩区中的物体经受第二流体动力压力，第二流体动力压力高于第一流体动力压力，从而迫使可变形物体穿过入口区域中的收缩区并进入一个或多个堰阱的内部区域。

33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中，所述第一流体动力压力在大约1至大约100mbar的范围内。

34.根据权利要求32或33所述的方法，其中，所述第二流体动力压力在大约100mbar到大约1000mbar的范围内。

35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中，所述第二流体动力压力与所述第一流体动力压力之比在大约10倍到大约20倍的范围内。

36.根据权利要求29至35中任一项所述的方法，其中所述物体是细胞或小球。

37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中，在（b）中的流动至少重复一次，从而允许将至少两个物体限制在一个或多个堰阱的内部区域内。

38.根据权利要求37所述的方法，其中，使用流体将（b）中的流动至少重复一次，该流体包括与第一实例中使用的相同物体。

39.根据权利要求37所述的方法，其中，使用流体将（b）中的流动至少重复一次，该流体包括与第一实例中使用的不同物体。

40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中，被限制在一个或多个堰阱内部区域内的所述至少两个物体包括至少两个相同细胞，至少两个不同细胞，至少两个相同的小球，至少两个不同的小球或至少一个细胞和一个小球。

41.根据权利要求29至40中任一项所述的方法，还包括通过使不混溶的流体流过所述微流控装置来密封所述多个堰阱。

42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述不混溶的流体是油或空气。

43.根据权利要求32至42中任一项所述的方法，其中，所述物体是细胞，并且其中，将所述细胞在所述一个或多个堰阱的内部区域中培养一天或多天的时间。

44.根据权利要求43所述的方法，其中将所述细胞在所述一个或多个堰阱的内部区域中培养一个或多个星期的时间。

45.根据权利要求43所述的方法，其中将所述细胞在所述一个或多个堰阱的内部区域中培养一个月或多个月的时间。

46.根据权利要求32至45中任一项所述的方法，其中，所述物体是细胞，并且其中，所述方法还包括使用成像技术对所述一个或多个堰阱的内部区域内的细胞进行表型化。

47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述成像技术选自明场成像、荧光成像、双光子荧光成像或其任意组合。

48.根据权利要求32至47中任一项所述的方法，其中，所述多个堰阱的内部区域各自包括唯一的分子识别符，当堰阱的所述内部区域内的细胞裂解时，所述唯一的分子识别符可以与细胞的分子成分结合或杂交。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述分子成分包括蛋白质、肽、DNA分子、RNA分子、mRNA分子或其任何组合。

50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述唯一的分子标识符用于执行DNA测序、基因表达分析或染色质分析。

51.根据权利要求50所述的方法，其中使用外部施加的电场来促进核酸分子成分与所述唯一的分子标识符的杂交。

52.根据权利要求32至51中任一项所述的方法，其中微流控装置还包括可移动的盖子。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述可变形物体是细胞，并且其中在将细胞捕获在一个或多个堰阱的内部区域中之后，将生物相容性水凝胶注入所述微流控装置中，以允许聚合。

54.根据权利要求53所述的方法，其中在所述水凝胶聚合之后，将所述微流控装置的盖子移除以允许获得所捕获的细胞。

55.根据权利要求53至54中任一项所述的方法，其中所述生物相容性水凝胶用于在细胞裂解时限制所捕获细胞的基因组材料。

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