CN107407691B - 用于单细胞中核酸靶标的分子条码化的装置和系统 - Google Patents

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Abstract

在此披露了包括如下项的装置和系统：a)基底，所述基底包括至少100个微孔和多个珠，其中多个所述至少100个微孔各自含有单一珠，并且其中所述微孔的平均直径与所述珠的直径的比率在约1.2至约1.8的范围内；b)与所述基底流体连通的流动池；以及c)至少一个入口和至少一个出口，其中所述至少一个入口和至少一个出口能够引导流体流通过所述流动池，从而使所述微孔与所述流体接触。

Description

用于单细胞中核酸靶标的分子条码化的装置和系统
交叉引用
本申请要求2015年1月22日提交的美国临时申请号62/106680和2015年2月26日提交的美国临时申请号62/121361以及2015年9月11日提交的美国临时申请号62/217274的权益，将全部这些申请都通过引用结合在此。
联邦资助研究的声明
本发明是在美国政府的支持下，在美国国立卫生研究院授权号1R44HG008323-01下完成的。
背景技术
在单独的细胞中检测和定量特异性核酸和蛋白质分子的能力对于了解细胞多样性在发育、健康和疾病中的作用至关重要。流式细胞术已成为单细胞上蛋白质标志物的高通量检测的标准技术，并且已广泛应用于基础研究和临床诊断。相比之下，核酸测量(如mRNA表达)典型地在整体样品上进行，模糊了来自单独的细胞的贡献。为了表征细胞系统的复杂性，高度希望的是开发用于监测数千个细胞中大量基因的表达的方法、装置和系统。
发明内容
在此披露了用于确定样品中靶分子数目的装置、系统和试剂盒。在一些实施例中，本披露的装置包括：a)基底，所述基底包括：i)至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积，和ii)多个珠，其中多个所述至少100个微孔各自含有单一珠，并且其中所述微孔的平均直径与所述珠的直径的比率在约1.2至约1.8的范围内；以及b)与所述基底流体连通的流动池。
在一些实施例中，本披露的装置包括：a)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积，并且其中所述至少100个微孔的表面涂覆有表面涂层以改善润湿性；以及b)与所述基底流体连通的流动池。
在一些实施例中，本披露的装置包括：a)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积，所述基底平面中的非圆形横截面和范围从约0.1至2的平均直径与深度的纵横比；以及b)与所述基底流体连通的流动池。
在一些实施例中，本披露的装置包括：a)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积和范围从约1度至约15度的正拔模角度；以及b)与所述基底流体连通的流动池。
在一些实施例中，本披露的装置包括：a)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积，并且其中所述基底进一步包括围绕每个微孔或跨过所述至少100个微孔的每个微孔之间的表面的表面特征；以及b)与所述基底流体连通的流动池。
在一些实施例中，本披露的装置包括：a)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积；b)与所述基底流体连通的流动池；以及c)至少一个入口和至少一个出口，其中所述至少一个入口和所述至少一个出口经由流体通道与所述流动池流体连通，所述流体通道具有相对于所述基底平面形成一定角度的轴线，并且其中所述至少一个入口和至少一个出口能够引导流体流通过所述流动池，从而使所述微孔与所述流体接触。
在一些实施例中，所述装置进一步包括至少一个入口和至少一个出口，其中所述至少一个入口和至少一个出口能够引导流体流通过所述流动池，从而使所述微孔与所述流体接触。在一些实施例中，微孔体积的变异系数小于5％。在一些实施例中，所述基底包括1,000至5,000,000个微孔。在一些实施例中，所述基底包括10,000至200,000个微孔。在一些实施例中，每个微孔具有范围从约21,000μm3至约170,000μm3的体积。在一些实施例中，每个微孔具有约144,000μm3的体积。在一些实施例中，所述微孔在所述基底平面中具有非圆形横截面。在一些实施例中，所述至少100个微孔的平均直径与深度的纵横比在约0.1至2的范围内。在一些实施例中，所述至少100个微孔的平均直径与深度的纵横比是约0.9。在一些实施例中，选择所述至少100个微孔的尺寸，使得每个微孔可以含有至多一个珠。在一些实施例中，所述微孔的平均直径与所述珠的直径的比率是约1.5。在一些实施例中，所述微孔的侧壁具有约1至15度的正拔模角度。在一些实施例中，所述微孔的侧壁具有约3至7度的正拔模角度。在一些实施例中，所述基底进一步包括围绕每个微孔或跨过所述至少100个微孔的微孔之间的表面的表面特征。在一些实施例中，所述基底进一步包括围绕每个微孔或跨过所述至少100个微孔的微孔之间的表面的表面特征，其中所述表面特征选自下组，该组由以下各项组成：圆形的、半球形的、脊形的和尖形的表面特征，或其任何组合。在一些实施例中，含有单一珠的所述至少100个微孔的百分比是至少约10％。在一些实施例中，含有单一珠的所述至少100个微孔的百分比是至少约50％。在一些实施例中，含有单细胞的所述至少100个微孔的百分比是在约0.01％和约15％之间。在一些实施例中，含有单细胞的所述至少100个微孔的百分比是在约1％和约11％之间。在一些实施例中，所述至少100个微孔的表面涂覆有聚乙二醇(PEG)、聚Hema、普朗尼克酸F68、普朗尼克酸F108、聚山梨醇酯20、二氧化硅(SiO2)或其任何组合。在一些实施例中，所述至少100个微孔的表面包括经等离子体处理的表面。在一些实施例中，所述至少一个入口和所述至少一个出口经由流体通道与所述流动池流体连通，所述流体通道具有相对于所述基底平面形成一定角度的轴线。在一些实施例中，所述至少一个入口和所述至少一个出口经由流体通道与所述流动池流体连通，所述流体通道具有相对于所述基底平面形成一定角度的轴线，并且其中与所述入口和所述出口流体连通的流体通道的角度是相同的。在一些实施例中，所述至少一个入口和所述至少一个出口经由流体通道与所述流动池流体连通，所述流体通道具有相对于所述基底平面形成一定角度的轴线，并且其中与所述入口和所述出口流体连通的流体通道的角度是不同的。在一些实施例中，所述流体通道的轴线和所述基底平面之间的角度在约15度和约75度之间。在一些实施例中，所述流体通道的轴线和所述基底平面之间的角度中的至少一个是约45度。在一些实施例中，所述基底由选自下组的材料制成，该组由以下各项组成：硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物、金属、弹性体、聚二甲基硅氧烷、琼脂糖和水凝胶或其任何组合。在一些实施例中，所述流动池包括所述基底。在一些实施例中，所述流动池可以与所述基底脱离。在一些实施例中，所述流动池由选自下组的材料制成，该组由以下各项组成：硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、环氧树脂、以及金属，或这些材料的任何组合。在一些实施例中，所述基底或流动池进一步包括用于所述至少100个微孔的光学成像的透明窗。在一些实施例中，所述装置进一步包括一个或多个样品储器、试剂储器、废物储器或其任何组合。在一些实施例中，一个或多个试剂储器预加载有珠悬浮液或测定试剂。在一些实施例中，所述装置进一步包括用于加载或从所述装置去除样品、测定试剂、珠悬浮液或废物的移液管尖端接口。在一些实施例中，所述移液管尖端接口包括圆锥形特征，所述圆锥形特征与移液管尖端配合以形成与所述入口或出口的流体连接。在一些实施例中，所述圆锥形特征由顺应材料构成，所述顺应材料与所述移液管尖端形成基本上防漏的密封。在一些实施例中，所述顺应材料是聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚氨酯或其任何组合。在一些实施例中，所述装置进一步包括防止流体在所述装置内流动的阀，除非移液管尖端插入到所述移液管尖端接口的圆锥形特征中。在一些实施例中，含在所述至少100个微孔内的多个珠的每个单一珠包括能够以随机方式附接至靶核酸分子的多个拴系随机标记。在一些实施例中，所述多个拴系随机标记中的每个随机标记包括对于附接至所述珠的所有随机标记来说相同但对于附接至不同珠的随机标记来说不同的细胞标记。在一些实施例中，附接至单一珠的所述多个拴系随机标记进一步包括一组不同的分子标记。在一些实施例中，所述多个拴系随机标记中的每个随机标记进一步包括靶核酸分子结合区。在一些实施例中，所述多个拴系随机标记中的每个随机标记进一步包括通用引物序列。在一些实施例中，拴系于珠的所述多个随机标记的靶核酸分子结合区包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：基因特异性序列、寡聚-dT序列和随机多聚体或其任何组合。在一些实施例中，所述装置构成被配置为在多个单细胞上进行自动化随机标记测定的仪器系统的可消耗部件。
在此还披露了包括如下项的系统：a)装置，所述装置包括：i)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积，并且其中所述基底进一步包括围绕每个微孔或跨过所述至少100个微孔的微孔之间的表面的表面特征；ii)与所述基底流体连通的流动池；以及iii)至少一个入口和至少一个出口，其中所述至少一个入口和至少一个出口能够引导流体流通过所述流动池，从而使所述微孔与所述流体接触；和b)流量控制器；其中所述流量控制器被配置为控制流体的递送。
在一些实施例中，本披露的系统包括：a)装置，所述装置包括：i)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积，所述基底平面中的非圆形横截面和范围从约0.1至2的平均直径与深度的纵横比；ii)与所述基底流体连通的流动池；以及iii)至少一个入口和至少一个出口，其中所述至少一个入口和至少一个出口能够引导流体流通过所述流动池，从而使所述微孔与所述流体接触；和b)流量控制器；其中所述流量控制器被配置为控制流体的递送。
在一些实施例中，所述系统进一步包括流体，其中所述流体包括细胞样品、珠悬浮液、测定试剂或其任何组合。在一些实施例中，所述装置是所述系统的可移除的、可消耗的部件。在一些实施例中，由用户将细胞样品和珠悬浮液直接分配或注入所述装置。在一些实施例中，将除了细胞样品的珠和测定试剂预加载进所述装置。在一些实施例中，所述流量控制器被配置为伴随空气注入将流体注入散布到所述流动池中。在一些实施例中，所述系统进一步包括用于增强细胞和珠跨所述至少100个微孔的均匀分配的分配机构，其中所述分配机构进行选自下组的动作，该组由以下各项组成：振动、振荡、漩涡、再循环流、低频搅拌和高频搅拌或其任何组合。在一些实施例中，所述系统进一步包括细胞裂解机构，所述机构使用高频压电换能器，用于超声处理细胞。在一些实施例中，所述系统进一步包括温度控制器，用于维持用户指定温度，或用于经两个或更多个指定时间间隔，在两个或更多个指定温度之间升降温度。在一些实施例中，所述系统进一步包括磁场控制器，用于产生在从所述至少100个微孔洗脱珠中使用的磁场梯度或用于将珠输送通过所述装置。在一些实施例中，所述系统进一步包括被配置为捕获和处理所述至少100个微孔的全部或部分的图像的成像系统，其中所述成像系统进一步包括照明子系统、成像子系统和处理器。在一些实施例中，所述成像系统被配置为进行明场、暗场、荧光或定量相位成像。在一些实施例中，所述成像系统被配置为提供实时图像分析能力，并且其中使用实时图像分析来控制分配机构，以增强细胞或珠跨所述至少100个微孔的均匀分配，使得实现了预定的细胞或珠分配。在一些实施例中，细胞和珠的预定分配是其中至少10％的微孔同时含有单细胞和单一珠的分配。在一些实施例中，细胞和珠的预定分配是其中至少25％的微孔同时含有单细胞和单一珠的分配。在一些实施例中，所述系统进一步包括选择机构，其中使用从经处理的图像导出的信息来鉴定展现一个或多个指定特征的细胞亚群，并且所述选择机构被配置为在后续数据分析中包括或排除所述细胞亚群。在一些实施例中，所述选择机构包括从所述至少100个微孔中物理去除与所鉴定的细胞亚群的细胞共定位的珠。在一些实施例中，所述选择机构包括在所述至少100个微孔中物理截留与所鉴定的细胞亚群的细胞共定位的珠。在一些实施例中，所述选择机构包括使用双重编码的珠，其中每个单独的珠是光学编码的和由附接的寡核苷酸细胞标记编码的，并且附接至与所鉴定的细胞亚群的细胞共定位的珠上的细胞标记的测序产生进一步分析待包括或排除的序列数据的列表。在一些实施例中，所述流量控制器被配置为在第一时间将第一测试化合物递送到所述至少100个微孔，并且在第二时间将细胞裂解试剂递送至所述至少100个微孔。在一些实施例中，所述第一时间和所述第二时间是相同的。在一些实施例中，所述一个或多个指定特征选自下组，该组由以下各项组成：细胞大小、细胞形状、活细胞、死细胞、指定范围的细胞内pH、指定范围的膜电位、指定水平的细胞内钙、一种或多种指定细胞表面标志物的存在、以及一种或多种指定遗传标志物的表达。在一些实施例中，所述细胞样品包括患者样品，并且医疗保健提供者使用测定结果来诊断疾病或做出明智的医疗保健治疗决策。在一些实施例中，将所述系统中使用的流体的粘度调整为水的约1.2倍和10倍之间，以便降低物质在微孔之间的扩散速率。在一些实施例中，将用于将细胞或珠分配到所述装置的至少100个微孔中的流体的粘度调整为水的约1.2倍和10倍之间。在一些实施例中，将用于将细胞或珠分配到所述装置的至少100个微孔中的流体的密度调整为所述细胞或珠的约0.8倍和1.25倍之间。在一些实施例中，将用于从所述装置的至少100个微孔中收回珠的流体的粘度调整为水的约1.2倍和10倍之间。在一些实施例中，将用于从所述装置的至少100个微孔中收回珠的流体的密度调整为所述珠的约0.8倍和1.25倍之间。
在此披露了被编程为执行一个或多个以下序列数据分析步骤的存在于计算机可读媒质中的软件：a)解码或多路解编样品条码、细胞条码、分子条码和靶序列数据；b)细胞标记的自动聚簇，以补偿扩增或测序的误差，其中序列数据是针对随机标记的靶寡核苷酸分子的文库收集的；c)序列数据与已知参照序列的比对；d)确定读取数目/基因/细胞，和唯一性转录物分子数目/基因/细胞；e)统计分析，以预测用于确定转录物分子数目/基因/细胞的置信区间；以及f)统计分析，以根据基因表达数据来聚簇细胞，或鉴定罕见细胞子群。
在此披露了被编程为执行以下图像处理和仪器控制步骤的存在于计算机可读媒质中的软件：a)在多个微孔的一个或多个图像中检测微孔；b)在多个微孔的一个或多个图像中检测含有单细胞的微孔；c)在多个微孔的一个或多个图像中检测含有两个或更多个细胞的微孔，并确定每个检测到的微孔中的细胞数目；d)在多个微孔的一个或多个图像中检测含有单一珠的微孔；e)在多个微孔的一个或多个图像中检测含有两个或更多个珠的微孔，并确定每个检测到的微孔中的珠数目；f)在执行步骤(b)之后确定含有单细胞的微孔数目；g)在执行步骤(d)之后确定含有单一珠的微孔数目；以及h)在执行步骤(b)和(d)之后确定含有单细胞和单一珠的微孔数目，其中使用步骤(f)-(h)中确定的数目来控制被配置为跨多个微孔分配细胞和珠的设备。
在此披露了被编程为执行以下图像处理和仪器控制步骤的存在于计算机可读媒质中的软件：a)在多个微孔的一个或多个图像中检测展现一个或多个指定特征的细胞亚群，其中一部分微孔含有细胞；b)确定含有所述细胞亚群的微孔的位置；以及c)使用步骤(b)中确定的位置来控制被配置为从后续序列数据分析中排除所述细胞亚群的选择设备。
在一些实施例中，步骤c)的选择设备被配置为在后续序列数据分析中仅包括所述细胞亚群。在一些实施例中，多个微孔的一个或多个图像是选自下组的图像，该组由以下各项组成：明场图像、暗场图像、荧光图像、发光图像和磷光图像。在一些实施例中，所述软件进一步包括使用选自下组的一种或多种算法，该组由以下各项组成：侃尼(Canny)边缘检测方法、侃尼-戴里什(Canny-Deriche)边缘检测方法、索贝尔(Sobel)算子方法、一阶梯度检测方法、二阶微分边缘检测方法、相位相干边缘检测方法、强度阈值分割法、强度聚簇方法、基于强度直方图的方法、广义霍夫变换、圆形霍夫变换、傅里叶变换、快速傅立叶变换、小波分析和自相关分析。在一些实施例中，所述一个或多个指定特征选自下组，该组由以下各项组成：细胞大小、细胞形状、活细胞、死细胞、指定范围的细胞内pH、指定范围的膜电位、指定水平的细胞内钙、一种或多种指定细胞表面标志物的存在、以及一种或多种指定遗传标志物的表达。
在此披露了包括如下项的试剂盒：a)装置，所述装置包括：i)基底，其中所述基底进一步包括：1)至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积；和2)多个珠，其中多个所述至少100个微孔各自含有单一珠，并且其中所述微孔的平均直径与所述珠的直径的比率在约1.2至约1.8的范围内；以及ii)与所述基底流体连通的流动池。
在此披露了包括如下项的试剂盒：a)装置，所述装置包括：i)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积，并且其中所述至少100个微孔的表面涂覆有表面涂层以改善润湿性；以及ii)与所述基底流体连通的流动池。
在此披露了包括如下项的试剂盒：a)装置，所述装置包括：i)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积，所述基底平面中的非圆形横截面和约0.9的平均直径与深度的纵横比；以及ii)与所述基底流体连通的流动池。
在此披露了包括如下项的试剂盒：a)装置，所述装置包括：i)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积和约1度和15度之间的正拔模角度；以及ii)与所述基底流体连通的流动池。
在此披露了包括如下项的试剂盒：a)装置，所述装置包括：i)基底，所述基底包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从约1,000μm3至约786,000μm3的体积，并且其中所述基底进一步包括围绕每个微孔或跨过所述至少100个微孔的微孔之间的表面的表面特征；以及ii)与所述基底流体连通的流动池。
在一些实施例中，所述装置进一步包括至少一个入口和至少一个出口，其中所述至少一个入口和至少一个出口能够引导流体流通过所述流动池，从而使所述微孔与所述流体接触。在一些实施例中，多个所述至少100个微孔含有单一珠。在一些实施例中，含有单一珠的所述至少100个微孔的百分比是至少约10％。在一些实施例中，含有单一珠的所述至少100个微孔的百分比是至少约50％。在一些实施例中，含有单一珠的所述至少100个微孔的百分比是至少约80％。在一些实施例中，含在微孔中的多个珠中的每个单一珠包括能够以随机方式附接至靶核酸分子的多个拴系随机标记。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括用于进行逆转录反应的试剂。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括用于进行核酸扩增反应的试剂。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括用于进行一个或多个靶特异性核酸扩增反应的试剂。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括细胞裂解缓冲液或杂交缓冲液。在一些实施例中，所述至少100个微孔的表面涂覆有聚乙二醇(PEG)、聚Hema、普朗尼克酸F68、普朗尼克酸F108、聚山梨醇酯20、二氧化硅(SiO2)或其任何组合。在一些实施例中，所述至少100个微孔的表面包括经等离子体处理的表面。在一些实施例中，所述基底进一步包括围绕每个微孔或跨过所述至少100个微孔的每个微孔之间的表面的表面特征。在一些实施例中，所述表面特征选自下组，该组由以下各项组成：圆形的、半球形的、脊形的和尖形的表面特征，或其任何组合。
在此披露了用于确定来自所选细胞子群的单细胞中靶核酸分子出现次数的方法，所述方法包括：a)在多个微孔中捕获单细胞和单一珠，其中单一珠包括多个拴系随机标记，并且其中所述多个拴系随机标记进一步包括：i)珠特异性细胞标记；ii)一组不同的分子标记；以及iii)能够与核酸分子杂交的多个靶结合区，其中附接至珠的靶结合区亚群对于定义所述子群的一组一个或多个核酸标志物是特异性的；b)使从单细胞释放的靶核酸分子和核酸标志物与以随机方式拴系于单一珠的所述多个靶结合区杂交；c)进行延伸反应以产生：i)多个分子缀合物，各自包括随机标记和所述靶核酸分子的互补序列的一部分；和ii)多个分子缀合物，各自包括随机标记和核酸标志物的互补序列的一部分；d)扩增和测序所述分子缀合物；e)产生与定义所述子群的一个或多个核酸标志物的所述组相关联的细胞标记的列表；并且f)确定所述细胞子群的单细胞中所述靶分子的出现次数。
在一些实施例中，所述方法是多重的。在一些实施例中，使用与定义所述子群的一个或多个核酸标志物的所述组相关联的细胞标记的列表来从进一步的序列数据分析中排除来自所述细胞子群的数据。在一些实施例中，所述靶核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，所述靶核酸分子是mRNA分子。在一些实施例中，所述多个拴系随机标记进一步包括通用引物序列。在一些实施例中，拴系于珠的所述多个随机标记的所述多个靶结合区包括选自下组的序列的混合物，该组由以下各项组成：基因特异性序列、寡聚-dT序列和随机多聚体序列或其任何组合。
在此披露了用于将一个或多个细胞样品加载到如权利要求1至6中任一项所述的装置的微孔中的方法，所述方法包括：a)将空气注入与包括至少100个微孔的基底流体连通的流动池中；b)将细胞样品注入所述流动池中；并且c)将空气注入所述流动池中。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤c)之后将缓冲液或珠悬浮液注入所述流动池中。在一些实施例中，所述一个或多个细胞样品各自包括一个或多个单细胞。在一些实施例中，所述一个或多个细胞样品包括至少两种不同细胞类型的细胞。在一些实施例中，所述一个或多个细胞样品包括免疫细胞。在一些实施例中，所述珠悬浮液包括多个珠，并且每个单独的珠包括附接至珠的多个寡核苷酸。在一些实施例中，附接至每个单独的珠的所述多个寡核苷酸包括一组不同的分子标记。在一些实施例中，附接至每个单独的珠的所述多个寡核苷酸包括对于附接至所述单独的珠的所有寡核苷酸来说相同的细胞标记，并且其中附接至不同珠的所述多个寡核苷酸的细胞标记彼此不同。在一些实施例中，附接至每个单独的珠的所述多个寡核苷酸包括靶结合区。在一些实施例中，附接至每个单独的珠的所述多个寡核苷酸包括通用引物结合序列。在一些实施例中，所述注入步骤置换了所述流动池的内容物。在一些实施例中，与不注入空气的加载相比，所述一个或多个细胞样品和所述珠跨所述至少100个微孔至少10％更均匀地分散。在一些实施例中，与不注入空气的加载相比，所述一个或多个细胞样品和所述珠跨所述至少100个微孔至少30％更均匀地分散。在一些实施例中，与不注入空气的加载相比，所述一个或多个细胞样品和所述珠跨所述至少100个微孔至少60％更均匀地分散。在一些实施例中，注入空气的步骤不会去除所述至少100个微孔的内容物。在一些实施例中，注入空气的步骤包括以约0.08ml/秒至约1.8ml/秒之间的速率注入空气。在一些实施例中，注入空气的步骤包括以约0.01和约0.25atm之间的压力注入空气。在一些实施例中，注入空气的步骤包括产生用于所述液体流通过所述流动池的均匀环境。在一些实施例中，所述方法进一步包括调整用于所述细胞样品或珠悬浮液的缓冲液的粘度，以改善所述细胞或珠分配到所述微孔中的均匀性。在一些实施例中，将所述缓冲液的粘度调整为水的约1.2倍和水的约10倍之间。在一些实施例中，所述方法进一步包括调整用于所述一个或多个细胞样品或珠悬浮液的缓冲液的密度，以改善所述细胞或珠分配到所述微孔中的均匀性。在一些实施例中，将用于注入珠的缓冲液的密度调整为所述珠的密度的约0.8倍和约0.99倍之间。
在此披露了用于从微孔阵列的微孔中收回珠的方法，所述方法包括：a)用珠加载所述微孔阵列；b)将所述微孔阵列暴露于磁场；c)使缓冲液流过所述微孔阵列；并且d)使用磁场从所述微孔阵列收回所述珠。
在一些实施例中，所述加载包括加载所述珠，使得所述微孔阵列的至少90％的微孔含有单一珠。在一些实施例中，所述加载包括加载所述珠，使得所述微孔阵列的至少95％的微孔含有单一珠。在一些实施例中，所述加载包括加载所述珠，使得所述微孔阵列的约100％的微孔含有单一珠。在一些实施例中，所述加载跨所述微孔阵列基本上是均匀的。在一些实施例中，每个珠包括多个附接的寡核苷酸。在一些实施例中，针对给定珠的所述多个附接的寡核苷酸包括一组不同的分子标记。在一些实施例中，针对给定珠的所述多个附接的寡核苷酸包括对于附接至所述珠的所有寡核苷酸来说相同的细胞标记。在一些实施例中，针对不同珠的所述多个附接的寡核苷酸包括不同的细胞标记。在一些实施例中，针对每个珠的所述多个附接的寡核苷酸包括靶结合区。在一些实施例中，针对每个珠的所述多个附接的寡核苷酸包括通用引物结合序列。在一些实施例中，使用磁体产生所述磁场。在一些实施例中，所述暴露步骤包括以0.01毫米/秒和10毫米/秒之间的速率跨所述微孔阵列移动所述磁场。在一些实施例中，所述暴露步骤包括以约0.5毫米/秒的速率跨所述微孔阵列移动所述磁场。在一些实施例中，所述暴露步骤包括将所述微孔阵列暴露于具有相对于所述基底平面形成非垂直角的场线的磁场。在一些实施例中，所述场线相对于所述基底平面形成45度和80度之间的角度。在一些实施例中，所述暴露步骤包括将所述珠拉入所述微孔阵列的孔中。在一些实施例中，所述缓冲液包括裂解缓冲液。在一些实施例中，所述缓冲液包括洗涤缓冲液。在一些实施例中，所述流动步骤基本上未从所述微孔阵列的微孔中除去所述珠。在一些实施例中，所述流动步骤将珠移动到所述微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，所述收回步骤包括用磁体收回所述珠。在一些实施例中，所述收回步骤从所述微孔阵列中收回至少85％的珠。在一些实施例中，所述收回步骤从所述微孔阵列中收回至少95％的珠。在一些实施例中，所述方法进一步包括调整所述缓冲液的粘度以改善珠收回的效率。在一些实施例中，将所述缓冲液的粘度调整为水的约1.2倍和水的约10倍之间。在一些实施例中，所述方法进一步包括调整所述缓冲液的密度以改善珠收回的效率。在一些实施例中，将所述缓冲液的密度调整为所述珠的密度的约0.8倍和约0.99倍之间。
通过引用结合
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用结合在此，如同每一单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地指明通过引用以其整体结合在此。在本文的术语与结合的参考文献中的术语之间发生冲突的情况下，以本文的术语为准。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1说明了附接至所述珠上的寡核苷酸的结构，以及来自单细胞的靶寡核苷酸的随机标记和分子索引的测定工作流程。
图2A-B说明了细胞和珠加载到微孔阵列中。图2A显示了在用稀释的细胞悬浮液(上)加载后和用珠悬浮液(下)加载后的微孔阵列的显微照片。图2B显示了含有单细胞和单一珠的两个微孔的放大视图。
图3A-C说明了用于对数千个单细胞的RNA含量进行大规模并行随机条码化的披露的方法、装置和系统的一个实施例。图3A描绘了捕获在微孔中的单细胞以及包括拴系随机标记的文库的珠(每孔一个细胞和一个珠)。图3B描绘了人外周血单核细胞随机条码化数据的主成分分析。图3C描绘了罕见细胞群体的随机条码化数据的主成分分析。
图4A-C说明了针对在含有两种不同细胞类型的受控混合物中的单细胞的数据聚簇。图4A显示了通过针对12个基因表达数据的主成分分析的K562和拉莫斯(Ramos)细胞的混合物的数据聚簇。双标图显示了两个不同的簇，其中一个簇表达拉莫斯特异性基因(CD74、CD79a、IGJ、TCL1A、SEPT9、CD27)，并且另一个表达由第一主成分(水平)分离的K562特异性基因(CD41、GYPA、GATA1、GATA2、HBG1)。第二主成分(垂直)指示K562细胞内胎血红蛋白(HBG1)的变异性。图4B显示了使用具有111个基因的面板的在来自健康个体的原代B细胞的背景下含有小百分比的拉莫斯细胞的混合物的主成分分析。每个数据点的颜色指示在整个基因面板中检测到的唯一性转录物分子的总数。1,198个细胞中的一组18个细胞(画圈的)展示出不同的基因表达谱，转录水平要高得多。图4C是显示每个基因在图4B的样品的前100个细胞中的表达水平的热图，利用在基因面板中检测到的转录物分子的总数进行排名。前18个细胞(由水平红条指示)优先表达一组已知与滤泡性淋巴瘤相关的基因，如通过箭头所指示。
图5A-D说明了用于本披露的方法中的扩增和测序方案的一个实施例。图5A说明了与感兴趣的特定基因相关联的分子条码的多重PCR扩增。图5B说明了先前扩增产物的多重巢式PCR扩增，其将第二测序引物引入扩增的条码化分子中。图5C说明了用于添加全长测序适配子序列以及任选样品索引的第三PCR扩增反应。图5D说明了扩增的分子条码-基因序列缀合物的配对末端测序。
图6提供了含有单一珠和单细胞的微孔的示意图。
图7A-B显示了微孔阵列和用于使用微成型工艺制造微孔阵列的修饰微柱的显微照片。图7A显示了在相邻微孔之间具有拱形脊的微孔阵列的显微照片。图7B显示了可用于在微成型孔之间产生拱形脊的具有弯曲表面的修饰微柱的侧视图的显微照片。
图8A-B显示了在使微柱阵列经受回流工艺之前和之后用微柱母体模制的微孔阵列的显微照片。图8A显示了在孔之间具有平坦基底表面的微孔阵列，如使用微柱母体在使其经受回流工艺之前制造的。图8B显示了在孔之间具有拱形脊的微孔阵列，如用已经经受回流工艺的微柱母体制造的。
图9A-B说明了机械固定器，微孔阵列基底可以被夹紧在其中，由此形成反应室或孔，可以向其中用移液管移取样品和试剂，用于进行多重、单细胞随机标记或分子条码化实验。图9A：显示了固定器的上下部分和用于与微孔阵列基底形成防漏密封的弹性垫圈的分解图。图9B：固定器的分解侧视图。
图10说明了机械固定器，当微孔阵列基底被夹紧在所述固定器内时，其产生两个反应室或孔。
图11说明了当手动进行时用于促进单细胞随机标记和分子条码化测定的铰链机械固定器。将包括微孔阵列的基底夹紧在弹性垫圈和固定器之间，以产生反应孔，细胞样品、珠样品和其他测定试剂可以被移取入其中。
图12说明了并入微孔阵列和光学透明窗的流动池，所述透明窗用于对微孔阵列的全部或部分进行成像。图12插图：微孔阵列的显微照片，其中微孔亚群含有细胞和/或珠。
图13A说明了用于构造流动池的不同流体层设计的实例。
图13B-C提供了流动池设计的示意图，其并入与包括微孔阵列的室流体连通的锥形倾斜入口和出口流体通道。图13B：俯视图。图13C：横截面侧视图。
图14A描绘了柱体组件的分解图，其包括流动池，所述流动池包括界面层、流体层和基底。
图14B描绘了其中已经粘合形成流动池(例如界面层、流体层和基底)的层的柱体组件的部分分解图。
图15显示了示例性柱体设计。
图16显示了示例性柱体设计的分解图。
图17描绘了示例性流动池设计的分解图。
图18描绘了示例性流动池设计。
图19A说明了并入密封环作为设计特征的3D印刷流动池零件。
图19B说明了由聚合物材料制成的流动池零件。
图20A说明了其中多个零件机械夹紧在一起的柱体组件的一种方法。
图20B说明了包括粘合和/或可消耗零件以及机械地夹紧在一起的附加零件两者以形成完整组件的柱体组件的一种方法。
图20C说明了预组装的可消耗柱体。
图21A-C描绘了微孔阵列被包装在其内的柱体的一个实施例。图21A：组装柱体的视图，显示了入口和出口的、用于使收回磁体与微孔阵列紧密接近的减压阀(relief)、以及板载试剂储器。图21B：柱体组件的部分分解图。图21C：柱体(从底部到顶部)的分解图，说明了微孔阵列基底，粘合到基底和限定流动池或阵列室的柱体主体的注入成型塑料，限定样品、试剂、或可能含有预加载的测定试剂或储存用过的试剂的废物储器的柱体主体，以及用于密封试剂和废物储器的盖。
图22A-B描绘了微孔阵列被包装在其内的柱体的另一个实施例。图22A：组装柱体的视图。图22B：柱体组件(从底部到顶部)的分解图，说明了微孔阵列基底，限定流动池或阵列室的流体层(例如，流动池的部分)和限定样品、试剂或废物储器的柱体主体。在这个实施例中，所述储器在外部不可见。
图23A说明了流动池或柱体组件的组成部分，其包括4个流体端口，其可以任选地并入流体入口和出口连接器，例如螺纹连接器、鲁尔锁紧连接器、鲁尔滑锁(Luer slip)或“滑动型(slip tip)”连接器、压入配合连接器等。
图23B说明了流动池或柱体组件的部件，其包括被设计成适应常规微量移液管的流体端口，以方便引入流体。
图24A说明了流动池或柱体组件的部件，其包括被设计成适应常规微量移液管的流体端口，以方便引入流体。
图24B说明了流动池或柱体组件，其中设计成适应常规微量移液管的一个或多个成角度入口可以包括刚性或顺应特征，以与微量移液管尖端形成基本上防漏的密封。
图24C说明了流动池或柱体组件，其中设计成适应常规微量移液管的一个或多个成角度入口可以并入如O形环的特征，以与微量移液管尖端形成基本上防漏的密封。
图25A说明了包括可以独立于柱体设计的其余部分而被修饰的模块移液管尖端接口的柱体设计。
图25B说明了用于并入柱体设计中的模块移液管尖端接口。
图26说明了并入注射器连接器和一个或多个止回阀的柱体组件，以及移液管尖端接口和在从微孔阵列收回之后存储珠的样品收集管。可以有两个入口和一个出口。柱体并入连接到管入口和管出口的外部阀，以及第二入口上的移液管接口。
图27说明了图26所示的柱体设计的变化。
图28说明了并入Upchurch NanoportTM连接器(厄普丘奇科学公司(UpchurchScientific)，IDEX健康与科学部(Division of IDEX Health and Science)，橡港市，华盛顿州)的柱体设计，以在外部管道和柱体之间产生低的死体积连接。所述柱体设计还并入注射器连接器、止回阀和任选的移液管尖端接口。
图29A描绘了并入流体端口(带有移液管接口)、流体通道、流体储器和与所有或一些流体端口或流体储器相邻的止回阀的柱体设计的分解图。所述视图显示了柱体的分解图，并且描绘了代表阀的四个圆柱体(红色)、界面层(顶部，绿色)、形成流动池的流体路径的流体层(中间，蓝色)、以及并入微孔阵列并且也是柱体的基部的基底层(底部，灰色)。
图29B描绘了并入流体端口(带有移液管接口)、流体通道、流体储器、输入和出口上的移液管接口，入口和出口上的储器以及门控每个入口和出口的阀和与所有或一些流体端口或流体储器相邻的止回阀的柱体设计的组装图。
图30提供了用于进行多重、单细胞随机标记或分子条码化测定的仪器系统的示意性说明。所述仪器系统可以提供多种控制和分析能力，并且可以被包装为单独的模块或包装为完全集成的系统。微孔阵列可以与作为系统的固定部件或可移除的流动池整合，或可以被包装在可移除的柱体内，所述柱体进一步包括预加载的测定试剂储器和其他功能性。
图31提供了针对进行多重、单细胞随机标记或分子条码化测定的仪器系统的框图。所述仪器系统可以提供多种控制和分析能力，并且可以被包装为单独的模块或包装为完全集成的系统。控制计算机可以如所示嵌入，或者经由电缆或无线接口可操作地连接。微孔阵列可以与作为系统的固定部件或可移除的流动池整合，或可以被包装在可移除的可消耗柱体内，所述柱体进一步包括预加载的测定试剂储器和其他功能性。
图32说明了其中细胞样品、珠悬浮液和其他测定试剂由用户加载到可消耗柱体中并插入到仪器中的柱体和仪器系统的工艺流程图的一个实施例。“用户”标题下未列出的所有工艺步骤由仪器以半自动或全自动方式进行。
图33说明了其中细胞样品和珠悬浮液由用户加载到可消耗柱体中并插入到仪器中的柱体和仪器系统的工艺流程图的另一个实施例。其他测定试剂被预加载在柱体中和/或储存在仪器中。“用户”标题下未列出的所有工艺步骤由仪器以半自动或全自动方式进行。
图34说明了其中珠悬浮液和其他测定试剂预加载到可消耗柱体中和/或存储在仪器中的柱体和仪器系统的工艺流程图的另一个实施例。细胞样品由用户加载到柱体中并插入仪器中。“用户”标题下未列出的所有工艺步骤由仪器以半自动或自动方式进行。
图35示出说明了其中珠和其他测定试剂预加载到可消耗柱体中并且其中珠预分配于含在柱体中的微孔阵列的微孔中的柱体和仪器系统的工艺流程图的又另一个实施例。细胞样品由用户加载到柱体中并插入仪器中。“用户”标题下未列出的所有工艺步骤由仪器以半自动或自动方式进行。
图36说明了用于为当前披露的测定系统提供仪器控制和数据分析能力的计算机系统或处理器的一个实施例。
图37显示了一个框图，说明了可以与本披露的测定系统的示例性实施例结合使用的计算机系统架构的一个实例。
图38描绘了一个图表，显示了具有多个计算机系统、手机、个人数据助理和附网存储(NAS)的网络，其可以与本披露的测定系统的示例性实施例一起使用。
图39描绘了多处理器计算机系统的框图，所述系统可以与本披露的测定系统的示例性实施例一起使用。
图40说明了用于在所披露的系统中用于进行多重单细胞随机标记和分子条码化测定的照明系统的光学设计的一个实施例。
图41显示了来自细胞沉降研究的数据，其中在如图12所示用细胞悬浮液填充流动池之后，使用自动图像分析软件测定随时间变化的微孔阵列中含有拉莫斯细胞的孔的百分比。
图42显示了来自细胞分布研究的数据，其中在如图12所示用拉莫斯细胞悬浮液填充流动池之后，相对于在不同时间收集的数据的每孔细胞数，对含有指定细胞数的微孔数进行绘图。
图43显示了细胞分配数据与泊松统计的预测的比较。相对于每孔细胞数，连同从泊松分布计算的值，对观察到的含有指定数目的细胞的微孔数进行绘图与。
图44显示了来自珠沉降研究的数据，其中在如图12所示用珠悬浮液填充流动池之后，使用自动图像分析软件测定随时间变化的微孔阵列中含有珠的孔的百分比。
图45A-C说明了图像处理和自动细胞计数的工作流程。
图46显示了在此披露的图像处理和自动细胞计数算法的输出结果的实例。
图47A显示了含有细胞的微孔阵列的明场图像。
图47B显示了与图47A所示的视野对应的荧光图像，其中细胞已预加载有钙黄绿素。
图47C显示了图47A和47B所示的图像的叠加。
图48说明了在此描述的图像处理和自动细胞计数算法中用于微孔检测、珠鉴定和细胞鉴定的步骤。
图49A显示了微孔阵列的明场图像，其中一些微孔含有珠或细胞。
图49B说明了使用边缘检测和霍夫圆变换进行图像处理以鉴定图49A所示的明场图像中的微孔的结果。
图49C说明了使用图49B的处理图像创建的二元掩膜，其中在孔之外的区域被设置为“黑色”(即，值为“0”)，并且孔内的区域被设置为“白色”(即，值为“1”)。
图50A-C说明了使用二元掩膜以消除图像的一些部分并且将随后的图像处理和分析集中在孔内的区域以鉴定珠和细胞。
图51A-C显示了使用图49A-C和50A-C所示的图像处理步骤获得的输出结果的实例。
图52A-C显示了由Norland光学粘合剂63(NOA63)制造的侧壁上具有拔模角度的微孔阵列的显微照片。图52A：俯视图。图52B：底视图。图52C：横截面视图。孔顶直径大于孔底直径。
图53A-C显示了由环烯烃共聚物(COC)制造的具有负拔模角度的微孔阵列的显微照片。图53A：俯视图。图53B：底视图。图53C：横截面视图。孔顶直径小于孔底直径。
图54显示了针对由COC制造的不同直径(50μm深，60μm间距)的微孔的珠捕获和收回效率的数据的实例。所示的孔具有正拔模角度。
图55A-D显示了针对由NOA63或COC制造的不同直径的微孔(针对光学粘合剂孔的孔深度＝40μm，而针对COC孔为50μm)的珠捕获效率(图55A和55C)和珠双联体(doublet)百分比(图55B和55D)的数据的实例。
图56显示了针对由NOA63或COC制造的不同直径的微孔(针对光学粘合剂孔的孔深度＝40μm，而针对COC孔为50μm)的珠捕获和收回的数据的实例。
图57显示了用聚HEMA预处理的切片PDMS的COC微孔的显微照片。
图58A说明了装入微孔阵列并包括锥形入口和出口的流动池。
图58B说明了加载和收回过程的步骤：(i)加载，(ii)磁场增强捕获，(iii)洗涤和(iv)基于磁场的收回。
图59A-D显示了在图58B中概述的每个步骤之后的微孔阵列的显微照片。含有珠的孔的百分比指示在每个图像下方。
图60显示了使用如所述的自动化图像处理和分析生成的数据的实例，以在每个工艺步骤之后根据基底上的位置量化含有珠的微孔数。
图61显示了针对在不同工艺步骤(包括裂解步骤)之后根据微孔基底上的位置的珠加载和收回的研究的数据的实例。
图62A-B说明了流动池设计的两个非限制性实例。图62A说明了单入口-单出口流动池设计。图62B说明了分支入口流动池设计。
图63显示了针对单入口-单出口流动池设计的叠加有珠填充效率数据的流动池图像。
图64显示了针对分支入口流动池设计的叠加有珠填充效率数据的流动池图像。
图65显示了针对单入口-单出口流动池设计的叠加有珠填充效率数据的流动池图像，其中在液体填充步骤之间使用空气注入。
图66总结了来自珠填充效率研究的数据。
图67提供了单细胞随机标记的测定工作流程的高级概述。
图68总结了来自概念验证研究的数据，以证明细胞加载、珠加载和从装在流动池中的微孔阵列收回珠。
图69总结了来自概念验证研究的数据，以证明细胞加载、珠加载和从装在流动池中的微孔阵列收回珠。
图70A显示了在测定程序中的不同步骤针对1mm厚流动池根据沿着流动池的位置的珠加载数据的实例。
图70B显示了在测定程序中的不同步骤针对2mm厚流动池根据沿着流动池的位置的珠加载数据的实例。
图71A显示了根据沿着1mm深度流动池的位置的在裂解步骤期间损失或在所述工艺结束时收回的珠的百分比的数据的实例。
图71B显示了根据沿着1mm深度流动池的位置的在裂解步骤期间损失或在所述工艺结束时收回的珠的百分比的数据的实例。
图72A-F显示了在测定程序的不同步骤根据沿着流动池的位置的细胞加载数据的实例。
图73显示了在测定过程的各个阶段根据沿着流动池的长度的位置的含有珠的孔的百分比的数据。
图74显示了在每个工艺步骤之后含有珠的孔的百分比(整组微孔的平均值)的数据的实例。
图75A-C显示了初始珠加载和沉降步骤之后(图75A)、初始珠加载和沉降步骤之后(图75B)、以及珠随后被磁体拉下之后(图75C)的细胞加载的数据。
图76提供了在工艺的不同步骤处的细胞加载和珠加载数据的概述。
图77A-B显示了比较当使用添加和未添加DTT的裂解缓冲液时，在测定程序中的不同步骤的珠加载的数据的实例。
图78A-B显示了比较当裂解缓冲液包括DTT时，在测定程序的不同步骤的磁场辅助珠分配对珠加载的影响的数据的实例。
图79A显示了在珠加载步骤之后和珠收回之后含有珠的孔的百分比的数据的实例。
图79B提供了个体实验中的细胞加载和珠加载的分析统计表。
图80A显示了在珠加载步骤之后根据流动池内的位置的珠填充率(具有珠的孔的百分比)的热图。
图80B显示了在珠收回步骤之后根据流动池内的位置的珠填充率(具有珠的孔的百分比)的热图。
图80C显示了在珠收回步骤之后根据流动池内的位置的珠收回百分比(1-剩余珠/加载的珠)*100％)的热图。
图81显示了在孔之间具有圆化表面的示例性微孔阵列的显微照片。
图82A-B显示了标准(“细胞第一”)和替代(“珠第一”)测定工作流程的比较。
图83A-B显示了已评价的标准和替代测定工作流程的几种变化。
图84A-B分别显示了“珠第一”和“细胞第一”测定工作流程中每个步骤的珠加载效率的比较。
图85显示了包括微孔阵列的流动池的合成图像。合成图像右下角的矩形显示了流动池的出口支路中流动阻抗增加的区域。
图86A-C显示了针对“珠第一”测定工作流程的不同步骤的根据流动池内的位置的单一珠加载效率的热图。
图87A-F显示了针对“珠第一”(图87A-C)和“细胞第一”(图87D-F)测定工作流程的细胞捕获效率的比较。
图88A-B显示了重要测定性能度量的频率(即，与微孔阵列内的单一珠相关联的细胞的百分比)的图。
图89A-D显示了针对重要测定性能度量的数据(即，在细胞裂解步骤之前含有单一珠的微孔的百分比)的实例。
图90A-B分别显示了针对“珠第一”(图90A)和“细胞第一”(图90B)测定工作流程的相对于微孔中的细胞数的珠加载效率的图。
图91说明了利用移液管尖端和柱体之间的摩擦配合密封的移液管尖端接口以及柱体出口上的鸭嘴阀的设计。
图92显示了利用移液管尖端和柱体之间的摩擦配合密封的移液管尖端接口以及柱体出口上的鸭嘴阀的横截面侧视图。
图93显示了具有模制顺应垫圈的替代移液管尖端接口和x-fragm分配阀。
图94显示了两个移液管尖端接口设计的总结比较。
图95A-B说明了标准“珠第一”测定工作流程(图95A)和改良的基于Ficoll的测定工作流程(图95B)的步骤。
图96A-B显示了说明使用基于Ficoll的珠洗涤步骤而不是用SiO2涂覆的微孔基底的空气置换技术实现的改善的珠加载效率的数据的实例。
图97A-F显示了使用基于Ficoll的测定工作流程实现的细胞捕获效率的数据的实例。
图98总结了在基于Ficoll的测定工作流程中使用的磁珠、细胞和溶液的估计的密度和粘度值。
具体实施方式
在此披露了用于单细胞中多个靶分子的分子条码化的方法、组合物、装置、系统和试剂盒。
用于分子条码化和计数的随机标记的概述：
在本披露的方法、装置和系统下的方法利用递归泊松策略来实现大量单独的细胞的单细胞分子条码化测定。例如，可通过将单独的细胞与单独的珠随机关联而用细胞标记(也称为细胞索引、条码或标签)和分子标记(也称为分子索引、条码或标签)随机地标记来自单独的细胞的分子靶标，其中每个单独的珠包括多个附接的随机标记。附接至给定珠的随机标记可用于随机标记来自相关细胞的蛋白质或核酸靶标。在一些实施例中，单细胞被随机分配到多个微孔(例如微孔阵列)中。各自包括多个拴系随机标记的珠的组合文库也被随机分配到所述多个微孔中，使得所述微孔的亚群含有单细胞和单一珠。在一些实施例中，在沉积所述细胞之前沉积所述珠。在其他实施例中，在沉积所述细胞之后沉积所述珠。包括所述细胞条码和分子条码的随机标记可进一步包括能够附接至分子靶标(例如，核酸分子)或与其杂交的靶识别区。所述靶分子可以从每个细胞释放，例如通过裂解所述细胞，并且然后附接至相应珠上的随机标记或与其杂交。在一些实施例中，所述靶分子通过切割(例如酶切割)从所述细胞释放。在一些实施例中，例如，当所述靶分子是mRNA分子时，在所述mRNA靶分子与所述随机标记杂交后，从所述微孔中收回所述珠，并在进行逆转录、扩增和测序反应之前进行聚池。
在一些实施例中，附接至给定珠的所述多个随机标记包括对于附接至所述珠的所有随机标记来说相同的细胞标记，而对于附接至不同珠上的所述多个随机标记来说细胞标记是不同的。在一些实施例中，附接至给定珠的所述多个随机标记包括一组不同的分子标记，所述分子标记选自包括指定数目的唯一性分子标记序列的组。在一些实施例中，附接至给定珠的所述多个随机标记可以包括相同的靶识别区。在一些实施例中，附接至给定珠的所述多个随机标记可以包括两个或更多个不同的靶识别区。
在一些实施例中，所述珠文库具有比待标记的细胞数目高至少一个或两个数量级的细胞标记多样性(即，唯一性细胞标记序列的数目)，使得每个细胞与唯一性细胞条码配对的概率非常高。例如，每个细胞与唯一性细胞条码配对的概率可以大于80％、大于90％、大于95％、大于99％、大于99.9％、大于99.99％或大于99.999％。
在一些实施例中，附接至珠的所述多个随机标记的分子标记多样性(即，唯一性分子标记序列的数目)比待标记的靶分子种类的估计出现次数高至少一个或两个数量级，使得细胞内的靶分子(例如mRNA分子)的每次出现被唯一性标记的概率也非常高。例如，靶分子的每次出现与唯一性分子条码配对的概率可以大于80％、大于90％、大于95％、大于99％、大于99.9％、大于99.99％或大于99.999％。在这些实施例中，可以通过确定附接至所述靶分子序列的唯一性分子标记序列的数目来计数(或估计)每个细胞中靶分子种类的出现次数。在许多实施例中，可以通过测序标记的靶分子(或其互补序列)的扩增文库来进行所述确定步骤。
在一些实施例中，附接至珠的所述多个随机标记的分子标记多样性与待标记的靶分子种类的估计出现次数相当或较低，使得给定类型的靶分子的多次出现将被给定分子标记的多于一个拷贝标记存在显著概率。在这些实施例中，可以使用泊松统计从附接至所述靶分子序列的唯一性分子标记序列的数目计算每个细胞中的靶分子的数目。
在许多实施例中，感兴趣的靶分子是在单细胞内表达的mRNA分子。由于每个细胞中全部或部分的聚腺苷酸化mRNA分子的cDNA拷贝被共价地归档在相应珠的表面上，所以可以随后分析基因转录物的任何选择。当对带有条码的转录物进行测序并且指定给源细胞(基于所鉴定的细胞标记)并计数(基于所鉴定的唯一性分子标记的数目)时，可对每个细胞的数字基因表达谱进行重构。测定方法的示例性描述可以在以下文献中找到：Fan,et al.,“Combinatorial Labeling of Single Cells for Gene Expression Cytometry”,Science 347(6222):628[Fan等人，“用于基因表达细胞计数的单细胞的组合标记”，科学，347(6222):628]；和Science 347(6222):1258367[科学，347(6222):1258367]。
测定靶标、样品、组分和方法：
靶分子：用于通过所披露的方法、装置和系统进行分析的合适的靶分子包括寡核苷酸分子、DNA分子、RNA分子、mRNA分子、微小RNA分子、tRNA分子等。在一些实施例中，靶分子可以是肽或蛋白质。所述靶分子可以是抗体重和轻多肽链和/或受体多肽链(例如，T细胞受体的α和β链)。
细胞样品：用于通过所披露的方法、装置和系统进行分析的合适的样品包括如下的任何样品，所述样品包括其中细胞外基质已被消化或溶解以将单独的细胞释放到悬浮液中的多个细胞，例如细胞培养物、血液样品、组织样品等。所述多个细胞可以源自单一样品或源自已经组合的两个或更多个样品，并且可以包括多个相同类型的细胞或多个混合类型的细胞。
在一些实施例中，细胞、亚细胞结构或其他含核酸的颗粒可以构成合适的样品。例如，在一些实施例中，所述样品可以包括细胞器(例如线粒体、细胞核、外来体等)、脂质体、细胞簇或多细胞生物体等。
在一些实施例中，所述细胞是正常细胞，例如不同发育阶段的人类细胞，或来自不同器官或组织类型的人类细胞(例如，白细胞、红细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、神经元、胶质细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、配子，或者来自心脏、肺、脑、肝、肾、脾、胰腺、胸腺、膀胱、胃、结肠、小肠的细胞)。在一些实施例中，所述细胞可以是未分化的人类干细胞或已被诱导分化的人类干细胞。在一些实施例中，所述细胞可以是人类胎儿细胞。人类胎儿细胞可以获得自怀有胎儿的母亲。
在一些实施例中，所述细胞是罕见细胞。罕见细胞可以是例如循环肿瘤细胞(CTC)、循环上皮细胞、循环内皮细胞、循环子宫内膜细胞、循环干细胞、干细胞、未分化干细胞、癌干细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞、滋养层、免疫系统细胞(宿主或移植物)、细胞片段、细胞器(例如线粒体或细胞核)、病原体感染的细胞等。
循环肿瘤细胞可以是癌细胞。CTC可以是CD45-。CTC可以表达细胞角蛋白如8、18和/或19，或是细胞角蛋白阴性的。CTC可以是癌干细胞和/或正经历上皮-间充质转换(EMT)的细胞。CTC可以是转移细胞。
在一些实施例中，所述样品包括免疫细胞。免疫细胞可以包括例如T细胞、B细胞、淋巴干细胞、骨髓祖细胞、淋巴细胞、粒细胞、B细胞祖细胞、T细胞祖细胞、自然杀伤细胞、Tc细胞、The细胞、浆细胞、记忆细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞和/或巨噬细胞，或其任何组合。
细胞可以是T细胞。T细胞可以是T细胞克隆，其可以指源自单一T细胞的T细胞或具有相同TCR的那些。T细胞可以是可包括T细胞克隆和具有不同TCR的混合T细胞群体的T细胞系的一部分，所述TCR全部都可以识别相同的靶标(例如，抗原、肿瘤或病毒)。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织和肿瘤。可以使用Ficoll分离技术从收集自受试者(如个体或患者)的血液单位获得T细胞。来自个体的循环血液的细胞可以通过单采术或白细胞分离术获得。单采产物可以包括淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。可以将所述细胞洗涤并重悬浮于培养基中以分离感兴趣的细胞。
可以通过裂解红细胞并消耗单核细胞而从外周血淋巴细胞中分离T细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定子群，如CD28+、CD4+、CDC、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，可以通过用缀合抗CD3/抗CD28(即，3×28)的珠(如
Figure GDA0002954171600000241
M-450 CD3/CD28 T或XCYTE DYNABEADSTM)孵育足以阳性选择所希望的T细胞的一段时间来分离T细胞。免疫细胞(例如，T细胞和B细胞)可以是抗原特异性的(例如，对于肿瘤是特异性的)。
在一些实施例中，所述细胞可以是抗原呈递细胞(APC)，如B细胞、来自淋巴结的活化B细胞、淋巴母细胞样细胞、静息B细胞或瘤性B细胞(例如，来自淋巴瘤)。APC可以指B细胞或滤泡树突细胞，在其表面上表达至少一种BCRC蛋白。
在一些实施例中，所述细胞是非人类细胞，例如其他类型的哺乳动物细胞(例如小鼠、大鼠、猪、狗、牛或马)。在一些实施例中，所述细胞是其他类型的动物或植物细胞。在其他实施例中，所述细胞可以是任何原核或真核细胞。
在一些实施例中，在将细胞与珠关联之前对所述细胞进行分选。例如，所述细胞可以通过荧光活化细胞分选或磁活化细胞分选进行分选，或更普遍地通过流式细胞术进行分选。所述细胞可以按尺寸进行过滤。在一些情况下，滞留物含有与所述珠相关联的细胞。在一些情况下，流过物(flow through)含有与所述珠相关联的细胞。
当加载细胞时，通常调整细胞悬浮液的浓度(即，每mL的细胞数目)，使得具有多于一个细胞沉降到给定微孔中的概率非常小。通常，将调整细胞悬浮液的浓度，使得用于加载(例如微孔阵列)的细胞悬浮液的体积含有微孔阵列中的孔数的大约十分之一的细胞数目。多于一个细胞沉降到给定的微孔中的概率由泊松统计控制。
随机标记化学结构：在所披露的方法的一些实施例中，用于单细胞分子条码化研究的随机标记(也称为条码、标签或索引)包括寡核苷酸，例如寡脱氧核糖核苷酸(DNA)、寡核糖核苷酸(RNA)、肽核酸(PNA)聚合物、2'-O-甲基取代的RNA、锁核酸(LNA)聚合物、桥接核酸(BNA)聚合物等。
随机标记可以附接至固体支持物：在许多实施例中，在所披露的方法中使用的随机标记可以拴系于珠(例如，拴系于合成树脂珠)或其他固体支持物，如将在下面更详细描述的。如在此使用的，短语“拴系”、“附接”和“固定”可以可互换使用，并且可以指用于将随机标记附接至如珠等的固体支持物的共价或非共价手段。在图1中示意性地说明了随机标记结构的一个非限制性实例。在这个实施例中，所述随机标记包括附接至珠的多个5'-胺修饰的寡核苷酸。所述寡核苷酸包括5'胺基、通用引物、细胞标记、分子标记和靶结合区。在一些实施例中，所述寡核苷酸可以任选地进一步包括一个或多个另外的标记，例如用于在同时处理两个或更多个样品时标记来自给定样品的所有细胞的样品标记。在一些实施例中，所述随机标记寡核苷酸序列可以在其5'末端附接至固体支持物。在一些实施例中，所述随机标记寡核苷酸序列可以在其3'末端附接至固体支持物。
随机标记可以包括一个或多个通用标记：在一些实施例中，在所披露的方法、组合物、装置、试剂盒和系统中使用的随机标记可以包括一个或多个通用标记。在一些实施例中，所述一个或多个通用标记对于附接至给定珠的寡核苷酸组中的所有寡核苷酸来说可以是相同的。在一些实施例中，所述一个或多个通用标记对于附接至多个珠的所有寡核苷酸来说可以是相同的。在一些实施例中，通用标记可以包括能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包括通用标记的寡核苷酸测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相关联的测序引物。在一些实施例中，通用标记可以包括能够与PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施例中，所述通用标记可以包括能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序或PCR引物杂交的通用标记的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包括可用来引发寡核苷酸的转录的序列。通用标记可以包括可用来延伸所述寡核苷酸或所述寡核苷酸内的区域的序列。通用标记的长度可以是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。通用标记可以包括至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至多约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。在一些实施例中，可切割接头或经修饰的核苷酸可以是所述通用标记序列的一部分，以使得能够从所述固体支持物上切割掉随机标记寡核苷酸。
随机标记可以包括细胞标记：在一些实施例中，随机标记可以包括细胞标记，例如提供用于确定哪个靶核酸来源于哪个细胞的信息的核酸序列。在许多实施例中，所述细胞标记对于附接至给定珠或固体支持物的所有寡核苷酸来说是相同的，但对于不同珠或固体支持物是不同的。在一些实施例中，同一固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的寡核苷酸可以包括相同的细胞标记。在一些实施例中，同一固体支持物上的至少60％的寡核苷酸可以包括相同的细胞标记。在一些实施例中，同一固体支持物上的至少95％的寡核苷酸可以包括相同的细胞标记。在一些实施例中，多个珠或固体支持物中可以表现多达103个或更多个唯一性细胞标记序列。在一些实施例中，多个珠或固体支持物中可以表现多达104个或更多个唯一性细胞标记序列。在一些实施例中，多个珠或固体支持物中可以表现多达105个或更多个唯一性细胞标记序列。在一些实施例中，多个珠或固体支持物中可以表现多达106个或更多个唯一性细胞标记序列。细胞标记的长度可以是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。细胞标记的长度可以是至多约300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4或更少个核苷酸。细胞标记可以包括约5至约200个之间的核苷酸。细胞标记可以包括约10至约150个之间的核苷酸。细胞标记的长度可以包括约20至约125个之间的核苷酸。
细胞标记可以包括纠错码：在一些实施例中，所述细胞标记还可以包括具有定义长度的一组唯一性核酸子序列，例如各自7个核苷酸(相当于一些汉明(Hamming)纠错码中使用的比特数)，其被设计成提供纠错能力。在一些实施例中，所述纠错子序列组包括被设计为使得所述组中的任何成对序列组合展现所定义的“遗传距离”(或错配碱基数目)的7个核苷酸序列，例如，纠错子序列组可以被设计成展现3个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，对于标记的靶核酸分子的序列数据组中的纠错序列的审查(在下面更全面地描述)可以允许检测或校正扩增或测序误差。在一些实施例中，用于产生纠错码的核酸子序列的长度可以变化，例如它们的长度可以是3个核苷酸、7个核苷酸、15个核苷酸或31个核苷酸。在一些实施例中，其他长度的核酸子序列可以用来产生纠错码。
细胞标记可以包括两个或更多个亚单元：在一些实施例中，所述细胞标记可以包括以组合的分离-聚池方式组装(或合成)的两个或更多亚单元(也称为子部件或部件)的组件，以便以最少的组装或合成步骤产生大量唯一性细胞标记序列。例如，使用一组6个唯一性细胞标记亚单元进行的三轮分离-聚池合成将产生63＝216个唯一性细胞标记序列，其中每个细胞标记包括三个亚单元的组件。更一般地，包括在每个步骤使用一组N个唯一性亚单元以组合的分离-聚池方式组装的M个亚单元的细胞标记序列将产生NM个唯一性组合。在一些实施例中，当所述随机标记是寡核苷酸时，可以通过使用聚合酶延伸或连接反应来组装所述细胞亚单元序列。在一些实施例中，可以使用一个或多个接头序列来促进所述细胞标记序列亚单元的组装。
随机标记可以包括分子标记。分子标记可以包括如下的核酸序列，所述核酸序列提供用于鉴定与所述寡核苷酸杂交的特定类型的靶核酸种类的信息。分子标记可以包括如下的核酸序列，所述核酸序列为与所述寡核苷酸杂交的靶核酸种类的特定出现提供计数器。在许多实施例中，一组不同的分子标记附接至给定珠。在一些实施例中，可以存在多达106个或更多个附接至给定珠的唯一性分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多达105个或更多个附接至给定珠的唯一性分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多达104个或更多个附接至给定珠的唯一性分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多达103个或更多个附接至给定珠的唯一性分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多达102个或更多个附接至给定珠的唯一性分子标记序列。分子标记的长度可以是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。分子标记的长度可以是至多约300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4或更少个核苷酸。
随机标记可以包括靶结合区：在一些实施例中，所述靶结合区可以包括与靶核酸(例如，待分析的细胞核酸)特异性杂交(例如与特定基因序列杂交)的核酸序列。在一些实施例中，靶结合区可以包括可附接(例如，杂交)至特定靶核酸的特定位置的核酸序列。在一些实施例中，所述靶结合区可以包括能够与限制性位点突出端(例如EcoRI粘端突出端)特异性杂交的核酸序列。然后所述随机标记可以连接到包括与所述限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。在一些实施例中，靶结合区可以包括非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以指独立于靶核酸的特定序列可与多个靶核酸结合的序列。例如，靶结合区可以包括与mRNA分子上的聚-A尾杂交的随机多聚体序列或寡聚-dT序列(图1)。随机多聚体序列可以是例如随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或任何长度的更高多聚体序列。在一些实施例中，靶结合区的长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。在一些实施例中，靶结合区的长度可以是至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。靶结合区可以包括在此范围内的任何数目的核苷酸，例如，靶结合区的长度可以是约18个核苷酸。
在一些实施例中，所述靶结合区对于附接至给定珠的所有寡核苷酸来说是相同的。在一些实施例中，附接至给定珠的所述多个寡核苷酸的靶结合区可以包括两个或更多个不同的靶结合序列。例如，在一些实施例中，附接至给定珠的所述多个寡核苷酸的靶结合区可以包括寡聚-dT序列和单一靶特异性序列的拷贝的混合物。在一些实施例中，附接至给定珠的所述多个寡核苷酸的靶结合区可以包括寡聚-dT序列和两个不同的靶特异性序列的拷贝的混合物。在一些实施例中，附接至给定珠的所述多个寡核苷酸的靶结合区可以包括寡聚-dT序列和三个不同的靶特异性序列的拷贝的混合物。通常，附接至给定珠的所述多个寡核苷酸的靶结合区可以包括一个和一百个之间或更多个不同的靶结合序列的混合物，所述序列包括但不限于靶特异性序列、随机多聚体序列、能够与限制性位点突出端特异性杂交的序列、或寡聚-dT序列，以序列的任何组合和以相对比例的任何组合。
拴系于珠的随机标记：在一些实施例中，在此披露的随机标记可以附接至固体支持物(如珠)。如在此使用的，术语“拴系”、“附接”和“固定”可以可互换使用，并且可以指用于将随机标记附接至如珠等的固体支持物的共价或非共价手段。在一些实施例中，所述随机标记可以固定在小的反应体积内，例如附接至孔或微孔中的表面或不同形式的固体支持物，而不是附接至珠。
预合成的随机标记可以通过涉及所述固体支持物和所述寡核苷酸上的官能团对的多种固定技术中的任何一种附接至珠或其他固体支持物。在一些实施例中，所述寡核苷酸官能团和所述固体支持物官能团单独地选自下组，该组由以下各项组成：生物素、链霉亲和素、一种或多种伯胺、一个或多个羧基、一个或多个羟基、一种或多种醛、一种或多种酮及其任何组合。可以通过例如将所述寡核苷酸上的5’氨基基团偶联(例如，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)至所述官能化的固体支持物的羧基基团来将随机标记寡核苷酸拴系于固体支持物。可以通过进行多次漂洗步骤从所述反应混合物中除去残留的未偶联的寡核苷酸。在一些实施例中，所述随机标记寡核苷酸和固体支持物通过接头分子(例如，短的官能化的烃分子或聚环氧乙烷分子)使用类似的附接化学而间接附接。在一些实施例中，所述接头可以是可切割的接头，例如酸不稳定接头或可光切割接头。
在一些实施例中，使用本领域技术人员已知的许多固相寡核苷酸合成技术中的任何一种，在固体支持物(如合成树脂珠)上合成随机标记。在一些实施例中，单一核苷酸能以逐步的方式与生长中的拴系寡核苷酸偶联。在一些实施例中，若干寡核苷酸的短的预合成序列(或嵌段)可以与生长中的拴系寡核苷酸偶联。在一些实施例中，寡核苷酸可以通过散布逐步或嵌段偶联反应用一轮或多轮分离-聚池合成进行合成，其中合成珠的总池被分成多个单独的较小的池，然后其各自经受不同的偶联反应，随后重组和混合单独的池，以使生长中的寡核苷酸序列跨整个珠池随机化。分离-聚池合成是组合合成工艺的一个实例，其中使用最少数目的化学偶联步骤合成最大数目的化合物。由此产生的化合物文库的潜在多样性由可用于每个偶联步骤的唯一性结构单元(例如核苷酸)的数目以及用于产生所述文库的偶联步骤的数目决定。例如，在每个步骤包括10轮偶联使用4种不同核苷酸的分离-聚池合成将产生410＝1,048,576个唯一性核苷酸序列。在一些实施例中，分离-聚池合成可以使用酶方法如聚合酶延伸或连接反应而不是化学偶联来进行。例如，在每轮分离-聚池聚合酶延伸反应中，在给定的池中拴系于珠的随机标记寡核苷酸的3'末端可以与一组半随机引物的5'末端杂交，例如具有5'-(M)k-(X)i-(N)j-3'结构的引物，其中(X)i是i个核苷酸长的随机核苷酸序列(所述引物组包括(X)i的所有可能的组合)，(N)j是特定核苷酸(或j个核苷酸的系列)，并且(M)k是特定核苷酸(或k个核苷酸的系列)，其中不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)加入到每个池中并通过聚合酶并入拴系寡核苷酸中。
在一些实施例中，缀合至固体支持物(如珠)或在其上合成的寡核苷酸的数目可以包括100个或更多个寡核苷酸分子。在一些实施例中，所述固体支持物可以包括1,000个或更多个寡核苷酸分子。在一些实施例中，所述固体支持物可以包括10,000个或更多个寡核苷酸分子。在一些实施例中，所述固体支持物可以包括100,000个或更多个寡核苷酸。在一些实施例中，所述固体支持物可以包括1,000,000个或更多个寡核苷酸。
在一些实施例中，缀合至固体支持物(如珠)或在其上合成的寡核苷酸的数目可以是细胞中靶核酸的数目的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施例中，缀合至固体支持物(如珠)或在其上合成的寡核苷酸的数目可以是细胞中靶核酸的数目的100倍。在一些实施例中，缀合至固体支持物(如珠)或在其上合成的寡核苷酸的数目可以是细胞中靶核酸的数目的1,000倍。在一些情况下，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的寡核苷酸被靶核酸结合。在一些情况下，至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的寡核苷酸被靶核酸结合。在一些情况下，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多个不同靶核酸被固体支持物上的寡核苷酸捕获。在一些情况下，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多个不同靶核酸被固体支持物上的寡核苷酸捕获。
在所披露的方法、装置和系统的一些实施例中，拴系于给定组的珠的所述多个随机标记可以被设计成将序列数据的下游分析集中在所选择的细胞子群上。在一些实施例中，拴系于一组珠的所述多个随机标记可以被设计成从序列数据的下游分析中排除所选择的细胞子群。用于实施这些实施例的合适方法的实例将包括附接至每个珠的拴系标记的亚群，其包括一个或多个靶特异性结合区，其中选择所述一个或多个核酸靶标(例如核酸标志物、遗传标志物)来将细胞亚群定义为包括在序列数据分析阶段的进一步分析中或从其中排除。所述亚群的拴系标记分子将各自包括细胞标记(对于附接至给定珠的所有标记来说的相同序列)、分子标记(例如，随机选自一组不同的分子标记或条码序列的单一唯一性序列，所述分子标记或条码序列被包括在附接至给定珠的拴系标记分子亚群中)和靶特异性结合区，以及如上所述的一个或多个另外的引物序列、样品标记序列等。可以选择一组核酸靶标(核酸标志物或遗传标志物)(例如mRNA靶标)以鉴定例如正经历凋亡的细胞(例如通过监测Bax、Bcl-2、半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7的表达，或可能参与凋亡的其他基因的表达，或其组合)、快速增殖(例如通过监测CKS1B、CCNB2、CDC2、DLG7、BUB3、MAD2L1、DLG7、PLK4、KIF2C、MKI67、BRRN1、NUSAP1、ASPM或KLF7的表达，或可能参与细胞增殖的其他基因的表达，或其组合)或可以基于核酸标志物定义的任何其他细胞子群。通过进行随机标记或分子条码化测定产生的序列数据的分析然后提供与指定细胞子群相关联的细胞条码的列表，使得进一步分析可以集中在所选择的细胞子群上，或者所选择的细胞子群可以被排除在进一步分析之外。
珠和其他编码的固体支持物。各种不同珠中的任何一种可用作固定支持物，用于附接预合成的随机标记寡核苷酸或用于原位固相合成随机标记寡核苷酸。珠可以包括任何类型的实心、多孔或空心球体、球、承座、圆柱体或其他类似配置，其由塑料、陶瓷、金属或聚合材料构成，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。珠可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状是如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。珠可以包括多种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁材料(例如，铁、镍、钴，其一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、交联琼脂糖、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙及其任何组合。珠可以指可以为生物颗粒和大分子(如DNA和RNA)的固定提供增加的表面积的任何三维结构。
通常，珠的直径的范围可以是从约1μm至约100μm或更大。在一些实施例中，所述珠的直径可以是至少1μm、至少5μm、至少10μm、至少20μm、至少25μm、至少30μm、至少35μm、至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm、或至少100μm。在一些实施例中，所述珠的直径可以是至多100μm、至多90μm、至多80μm、至多70μm、至多60μm、至多50μm、至多45μm、至多40μm、至多35μm、至多30μm、至多25μm、至多20μm、至多15μm、至多10μm、至多5μm或至多1μm。所述珠的直径可以具有在所述范围内的任何值，例如珠可以具有在约20至50μm范围内的直径。在一些实施例中，珠可以具有约33μm的直径。在一些实施例中，可能希望的是使用可能最小的珠(即，与用于产生附接至所述珠的多个随机标记的合成过程以及其他测定和装置要求相容的)，因为较大的珠将趋向于比相同密度的较小的珠沉降得更快，并因此可能导致珠跨微孔阵列的较不均匀分配。对于球形珠，沉降速度可以使用斯托克斯定律计算：
Figure GDA0002954171600000311
其中V＝沉降速度(cm/sec)，G＝重力加速度(cm/sec2)，a＝珠半径(cm)，ρ1＝珠密度(g/cm3)，ρ2＝悬浮介质的密度(g/cm3)，并且η＝粘度系数(泊；g/cm-sec)。因此，50μm直径的珠可以比相同密度的10μm直径的珠沉降地快25倍。
珠可以附接至一个或多个支持物、定位于其内或被包埋在其中。例如，珠可以附接至凝胶或水凝胶。珠可以附接至基质。珠可以被包埋在基质中。珠可以附接至聚合物。珠可以被包埋在聚合物中。可以使用珠上存在的用作位置地址的寡核苷酸鉴定所述珠在所述支持物(例如，凝胶、基质、支架或聚合物)内的空间位置。
珠的实例包括但不限于链霉亲和素珠、琼脂糖珠、磁珠、
Figure GDA0002954171600000312
Figure GDA0002954171600000313
微珠、缀合抗体的珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、缀合A蛋白的珠、缀合G蛋白的珠、缀合A/G蛋白的珠、缀合L蛋白的珠、缀合寡聚-dT的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠以及BcMagTM羧基封端的磁珠。
珠可以关联有(例如浸渍有)量子点或荧光染料，以使其在一个荧光光通道或多个光通道中是荧光的。珠可以关联有氧化铁或氧化铬，以使其具有顺磁性或铁磁性。另外，珠的形状可以是非球形的。在一些实施例中，可以使用更平的盘状珠。在一些实施例中，所述盘状珠可以基本上在一些方向上封闭孔体积，但允许细胞在其他方向上自由移动到孔中。这种大的盘状珠对于实现两种不同的功能是有益的，首先是裂解后细胞和细胞内的材料的限制，并且其次是在测定期间容易加载细胞的能力。所述方向也可以在操作期间使用施加的磁场来控制，包括通过仪器自动地。可以使用与其他孔形状(可以与简单圆柱体不同)组合使用的其他珠形状来改善柱体、珠和细胞加载以及进行测定的效率和速度。
用于随机标记和分子条码化的双重编码珠：在上述随机标记和分子条码化方法的一些实施例中，可能希望的是从进一步处理中去除与展现预定义的一组性质的单独的细胞相关联的珠或与多于一个细胞相关联的珠，或者使用从所述珠产生的序列数据来集中序列数据的下游分析。在一些实施例中，可以从任何进一步的序列数据分析中排除从所述珠产生的序列数据。在一些实施例中，序列数据的进一步分析可以仅包括由所述珠产生的序列数据。在一些实施例中，这可以通过在双重编码方案中使用光学编码的珠来实现，例如，其中单独的珠由光码(例如通过用一组光谱不同的荧光团、量子点、拉曼(Raman)标签、上转换磷光体等来浸渍所述珠；或通过使用固相分离-聚池合成方法和一组光谱不同的荧光结构单元合成所附接的光码)以及并入附接至给定珠的所述多个拴系随机标记中的核酸序列(例如细胞标记)而唯一地鉴定。各自基于它们的光码鉴定与展现一组预定义性质的细胞或多于一个细胞共定位的珠，并且随后由相应的细胞标记序列鉴定由所述珠产生的序列数据，由此产生进一步分析待包括或排除的序列数据的列表。可以通过多种合适技术中的任何一种，例如使用针对细胞表面标志物的荧光标记抗体和荧光成像技术通过微孔阵列形式中单独的细胞的免疫组织化学染色，或通过使用流式细胞术和荧光活化细胞分选方法，来鉴定展现预定义的一组特征的单独的细胞或细胞子群，例如表达特定细胞表面受体(标志物)或一组细胞表面受体的单独的细胞或细胞子群。在一些实施例中，如果可以鉴定和记录每个细胞标记序列在二维空间中的位置，则所述测定可提供单细胞基因表达的空间信息，并且可以特别用于分析例如常规收集用于病理学研究的薄组织切片中的基因表达。
使用阵列地址码的双重编码：在一些实施例中，双重编码方案可以通过以下方式实现：使用预先沉积的阵列地址码(例如编码所述阵列中的特定孔的位置的核酸条码)代替光学编码的珠来实现双重编码方案。在一些实施例中，阵列地址码可以使用喷墨印刷技术、微阵列点样技术、浸笔纳米光刻技术等沉积在孔中。在一些实施例中，所述阵列地址码可以非特异性地吸附到微孔的一个或多个内表面。在一些实施例中，所述阵列地址码可以共价附接至微孔的一个或多个内表面。在一些实施例中，所述阵列地址码可以通过固相合成技术原位合成，其中微孔的一个或多个内表面被用作固体支持物。在所述阵列地址码共价附接至微孔的一个或多个内表面的实施例中，所述附接可以包括使用可切割的接头，例如酸不稳定的、碱不稳定的或可光切割的接头，使得所述阵列地址码可以在希望时释放，并允许与附接至珠的所述拴系随机标记的亚群杂交。在一些实施例中，所述阵列地址码可以与附接至包括细胞标记的珠的所述多个随机标记组合使用。在一些实施例中，可以使用所述阵列地址码来代替附接至珠的多个随机标记，并且它们本身可以包括细胞标记、分子标记和一个或多个引物或适配子序列。所述阵列地址码能以与上述针对光学编码珠的相似的方式用于鉴定下游序列数据分析待包括或排除的细胞亚群。
细胞的刺激：在一些实施例中，在进行细胞裂解和后续测定步骤之前，细胞可以在已知的可调整时间与活化剂、物理或化学刺激或测试化合物接触。以这种方式，所述测定可以用于测量刺激诱导的基因表达的时间依赖性或瞬时变化，例如或者药物候选物的时间依赖性剂量-反应曲线。细胞活化剂的实例包括但不限于T细胞活化剂，如药理学试剂(例如佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)、抗CD3/TCR或抗Thy-1单克隆抗体、肠毒素和凝集素。物理和化学刺激的实例包括但不限于温度跃变、pH变化、离子强度变化等。
细胞裂解：在细胞和基于珠的随机标记的随机分配后，使得单独的细胞和单独的珠被一起限制在小的反应体积(例如孔或微孔)内，可以裂解所述细胞以释放靶分子(图1)。细胞裂解可以通过多种手段中的任何一种来完成，例如通过化学或生化手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解。在一些实施例中，例如，可以通过加入包括洗涤剂(例如SDS、十二烷基硫酸锂、曲通X-100、吐温-20或NP-40)、有机溶剂(例如甲醇或丙酮)或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。
将随机标记附接至靶核酸分子：在所述细胞裂解和核酸分子从其中释放后，所述核酸分子可以随机附接至所述共定位的珠的随机标记寡核苷酸。在一些实施例中，附接可以包括使标记的靶识别区与所述靶核酸分子的互补部分杂交(图1)。选择用于杂交的测定条件(例如缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进特定的稳定杂交体的形成，如本领域技术人员所熟知的。
在一些实施例中，附接可以进一步包括将标记的靶识别区与所述靶核酸分子的一部分连接。例如，在一些实施例中，所述靶结合区可以包括能够与限制性位点突出端(例如EcoRI粘端突出端)特异性杂交的核酸序列。在一些实施例中，所述测定方法进一步包括用限制酶(例如EcoRI)处理所述靶核酸以产生限制性位点突出端。然后所述随机标记可以连接到包括与所述限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。连接酶(例如，T4 DNA连接酶)可以用于连接这两个寡核苷酸片段。
在所披露的方法的一些实施例中，随后聚池来自多个细胞(或多个样品)的所述标记的靶核酸分子，例如通过收回附接有所述随机标记的核酸分子的珠(图1)。在一些实施例中，基于珠的附接的核酸分子的集合的分配和/或收回可以通过使用磁珠和外部施加的磁场来实现。一旦所述随机标记的核酸分子已经聚池，所有进一步的处理可以在单个反应容器中进行。在一些实施例中，可以在微孔内进行进一步的处理(例如逆转录反应(或其他核酸延伸反应)和扩增反应)，即不首先从多个细胞聚池所述标记的靶核酸分子。
逆转录：在所披露的方法的一些实施例中，进行逆转录反应(图1)以产生包括所述随机标记和所述靶核酸(即标记的cDNA分子)的全部或一部分互补序列的随机标记-靶核酸缀合物(例如共价连接的分子复合物或分子缀合物)。可以使用本领域的普通技术人员已知的多种技术中的任何一种来进行逆转录。所述标记的RNA分子的逆转录可以通过加入逆转录引物连同逆转录酶而进行。在一些实施例中，所述逆转录引物是寡聚-dT引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，寡聚-dT引物的长度为12-18个核苷酸，并结合至在哺乳动物mRNA的3’末端的内源性聚-A尾。随机六核苷酸引物可以在多个互补位点结合至mRNA。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
扩增：在所披露的方法的一些实施例中，可以进行一个或多个核酸扩增反应以产生所述标记的靶核酸分子的多个拷贝(图1和5A-D)。扩增能以多重方式进行，其中多个靶核酸序列同时进行扩增。所述扩增反应可用于将测序适配子添加至所述核酸分子。所述扩增反应可以包括扩增至少一部分的样品标记(如果存在的话)。所述扩增反应可以包括扩增至少一部分的细胞和或分子标记。所述扩增反应可以包括扩增至少一部分的样品标签、细胞标记、分子标记、靶核酸、或其组合。所述扩增反应可以包括扩增所述多个核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或100％。所述方法可以进一步包括进行一个或多个cDNA合成反应，以产生样品标记标签化的核酸、细胞标记标签化的核酸或分子标记标签化的核酸的一个或多个cDNA拷贝。
在一些实施例中，可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。如在此使用的，PCR可以指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特异性DNA序列体外扩增的反应。如在此使用的，PCR可包括所述反应的派生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR和组装PCR。
在一些实施例中，所述标记的核酸的扩增包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增(circle-to-circleamplification)。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多个循环以扩增DNA或RNA靶标、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物杂交至核酸序列并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前切割的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。
在一些情况下，在此披露的方法进一步包括对所述标记的核酸(例如，标记的RNA、标记的DNA、标记的cDNA)进行聚合酶链式反应，以产生标记的扩增子。所述标记的扩增子可以是双链分子。所述双链分子可以包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。所述双链分子的一条或两条链可以包括样品标记、细胞标记或分子标记。可替代地，所述标记的扩增子是单链分子。所述单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本发明的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
在一些实施例中，扩增可以包括使用一种或多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或多个循环中。添加所述非天然核苷酸也可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行所述一个或多个扩增反应可以包括使用一个或多个引物。所述一个或多个引物可以包括一个或多个寡核苷酸。所述一个或多个寡核苷酸可以包括至少约7-9个核苷酸。所述一个或多个寡核苷酸可以包括少于12-15个核苷酸。所述一个或多个引物可以退火至所述多个标记的核酸的至少一部分。所述一个或多个引物可以退火至所述多个标记的核酸的3’末端或5’末端。所述一个或多个引物可以退火至所述多个标记的核酸的内部区。所述内部区可以是从所述多个标记的核酸的3’末端的至少约50、100、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900或1000个核苷酸。所述一个或多个引物可以包括固定的引物面板。所述一个或多个引物可以包括至少一个或多个定制引物。所述一个或多个引物可以包括至少一个或多个对照引物。所述一个或多个引物可以包括至少一个或多个管家基因引物。所述一个或多个引物可以包括通用引物。所述通用引物可以退火至通用引物结合位点。所述一个或多个定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、细胞标记、分子标记、靶核酸或其组合。所述一个或多个引物可以包括通用引物和定制引物。所述定制引物可以被设计成扩增一个或多个靶核酸。所述靶核酸可以包括一个或多个样品中总核酸的亚群。所述靶核酸可以包括一个或多个样品中总标记核酸的亚群。所述一个或多个引物可以包括至少96个或更多个定制引物。所述一个或多个引物可以包括至少960个或更多个定制引物。所述一个或多个引物可以包括至少9600个或更多个定制引物。所述一个或多个定制引物可以退火至两个或更多个不同的标记的核酸。所述两个或更多个不同的标记的核酸可以对应于一个或多个基因。
图5A-D说明了用于本披露的方法的扩增方案的一个实施例。第一PCR反应使用基因特异性引物和针对通用亿明达(Illumina)测序引物1序列的引物扩增附接至珠的分子(图5A)。第二PCR反应使用侧翼于亿明达测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用亿明达测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物(图5B)。第三PCR反应添加P5和P7以及样品索引，以便使PCR产物进入亿明达测序文库(图5C)。使用150bp x 2测序进行的测序揭示了读数1上的细胞标记和分子索引、读数2上的基因以及索引1读数上的样品索引(图5D)。
在一些实施例中，序列数据的下游分析可以通过使用一个或多个靶特异性引物进行扩增反应而集中在所选择的细胞子群上，其中所述一个或多个靶特异性引物能够与例如定义细胞子群的一个或多个基因或基因产物特异性杂交。可以选择一组核酸靶标(核酸标志物或遗传标志物)(例如mRNA靶标)以鉴定例如正经历凋亡的细胞(例如通过监测Bax、Bcl-2、半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7的表达，或可能参与凋亡的其他基因的表达，或其组合)、快速增殖(例如通过监测CKS1B、CCNB2、CDC2、DLG7、BUB3、MAD2L1、DLG7、PLK4、KIF2C、MKI67、BRRN1、NUSAP1、ASPM或KLF7的表达，或可能参与细胞增殖的其他基因的表达，或其组合)或可以基于核酸标志物定义的任何其他细胞子群。使用所述一个或多个靶特异性引物进行的多重扩增反应来产生附接至珠的所述标记的靶核酸分子的多个拷贝，然后可以对其进行测序以产生包括所述一个或多个指定靶核酸分子的细胞列表。
测序：在一些方面，确定不同的标记的核酸的数目可以包括确定所述标记的核酸或其任何产物(例如，标记的扩增子、标记的cDNA分子)的序列。在一些情况下，扩增的靶核酸可经受测序(图1和5A-D)。确定所述标记的核酸或其任何产物的序列可以包括进行测序反应以确定样品标记、细胞标记、分子标记的至少一部分的、所述标记的靶核酸的至少一部分的、其互补体的、其反向互补体的或其任何组合的序列。
可以使用多种测序方法确定核酸的序列(例如，扩增的核酸、标记的核酸、标记的核酸的cDNA拷贝等)，这些方法包括但不限于杂交测序(SBH)、连接法测序(SBL)、量化增量荧光核苷酸附加测序(quantitative incremental fluorescent nucleotide additionsequencing)(QIFNAS)、分段连接与断裂、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标、TaqMan报告探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序(FISSEQ)、FISSEQ珠、摆动测序(wobblesequencing)、多重测序、聚合集群(polymerized colony)(POLONY)测序；纳米格滚环测序(nanogrid rolling circle sequencing)(ROLONY)、等位基因特异性寡核苷酸连接检验(allele-specific oligo ligation assay)(例如，寡核苷酸连接检验(OLA)、使用连接的线性探针和滚环扩增(RCA)读出、连接的持锁探针的单模板分子(single templatemolecule)OLA或使用连接的环形持锁探针和滚环扩增(RCA)读出的单模板分子OLA)等。
在一些情况下，确定所述标记的核酸或其任何产物的序列包括配对末端测序、纳米孔测序、高通量测序、鸟枪法测序、染料终止剂测序、多重引物DNA测序、引物步移、桑格双脱氧测序法、马克西姆-吉尔伯特(Maxim-Gilbert)测序、焦磷酸测序、真正的单分子测序或其任何组合。可替代地，可以通过电子显微镜分析法或化学敏感场效应晶体管(chemFET)阵列来确定所述标记的核酸或其任何产物的序列。
也可以使用高通量测序方法，如使用平台(如Roche 454、Illumina Solexa、ABI-SOLiD、ION Torrent、Complete Genomics、Pacific Bioscience、Helicos、或Polonator平台)的循环阵列测序。在一些实施例中，测序可以包括MiSeq测序。在一些实施例中，测序可以包括HiSeq测序。
在一些实施例中，所述标记的核酸包括代表来自生物体基因组基因的约0.01％至生物体基因组基因的约100％的核酸。例如，可以使用包括多个多聚体的靶互补区，通过从样品中捕获含有互补序列的基因，对约0.01％的生物体基因组基因至约100％的生物体基因组基因进行测序。在一些实施例中，所述标记的核酸包括代表来自约0.01％的生物体转录组转录物至约100％的生物体转录组转录物的核酸。例如，可以使用包括聚-T尾的靶互补区，通过从样品中捕获mRNA，对约0.501％的生物体转录组转录物至约100％的生物体转录组转录物进行测序。
测序可以包括对所述标记的核酸的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。在一些情况下，测序包括对所述标记的核酸的至少约200、300、400、500、600、700、800、900、1,000个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。在其他情况下，测序包括对所述标记的核酸的至少约1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。
测序可以包括至少约200、300、400、500、600、700、800、900、1,000个或更多个测序读数/运行。在一些情况下，测序包括测序至少约1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个或更多个测序读数/运行。测序可以包括小于或等于约1,600,000,000个测序读数/运行。测序可以包括小于或等于约200,000,000个读数/运行。
用于截留的微孔：如上所述的，在一些实施例中，微孔被用来将单细胞和珠(一个珠/细胞)截留在具有限定体积的小反应室内(图6A)。每个珠包括用于随机标记核酸靶标(例如细胞mRNA分子的整个互补体)并对其进行数字计数的寡核苷酸探针文库，当细胞裂解后所述探针被释放。
在所披露的方法、装置和系统的一些实施例中，使用跨基底随机分配的多个微孔。在一些实施例中，所述多个微孔以有序模式例如有序阵列跨基底分配。在一些实施例中，所述多个微孔以随机模式例如随机阵列跨基底分配。在本披露的一个实施例中，所述多个微孔(例如微孔阵列)是所述测定系统的可消耗部件。在其他实施例中，所述多个微孔(例如微孔阵列)可以是可重复使用的。在任一情况下，它们可以被配置成被用作用于手动进行测定的独立式装置，或者它们可以被配置成包括提供测定程序的完全或部分自动的仪器系统的固定或可移除部件。
在所披露的方法的一些实施例中，随机标记的珠基文库(例如寡核苷酸探针)沉积在所述微孔中，作为测定程序的一部分。在一些实施例中，所述珠可以预加载到所述微孔中，并且作为例如用于进行核酸靶标的随机标记和数字计数的试剂盒的一部分提供给用户。在一些实施例中，可以提供两个配对的微孔阵列，一个预先加载有被第一磁体保持在适当位置的珠，并且另一个由用户用来加载单独的细胞。在将细胞分配到第二微孔阵列之后，这两个阵列可以面对面放置，并且第一磁体被去除，而第二磁体被用于将所述珠从第一阵列下拉到第二阵列的对应微孔中，从而确保所述珠位于第二微孔阵列中的细胞上方，并且因此最小化细胞裂解后靶分子的扩散损失，同时最大限度地将靶分子有效附接至所述珠上的随机标记。可以使用多种珠加载和收回工艺中的任何一种，如下面更详细地描述的。
微孔几何形状和尺寸：微孔能以多种形状和大小制造。微孔几何形状和尺寸可能影响细胞加载和珠加载/收回效率，并且通常对其进行选择以最小化每个孔加载多于一个珠的机会。适当的孔几何形状包括但不限于圆柱形、椭圆形、立方形、圆锥形、半球形、矩形或多面体(例如，由若干平面组成的三维几何体，例如矩形长方体、六角柱、八角柱、倒三棱锥、倒四棱锥、倒五棱锥、倒六棱椎或倒截棱锥)。在一些实施例中，非圆柱形微孔(例如具有椭圆形或正方形足迹的孔)可以在能够容纳更大的细胞方面提供优点。在一些实施例中，孔壁的上边缘和/或下边缘可以是圆形的，以避免锐角，并且从而降低由于静电场的集中而在锐边或点产生的静电力。因此，使用修圆的角可以改善从微孔中收回珠的能力。
在一些实施例中，所述微孔的侧壁可以具有非零拔模角度(即，侧壁与垂直于微孔基底的平面的垂直轴之间的角度)。换句话说，微孔的壁可以倾斜而不是垂直，并且正拔模角度在孔的顶部产生更大的开口。在一些实施例中，所述壁可以正或反倾斜至少1度、至少2度、至少3度、至少4度、至少5度、至少6度、至少7度、至少8度、至少9度、至少10度、至少11度、至少12度、至少13度、至少14度、或至少15度或更多度。在一些实施例中，所述壁可以正或反倾斜至多1度、至多2度、至多3度、至多4度、至多5度、至多6度、至多7度、至多8度、至多9度、至多10度、至多11度、至多12度、至多13度、至多15度、或至多15度或更多度。因此，在这些实施例中，微孔的顶部可以具有与微孔的底部不同的直径(或平均直径)。在优选实施例中，所述壁以约3至约7度范围内的正拔模角度倾斜。
在一些实施例中，所述微孔可以包括组合了两种或更多种几何形状的形状。例如，在一个实施例中，它可以是部分圆柱形的，其余部分具有倒锥形的形状。在另一个实施例中，它可以包括两个并列圆柱体，一个的直径(例如大致对应于珠的直径)大于另一个(例如大致对应于细胞的直径)，这两个圆柱体通过延伸圆柱体的全长(深度)的竖直通道或槽(即，平行于圆柱轴)连接。通常，所述微孔的开口端被定位在包括所述多个微孔的基底的上表面上，但是在一些实施例中，所述开口可以被定位在所述基底的下表面上。在一些实施例中，例如，如果基本上平的平面基底在垂直方向上以一个长轴定向，那么所述开口可以被定位于所述基底的一侧，例如既不是上表面也不是下表面。通常，所述微孔的封闭端(或底部)是平的，但曲面(例如，凸出或凹陷)也是可能的。通常，基于待俘获在微孔中的细胞或珠的类型确定微孔的形状(和大小)。
可以就孔的平均直径和深度而言来表征微孔尺寸。如在此使用的，微孔的平均直径是指可以内切于微孔几何体的平面横截面内的最大圆。在本披露的一个实施例中，微孔的平均直径的范围可以是待俘获在微孔内的细胞或珠的直径的从约1倍至约10倍。在其他实施例中，平均微孔直径是待俘获在微孔内的细胞或珠的直径的至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。在又其他实施例中，平均微孔直径是待俘获在微孔内的细胞或珠的直径的至多10倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍、至多2倍、至多1.5倍或至多1倍。在一个实施例中，平均微孔直径是待俘获在微孔内的细胞或珠的直径的约2.5倍。本领域的普通技术人员应理解的是，微孔的平均直径可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，待俘获在微孔内的细胞或珠的直径的从约1.2倍至约3.5倍)。在一些实施例中，所述多个微孔中的每个微孔的平均直径可以是相同的。在其他实施例中，所述多个微孔中的单独的微孔的平均直径可以是不同的。
可替代地，可以就绝对尺寸而言指定微孔的直径。在本披露的一个实施例中，微孔的平均直径的范围可以是从约5μm至约100μm。在其他实施例中，平均微孔直径是至少5μm、至少10μm、至少15μm、至少20μm、至少25μm、至少30μm、至少35μm、至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm或至少100μm。在又其他实施例中，平均微孔直径是至多100μm、至多90μm、至多80μm、至多70μm、至多60μm、至多50μm、至多45μm、至多40μm、至多35μm、至多30μm、至多25μm、至多20μm、至多15μm、至多10μm或至多5μm。在一个实施例中，平均微孔直径是约50μm。本领域的普通技术人员应理解的是，微孔的平均直径可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约34μm至约64μm)。
可以选择微孔深度以提供细胞和珠的有效俘获。可以选择微孔深度以提供包含在孔内的测定缓冲液和其他试剂的有效交换。可以选择微孔深度与平均直径的比率(即纵横比)，使得一旦细胞和珠沉积在微孔内，它们将不会由于微孔上方的流体运动而移位。可以选择微孔的尺寸，使得微孔具有足够的空间以容纳各种大小的珠和细胞，而不会由于微孔上方的流体运动而移动。在本披露的一个实施例中，微孔的深度的范围可以是待俘获在微孔内的细胞或珠的直径的从约1倍至约10倍。在其他实施例中，微孔深度是待俘获在微孔内的细胞或珠的直径的至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。在又其他实施例中，微孔深度是待俘获在微孔内的细胞或珠的直径的至多10倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍、至多2倍、至多1.5倍或至多1倍。在一个实施例中，微孔深度是待俘获在微孔内的细胞或珠的直径的约2.5倍。本领域的普通技术人员应理解的是，微孔深度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，待俘获在微孔内的细胞或珠的直径的从约1.2倍至约3.5倍)。
对于圆柱形几何形状的微孔，珠直径与微孔直径的合适比率的范围可以是从约0.1至约1.0。在一些实施例中，珠直径与微孔直径的比率是至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.9、至少0.95或至少0.99。在一些实施例中，珠直径与微孔直径的比率是至多0.99、至多0.95、至多0.9、至多0.8、至多0.7、至多0.6、至多0.5、至多0.4、至多0.3、至多0.2或至多0.1。在一些实施例中，珠直径与微孔直径的比率可以具有0.67的值。本领域的普通技术人员应认识的是，珠直径与微孔直径的比率可以具有在所述范围内的任何值，例如约0.75。
对于圆柱形几何形状的微孔，合适的孔深度与直径的纵横比的范围可以是从约0.1至约2。在一些实施例中，孔深度与直径的纵横比是至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.9、至少0.95、至少1.0、或至少1.05、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9或至少2.0。在一些实施例中，孔深度与直径的纵横比是至多2、至多1.9、至多1.8、至多1.7、至多1.6、至多1.5、至多1.4、至多1.3、至多1.2、至多1.1、至多1.1、至多1.05、至多1.0、至多0.95、至多0.9、至多0.8、至多0.7、至多0.6、至多0.5、至多0.4、至多0.3、至多0.2或至多0.1。在一些实施例中，孔深度与直径的纵横比可以具有0.9的值。本领域的普通技术人员应认识的是，孔深度与直径的纵横比可以具有在所述范围内的任何值，例如约0.94。
可替代地，可以就绝对尺寸而言指定微孔的深度。在本披露的一个实施例中，微孔的深度的范围可以是从约5μm至约100μm。在其他实施例中，微孔深度是至少5μm、至少10μm、至少20μm、至少25μm、至少30μm、至少35μm、至少40μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm或至少100μm。在又其他实施例中，微孔深度是至多100μm、至多90μm、至多80μm、至多70μm、至多60μm、至多50μm、至多40μm、至多35μm、至多30μm、至多25μm、至多20μm、至多10μm或至多5μm。在一个实施例中，微孔深度是约30μm。本领域的普通技术人员应理解的是，微孔深度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约24μm至约36μm)。
在本披露的方法、装置和系统中使用的微孔的体积的范围可以是从约200μm3至约800,000μm3。在一些实施例中，微孔体积是至少200μm3、至少500μm3、至少1,000μm3、至少10,000μm3、至少25,000μm3、至少50,000μm3、至少100,000μm3、至少200,000μm3、至少300,000μm3、至少400,000μm3、至少500,000μm3、至少600,000μm3、至少700,000μm3或至少800,000μm3。在其他实施例中，微孔体积是至多800,000μm3、至多700,000μm3、至多600,000μm3、500,000μm3、至多400,000μm3、至多300,000μm3、至多200,000μm3、至多100,000μm3、至多50,000μm3、至多25,000μm3、至多10,000μm3、至多1,000μm3、至多500μm3或至多200μm3。在一个实施例中，微孔体积是约119,000μm3。本领域的普通技术人员应理解的是，微孔体积可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约18,000μm3至约350,000μm3)。
在本披露的方法、装置和系统中使用的微孔的体积可以就从一个微孔到另一个微孔的体积变化而言来进一步表征。在一些实施例中，微孔体积的变异系数(表示为百分比)的范围可以是从约1％至约10％。在一些实施例中，微孔体积的变异系数可以是至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％。在一些实施例中，微孔体积的变异系数可以是至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％或至多1％。微孔体积的变异系数可以具有在由这些值包括的范围内的任何值，例如在约1.5％和约6.5％之间。在一些实施例中，微孔体积的变异系数可以是约2.5％。
在本披露的方法、装置、试剂盒和系统中使用的微孔的体积与珠的表面积(或随机标记寡核苷酸可以附接的固体支持物的表面积)的比率的范围可以是从约2.5至约2,500(以微米为单位)。在一些实施例中，所述比率是至少2.5、至少5、至少10、至少100、至少500、至少750、至少1,000、至少1,250、至少1,500、至少1,750、至少2,000、至少2,250或至少2,500。在其他实施例中，所述比率是至多2,500、至多2,250、至多2,000、至多1,750、至多1,500、至多1,250、至多1,000、至多750、至多500、至多100、至多10、至多5或至多2.5。在一个实施例中，所述比率是约67.5。本领域的普通技术人员应理解的是，微孔体积与珠(或用于固定的固体支持物)的表面积的比率可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约30至约120)。
微孔的随机和有序阵列：在一些实施例中，所述多个微孔的孔可以被安排在一维、二维或三维阵列中，其中三维阵列可以例如通过堆积一系列的两个或更多个二维阵列(即，通过堆积包括微孔阵列的两个或更多个基底)来实现。通常，对孔之间的模式和间隔进行选择，以便优化在每个孔中俘获单细胞和单一珠的效率，并且最大化基底的每单位面积的孔数目。可以根据多种随机或非随机模式来分配所述微孔，例如，它们可以在基底的表面上完全随机地分配，或者它们可以被安排成方形网格、矩形网格、六角网格、圆形图样等。
在本披露的一些实施例中，孔之间的中心距(或“间距”或“间隔”)可以从约15μm至约75μm变化。在其他实施例中，孔之间的间隔是至少15μm、至少20μm、至少25μm、至少30μm、至少35μm、至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少55μm、至少60μm、至少65μm、至少70μm或至少75μm。在又其他实施例中，微孔间隔是至多75μm、至多70μm、至多65μm、至多60μm、至多55μm、至多50μm、至多45μm、至多40μm、至多35μm、至多30μm、至多25μm、至多20μm或至多15μm。在一个实施例中，微孔间隔是约55μm。本领域的普通技术人员应理解的是，微孔间隔可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约18μm至约72μm)。
所述多个微孔中的孔的总数目由孔的模式和间隔以及基底的总尺寸决定。在本披露的一个实施例中，阵列中的微孔数目的范围可以是从约10至约5,000,000或更高。在其他实施例中，阵列中的微孔数目是至少10、至少96、至少384、至少1,536、至少2,500、至少5,000、至少10,000、至少25,000、至少50,000、至少75,000、至少100,000、至少200,000、至少300,000、至少400,000、至少500,000、至少600,000、至少700,000、至少800,000、至少900,000、至少1,000,000、至少2,500,000或至少5,000,000。在又其他实施例中，阵列中的微孔数目是至多5,000,000、至多2,500,000、至多1,000,000、至多900,000、至多800,000、至多700,000、至多600,000、至多500,000、至多400,000、至多300,000、至多200,000、至多100,000、至多75,000、至多50,000、至多25,000、至多10,000、至多5,000、至多2,400、至多1,536、至多384、至多96个孔或至多10个孔。在一个实施例中，所述多个微孔中的微孔数目是约96。在一个实施例中，所述多个微孔中的微孔数目是约10,000。在又另一个实施例中，微孔数目是约150,000。本领域的普通技术人员应理解的是，所述多个微孔中的微孔数目可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，约144,000个微孔)。
微孔基底表面特征：在一些实施例中，所述多个微孔在微孔之间可以包括表面特征，其被设计成帮助引导细胞和珠进入孔或防止它们沉降在孔之间的基底表面上。适合的表面特征的实例包括但不限于环绕孔或跨过孔之间的表面的圆形的、半球形的、脊形的或尖形的表面特征。图7A-B和8A-B示出了微孔阵列的显微照片，其中孔被半球形的脊(图7B，501)隔开，以最小化沉积在孔之间的表面上的细胞或珠的数目。
微孔制造：可以使用本领域的普通技术人员已知的多种制造技术中的任何一种来制造微孔。可以使用的制造方法的实例包括但不限于体微机械加工技术，如光刻法和湿化学蚀刻、等离子蚀刻或深反应离子蚀刻；微模塑和微压花；激光微机械加工；3D打印或使用可固化材料的其他直接写入制造工艺；以及类似技术。
微孔可以由本领域的普通技术人员已知的多种基底材料中的任何一种制造而来，其中材料的选择典型地取决于制造技术的选择，反之亦然。适合的材料的实例包括但不限于硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物(例如，琼脂糖、明胶、水凝胶、聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、光学粘合剂(例如Norland Optical Adhesive 63)、环氧树脂、基于硫醇-烯的树脂)、金属或金属膜(例如，铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)等。典型地，亲水材料对于制造微孔阵列而言是令人希望的(例如，以增强润湿性并最小化细胞和其他生物材料的非特异性结合)，但是可以(例如，通过氧等离子体处理，或聚环氧乙烷表层的接枝)可处理或涂覆的疏水材料也是可以使用的。使用多孔亲水材料来制造微孔阵列可以是令人希望的，以便有助于装置中截留的气泡的毛细管芯吸/通气。在一些实施例中，所述微孔由单一材料制造而来。在其他实施例中，微孔可以包括两种或更多种已经粘合在一起或机械连接的不同材料。
微孔可以使用具有多种大小与性状中的任何一种的基底来制造。在一些实施例中，例如，其内制造有微孔的基底的形状(或足迹)可以是正方形、矩形、圆形或不规则形状。在一些实施例中，所述微孔基底的足迹将类似于微量滴定板的。在一些实施例中，所述微孔基底的足迹将类似于标准显微镜载玻片的，例如约75mm长x 25mm宽(约3”长x 1”宽)或约75mm长x 50mm宽(约3”长x 2”宽)。
在一些实施例中，其内制造有微孔的基底的厚度的范围可以是从约0.1mm厚至约10mm厚或更厚。在一些实施例中，微孔基底的厚度可以是至少0.1mm厚、至少0.5mm厚、至少1mm厚、至少2mm厚、至少3mm厚、至少4mm厚、至少5mm厚、至少6mm厚、至少7mm厚、至少8mm厚、至少9mm厚或至少10mm厚。在一些实施例中，微孔基底的厚度可以是至多10mm厚、至多9mm厚、至多8mm厚、至多7mm厚、至多6mm厚、至多5mm厚、至多4mm厚、至多3mm厚、至多2mm厚、至多1mm厚、至多0.5mm厚或至多0.1mm厚。在一些实施例中，微孔基底的厚度将是约1mm厚。对于本领域的普通技术人员显而易见的是，微孔基底的厚度可以是这些范围内的任何值，例如，微孔基底的厚度可以在约0.2mm和约9.5mm之间。
在一些实施例中，其中制造有微孔的基底本身可以包括三维几何形状，例如，所述基底可以是球形、圆柱形、椭圆形、圆锥形、半球形、立方形、矩形或多面体形，或者可以具有不规则三维几何形状。
微孔和基底涂层：可以使用多种表面处理和表面改性技术来改变微孔表面的性质，例如改善珠和细胞的润湿性和/或降低珠和细胞对微孔或基底表面的粘附性。合适的表面处理的实例包括但不限于氧等离子体处理以使得疏水材料表面更亲水，使用湿或干蚀刻技术以使玻璃和硅表面光滑(或粗糙)，将聚环氧乙烷、聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸-PEG或其他聚合物层(例如普朗尼克多元醇，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(pHEMA或聚HEMA))、聚山梨醇酯(例如，吐温20、吐温80、吐温60)或蛋白质(例如牛血清白蛋白)吸附(例如非特异性吸附或静电吸附)或接枝到基底表面以使它们更亲水(或在一些情况下更疏水)并且更不易于通过生物分子和细胞的非特异性吸附而结垢。在一些实施例中，可以使用表面涂层的施加来使基底表面对于细胞来说无毒且无粘性。在一些实施例中，可以使用表面涂层或改性技术来中和带电表面。在一些实施例中，可以使用表面涂层或改性技术来将电荷添加到另外的中性表面。在一些实施例中，硅烷反应可用于将化学反应性官能团接枝到另外的惰性硅和玻璃表面等。光脱保护技术可以用于选择性地活化微孔结构中的特定位置处的化学反应性官能团，例如，选择性添加或活化微孔的内壁上的化学反应性官能团(如伯胺或羧基基团)可以用于将寡核苷酸探针、肽、蛋白质或其他生物分子共价偶联至微孔壁。通常，利用的表面处理或表面改性的选择取决于所希望的表面特性的类型和制成微孔的材料的类型两者。
Figure GDA0002954171600000461
多元醇是基于环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物表面活性剂，其可以提供在改善润湿性方面的优点。可商购的
Figure GDA0002954171600000462
产品的实例包括但不限于
Figure GDA0002954171600000463
10R5、
Figure GDA0002954171600000464
17R2、
Figure GDA0002954171600000465
17R4、
Figure GDA0002954171600000466
25R2、
Figure GDA0002954171600000467
25R4、
Figure GDA0002954171600000468
31R1、
Figure GDA0002954171600000469
F 108Cast Solid Surfactant、
Figure GDA00029541716000004610
F 108NF、
Figure GDA00029541716000004611
F108Pastille、
Figure GDA00029541716000004612
F 108NF Prill Poloxamer 338、
Figure GDA00029541716000004613
F 127NF、
Figure GDA00029541716000004614
F127NF 500BHT Prill、
Figure GDA00029541716000004615
F 127NF Prill Poloxamer 407、
Figure GDA00029541716000004616
F 38、
Figure GDA00029541716000004617
F 38Pastille、
Figure GDA00029541716000004618
F 68、
Figure GDA00029541716000004619
F 68LF Pastille、
Figure GDA00029541716000004620
F68NF、
Figure GDA00029541716000004621
F 68NF Prill Poloxamer 188、
Figure GDA00029541716000004622
F 68Pastille、
Figure GDA00029541716000004623
F77、
Figure GDA00029541716000004624
F 77Micropastille、
Figure GDA00029541716000004625
F 87、
Figure GDA00029541716000004626
F 87NF、
Figure GDA00029541716000004627
F 87NFPrill Poloxamer 237、
Figure GDA00029541716000004628
F 88、
Figure GDA00029541716000004629
F 88Pastille、
Figure GDA00029541716000004630
FT L 61、
Figure GDA00029541716000004631
L 10、
Figure GDA00029541716000004632
L 101、
Figure GDA00029541716000004633
L 121、
Figure GDA00029541716000004634
L 31、
Figure GDA00029541716000004635
L 35、
Figure GDA00029541716000004636
L 43、
Figure GDA00029541716000004637
L 61、
Figure GDA00029541716000004638
L 62、
Figure GDA00029541716000004639
L 62LF、
Figure GDA00029541716000004640
L 62D、
Figure GDA00029541716000004641
L 64、
Figure GDA00029541716000004642
L 81、
Figure GDA00029541716000004643
L 92、
Figure GDA00029541716000004644
L44NF INH surfactantPoloxamer 124、
Figure GDA00029541716000004645
N 3、
Figure GDA00029541716000004646
P 103、
Figure GDA00029541716000004647
P 104、
Figure GDA00029541716000004648
P 105、
Figure GDA00029541716000004649
P 123Surfactant、
Figure GDA00029541716000004650
P 65、
Figure GDA00029541716000004651
P 84、以及
Figure GDA00029541716000004652
P 85，可从巴斯夫(BASF)(弗洛勒姆帕克，新泽西州)获得。
当被包括在测定缓冲液中时，可能有利于改善润湿性和/或降低珠和细胞对微孔或基底表面的粘附的两性离子洗涤剂的实例包括但不限于1-十二烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、3-(4-叔丁基-1-吡啶基)-1-丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基肉豆蔻基胺基)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基肉豆蔻基胺基)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基肉豆蔻基胺基)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基十八烷基胺基)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基辛基胺基)丙磺酸盐内盐、3-(N,N-二甲基棕榈基胺基)丙磺酸盐、3-(1-吡啶基)-1-丙磺酸盐、3-(苄基二甲基胺基)丙磺酸盐BioXtra、3-(癸基二甲基胺基)-丙磺酸盐内盐两性离子洗涤剂、3-(N,N-二甲基辛基胺基)丙磺酸盐、3-[N,N-二甲基(3-棕榈酰氨基丙基)胺基]-丙磺酸盐、来自大豆(Glycine max，soybean)的L-α-溶血磷脂酰胆碱、来自牛脑的L-α-溶血磷脂酰胆碱、来自蛋黄的L-α-溶血磷脂酰胆碱、来自大豆(soybean)的L-α-溶血磷脂酰胆碱、ASB-14、ASB-C80、C7BzO、CHAPS、CHAPS水合物、CHAPS水合物BioReagent、CHAPS水合物BioXtra、CHAPSO、CHAPSO BioXtra、DDMAB、二甲基乙基丙磺酸铵、
Figure GDA0002954171600000471
BB洗涤剂、水合米替福新、米替福新、N,N-二甲基十二烷基胺N-氧化物溶液BioUltra、N,N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸盐、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸盐、O-(癸基磷酰基)胆碱、O-(辛基磷酰基)胆碱、聚(马来酸酐-alt-1-癸烯)、3-(二甲基氨基)-1-丙胺衍生物BioReagent、聚(马来酸酐-alt-1-十四碳烯)、3-(二甲基氨基)-1-丙胺衍生物BioReagent、2,3-二巯基丙磺酸钠一水合物和来自枯草芽孢杆菌的表面活性素，可从西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(圣路易斯，密苏里州)获得。
当被包括在测定缓冲液中时，可能有利于改善润湿性和/或降低珠和细胞对微孔或基底表面的粘附的其他洗涤剂的实例包括但不限于阴离子、阳离子和非离子洗涤剂。非离子洗涤剂包括聚(氧乙烯)醚和相关聚合物(例如
Figure GDA0002954171600000472
Figure GDA0002954171600000473
TRITON X-100和
Figure GDA0002954171600000474
CA-630)、胆盐和糖苷洗涤剂。
微孔的密封：在一些实施例中，可能有利的是在例如细胞裂解步骤过程中将微孔的开口密封，以防止相邻微孔之间的靶核酸进行交叉杂交。微孔(或多个微孔)可以使用例如夹紧在微孔基底的表面上的固体材料(即，板或箔)的柔性膜或片或者合适的珠来密封或加帽，其中所述珠的直径大于所述微孔的直径。使用固体材料的柔性膜或片形成的密封可以包括例如无机纳米孔膜(例如，氧化铝)、透析膜、载玻片、盖玻片、弹性体膜(例如，PDMS)或亲水性聚合物膜(例如，涂覆有已经用裂解缓冲液水合的琼脂糖薄膜的聚合物膜)。
在一些实施例中，通过在适当的物理或化学刺激下经历相变的不混溶流体或材料置换孔上方的流体可以密封微孔(或孔)。合适的流体和材料的实例包括但不限于矿物油、蜡、聚合物溶液、对UV光有反应的光学粘合剂(例如Norland 63或81)和依赖于聚合物的浓度和分子量具有接近室温的Tms的可以经历溶液-凝胶相变的普朗尼克多元醇溶液。
用于对所述微孔加帽的珠可以包括例如交联葡聚糖珠(例如，Sephadex)。交联葡聚糖的范围可以是从约10微米至约80微米。用于加帽的交联葡聚糖珠可以是从20微米至约50微米。在一些实施例中，所述珠可以例如比所述微孔的直径大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。可替代地，用于加帽的珠可以比所述微孔的直径大至多约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在一些实施例中，所述密封或帽可以允许缓冲液穿过进出所述微孔，同时阻止大分子(例如，核酸)从所述孔中迁移出来。在一些实施例中，通过所述密封或帽可以阻挡至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个核苷酸的大分子迁移进入或离开所述微孔。在一些实施例中，通过所述密封或帽可以阻挡至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个核苷酸的大分子迁移进入或离开所述微孔。
微孔的替代物：在一些实施例中，可以使用微孔的替代物来隔区化单独的细胞和珠，例如单一珠和单细胞可以被限制在乳液中的单一液滴中(例如在液滴数字微流体系统中)。可替代地，细胞可以被限制在多孔珠内，这些珠本身包括所述多个栓系随机标记。如本领域的普通技术人员将理解的，单独的细胞和珠可以在任何类型的容器、微容器、反应室、反应容器等中隔区化。因此，在一些实施例中，可以在不使用微孔的情况下进行单细胞、随机标记或分子条码化测定。在一些实施例中，可以在不使用任何物理容器的情况下进行单细胞、随机标记或分子条码化测定，例如通过将细胞和珠彼此靠近地嵌入聚合物层或凝胶层内以在不同细胞/珠对之间产生扩散屏障。
微孔内的珠分配：在一些实施例中，包括拴系随机标记文库的珠可以被分配在多个微孔中，作为测定程序的一部分。在一些实施例中，作为用于并入包括多个微孔的基底的流动池或柱体的制造过程的一部分，可以将所述珠预先加载到多个微孔中。在一些实施例中，含有单一珠的微孔的百分比可以在1％和100％之间。在一些实施例中，所述多个微孔中的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的微孔可以含有单一珠。在一些实施例中，所述多个微孔中的至多100％、至多99％、至多95％、至多90％、至多80％、至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的微孔可以含有单一珠。
微孔内的细胞分配：在许多实施例中，细胞可以被分配在多个微孔中，作为测定程序的一部分。在一些实施例中，含有单细胞的微孔的百分比可以在1％和100％之间。在一些实施例中，所述多个微孔中的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的微孔可以含有单细胞。在一些实施例中，所述多个微孔中的至多100％、至多99％、至多95％、至多90％、至多80％、至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的微孔可以含有单细胞。
含有单细胞和单一珠的微孔：在许多实施例中，细胞和珠可以被分配在多个微孔中，使得一部分的微孔含有单细胞和单一珠两者。在一些实施例中，含有单细胞和单一珠的微孔的百分比可以在约1％和约100％之间。在一些实施例中，所述多个微孔中的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的微孔可以含有单细胞和单一珠两者。在一些实施例中，所述多个微孔中的至多100％、至多99％、至多95％、至多90％、至多80％、至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的微孔可以含有单细胞和单一珠两者。
包括具有微孔的基底的机械固定器：
当手动进行多重、单细胞随机标记或分子条码化测定时，可能方便的是将微孔基底安装在机械固定器中(图9A-B、10、11)，以便产生反应室，其有助于将细胞悬浮液和测定试剂移液管移取或分发到基底上。在图11说明的实例中，铰链式固定器接受在1mm厚的基底上制造的微孔阵列，并且提供呈硅酮垫圈形式的机械支持物，以便将测定试剂限制在16mm宽x 35mm长x大约1mm深的反应室中，由此允许使用800ul至1ml的细胞悬浮液和珠悬浮液(包括基于珠的随机标记)进行测定。
所述固定器可以由例如刚性的机器加工的顶板和底板(例如，铝)以及用于产生室壁或孔的可压缩(例如，硅酮、聚二甲基硅氧烷)垫圈组成。设计特征包括：(i)用于根据需要将显微镜物镜旋转进出适当位置的倒角孔径边缘和间隙(用于在不同放大倍数下查看微孔阵列)，(ii)硅酮垫圈的可控压缩以确保与微孔阵列基底统一地可重复的形成防漏密封，(iii)用于方便操作的系留紧固件，(iv)用于牢固且可重复地定位阵列的定位夹紧机构，以及(v)用于在漂洗步骤过程中移除阵列的方便开口。
所述顶板和底板可以使用多种材料(例如，铝、阳极氧化铝、不锈钢、特氟龙、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)或类似的刚性聚合物材料)使用多种技术中的任何一种(例如，常规机器加工、CNC机器加工、注塑、3D打印等)来制造。
所述顶板和底板以及硅酮(聚二甲基硅氧烷；PDMS)垫圈可以被配置成产生多个室(参见图10)，以便平行地运行对照和实验(或重复实验)。所述垫圈可以使用例如特氟龙模具由PDMS或类似的弹性体材料模塑而来，所述模具包括针对垂直垫圈的拔模角度以提供良好的释放特征。可替代地，模具可以由铝或其他材料(例如，黑迭尔林(delrin)、聚醚酰亚胺(ultem)等)机器加工而来，并且如果必要用材料如特氟龙涂覆以提供良好的释放特征。所述垫圈模具设计可以是颠倒的，即，这样使得模制件的顶表面(即与在铸造过程中用于覆盖模具的、载玻片或硅晶片界面结合处的表面)在使用过程中变为用于与微孔基底产生密封的表面，由此避免在产生光滑垫圈表面(以确保与基底形成防漏密封)中模具表面粗糙度和表面污染的潜在问题，并且通过在铸造过程中使用微孔基底作为基部还提供了基底材料的灵活选择和预组装的选择权。所述垫圈模具设计还可以包括孔区边界处的聚力脊(forcefocusing ridge)，即模具中的一个或多个中央台面(mesa)(其形成一个或多个孔)在成为所述一个或多个孔的周界的位置处具有凸起的脊，这样使得在填充后放置在模具顶部的盖停留在精确位置处的小接触面积上，在所述精确位置处良好的边缘轮廓对于在使用过程中在垫圈与基底之间形成防漏密封而言是关键的。
装置和仪器系统：
本披露还包括用于支持多重、单细胞随机标记和分子条码化测定的自动化的装置、仪器系统和消耗品。此类系统可以包括并入与流动池整合的微孔的可消耗柱体，连同用于提供控制和分析功能性所必需的仪器装备，所述功能性是如(i)射流控制、(ii)细胞或珠分配和收集机构、(iii)细胞裂解机构、(iv)磁场控制、(v)温度控制、(vi)成像能力以及(vii)图像处理。在一些实施例中，所述系统的输入包括细胞样品并且输出包括包含具有附接的寡核苷酸的珠的珠悬浮液，所述寡核苷酸并入了样品标记、细胞标记或分子标记。在其他实施例中，所述仪器系统可以包括另外的功能性，如用于进行PCR扩增的热循环能力，在这种情况下所述系统的输入包括细胞样品并且输出包括由寡核苷酸的扩增产生的寡核苷酸文库，所述寡核苷酸并入了最初附接至珠的样品标记、细胞标记或分子标记。在又其他实施例中，所述系统还可以包括测序能力，需要或不需要寡核苷酸扩增，在这种情况下，所述系统的输入是细胞样品并且输出包括数据集，所述数据集进一步包括与感兴趣的靶序列相关的所有样品标记、细胞标记或分子标记的序列。
流动池：在所述自动化测定系统的许多实施例中，所述微孔基底被包装在流动池内(图12)，所述流动池提供与流体处理系统的其余部分的方便界面结合并且有助于被递送至所述微孔的流体(例如，细胞和珠悬浮液、裂解缓冲液、漂洗缓冲液等)的交换。在许多实施例中，所述流动池可以被设计成有助于细胞和珠跨所述多个微孔的均匀分配。设计特征可以包括：(i)一个或多个用于引入细胞样品、珠悬浮液或其他测定试剂的入口，(ii)一个或多个被设计成提供均匀填充和有效流体交换同时最小化回涡或死区的微孔室，以及(iii)一个或多个用于将流体递送到样品收集点或废物储器的出口。在一些实施例中，所述流动池的设计可以包括与单一基底上的多个微孔阵列或与多个微孔阵列基底界面结合的多个微孔室，这样使得可以平行处理一个或多个细胞样品。在一些实施例中，可以调整所述流动池的设计，例如流体通道和室的布局，使得在给定设计中不同的微孔模式(即可配置的微阵列模式)存取流体。
在一些实施例中，所述流动池的设计可以进一步包括用于跨微孔室的宽度产生匀流速度剖面图(即“活塞流”)的特征，以提供细胞和珠到微孔的更均匀递送，例如，通过使用作为“流动扩散器(flow diffuser)”的位于室入口附近和微孔上游的多孔隔板，或通过将每个微孔室分成若干分段，所述分段共同覆盖相同的总阵列区，但是通过它们分开的入口液流平行地流动。
流动池设计的非限制性实例在图13A中进行了说明，并且包括具有居中的入口和出口的设计，其中入口和出口在两个或三个维度上是锥形的；具有偏离中心的入口和出口的设计，其中所述入口和出口在两个或三个维度上是锥形的；以及具有多个入口和/或出口的设计，其中一些或全部入口和出口可以偏离中心。在一些实施例中，入口还可以用作出口，以有助于设计和组装的容易性，以及提供在珠收回效率方面的对称性相关改善。
图13B-C示意性地说明了替代的流动池设计，其中入口和出口通过锥形的倾斜的入口和出口流体通道连接到微孔阵列室。图13B说明了流动池设计的俯视图。图13C说明了流动池的横截面侧视图，其中入口和出口通道各自相对于微孔基底平面形成一个角度。在一些实施例中，微孔阵列室的垂直高度(即深度)典型在大约1mm的数量级上(但是可以取在本披露的其他地方指定的范围内的任何值)，并且因此允许将压力用于驱动流体流动时的抛物线型流速度剖面图(图13C)。使用抛物线型流与散布的空气注入相结合，如本披露的其他地方所述的，允许液体/空气界面在流体注入之间扫过微孔基底的表面，并且可以提供在改善细胞和/或珠加载效率方面的优点。在一些实施例中，由入口和出口通道形成的角度可以是相同的。在一些实施例中，由入口和出口通道形成的角度可以是不同的。在一些实施例中，由入口和/或出口流体通道形成的角度相对于微孔基底平面可以在从约15度至约75度的范围内。在一些实施例中，所述角度可以是至少15度、至少20度、至少25度、至少30度、至少35度、至少40度、至少45度、至少50度、至少55度、至少60度、至少65度、至少70度、或至少75度或更多度。在一些实施例中，所述角度可以是至多75度、至多70度、至多65度、至多60度、至多55度、至多50度、至多45度、至多40度、至多35度、至多30度、至多25度、至多20度或至多15度。在一些实施例中，由入口和/或出口流体通道形成的角度相对于微孔基底平面可以在从约30度至约60度的范围内。在一些实施例中，由入口和/或出口流体通道形成的角度可以是约45度。
在一些实施例中，所述流动池可以构成所述仪器系统的固定部件。在一些实施例中，所述流动池可以是可从所述仪器系统移除的。在一些实施例中，所述流动池可以是单次使用装置。在其他实施例中，所述流动池可以是多次使用装置。
流动池流体通道尺寸：通常，可以优化流体通道和所述一个或多个微孔室在流动池设计中的尺寸，以便(i)提供细胞和珠到所述微孔的均匀递送，和(ii)最小化样品和试剂消耗。在一些实施例中，流体通道或微孔室的宽度将在50μm和20mm之间。在其他实施例中，流体通道或微孔室的宽度可以是至少50μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少750μm、至少1mm、至少2.5mm、至少5mm、至少10mm、至少20mm、至少50mm、至少100mm或至少150mm。在又其他实施例中，流体通道或微孔室的宽度可以是至多150mm、至多100mm、至多50mm、至多20mm、至多10mm、至多5mm、至多2.5mm、至多1mm、至多750μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm或至多50μm。在一个实施例中，流体通道的宽度是约2mm。本领域的普通技术人员应理解的是，流体通道或微孔室的宽度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约250μm至约10mm)。
在一些实施例中，流体通道的深度将在50μm和5mm之间。在其他实施例中，流体通道的深度可以是至少50μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少750μm、至少1mm、至少1.25mm、至少1.5mm、至少1.75mm、至少2mm、至少2.25mm、至少2.5mm、至少2.75mm、至少3mm、至少4mm或至少5mm。在又其他实施例中，流体通道的深度可以是至多5mm、至多4mm、至多3mm、至多2.75mm、至多2.5mm、至多2.25mm、至多2mm、至多1.75mm、至多1.5mm、至多1.25mm、至多1mm、至多750μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm或至多50μm。在一个实施例中，流体通道的深度是约1mm。本领域的普通技术人员应理解的是，流体通道的深度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约800μm至约3mm)。
流动池制造：所述流动池可以被制造为单独零件并且随后被机械地夹紧或永久地粘合到微孔阵列基底上。适合的制造技术的实例包括常规机器加工、CNC机器加工、注塑、3D打印、对齐并层压一层或多层激光切割或冲切聚合物膜或多种微制造技术中的任何一种，如光刻法和湿化学蚀刻、干蚀刻、深反应离子蚀刻或激光微机械加工。在一些实施例中，所述流体层是由弹性体材料3D打印的。
流动池可以使用本领域的普通技术人员已知的多种材料制造而来。通常，所使用的材料的选择将取决于所使用的制造技术的选择，反之亦然。适合的材料的实例包括但不限于硅、熔融二氧化硅、玻璃、多种聚合物中的任何一种(例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、光学粘合剂(NOA)、环氧树脂)、金属(例如，铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)、非粘性材料(如特氟龙(PTFE))或这些材料的组合。在一些实施例中，包括多个层的流动池中的不同层可以由不同的材料制成，例如，流体通道层可以由弹性体材料制成，而微孔基底和盖板(顶部)可以由玻璃或另一种合适的材料制成。在一些实施例中，选择用于制造流动池的所述一种或多种材料将是乙醇相容的，使得用乙醇或乙醇:水溶液启动流体装置可以用于促进表面润湿和从所述装置中去除被俘获的空气。
在一些实施例中，所述流动池可以包括三层结构，其包括微孔阵列基底、流体通道层(流体层)和盖板(即顶部或界面层)，由此微孔阵列室的体积由微孔阵列室的横截面积和流体通道层的厚度决定(参见图14A-B)。在一些实施例中，所述流动池-微孔阵列基底组件可以包括两层、三层、四层、五层或多于五层。
如上所指出的，在一些实施例中，流体通道层的厚度将决定流体通道和微孔阵列室的深度，并将影响微孔阵列室的总体积。在一些实施例中，流体通道层的厚度将在50μm和3mm之间。在其他实施例中，流体通道层的厚度可以是至少50μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少750μm、至少1mm、至少1.25mm、至少1.5mm、至少1.75mm、至少2mm、至少2.25mm、至少2.5mm、至少2.75mm或至少3mm。在又其他实施例中，流体通道层的厚度可以是至多3mm、至多2.75mm、至多2.5mm、至多2.25mm、至多2mm、至多1.75mm、至多1.5mm、至多1.25mm、至多1mm、至多750μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm或至多50μm。在一个实施例中，流体通道层的厚度是约0.8mm。在另一个实施例中，流体通道层的厚度是约1.2mm、2mm或3mm。本领域的普通技术人员应理解的是，流体通道的深度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约800μm至约1.6mm)。
在一些实施例中，可以在单一集成零件中制造多个层，例如如图15-18所示的集成流动池和垫圈零件的3D打印。在3D打印零件不足够平以实现与基底或盖板的良好粘合的情况下，可以并入设计特征，如密封环(也是3D打印的)(参见图19A)。在一些实施例中，可以将多于一种材料用于3D打印单一部件或组件，例如，流体层可以由低粘合性聚合物打印而来，并且与由弹性体材料制成的打印密封垫圈直接集成以防止泄漏(图19B)。
一旦流动池零件已经被制造出，则它可以机械地附接至微孔基底，例如通过将它抵着微孔基底夹紧(使用或未使用垫圈)，或者可以使用本领域的普通技术人员已知的多种技术中的任何一种(取决于所使用的材料的选择)使它直接粘合到微孔基底上，例如通过使用阳极粘合、热粘合或多种粘合剂或粘附膜中的任何一种，包括基于环氧树脂的、基于丙烯酸的、基于硅酮的、可UV固化的、基于聚氨酯的或基于氰基丙烯酸酯的粘合剂。
柱体：在所述自动化测定系统的许多实施例中，所述微孔基底(具有或不具有附接的流动池)将被包装在可消耗柱体内，所述柱体与所述仪器系统界面结合并且可以并入另外的功能性。图14A-B和20A-C说明了用于将流动池(或微孔阵列基底)并入到柱体组件中的多种方法，其中所述方法的范围是从一堆单独的零件的机械夹紧，到单独的零件和预组装的部件的机械夹紧，到完全组装的可消耗柱体，其为自动化测定系统的最终用户提供易用性。柱体的设计特征可以包括(i)一个或多个入口，用于与仪器形成流体连接或将细胞样品、珠悬浮液或其他测定试剂手动引入柱体中；(ii)一个或多个旁路通道，即用于自计量细胞样品和珠悬浮液，以避免满溢或回流；(iii)一个或多个整合的微孔基底/流动池组件、或一个或多个室，其内定位有一个或多个微阵列基底；(iv)整合的微型泵或其他流体致动机构，用于控制流体流经装置；(v)整合的微型阀(或其他牵制机构)，用于将预加载试剂(例如珠悬浮液)隔区化或控制流体流经装置；(vi)一个或多个通气孔，用于为俘获空气提供逃逸路径；(vii)一个或多个样品和试剂废物储器；(viii)一个或多个出口，用于与仪器形成流体连接或提供处理的样品收集点；(ix)机械接口特征，用于相对于仪器系统重复性定位可移除的可消耗柱体，并且用于提供进入，这样使得外磁体可以与微孔非常接近；(x)整合的温度控制部件或热接口，用于提供与仪器系统的良好热接触；(xi)光学对准记号，用于确定仪器内的柱体或孔的位置；以及(xii)光学接口特征，例如透明窗，用于对微孔进行光学探询。在一些实施例中，所述柱体被设计成平行地处理多于一个样品。在所述装置的一些实施例中，所述柱体可以进一步包括适合用于下游测定程序或用于与独立式PCR热循环仪或测序仪界面结合的一个或多个可移除样品收集管或室。在所述装置的一些实施例中，所述柱体自身适于与独立式PCR热循环仪或测序仪界面结合。如在本披露中使用的术语“柱体”意在包括在进行测定期间含有样品和珠的零件的任何组件。
在一些实施例中，所述柱体的设计可以包括多个流动池或单独的微孔室，各自包括多个微孔，使得可以平行处理多个细胞样品。在一些实施例中，所述柱体内的多个微孔室可用于将单细胞样品分成各自分别分析的等分试样。在一些实施例中，所述柱体内的多个微孔室可用于将单细胞样品分成等分试样，其中的一些可用作对照，并且其中的一些可在进行分子条码化检测之前用活化剂、刺激或测试化合物处理。
图21A-C说明了被设计成包括板载试剂储器的柱体的一个实施例。所述柱体由在基底2110中制造的微孔模式809、流体层2108、包括一个或多个板载试剂储器2107的柱体主体2106和可以任选地包括通气孔的一个或多个试剂储器密封2105构成，如右侧的分解组装视图所示的。组装的柱体显示在左侧，其说明了入口2101和出口2102、减压阀2103用于通过收回磁体提供通路、以及密封储器2104，如果用透明或半透明密封或盖密封则这些可以看见。
图22A-B说明了被设计成包括板载试剂储器的柱体的另一个实施例。在这个实施例中，所述试剂储器由于被柱体主体完全封闭而隐藏起来。所述柱体由在基底2207中制造的微孔模式2206、流体层2205和包括一个或多个板载试剂储器的柱体主体2203以及用于通过收回磁体提供通路的减压阀904构成，如右侧的分解组装视图所示的。组装的柱体显示在左侧，其说明了入口2201和出口2202，以及用于通过收回磁体提供通道的减压阀。
柱体流体通道尺寸：通常，将优化流体通道和所述一个或多个微孔室在柱体设计中的尺寸，以便(i)提供细胞和珠到微孔的均匀递送，和(ii)最小化样品和试剂消耗。在一些实施例中，流体通道的宽度将在50μm和20mm之间。在其他实施例中，流体通道或微孔室的宽度可以是至少50μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少750μm、至少1mm、至少2.5mm、至少5mm、至少10mm或至少20mm。在又其他实施例中，流体通道或微孔室的宽度可以是至多20mm、至多10mm、至多5mm、至多2.5mm、至多1mm、至多750μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm或至多50μm。在一个实施例中，流体通道或微孔室的宽度是约2mm。本领域的普通技术人员应理解的是，流体通道或微孔室的宽度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约250μm至约10mm)。
在一些实施例中，柱体设计中的流体通道的深度将在50μm和4mm之间。在其他实施例中，流体通道的深度可以是至少50μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少750μm、至少1mm、至少1.25mm、至少1.5mm、至少1.75mm、至少2mm、至少3mm、至少4mm或至少5mm。在又其他实施例中，流体通道的深度可以是至多5mm、至多4mm、至多3mm、至多2mm、至多1.75mm、至多1.5mm、至多1.25mm、至多1mm、至多750μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm或至多50μm。在一个实施例中，流体通道的深度是约1mm。本领域的普通技术人员应理解的是，流体通道的深度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约800μm至约3mm)。
柱体制造：柱体可以使用本领域的普通技术人员已知的多种技术和材料制造而来。通常，使用多种机械组装或粘合技术中的任何一种将柱体制造为一系列单独的零部件(图21A-C和22A-B)并且随后组装。适合的制造技术的实例包括但不限于常规机器加工、CNC机器加工、注塑、热成形以及3D打印。一旦柱体部件已经被制造出，可以使用螺钉、夹子等将它们进行机械组装，或使用多种技术中的任合一种(取决于所使用的材料的选择)使它们永久结合，例如通过使用热粘合/焊接或多种粘合剂或粘附膜中的任何一种，包括基于环氧树脂的、基于丙烯酸的、基于硅酮的、可UV固化的、基于聚氨酯的或基于氰基丙烯酸酯的粘合剂。
柱体部件可以使用多种适合的材料中的任何一种制造而来，包括但不限于硅、熔融二氧化硅、玻璃、多种聚合物中的任何一种(例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、环氧树脂)、非粘性材料(如特氟龙(PTFE))、金属(例如，铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)或其任何组合。在一些实施例中，选择用于制造流动池的所述一种或多种材料将是乙醇相容的，使得用乙醇或乙醇:水溶液启动流体装置可以用于促进表面润湿和从所述装置中去除被俘获的空气。
柱体扩散屏障：在所述装置的一些实施例中，所述流动池或柱体可以进一步包括如下部件，所述部件被设计成产生防止大分子扩散(或增加其路径长度和扩散时间)的物理或化学屏障，以便最小化微孔之间的交叉污染。此类屏障的实例包括但不限于用于将细胞和珠递送到微孔的一套蛇形通道，在裂解或孵育步骤过程中经过按压与微孔基底表面接触的可伸缩压板或可变形膜，使用较大的珠(例如如上所述的Sephadex珠)来堵塞微孔的开口，或在裂解或孵育步骤过程中使不互混的疏水流体从柱体内的储器中释放出来以有效地分离并隔区化基底中的每个微孔。在一些实施例中，可以使用添加剂来调整测定缓冲液的粘度，以便降低物质在微孔之间的扩散速率。可用于调整缓冲液粘度的缓冲液添加剂的实例包括但不限于蔗糖、聚乙二醇(PEG)、Ficoll、甘油、丙三醇、硫酸葡聚糖、histopaque、牛血清白蛋白或其他蛋白质等。
包括泵的柱体：如上所指出的，在一些实施例中，所述柱体可以包括整合的微型泵或其他流体致动机构，用于控制流体流经装置。适合的微型泵或流体致动机构的实例包括但不限于机电或气动致动的微型注射器或柱塞机构、气动地或通过外部活塞致动的膜隔膜泵、气动致动的试剂小袋或气囊、或电渗泵。
包括阀的柱体：如上所述的，在一些实施例中，所述柱体可以包括微型阀，用于将预加载试剂隔区化或控制流体流经装置。适合的微型阀的实例包括但不限于使用可以被熔化或溶解的蜡或聚合物塞或可以被刺破的聚合物膜制造的一次性“阀”；使用可变形膜或管构造的夹管阀和使用可变形膜片构造的气动、磁、电磁或机电(螺线管)致动的止回阀以及微型门阀。在一些实施例中，所述柱体的所有入口和出口可以包括用于控制流体流动的方向性的集成止回阀，如图29A-B所示的。在一些实施例中，所述集成止回阀可以包括微型的“鸭嘴”型模制的硅酮止回阀，例如Minivalve DU039.005(迷你阀有限公司(Minivalve,Inc.)，克利夫兰，俄亥俄州)。
包括通气孔的柱体：如上所指出的，在一些实施例中，所述柱体可以包括用于为俘获空气提供逃逸路径的通气孔。可以根据本领域的普通技术人员已知的多种技术构造通气孔，例如使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其他疏水材料的多孔塞，所述材料允许毛细管芯吸空气但阻止被水渗透。
柱体连接：如上所述的，所述柱体的入口和出口特征可以被设计成提供与仪器的方便且防漏的流体连接，或可以用作开放储器，用于将样品和试剂手动地用移液管移取进出柱体。入口和出口连接器的方便机械设计的实例包括但不限于螺纹连接器、鲁尔锁紧连接器、鲁尔滑锁(Luer slip)或“滑动型(slip tip)”连接器、压入配合连接器、管道连接器等(图23A)。
柱体微量移液管接口：图23B和图24A-C说明了用于促进使用标准微量移液器将流体引入流动池装置或柱体的微量移液器接口(或“移液管尖端接口”)的实例。所述接口被设计成在移液管尖端和流动池装置或柱体之间提供可靠的密封，从而最小化死体积和气泡引入，并且使用手动或自动移液管(例如1ml和5ml Eppendorf移液管尖端或5ml Tecan移液器尖端)提供一致的填充。所述移液器尖端接口还使得完全交换流体所需的转移步骤的数目最小化，并且另外，当移液管尖端未插入入口时，通过消除流体流入和流出柱体来简化流体处理。
在一些实施例中，所述移液管尖端接口包括直线或垂直特征，其可用于避免用户的利手差异。在一些实施例中，所述移液管尖端接口包括与移液管尖端的形状配合或符合移液管尖端的形状的成角度的圆锥形特征。在一些实施例中，预切割的移液器尖端可以在一个或多个成角度的圆锥形入口内粘合就位，以在启动步骤期间减少与乙醇的接触。在一些实施例中，所述移液管尖端接口包括圆锥形特征，其与移液管尖端配合以形成与流动池装置或柱体的入口或出口的低的死体积连接。在一些实施例中，所述圆锥形特征或一个或多个成角度的入口可以并入如O型环的特征(图24B)或其他刚性或顺应性内部特征(图24C)，移液管尖端与之相配合以形成基本上防漏的密封。在一些实施例中，所述圆锥形特征或成角度的入口由顺应材料构成，所述顺应材料与所述移液管尖端形成基本上防漏的密封。在一些实施例中，所述顺应材料是聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚异戊二烯、聚丁二烯或聚氨酯。在一些实施例中，所述移液管尖端接口包括可独立于柱体设计的其余部分改良的模块化单元(图25B)。
柱体连接器帽：在一些实施例中，所述柱体的入口和出口可以进一步包括帽、弹簧加载盖或塞或聚合物膜，当柱体被定位在所述仪器中时，其被打开或刺破，并且用于防止在储存过程中柱体内表面的污染或当柱体被从仪器上移除时防止流体溢出。
可移除的样品收集管：如上所指出的，在一些实施例中，所述柱体的一个或多个出口可以进一步包括适合用于下游测定程序或与独立式PCR热循环仪或测序仪界面结合的可移除的样品收集管或室。图25-28说明了并入样品收集管的不同的柱体设计。图26说明了并入鲁尔锁注射器连接器和止回阀以及移液管尖端接口和在从微孔阵列收回之后存储珠的样品收集管的柱体组件。图27说明了图26所示的柱体设计的变体。图25和28说明了并入Upchurch NanoportTM连接器(厄普丘奇科学公司(Upchurch Scientific)，IDEX健康与科学部(Division of IDEX Health and Science)，橡港市，华盛顿州)的柱体组件，以在外部管道和柱体之间产生低的死体积连接。所述柱体设计还并入了注射器连接器、止回阀和任选的移液器尖端接口。
多种不同的样品收集管中的任何一种可以并入所述设计中，例如如所示的5ml样品收集管或更小体积的样品收集管，例如1.5ml。通常，样品收集管的体积的范围可以是从约10μl至约5ml。在一些实施例中，所述一个或多个样品收集管的体积可以是至少10μl、至少25μl、至少50μl、至少75μl、至少100μl、至少250μl、至少500μl、至少750μl、至少1ml、至少2ml、至少3ml、至少4ml或至少5ml。在一些实施例中，所述一个或多个样品收集管的体积可以是至多5ml、至多4ml、至多3ml、至多2ml、至多1ml、至多750μl、至多500μl、至多250μl、至多100μl、至多75μl、至多50μl、至多25μl或至多10μl。本领域的普通技术人员应认识的是，所述一个或多个样品收集管的体积可以彼此独立地变化，并且可以具有在上述指定体积范围内的任何值的体积，例如约900μl。
柱体机械接口：通常，所述柱体的机械接口特征提供了柱体相对于仪器系统的易于移除但高度精确且可重复的定位。适合的机械接口特征包括但不限于定位销、定位导件、机械止动件等。在一些实施例中，所述机械设计特征将包括减压阀特征，用于使外部设备(例如，磁体或光学部件)与微孔室非常接近(图21A，图22B)。
柱体温度控制或热接口：在一些实施例中，所述柱体还包括温度控制部件或热接口特征，用于与外部温度控制模块配合。适合的温度控制元件的实例包括但不限于电阻加热元件、微型红外发射光源、珀耳帖(Peltier)加热或冷却装置、散热器、热敏电阻、热电偶等。热接口特征将典型地由作为良好热导体的材料(例如，铜、金、银等)制成并且将典型地包括一个或多个能够与外部加热块或冷却块产生良好热接触的平表面。
柱体光学接口：在许多实施例中，所述柱体将包括光学接口特征，用于对微孔阵列进行光学成像或光谱学探询。典型地，所述柱体将包括光学透明窗，例如，微孔基底本身或与微孔基底相对的流动池的或微孔室的侧面，所述透明窗由满足用于探测微孔的成像或光谱技术的频谱要求的材料制成。适合的光学窗材料的实例包括但不限于玻璃、熔融二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃聚合物(COP)或环烯烃共聚物(COC)。
仪器模块和系统：本披露还包括用于在多重单细胞随机标记或分子条码化测定的自动化中使用的仪器模块和系统。如上所指出的，这些仪器可以提供控制和分析功能性，如(i)射流控制、(ii)细胞或珠分配和收集机构、(iii)细胞裂解机构、(iv)磁场控制、(v)温度控制、(vi)成像能力以及(vii)图像处理。在一些实施例中，所述仪器系统可以包括一个或多个模块(示意性地说明于图30中)，其中每个模块为所述系统提供一个或多个特定功能特征集。在其他实施例中，所述仪器系统可以被包装成使得所有系统功能性位于一个或多个包装内(图30；内部组虚线)或同一包装内(图30；外部虚线)。如上所指出的，在一些实施例中，所述系统可以包括另外的功能单元，作为所述系统的集成部件或作为模块化部件，其将所述系统的功能能力扩展到包括PCR扩增(或其他类型的寡核苷酸扩增技术)和寡核苷酸测序。
图31说明了仪器系统配置的一个非限制性实例。在图31中，用户将细胞样品用移液管移入预先加载有所有其他测定试剂的可移除柱体的入口或样品孔中，将柱体插入仪器系统中进行处理，并收集来自柱体的出口或孔的输出(例如，包括标记的寡核苷酸文库的珠悬浮液)。所述仪器系统自动化测定步骤，包括将细胞分配到微孔中、分配来自板载试剂孔的珠(如果尚未预先加载到微孔中的话)、漂洗步骤、细胞裂解步骤、用于RNA或DNA靶标的杂交步骤、以及磁辅助珠收回。在一些实施例中，所述仪器系统进一步包括成像和分析能力，以及一些测定步骤的实时反馈和控制，例如细胞和珠分配步骤，以确保微孔模式的最佳覆盖，同时使含有多于一个细胞或多于一个珠的孔的数目最小化。在一些实施例中，所述成像系统提供对微孔中的细胞的光学监测，以鉴定细胞的指定亚群，例如死细胞、展现特定细胞表面标志物的细胞等，并且然后提供反馈，用以使得机构能够物理去除、俘获或破坏所选择的细胞(或共定位的珠)，使得核酸序列数据的下游分析可以包括或排除它们。在许多实施例中，所述仪器系统包括嵌入式计算机或处理器(尽管在一些实施例中可以使用外围计算机或处理器)，其运行软件用于控制和协调如下活动：成像、运动控制、磁控制、射流控制(例如应用压力或真空到流体管线)和其他功能子系统。
自动化测定处理步骤和工作流程：图32-35提供了由用户和自动化测定系统进行的过程步骤的不同实施例的示意图。
图32说明了自动化测定工作流程的一个实施例，其中向用户提供不含珠或其他试剂的可消耗测定柱体。用户将珠和试剂与细胞样品同时加载到测定柱体(包括裂解缓冲液和杂交缓冲液)中。所述仪器系统自动化将细胞和珠分配到微孔中的步骤。在一些实施例中，所述成像系统以及实时图像处理和分析用于监测细胞和珠分配过程，并且反馈用于相应地调整过程步骤，例如通过延长或重复一些步骤，通过活化替代细胞或珠分配机构等。然后，所述仪器系统依次进行细胞裂解和杂交步骤，随后从微孔中磁场辅助收回珠。在所述过程结束时，从测定柱体上的端口收集输出样品(例如包括标记的寡核苷酸文库的珠悬浮液)。在所述测定柱体设计的一些实施例中，为了方便起见，测定柱体的出口可以包括卡扣(snap-off)管。
图33说明了自动化测定工作流程的另一个实施例，其中向用户提供包括预加载的测定试剂的可消耗测定柱体。用户将细胞样品和珠加载到柱体中，并且仪器系统进行将细胞和珠跨多个微孔分配以及如上所述的另外的测定步骤的任务。在一些实施例中，可以首先将细胞分配到微孔中，随后分配珠。在其他实施例中，可以首先分配珠，随后分配细胞。
图34说明了自动化测定工作流程的另一个实施例，其中向用户提供可消耗测定柱体，柱体内的试剂容器中预加载有珠和试剂。在一些实施例中，所述珠和试剂可以含在仪器内，例如在可替换的瓶或试剂柱体内，而不是测定柱体中。如上所述的，在一些实施例中，可以首先将细胞分配到微孔中，随后分配珠。在其他实施例中，可以首先分配珠，随后分配细胞。
图35说明了自动化测定过程的又另一个实施例，其中向用户提供可消耗测定柱体，其具有预加载到微孔中的珠和预加载在柱体的试剂容器中的其他测定试剂。在将细胞分配到微孔中(其中再次，使用成像系统和实时图像处理来监测细胞分配过程，并且使用反馈来相应地调整过程步骤以实现预先指定的分配)后，细胞和珠的相对位置可以例如通过使用一个或多个磁体来操纵局部磁场和/或使用搅拌来调整。
射流：通常，所述仪器系统将提供射流能力，用于将样品或试剂递送到与所述系统连接的一个或多个测定柱体内的一个或多个微孔室或流动池中。测定试剂和缓冲液可以被存储在瓶、试剂和缓冲液柱体或其他与柱体入口连接的适合容器中。在一些实施例中，测定试剂和缓冲液可以被预加载并储存在位于柱体本身内的储器中。所述系统还可以包括经处理的样品和废物储器，其所处的形式为瓶、柱体或其他用于收集一个或多个测定柱体的下游流体的适合容器。在一些实施例中，经处理的样品和废液可以被收集在位于柱体本身内的储器中。在一些实施例中，所述射流模块可以提供不同来源之间的流动的切换，所述来源是例如位于柱体上的样品或试剂储器或位于仪器中的试剂瓶和一个或多个微孔室入口。在一些实施例中，在进行细胞裂解和下游测定步骤之前的指定的可调整时间，所述射流模块可以提供使阵列中的细胞与活化剂、化学刺激或测试化合物接触。在一些实施例中，所述射流模块可以提供一个或多个微孔室出口和不同收集点例如位于柱体内的经处理的样品储器、位于柱体内的废物储器或位于仪器内的废物瓶之间的流动的切换。
使用泵和阀的流动控制：控制流体流动通过系统将典型地通过使用泵(或其他流体致动机构)和阀进行。适合的泵的实例包括但不限于注射泵、可编程注射泵、蠕动泵、隔膜泵等。在一些实施例中，可以借助在试剂和缓冲液容器的一个或多个入口处或在一个或多个测定柱体的入口处施加正气动压来控制流体流动通过系统。在一些实施例中，可以借助在废物储器的一个或多个出口处或在一个或多个测定柱体的出口处抽真空来控制流体流动通过系统。适合的阀的实例包括但不限于止回阀、机电两通或三通阀、气动两通和三通阀等。
流体流动模式：可以在测定程序中的不同点利用不同的流体流动控制模式，例如向前流动(相对于给定微孔室的入口和出口)、逆流、振荡或脉动流或其组合都可以使用。在一些实施例中，可以使用振荡或脉动流，例如在微孔加载步骤期间，以促进细胞和珠的均匀分配。在一些实施例中，可以在测定洗涤/漂洗步骤过程中应用振荡或脉动流，以有助于一个或多个微孔流动池或室内的流体的完全且有效的交换。
可以在测定过程工作流程中的不同点利用不同的流体流速，例如在所披露的仪器模块和系统的一些实施例中，体积流速可以在从-100ml/sec至+100ml/sec变化。在一些实施例中，体积流速的绝对值可以是至少0.001ml/sec、至少0.01ml/sec、至少0.1ml/sec、至少1ml/sec、至少10ml/sec或至少100ml/sec。在一些实施例中，体积流速的绝对值可以是至多100ml/sec、至多10ml/sec、至多1ml/sec、至多0.1ml/sec、至多0.01ml/sec或至多0.001ml/sec。给定时间点的体积流速可以具有在这个范围内的任何值，例如2.5ml/sec的正向流速、-0.05ml/sec的反向流速或0ml/sec(即停流)的值。
空气注入：在所述射流系统的一些实施例中，可能有利的是在当从一种溶液变到另一种溶液时的溶液注入之间插入空气注入，例如在启动流动池和注入细胞悬浮液之间，或在漂洗缓冲步骤和注入珠悬浮液之间。这种方法的潜在优点包括减少的分散(通过消除液/液界面)，以及减少的样品和试剂消耗(填充或清空流动池需要更少流体体积)。
在一些实施例中，可以将空气注入流动池本身(例如，包括流体层)内。在一些实施例中，可以将空气注入流动池中的微孔阵列上方的空间(例如，微孔室)内。在一些实施例中，空气的注入基本上不能除去微孔阵列中微孔的内容物。在一些实施例中，空气的注入可以去除微孔阵列的微孔的内容物的至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更多。
可以使用空气的注入来产生用于随后的液体(例如，包括细胞或珠悬浮液)的注入(例如，加载)的均匀环境。在一些实施例中，空气注入之后的液体加载可以比没有之前的空气注入的加载至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％更均匀地分散。在一些实施例中，空气注入之后的液体加载可以比没有之前的空气注入的加载至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％更均匀地分散。
注入空气可以减少流动池和/或微孔阵列中的死体积(或死空间)。在一些实施例中，注入空气可以将死体积减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施例中，注入空气可以将死体积减少至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一些实施例中，可以使用自动移液器、注射泵等注入空气。在一些实施例中，能以范围在0.08ml/秒至1.8ml/秒之间的速率注入空气。在一些实施例中，空气注入的速率是至少0.08ml/秒、至少0.1ml/秒、至少0.2ml/秒、至少0.3ml/秒、至少0.4ml/秒、至少0.5ml/秒、至少0.6ml/秒、至少0.7ml/秒、至少0.8ml/秒、至少0.9ml/秒、至少1.0ml/秒、至少1.2ml/秒、至少1.4ml/秒、至少1.6ml/秒或至少1.8ml/秒。在一些实施例中，空气注入的速率是至多1.8ml/秒、至多1.6ml/秒、至多1.4ml/秒、至多1.2ml/秒、至多1.0ml/秒、至多0.8ml/秒、至多0.6ml/秒、至多0.4ml/秒、至多0.2ml/秒、至多0.1ml/秒或至多0.08ml/秒。本领域的普通技术人员应认识的是，空气注入的速率可以具有在这个范围内的任何值，例如约1.25ml/秒。在一些情况下，注入速率是约0.36ml/秒。
在一些实施例中，注入空气的压力可以在0.01和0.25atm之间。在一些实施例中，空气注入的压力是至少0.01atm、至少0.05atm、至少0.10atm、至少0.15atm、至少0.2atm或至少0.25atm。在一些实施例中，空气注入的压力是至多0.25atm、至多0.2atm、至多0.15atm、至多0.1atm、至多0.05atm或至多0.01atm。本领域的普通技术人员应认识的是，空气注入的压力可以具有在这个范围内的任何值，例如约0.11atm。
细胞和珠分配机构：如上所指出的，在一些实施例中，所述仪器系统可以包括用于分配并且进一步有助于在所述多个微孔上均匀分配细胞和珠的机构。此类机构的实例包括但不限于磁输送、振动、摇动、漩涡、再循环流、振荡或脉动流、低频搅拌(例如，通过脉冲柔性(例如，硅酮)膜，所述膜形成室壁或在流体通道附近)或高频搅拌(例如，通过使用压电换能器)。在一些实施例中，将这些机构中的一种或多种与流动池或微孔室的内壁上的物理结构或特征组合应用，例如，夹层/顶帽结构、V状物(chevron)或脊阵列，以有助于在阵列室内混合细胞或珠或帮助阻止其聚池化。所述流动池或微孔室的上表面或下表面上的流动增强肋状物可以用来控制流动速度谱并且减小跨微孔开口的剪切力(即，为了防止在试剂交换和漂洗步骤过程中将细胞或珠从微孔中拉出)。
细胞和珠分配目标：当在多个微孔中分配珠时，可以靶向多个预定水平中的任何一个。例如，在一些实施例中，含有单一珠的微孔的百分比可以在1％和100％之间。在一些实施例中，所述多个微孔中的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的微孔可以含有单一珠。在一些实施例中，所述多个微孔中的至多100％、至多99％、至多95％、至多90％、至多80％、至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的微孔可以含有单一珠。
当在多个微孔中分配珠时，在一些实施例中，含有两个珠的微孔的百分比可以是至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、或至少10％或更多。在其他实施例中，含有两个珠的微孔的百分比可以是至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％或至多1％。
当在多个微孔中分配细胞时，可以靶向多个预定水平中的任何一个。例如，在一些实施例中，含有单细胞的微孔的百分比可以在1％和100％之间。在一些实施例中，所述多个微孔中的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的微孔可以含有单细胞。在一些实施例中，所述多个微孔中的至多100％、至多99％、至多95％、至多90％、至多80％、至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的微孔可以含有单细胞。
当在多个微孔中分配细胞时，在一些实施例中，含有两个细胞的微孔的百分比可以是至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、或至少10％或更多。在其他实施例中，含有两个细胞的微孔的百分比可以是至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％或至多1％。
当在多个微孔中分配细胞和珠两者时，可以靶向多个预定水平中的任何一个。例如，在一些实施例中，含有单细胞和单一珠两者的微孔的百分比可以在1％和100％之间。在一些实施例中，所述多个微孔中的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的微孔可以含有单细胞和单一珠两者。在一些实施例中，所述多个微孔中的至多100％、至多99％、至多95％、至多90％、至多80％、至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的微孔可以含有单细胞和单一珠两者。
珠和/或细胞分配可以取决于大小和/或密度。例如，较大的珠和/或细胞能以比较小的珠和/或细胞更快的速度沉降(即，进入孔)。例如，直径为33微米的珠可以比直径为22微米的珠(假设相等或相似的密度)沉降地快约0.5、1、1.5、2、2.5或3倍或更多倍。在一些情况下，直径为33微米的珠比直径为22微米的珠沉降地快约2.25倍。
不同大小和/或密度的细胞能以不同的速率沉降到基底的孔中。例如，红细胞可以比白细胞沉降地快至少0.5、1、1.5、2、2.5或3倍或更多倍。红细胞可以比白细胞沉降地快，归因为其密度较高，尽管其尺寸较小。
在一些实施例中，缓冲液可以在加载细胞或珠之前和/或之后流过微孔阵列。所述缓冲液可以是裂解缓冲液和/或洗涤缓冲液。在许多实施例中，缓冲液的流动将基本上不会除去微孔的内容物。在一些实施例中，缓冲液的流动可以除去至多1％、至多2％、至多3％、至多4％、至多5％、至多6％、至多7％、至多8％、至多9％、或至多10％或更多微孔的内容物。
在一些实施例中，可以调整缓冲液的粘度和/或密度以优化珠和/或细胞均匀加载到微孔中。改变加载缓冲液的粘度或密度可以例如有助于保护细胞免受剪切力的影响，或者为细胞和/或珠提供正或负的浮力以促进均匀加载。例如，在所披露的方法的一些实施例中，用于加载珠和/或细胞的缓冲液的粘度的范围可以是从水的约1倍至约10倍。在一些实施例中，缓冲液的粘度可以是水的粘度的至少1倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍或更多倍。在一些实施例中，缓冲液的粘度可以是水的至多10倍、至多9倍、至多8倍、至多7倍、至多6倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍、至多2倍、至多1.9倍、至多1.8倍、至多1.7倍、至多1.6倍、至多1.5倍、至多1.4倍、至多1.3倍、至多1.2倍、至多1.1倍或至多1倍。本领域的普通技术人员应认识的是，缓冲液粘度可以具有在这个范围内的任何值，例如是水的约1.75倍。
类似地，在一些实施例中，用于加载珠和/或细胞的缓冲液的密度的范围可以是待加载的珠和/或细胞的密度的从约0.8倍至约1.25倍。在一些实施例中，用于加载珠和/或细胞的缓冲液的密度可以是珠和/或细胞的至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍或至少1.25倍或更高。在一些实施例中，用于加载珠和/或细胞的缓冲液的密度可以是珠和/或细胞的至多1.25倍、至多1.2倍、至多1.1倍、至多1.0倍、至多0.9倍或至多0.8倍或更低。本领域的普通技术人员应认识的是，用于加载珠和/或细胞的缓冲液的密度可以具有在这个范围内的任何值，例如是珠和/或细胞的约0.85倍。
在一些实施例中，可以调整缓冲液的粘度和/或密度以优化从微孔中收回珠的效率。例如，改变珠收回缓冲液的粘度或密度可以提供粘性阻力，或者为珠提供正或更少的负浮力以促进有效的珠收回。例如，在所披露的方法的一些实施例中，用于珠收回的缓冲液的粘度的范围可以是从水的约1倍至约10倍。在一些实施例中，缓冲液的粘度可以是水的粘度的至少1倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍或更多倍。在一些实施例中，缓冲液的粘度可以是水的至多10倍、至多9倍、至多8倍、至多7倍、至多6倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍、至多2倍、至多1.9倍、至多1.8倍、至多1.7倍、至多1.6倍、至多1.5倍、至多1.4倍、至多1.3倍、至多1.2倍、至多1.1倍或至多1倍。本领域的普通技术人员应认识的是，缓冲液粘度可以具有在这个范围内的任何值，例如是水的约2.3倍。
类似地，在一些实施例中，用于珠收回的缓冲液的密度的范围可以是珠的密度的从约0.8倍至约1.25倍。在一些实施例中，用于珠收回的缓冲液的密度可以是珠和/或细胞的至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍或至少1.25倍或更高。在一些实施例中，用于珠收回的缓冲液的密度可以是珠和/或细胞的至多1.25倍、至多1.2倍、至多1.1倍、至多1.0倍、至多0.9倍或至多0.8倍或更低。本领域的普通技术人员应认识的是，用于珠收回的缓冲液的密度可以具有在这个范围内的任何值，例如是珠的约1.1倍。
可用于调整缓冲液粘度和/或密度的缓冲液添加剂的实例包括但不限于蔗糖、聚乙二醇(PEG)、Ficoll、甘油、丙三醇、硫酸葡聚糖、histopaque、牛血清白蛋白等。
磁场辅助珠输送和操纵：在一些实施例中，细胞或珠可以通过使用磁珠(例如与针对细胞表面标志物的抗体缀合，或作为随机标记文库的固体支持物)和外部施加的磁场梯度而被分配在微孔中，从微孔中去除，或者以其他方式输送通过仪器系统的流动池或柱体。在一些实施例中，例如当使用磁场将磁珠俘获在微孔中或从微孔中洗脱磁珠时，外部施加的磁场梯度可以同时被施加到整个微孔模式。在一些实施例中，外部施加的磁场梯度可以施加到所述微孔模式的所选择的区域。在一些实施例中，外部施加的磁场梯度可以施加到单一微孔。在一些实施例中，永磁体可以用于通过相对于微孔阵列移动一个或多个永磁体的位置而施加时变磁场梯度或反之亦然。在这些实施例中，可以调整相对运动的速度，使得磁场梯度的时间依赖性与磁珠经历磁泳进入或离开微孔的时间尺度相匹配。在一些实施例中，可以通过改变施加到一个或多个电磁体的电流来提供时变磁场。在一些实施例中，可以使用一个或多个永磁体和一个或多个电磁体的组合来提供磁场梯度，用于将磁珠输送进微孔中、离开微孔或通过所述装置。在一些实施例中，细胞或珠可以通过离心或其他非磁性手段而被分配在微孔中，从微孔中去除，或者以其他方式输送通过仪器系统的流动池或柱体。
在一些实施例中，珠(固体支持物)可以使用一个或多个磁场从微孔中除去。在一些实施例中，可以在微孔中的细胞裂解和/或将核酸附接至固定在单独的珠上的所述多个寡核苷酸上之后除去珠。可以将磁体放置在柱体的顶部，并且可以使用所得磁场从孔中除去珠。在一些实施例中，可以除去至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的珠。在一些实施例中，可以除去至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％的珠。
实时成像和反馈以改善细胞和/或珠分配：在一些实施例中，成像系统以及实时图像处理和分析用于监测细胞和珠分配过程(即细胞和/或珠在所述多个微孔内的分配)，并且反馈用于相应地调整过程步骤，例如通过延长或重复一些步骤，通过活化替代细胞或珠分配机构等，以便改善细胞和/或珠分配，或者实现预先指定的靶标分配。
实时成像和反馈以选择细胞子群：在一些实施例中，可以使用实时图像处理和分析来鉴定含有展现一个或多个指定特征(如下面更详细地描述的)的细胞的孔，随后在进一步分析中选择或排除细胞亚群。在一些实施例中，使用实时图像处理和分析来鉴定含有两个或更多个细胞的孔，随后在进一步分析中排除那些孔中的细胞。可用于在进一步分析中选择或排除细胞亚群的机构(例如选择机构)的实例包括但不限于(i)从阵列中物理去除所选择的细胞或珠，(ii)物理截留阵列内的所选择的细胞或珠，(iii)物理破坏阵列内所选择的细胞或珠，或(iv)使用双重编码方案，由此在进一步分析中选择或排除针对给定细胞产生的序列数据。
用于从微孔物理去除所选择的珠(其中所述珠是磁珠)(从而阻止来自所述一个或多个相应细胞的核酸靶分子的下游序列分析)的选择机构的一个非限制性实例是使用微型化磁探针(例如改良的计算机硬盘驱动器写头)从含有已经被鉴定为匹配一组预先指定的细胞特征的细胞的孔中摘出珠。现代硬盘驱动器可以达到超过800Gbit/in2的位密度，其对应于8.1x 10-4μm2的位区。开始于20世纪80年代的硬盘驱动器技术具有大约50μm2或更小的位区，因此在所披露的装置和系统的一些实施例中，为了从指定孔中去除珠的目的，可以改编磁写头技术。
用于从微孔物理去除所选择的细胞或珠的选择机构的另一个实例是使用微量移液管和显微操纵器。在微孔可及(例如通过使用可移除的室壁或光学窗)的实施例中，可以使用显微操纵器来定位一个或多个微量移液管，从微孔中提取所选择的细胞或珠(例如通过温和地抽吸到所述一个或多个微量移液管)，并将它们移动到柱体或仪器(例如储器)中的位置，在所述位置它们可以被隔离以用于后续处置或后续处理和分析。可商购的显微操纵器提供亚微米步进分辨率以进行精确定位，而可商购的拉针仪允许制造约5μm和更小的尖端直径。
用于从微孔物理去除所选择的细胞或珠的选择机构的另一个实例是使用单光束梯度力俘获(例如“光镊”)。这些设备使用高度聚焦的激光束来产生光俘获(例如通过产生吸引力或排斥力，取决于物体和周围介质之间的折射率的不匹配)，以便物理地保持和移动微观电介质物体。在一些实施例中，光镊可以用于从微孔中提取所选择的细胞或珠，并且直接使用光镊或通过同时控制流体流动通过流动池或微孔室，将其移动到柱体(例如储器)中的位置，在所述位置它们可以被隔离以用于后续处置或后续处理和分析。
用于从微孔物理去除所选择的细胞或珠的选择机构的另一个实例可以是使用声学液滴喷射。声学液滴喷射已被用于精确分配液体的小液滴(体积范围是从几百皮升到几百纳升)，并且也已被用于分配细胞、珠和蛋白质微晶。由微制造的超声换能器产生的聚焦声能可用于从微孔中喷射并捕获所选择的细胞或珠，以便从下游测定和分析步骤排除它们。典型地，液滴的大小可以通过调整超声参数(如脉冲频率和振幅)来控制。在一些实施例中，可以保留喷射的细胞或珠以供在下游测定和分析步骤中选择性使用。
无需从微孔物理去除细胞或珠，用于确保从下游处理中消除针对所选择的细胞的数据的选择机构的相关实例将是使用可光切割的接头来将随机标记附接至珠。与指定的细胞共定位的珠将被聚焦的光束(典型为UV光)照射以释放附接的标记，并允许将其漂洗掉并从进一步的测定步骤中消除。这种方法可能需要鉴定用以实现有效的光解同时使剩余的细胞在微孔模式中保持完整的合适条件。
用于在微孔中物理破坏所选择的细胞或珠的选择机构的实例是使用激光消融，其中使用聚焦的激光(例如聚焦的CO2或准分子激光脉冲)来选择性地破坏键并除去材料，同时对周围材料造成很少或不造成损伤。
用于在微孔内物理截留磁珠的选择机构的一个非限制性实例是使用微型化磁探针，例如在所披露的装置和系统的一些实施例中，为了在指定的孔中俘获珠的目的，可以改编最初为计算机硬盘开发的磁写头技术。一个或多个改良的微制造的磁写头可以被移动到一个或多个指定的微孔附近，并被活化以将相应的珠保持在适当的位置，从而在洗脱和下游测定步骤中阻止它们。在一些实施例中，可以在微孔阵列基底(或基底本身内)的一个表面上制造微制造的电磁体的阵列，以产生可用于俘获所选择的珠的磁探针的可寻址阵列。
用于物理截留细胞或珠的选择机构的其他实例包括使用在暴露于局部的物理或化学刺激时收缩或膨胀的珠或微孔基底材料。在一些实施例中，例如，珠由合适的材料制造而来，使得所选择的珠(即与微孔中的指定的细胞亚群相关联的那些)经受局部刺激并膨胀，使得它们不能从其所定位的微孔中去除，从而有效地将它们从进一步的测定过程步骤中去除。可替代地，在一些实施例中，微孔由合适的材料制造而来，使得所选择的孔(即含有指定的细胞亚群的那些孔)经受局部刺激并收缩，使得其内含有的珠不能被去除，从而有效地将它们从进一步的测定过程步骤中去除。合适的可膨胀的或可收缩的材料的实例可以包括热响应聚合物凝胶(其随温度膨胀程度展现不连续变化)、pH敏感聚合物(取决于局部pH而收缩或膨胀)、电响应聚合物(其响应于局部电场而收缩或膨胀)和光响应聚合物(其响应于暴露于UV或可见光而收缩或膨胀)。
多于一种细胞类型的分配：在一些实施例中，所述系统可以包括用于在微孔阵列上分配多一种细胞类型的功能性。例如，所述系统可以加载具有第一细胞类型A的微孔阵列，之后冲洗和随后用第二细胞类型B加载，使得多个微孔含有A型单细胞和B型单细胞。这样的系统功能性可用于研究细胞-细胞相互作用和其他应用。通常，所述系统可以被配置为在微孔阵列上分配至少一种细胞类型、至少两种细胞类型、至少三种细胞类型、至少四种细胞类型或至少五种细胞类型。在一些实施例中，所述系统可以被配置为在微孔阵列上分配至多五种细胞类型、至多四种细胞类型、至多三种细胞类型、至多两种细胞类型或至多一种细胞类型。在一些实施例中，所述系统可以被配置为在微孔阵列上分配复杂细胞混合物。在所有这些配置中，可以设置所述系统以优化微孔中的细胞分配，并且使用如上所述的细胞分配、实时成像和反馈机构鉴定具有比指定的细胞数目更多或更少数目的细胞的孔。通常，含有多于一种细胞类型(例如A和B型中每个的一个细胞，或者各自来自A、B和C型的一个细胞)的微孔的百分比的范围可以是从约1％至约100％。在一些实施例中，含有多于一种细胞类型的微孔的百分比可以是至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少40％、至少60％、至少80％或至少90％。在其他实施例中，含有多于一种细胞类型的微孔的百分比可以是至多100％、至多90％、至多80％、至多60％、至多40％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在具体实施例中，含有多于一种细胞类型的微孔的百分比可以具有落在这个范围内任何处的值，例如约8.5％。
细胞裂解机构：在所披露的方法、装置和系统的一些实施例中，细胞裂解可以通过化学或生化手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解来完成。在一些实施例中，例如，可以通过加入包括洗涤剂(例如SDS、十二烷基硫酸锂、曲通X-100、吐温-20或NP-40)、有机溶剂(例如甲醇或丙酮)或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其组合的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。在所述仪器系统的一些实施例中，这些试剂(例如，珠悬浮液)中的一种或多种可以存储在瓶或容器中，所述瓶或容器在插入到所述仪器中时连接到微孔流动池或柱体。在一些实施例中，可以将所述试剂(例如，珠悬浮液)预加载到所述柱体中。
在一些实施例中，所述仪器系统可以包括机械细胞裂解能力，作为使用洗涤剂或其他试剂的替代方案。使用高频压电换能器进行声处理是适合技术的一个实例。
磁场控制：如在本披露的其他地方所指出的，所披露的方法的许多实施例都利用磁场来在完成测定后将珠从微孔中去除。在一些实施例中，所述仪器系统可以进一步包括使用磁场用于将珠输送进出微孔流动池或室或通过仪器系统的其他部分，或用于在测定之前或在测定期间已经加载或分配珠之后将珠保留或俘获在特定位置。用于提供磁场控制的适合手段的实例包括但不限于相对于柱体在一个或多个固定位置中使用电磁体，或必要时使用被机械重新定位的永磁体。在所述仪器系统的一些实施例中，施加的一个或多个磁场的强度将通过改变施加至一个或多个电磁体的电流量而改变。在所述仪器系统的一些实施例中，施加的磁场的强度通过使用例如步进电机驱动的线性致动器、伺服电机驱动的线性致动器或凸轮轴机构改变相对于一个或多个微孔室的位置的一个或多个永磁体的位置而改变。在其他实施例中，能以线性(或非线性)方式控制磁体的位置，与仅在两个固定位置之间进行转换相反，速度被选择为最大化珠收集效率。在所述仪器系统的一些实施例中，使用脉冲磁场可能是有利的，例如，以防止磁珠聚簇。
除了考虑用于操纵珠和其他材料的磁场的强度和位置之外，重要的是设计系统使得磁场梯度适合于正在进行的任务。磁场中的空间梯度对磁性材料和颗粒施加平移力。可以通过使用多个磁体，使用具有特定边缘和面几何形状的磁体或磁化材料，以及通过设计具有适当的空间尺度的磁体来实现场中的适合梯度。此处，术语“磁体”是指永磁体或电磁体。包括多个磁畴的磁体组件(固有或通过设计形成的)可用于产生具有所希望场强和空间变化的磁场。例如，具有平行或反平行场轴或其他相对角度的小磁体的模式可以邻近孔和流体的模式放置，以在装置的加载和操作期间实现珠的最佳俘获或操纵。在所披露的系统的一些实施例中，例如当使用磁场将磁珠俘获在微孔中或从微孔中洗脱磁珠时，外部施加的磁场梯度可以同时被施加到整个微孔模式。在一些实施例中，外部施加的磁场梯度可以施加到所述微孔模式的所选择的区域。在一些实施例中，外部施加的磁场梯度可以施加到单一微孔。在一些实施例中，外部施加的磁场的磁场线可以相对于微孔基底平面成约30度和89度之间的角度。在一些实施例中，磁场线相对于微孔基底平面的角度可以在约45度和80度之间。在一些实施例中，磁场线相对于微孔基底平面的角度可以是至少45度、至少50度、至少55度、至少60度、至少65度、至少70度、至少75度、或至少80度或更大。在一些实施例中，磁场线相对于微孔基底平面的角度可以是至多80度、至多75度、至多70度、至多65度、至多60度、至多55度、至多50度、或至多45度或更小。本领域的普通技术人员应认识的是，磁场线相对于微孔基底平面的角度可以具有在这个范围内的任何值，例如约52度。
温度控制：在一些实施例中，所述仪器系统将包括温度控制功能性，用于有助于测定结果的准确度和再现性的目的，例如，冷却微孔流动池或室对于最小化微孔之间的分子扩散可以是有利的。可以被并入所述仪器系统(或柱体)设计中的温度控制部件的实例包括但不限于电阻加热元件、红外光源、珀耳帖加热或冷却装置、散热器、热敏电阻、热电偶等。在所述系统的一些实施例中，所述温度控制器可以在进行细胞裂解和下游测定步骤之前在指定的可调整时间提供可编程的温度变化。在所述系统的一些实施例中，所述温度控制器可以提供在指定的时间间隔内的可编程温度变化。在一些实施例中，所述温度控制器可以进一步以指定频率和斜率提供两个或更多个设定温度之间的温度循环，从而可进行用于扩增反应的热循环。
成像能力：如上所指出的，在许多实施例中，所述仪器系统将包括光学成像或其他光谱能力。这样的功能性可以有用于例如检查微孔基底，以确定所述微孔模式是否已经被细胞或珠均匀且最佳地填充。可以应用多种成像模式中的任何一种，包括但不限于明场、暗场、荧光、发光或磷光成像。成像模式的选择将影响微孔阵列、流动池和柱体室的设计，因为流动池或微孔室的微孔基底或相对壁需要在感兴趣的光谱范围内必须是透明的。在一些实施例中，可以使用部分相干的照明光来改善明场图像中的未染色细胞的对比度。
在一些实施例中，可以使用定量相位成像来改善自动图像处理和分析软件在确定位于每个微孔中的细胞数目中的性能。未染色的细胞典型地吸收很少的光，但是在透射光中引起可测量的相位延迟。定量相位成像可以指用于从使用相干或部分相干光收集的一系列两个或更多个图像(其捕获强度数据)计算相位信息的几种方法中的任何一种。可以例如通过在不同散焦距离处捕获图像来捕获一系列合适的强度图像。然后例如使用“输送强度(Transport of Intensity)”算法或基于契伯格-山克斯顿(Gerchberg-Saxton)方法的迭代技术来处理图像以恢复相位信息，以便在视场中创建细胞的形状和密度图。
在一些实施例中，可以在单一图像中将每多个微孔整个成像。在一些实施例中，可以将一系列图像“平铺”，以产生整个微孔模式的高分辨率图像。在一些实施例中，代表所述模式的分段的单一图像可以用于整体上评价所述模式的特性(例如，细胞或珠分配)。
在一些实施例中，可以进行双波长激发和发射(或多波长激发或发射)成像。
光源：多种光源中的任何一种都可以用于提供成像或激发光，包括但不限于钨灯、卤钨灯、弧光灯、激光器、发光二极管(LED)或激光二极管。在许多实施例中，一个或多个光源和附加光学部件(例如透镜、滤光片、光圈、光阑、反射镜等)的组合将包括照明系统(或子系统)。
检测器：多种图像传感器中的任何一种都可以用于成像目的，包括但不限于光电二极管阵列、电荷耦合装置(CCD)摄像机或CMOS图像传感器。成像传感器可以是一维(线性)或二维阵列传感器。在许多实施例中，一个或多个图像传感器和附加光学部件(例如透镜、滤光片、光圈、光阑、反射镜等)的组合将包括成像系统(或子系统)。
其他光学部件：所述光学系统将典型地包括多种光学部件，用于使穿过系统的光束转向、成形、过滤或聚焦。适合的光学部件的实例包括但不限于透镜、反射镜、棱镜、衍射光栅、着色玻璃滤光片、窄带干涉滤光片、宽带干涉滤光片、分色反射镜、光学纤维、光学波导等。在一些实施例中，所述成像系统将进一步包括一个或多个平移台或其他运动控制机构，用于相对于照明和/或成像系统移动所述一个或多个微孔基底的目的，或反之亦然。在一些实施例中，所述仪器系统可以使用光学透明的微阵列基底作为波导，用于将激发光递送到微孔。
互补测定技术：成像模式的选择还可以允许与随机标记和分子索引测定平行地使用待运行的其他类型的测定，例如，与明场成像平行地使用台盼蓝活细胞/死细胞测定、与荧光成像平行地使用基于荧光的活细胞/死细胞测定等。相关微孔中的单独的细胞的生存力数据和与每个珠相关的细胞标签的相关性可以在分析来自多重、单细胞测定的数据方面提供另外的辨别标准。
另外的系统能力：在一些实施例中，所述系统可以包括用于探测微孔阵列的非成像或非光学能力。用于检测俘获的气泡、确定阵列中的细胞或珠分配等的非成像或非光学技术的实例包括但不限于测量光散射、紫外/可见/红外吸收测量(例如，使用掺入染料的经染色的细胞或珠)、相干拉曼(Raman)散射以及电导测量(例如，使用与微孔阵列配准的微制造的电极阵列)。在一些实施例中，获得的关于特定孔的条件或内容物的信息可以用于确定那些孔必须被隔离、切除或以其他方式阻止而不对测定结果有贡献。例如，电加热元件可以用于形成气泡或使孔内容物变性，或者可以施加光能以使孔壁变形，并且从而俘获内容物，或者可以施加局部磁场，以使得待消除的珠被俘获在基底中而不是洗脱用于分析。
与PCR热循环仪、测序仪和FACS仪器的接口：在一些实施例中，本披露的仪器系统可以进一步包括与PCR热循环仪、测序仪、细胞分选仪、荧光活化细胞分选仪(FACS)仪器或其他类型的实验室自动化设备的接口。
在一些实施例中，提供针对PCR热循环仪的接口，使得仪器系统将标记的寡核苷酸文库直接输出到与可商购的PCR仪器(例如Roche
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系列实时PCR仪器等)相容的管、条或板中。
在一些实施例中，提供针对细胞分选仪或FACS仪器的接口，使得经分选的细胞直接沉积到微孔阵列或柱体中。针对FACS仪器的接口可以例如包括硬件和软件部件，其中软件提供同时控制FACS仪器和单细胞、随机标记或分子条码化系统的能力。在一些实施例中，所述软件可以提供用于鉴定FACS数据(例如，指定的细胞表面标志物的存在或不存在)与指定的细胞子群中一个或多个基因的拷贝数目之间的相关性的分析能力。FACS机器可以用于将单细胞直接分选到本披露的微孔阵列中。
在一些实施例中，通常提供了与实验室自动化设备的接口，例如，用于与所披露的仪器系统一起使用的柱体可以被配置成具有适当尺寸和间隔的入口，使得可以使用可商购的移液站和液体处理机器人直接将样品和试剂分配到柱体中。类似地，在一些实施例中，与所披露的仪器系统一起使用的柱体可以被配置成具有与可商购的板处理机器人相容的尺寸，用于进行自动存储、收回或在其他实验室工作站之间移动。
系统处理器和软件：
通常，被设计成支持多重、单细胞随机标记和分子条码化测定的自动化的仪器系统将包括处理器或计算机连同软件，以提供(i)仪器控制功能性、(ii)图像处理和分析能力以及(iii)数据存储、分析和显示功能性。
系统处理器和控制软件：在许多实施例中，所述仪器系统将包括计算机(或处理器)和计算机可读媒质，所述媒质包括用于提供用户界面连同所有系统功能的手动、半自动化或全自动化控制的代码，例如射流系统、温度控制系统、细胞或珠分配功能、磁珠操纵功能以及成像系统的控制。在一些实施例中，所述系统计算机或处理器可以是所述仪器系统的集成部件(例如嵌入仪器内的微处理器或母板)。在一些实施例中，所述系统计算机或处理器可以是独立式模块，例如个人计算机或便携式计算机。由仪器控制软件提供的流体控制功能的实例包括但不限于流体体积流量，流体流速，样品和珠添加、试剂添加以及漂洗步骤的时机和持续时间。由仪器控制软件提供的温度控制功能的实例包括但不限于指定一个或多个温度设定点以及温度变化的时机、持续时间和斜率的控制。由仪器控制软件提供的细胞或珠分配功能的实例包括但不限于搅拌参数的控制，如幅度、频率和持续时间。由仪器控制软件提供的磁场功能的实例包括但不限于施加的一个或多个磁场的时机和持续时间，并且在电磁体的情况下，还有磁场强度。由仪器控制软件提供的成像系统控制功能的实例包括但不限于自动对焦能力，照明或激发光暴露时间和强度的控制，图像采集速率、暴露时间的控制以及数据存储选项。
图象处理软件：在所述仪器系统的一些实施例中，所述系统将进一步包括计算机可读媒质，其包括用于提供图像处理和分析能力的代码。由软件提供的图像处理和分析能力的实例包括但不限于手动、半自动化或全自动化图像曝光调整(例如，白平衡、反差调整、信号平均和其他降噪能力等)，自动化边缘检测和目标鉴定(即用于鉴定图像中的细胞和珠)，自动化统计分析(即用于确定微孔基底的每微孔或每单位面积鉴定出的细胞或珠的数目，或用于鉴定含有多于一个细胞或多于一个珠的孔)以及手动测量能力(例如，用于测量目标之间的距离等)。在一些实施例中，仪器控制和图像处理/分析软件将被写为独立的软件模块。在一些实施例中，仪器控制和图像处理/分析软件将被并入集成包装中。
在一些实施例中，所述系统软件可以提供集成的实时图像分析和仪器控制，使得可以延长、修饰或重复细胞和珠样品加载步骤，直到实现最佳细胞和珠分配(例如，在针对含有单细胞的孔的数目、含有单一珠的孔的数目或者含有单细胞和单一珠两者的孔的数目的预定水平跨微孔模式均匀分配)。可以使用本领域的普通技术人员已知的许多图像处理和分析算法中的任何一种来实现实时或处理后图像分析能力。实例包括但不限于侃尼边缘检测方法、侃尼-戴里什边缘检测方法、一阶梯度边缘检测方法(例如索贝尔算子)、二阶微分边缘检测方法、相位一致(相位相干)边缘检测方法、其他图像分割算法(例如强度阈值分割、强度聚簇方法、基于强度直方图的方法等)、特征和模式识别算法(例如用于检测任意形状的广义霍夫变换、圆形霍夫变换等)和数学分析算法(例如傅里叶变换、快速傅里叶变换、小波分析、自相关等)或其组合。如上所概述的，可以通过来自实时图像分析的反馈来控制的促进细胞和珠分配的机构的实例包括但不限于振动、摇动、漩涡、再循环流、振荡或脉动流、低频搅拌(例如，通过脉冲柔性(例如，硅酮)膜，所述膜形成室壁或在流体通道附近)或高频搅拌(例如，通过使用压电换能器)。在一些实施例中，如通过图像处理和分析确定的，所述仪器系统可以监测在微孔中捕获的细胞的总数，并且当达到预定数目的细胞时关闭细胞供应，以避免加载超额数目的具有两个或更多个细胞的孔。在一些实施例中，所述仪器系统可以监测含有单细胞的孔的数目，并且当达到预定数目的孔时关闭细胞供应，以避免加载超额数目的具有两个或更多个细胞的孔。在一些实施例中，所述仪器系统可以监测含有单一珠的孔的数目，并且当达到预定数目的孔时关闭珠供应，以避免加载超额数目的具有两个或更多个珠的孔。在一些实施例中，所述仪器系统可以监测含有单细胞和单一珠两者的孔的数目，并且关闭细胞或珠(或两者)的供应，以避免加载超额数目的具有两个或更多个细胞或珠的孔。
当使用集成的实时图像分析和仪器控制来实现最佳珠分配时，可以靶向多个预定水平中的任何一个。例如，在一些实施例中，含有单一珠的微孔的百分比可以在1％和100％之间。在一些实施例中，所述多个微孔中的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的微孔可以含有单一珠。在一些实施例中，所述多个微孔中的至多100％、至多99％、至多95％、至多90％、至多80％、至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的微孔可以含有单一珠。
当使用集成的实时图像分析和仪器控制来实现最佳细胞分配时，可以靶向多个预定水平中的任何一个。例如，在一些实施例中，含有单细胞的微孔的百分比可以在1％和100％之间。在一些实施例中，所述多个微孔中的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的微孔可以含有单细胞。在一些实施例中，所述多个微孔中的至多100％、至多99％、至多95％、至多90％、至多80％、至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的微孔可以含有单细胞。
实时图像分析可以包括监测微孔中的细胞捕获效率(即，确定在其中具有细胞的孔的数目和/或确定在孔之间的细胞的百分比)。可以通过如下方法，例如搅拌、洗涤(即，冲洗)流体和/或磁性方法，来改善细胞捕获。例如，可以在微孔之间的细胞的百分比可以在1％和100％之间。在一些实施例中，至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的细胞可以在微孔之间(例如，在微孔之间的表面上)。在一些实施例中，至多100％、至多99％、至多95％、至多90％、至多80％、至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的细胞可以在微孔之间(例如，在微孔之间的表面上)。
当使用集成的实时图像分析和仪器控制来实现最佳细胞和珠分配(例如最大化含有单细胞和单一珠两者的微孔的百分比)时，可以靶向多个预定水平中的任何一个。例如，在一些实施例中，含有单细胞和单一珠两者的微孔的百分比可以在1％和100％之间。在一些实施例中，所述多个微孔中的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的微孔可以含有单细胞和单一珠两者。在一些实施例中，所述多个微孔中的至多100％、至多99％、至多95％、至多90％、至多80％、至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的微孔可以含有单细胞和单一珠两者。
在一些实施例中，所述系统软件可以提供集成的实时图像分析和仪器控制，这样使得可以根据一组预定的特征光学地监测和分类细胞，并且随后在下游序列数据分析中包括或排除。可以被光学地监测并用于分类目的的细胞特征的实例包括但不限于细胞大小、细胞形状、活细胞/死细胞测定(例如使用选择性吸收的发色团如台盼蓝、或荧光染料如钙黄绿素AM、乙锭均二聚物-1、DiOC2(3)、DiOC5(3)、DiOC6(3)、DiSC3(5)、DiIC1(5)、DiOC18(3)、碘化丙啶、
Figure GDA0002954171600000771
14、
Figure GDA0002954171600000772
Green等)、展现指定范围的细胞内pH的细胞(例如使用细胞内pH敏感荧光探针，如2′,7′-双-(2-羧乙基)-5-(和-6-)羧基荧光素(BCECF)、2′,7′-双-(2-羧丙基)-5-(和-6-)-羧基荧光素(BCPCF)等)、展现指定范围的膜电位的细胞(例如使用膜电位敏感性荧光团，如FluoVoltTM、二-3-ANEPPDHQ、二-(1,3-二丁基巴比妥酸)三次甲基氧杂菁(DiBAC4(3))、DiBAC4(5)、DiSBAC2(3)、部花青540、JC-1、JC-9、Oxonol V、Oxonol VI、四甲基罗丹明甲酯和乙酯、罗丹明123、二-4-ANEPPS、二-8-ANEPPS、二-2-ANEPEQ、二-3-ANEPPDHQ、二-4-ANEPPDHQ等)、展现指定水平的细胞内钙的细胞(例如使用Ca2+敏感荧光染料，如fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4、Calcium Green-1、Quin 2等)、展现一种或多种指定细胞表面标志物的细胞(例如针对细胞表面标志物的荧光标记抗体)、表达荧光蛋白(例如GFP、胆红素诱导型荧光蛋白、UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、TagRFP、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP等)的细胞等。在许多实施例中，可以选择两种或更多种染料、荧光团或具有非重叠光谱性质(例如非重叠激发峰、非重叠吸收或发射峰等)的其他光学探针，这样使得可以相对于两种或更多种性质同时表征细胞。在一些实施例中，使用实时图像处理和分析来鉴定含有展现一个或多个指定特征的细胞的孔，随后在进一步分析中选择或排除阵列上的细胞亚群。在一些实施例中，使用实时图像处理和分析来鉴定含有两个或更多个细胞的孔，随后在进一步分析中排除那些孔中的细胞。如上文更详细描述的，可用于在进一步分析中选择或排除细胞亚群的机构的实例包括但不限于(i)借助于微型化磁探针、光镊设备、显微操纵器、光消融等从微孔中物理去除所选择的细胞或珠，(ii)借助于微型化磁探针、可膨胀珠、可收缩孔将所选择的细胞或珠物理截留在微孔内，或(iiii)使用双重编码方案，由此在进一步分析中选择或排除针对给定细胞产生的序列数据。
在一些实施例中，所述系统软件(或独立式软件模块)可以使用血细胞计数器提供用于自动细胞计数的图像分析能力，从而允许用户确定将多少细胞悬浮液加载到微孔阵列基底上。在一些实施例中，自动细胞计数能力可以与任选的荧光图像分析结合，使得可以在进行计数的同时相对于生存力或其他性质来表征细胞(使用例如上述光学探针)。
数据分析和显示软件：在所述仪器系统的一些实施例中，所述系统将包括计算机可读媒质，其包括用于为通过进行单细胞、随机标记或分子条码化测定而产生的序列数据集提供数据分析提供数据分析的代码。可以由数据分析软件提供的数据分析功能性的实例包括但不限于(i)用于由对在运行测定时产生的寡核苷酸文库进行测序提供的样品条码、细胞条码、分子条码和靶序列数据的解码/多路解编的算法，(ii)用于基于数据来确定读数数目/基因/细胞和唯一性转录物分子数目/基因/细胞和创建汇总表的算法，(iii)序列数据的统计分析，例如用于由基因表达数据来聚簇细胞，或用于预测转录物分子数目/基因/细胞的测定的置信区间等，(iv)用于鉴定罕见细胞子群的算法，例如，使用主成分分析、层次聚簇、k均值聚簇、自组织映射、神经网络等，(v)用于将基因序列数据与已知参照序列进行比对和对突变、多态性标志物和剪接变体进行检测的序列比对能力，以及(vi)分子标记的自动化聚簇，以补偿扩增或测序误差。在一些实施例中，可商购的软件可用于进行数据分析的全部或一部分，例如，Seven Bridges软件可用于针对整个细胞集合编译每个细胞中出现的一个或多个基因的拷贝数目表。在一些实施例中，数据分析软件可以包括用于以有用的图形格式输出测序结果的选项，例如指示出现在细胞集合的每个细胞中的一个或多个基因的拷贝数目的热图。在一些实施例中，数据分析软件可以进一步包括用于从测序结果提取生物学意义的算法，例如通过将在细胞集合的每个细胞中出现的一个或多个基因的拷贝数目与细胞类型、罕见细胞类型、或者源自患有特定疾病或病况的受试者的细胞相关联。在一些实施例中，数据分析软件可以进一步包括用于比较不同生物样品的细胞群的算法。
在一些实施例中，所有数据分析功能性可以被包装在单一软件包内。在一些实施例中，完整的数据分析能力集可以包括一套软件包。在一些实施例中，数据分析软件可以是独立于测定仪器系统的用户可用的独立式包装。在一些实施例中，所述软件可以是基于网络的，并且可以允许用户共享数据。
系统处理器和网络：通常，包括在当前披露的仪器系统(如图36所说明的)中的计算机或处理器可以被进一步理解为逻辑设备，其可以读取来自媒质511或网络端口505的指令，所述媒质或网络端口可以任选地与具有固定媒质512的服务器509连接。系统500(如图36所示的)可以包括CPU 501、磁盘驱动器503、任选的输入装置(如键盘515或鼠标516)以及任选的监测器507。可以通过从指定的通信媒质传至在本地或远程位置的服务器来实现数据通信。通信媒质可以包括发送或接收数据的任何工具。例如，通信媒质可以是网络连接、无线连接或因特网连接。这样的连接可以提供经由万维网的通信。可以设想的是，与本披露有关的数据可以通过这样的网络或连接进行传输，以由接收方522接收或审阅，如图36所说明的。
图37是一个框图，说明了可以与本披露的示例性实施例结合使用的计算机系统100的第一示例性架构。如图37所描绘的，所述示例性计算机系统可以包括用于处理指令的处理器102。处理器的非限制性实例包括：英特尔XeonTM处理器、AMD OpteronTM处理器、三星32位RISC ARM 1176JZ(F)-S v1.0TM处理器、ARM Cortex-A8三星S5PC100TM处理器、ARMCortex-A8苹果A4TM处理器、美满PXA 930TM处理器或功能等效的处理器。多个执行线程可以用于并行处理。在一些实施例中，也可以使用多处理器或具有多个核心的处理器，无论是以单个计算机系统、成群地还是通过网络跨系统分配的，所述网络包括多个计算机、手机或个人数据助理装置。
如图37所说明的，可以将高速缓存104连接至或并入处理器102中，以便为最近已经被或频繁地被处理器102使用的指令或数据提供高速存储器。通过处理器总线108将处理器102与北桥106连接。北桥106通过存储总线112与随机存取内存(RAM)110连接并且管理处理器102对RAM 110的访问。北桥106还通过芯片集总线116与南桥114连接。南桥114进而与外设总线118连接。外设总线可以是例如PCI、PCI-X、PCI Express或其他外设总线。北桥和南桥通常被称为处理器芯片集并且管理处理器、RAM与外设总线118上的外设部件之间的数据传输。在一些替代性架构中，可以将北桥的功能性并入处理器中而取代使用单独的北桥芯片。
在一些实施例中，系统100可以包括附接至外设总线118的加速器卡122。加速器可以包括现场可编程门阵列(FPGA)或其他用于加速某些处理的硬件。例如，加速器可以用于自适应性数据重构或用于评价扩展集处理中所用的代数表达式。
软件和数据被存储在外部存储器124中并且可以被加载到RAM 110或缓存104中，用于为处理器所用。系统100包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性实例包括：Linux、WindowsTM、MacOSTM、BlackBerry OSTM、iOSTM和其他功能等效的操作系统，以及在操作系统之上运行的用于根据本发明的示例性实施例管理数据存储和优化的应用软件。
在这个实例中，系统100还包括与外设总线附接的网络接口卡(NIC)120和121，用于为外部存储器(如附网存储(NAS))和其他可以用于分配式并行处理的计算机系统提供网络接口。
图38是一个图表，显示了网络200，其具有多个计算机系统202a和202b、多个手机和个人数据助理202c以及附网存储(NAS)204a和204b。在示例性实施例中，系统202a、202b和202c可以管理数据存储并针对存储在附网存储(NAS)204a和204b中的数据优化数据访问。数学模型可以用于数据并且使用跨计算机系统202a和202b、和手机以及个人数据助理系统202c的分配式并行处理进行评价。计算机系统202a和202b和手机以及个人数据助理系统202c还可以为存储在附网存储(NAS)204a和204b中的数据的自适应性数据重构提供并行处理。图38仅说明了一个实例，并且多种多样的其他计算机架构和系统也可以与本发明的不同实施例结合使用。例如，刀片式服务器可以用来提供并行处理。处理器刀片可以通过底板进行连接，以提供并行处理。存储器也可以通过单独的网络接口与底板附接或作为附网存储(NAS)。
在一些示例性实施例中，处理器可以保持分开的存储空间并且通过网络接口、底板或其他连接器传输数据，用于通过其他处理器进行并行处理。在其他实施例中，一些或所有处理器可以使用共享的虚拟地址存储空间。
图39是根据一个示例性实施例的多处理器计算机系统300的框图，所述系统使用共享的虚拟地址存储空间。所述系统包括多个可以访问共享的存储子系统304的处理器302a-f。所述系统在存储子系统304中并入了多个可程编硬件存储算法处理器(MAP)306a-f。MAP 306a-f各自可以包括存储器308a-f以及一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)310a-f。MAP提供了可配置性功能单元并且具体算法或算法部分可以被提供给FPGA 310a-f，用于与对应的处理器密切配合进行处理。例如，MAP可以用于相对于数据模型来评价代数表达式以及用于在示例性实施例中进行自适应性数据重构。在这个实例中，每个MAP都可被所有处理器全球访问，用于这些目的。在一种配置中，每个MAP都可以使用直接内存访问(DMA)来访问相关的存储器308a-f，从而允许它独立于对应的微处理器302a-f并且与其不同步地执行任务。在这种配置中，MAP可以将结果直接给至另一MAP，用于流水操作和并行执行算法。
以上计算机架构和系统仅仅是实例，并且多种多样的其他计算机、手机和个人数据助理架构和系统可以与示例性实施例结合使用，包括使用一般处理器、协同处理器、FPGA和其他可编程逻辑装置、片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)以及其他处理和逻辑元件的任何组合的系统。在一些实施例中，全部或部分的计算机系统可以在软件或硬件中实施。任何种类的数据存储媒质都可以与示例性实施例结合使用，包括随机存取内存、硬盘驱动器、闪速存储器、磁带驱动器、磁盘阵列、附网存储(NAS)以及其他局部或分布式数据存储装置和系统。
在示例性实施例中，可以使用在任何以上或其他计算机架构和系统上执行的软件模块来实施本披露的计算机子系统。在其他实施例中，可以部分地或完全地在以下项中实现所述系统的功能：固件、可编程逻辑装置(如在图39中提及的现场可编程门阵列(FPGA))、片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)或其他处理和逻辑元件。例如，可以通过使用硬件加速器卡(如图37中所说明的加速器卡122)通过硬件加速来实施集处理器和优化器。
试剂盒：
在此还披露了用于进行单细胞、随机标记或分子条码化测定的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒可以包括一个或多个微孔基底(作为包括一个或多个微孔模式的独立式的基底(或芯片)，或包装在一个或多个流动池或柱体内)和一种或多种珠悬浮液，其中悬浮液内的单独的珠包括多个附接的随机标记。在一些实施例中，所述试剂盒可以进一步包括用于安装独立式的微孔基底的机械固定器，以便产生促进将样品和试剂用移液管移取进微孔中的反应孔。在一些实施例中，所述试剂盒可以进一步包括用于进行随机标记测定的试剂，例如裂解缓冲液、漂洗缓冲液或杂交缓冲液。在一些实施例中，所述试剂盒可以进一步包括用于进行核酸延伸反应(例如，逆转录反应)的试剂(例如酶、引物或缓冲液)。在一些实施例中，所述试剂盒可以进一步包括用于进行扩增反应以制备测序文库的试剂(例如酶、通用引物、测序引物、靶特异性引物或缓冲液)。在一些实施例中，所述试剂盒可以包括一个或多个模具，例如包括用于铸造微孔模式的微柱模式的模具，以及一种或多种珠悬浮液，其中悬浮液内的单独的珠包括多个附接的随机标记。在一些实施例中，所述试剂盒可以进一步包括用于铸造微孔的材料(例如琼脂糖、水凝胶、PDMS等)。
在所披露的试剂盒的一些实施例中，所述试剂盒可以包括一个或多个微孔基底，其预加载有包括多个附接的随机标记的珠，其中每微孔存在至多一个珠。在一些实施例中，所述多个随机标记可以直接附接至微孔的表面，而不是附接至珠。在这些实施例的任何一个中，所述一个或多个微孔基底能以独立的基底(或芯片)的形式提供，或者它们可以被包装在流动池或柱体中。
在所披露的试剂盒的一些实施例中，所述试剂盒可以包括一个或多个柱体，所述柱体并入了一个或多个微孔基底。在一些实施例中，所述一个或多个柱体可以进一步包括一种或多种预加载的珠悬浮液，其中悬浮液内的单独的珠包括多个附接的随机标记。在一些实施例中，所述珠可以被预分配到柱体的一个或多个微孔基底中。在一些实施例中，处于悬浮液形式的珠可以被预加载并储存在柱体的试剂孔内。在一些实施例中，所述一个或多个柱体可以进一步包括预先加载并储存在柱体的试剂储器内的其他测定试剂。
应用：
在此披露的方法、装置和系统可用于基础研究、生物医学研究、环境测试和临床诊断中的多种应用。所披露技术的潜在应用的实例包括但不限于基因分型、基因表达谱分析、罕见细胞的检测和鉴定、疾病或病况的诊断、确定疾病或病况的预后、确定疾病或病况的治疗过程(例如，确定患者是否可能对治疗作出反应)、以及监测对疾病或病况治疗的反应、以及了解生物发育过程。
循环肿瘤细胞(CTC)：在一些实施例中，本披露的方法、装置和系统可用于表征循环肿瘤细胞(CTC)。本披露的方法、装置和系统可用于检测来自富集血液样品的循环肿瘤细胞中的表达谱。所述方法可以包括获得含有来自怀疑具有靶罕见细胞的个体的混合细胞群的生物样品，使所述样品(其可能是富集的)接触本披露的装置和系统，使得单细胞处于单一孔中。所述样品可以经受用于从血液中去除红细胞和/或死细胞的方法。所述样品可以与本披露的珠接触，使得单一珠与单细胞在单一孔中。所述细胞可以被裂解。所述珠可以包括随机标记，其可以结合细胞中的特定位置基因和/或细胞的mRNA。来自与固体支持物相关联的CTC的分子可以经受本披露的分子生物学方法，包括逆转录、扩增和测序。基于细胞的基因表达谱可以聚簇所述细胞，从而基于其基因型鉴定罕见细胞(例如，CTC)和罕见细胞(例如，CTC)子群。
所述方法可用于鉴定和表征CTC群或样品中循环肿瘤细胞(CTC)的子群(子组)，定量所述CTC群或所述样品中的CTC的子组，诊断和监测癌症、治疗和预后，特别是针对实体瘤，以及使用鉴定的CTC子组作为诊断、预后和治疗性治疗的生物标志物。
T细胞受体链配对：T细胞受体(TCR)是存在于T淋巴细胞表面的识别分子。在T细胞表面发现的T细胞受体可以由称为α链和β链的两个糖蛋白亚基组成。两条链可以包括约40kDa的分子量并具有可变和恒定结构域。编码α链和β链的基因可以被组织在通过遗传重排而形成基因的V、D和J区的文库中。TCR可以识别由抗原呈递细胞呈递的抗原，作为与组织相容性基因编码的特异性自身分子的复合物的一部分。最有效力的组织相容性基因被称为主要组织相容性复合物(MHC)。因此，由T细胞受体识别的复合物由MHC/肽配体组成。
在一些实施例中，本披露的方法、装置和系统可用于T细胞受体测序和配对。本披露的方法、装置和系统可以用于对T细胞受体α链和β链测序，使α链和β链配对，和/或确定T细胞受体α链的功能拷贝。单细胞可以含在具有单一珠的单一孔中。所述细胞可以被裂解。所述珠可以包括随机标记，其可以结合TCR的α链和/或β链内的特定位置。与固体支持物相关联的TCR α和β分子可以经受本披露的分子生物学方法，包括逆转录、扩增和测序。包括相同细胞标记的TCRα链和β链可以被认为来自相同的单细胞，从而使TCR的α链和β链配对。
抗体组库中的重链和轻链配对：本披露的方法、装置和系统可用于抗体中的重链和轻链配对。本披露的方法允许确定个体生物体或细胞群中的免疫受体和抗体的组库。本披露的方法可帮助确定构成免疫受体的多肽链对。B细胞和T细胞各自表达免疫受体；B细胞表达免疫球蛋白，并且T细胞表达T细胞受体(TCR)。两种类型的免疫受体可以包括两条多肽链。免疫球蛋白可以包括可变重(VH)链和可变轻(VL)链。可以存在两种类型的TCR：一种由α链和β链组成，并且一种由γ链和δ链组成。免疫受体中的多肽可以包括恒定区和可变区。可变区可以由B细胞或T细胞的染色体上的基因片段的重组和末端接合重排产生。在B细胞中，可变区的另外的多样化可以通过体细胞超突变发生。免疫系统具有较大的受体组库，并且由淋巴细胞表达的任何给定的受体对可以由一对单独的唯一性转录物编码。了解在单细胞中表达的免疫受体链对的序列可用于确定给定个体或细胞群的免疫组库。
在一些实施例中，本披露的方法、装置和系统可用于抗体测序和配对。本披露的方法、装置和系统可用于对抗体重链和轻链(例如，B细胞中的)测序和/或使重链和轻链配对。单细胞可以含在具有单一珠的单一孔中。所述细胞可以被裂解。所述珠可以包括随机标记，其可以结合抗体(例如，B细胞中的)的重链和/或轻链内的特定位置。与固体支持物相关联的重链和轻链分子可以经受本披露的分子生物学方法，包括逆转录、扩增和测序。包括相同细胞标记的抗体重链和轻链可以被认为来自相同的单细胞，从而使抗体的重链和轻链配对。
免疫肿瘤学：可以使用基于抗原、抗体、肽、DNA等的免疫介导的治疗来治疗癌症。所述治疗可以刺激患者自己的免疫系统来抗击癌症(例如，通过增加免疫应答和/或通过去除免疫应答的制动)。示例性的免疫疗法可以包括结合并抑制细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)的抗体(Ab)伊匹木单抗
Figure GDA0002954171600000841
用于治疗晚期黑素瘤患者，以及阻断抑制性PD-1途径的Ab的开发。程序性死亡-1(PD-1)是由活化的T细胞和B细胞表达的关键免疫检查点受体并介导免疫抑制。PD-1是CD28受体家族的成员，所述家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。已经鉴定了PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体，程序化死亡配体-1(PD-L1)和程序化死亡配体-2(PD-L2)，其在抗原呈递细胞以及许多人类癌症上表达，并且已被证明在结合PD-1后下调T细胞活化和细胞因子分泌。与CTLA-4不同，PD-1主要在外周组织中起作用，在所述外周组织中活化的T细胞可能遇到由肿瘤和/或基质细胞表达的免疫抑制性PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)配体。PD-1/PD-L1相互作用的抑制可以介导临床样品中的强效抗肿瘤活性。
不是所有的癌症患者都对免疫疗法有反应。尚没有可靠的方法来确定患者是否会对治疗有反应。本披露的装置、方法和系统可用于预测患有癌症的患者对免疫疗法的反应和/或从中受益，涉及例如在肿瘤样品中确定指示对肿瘤的免疫疗法的反应的至少一种标记基因的表达，并且取决于基因表达，预测所述反应和/或益处。在一些情况下，本披露的装置、方法和系统可用于预测免疫疗法在癌症患者体内的效果，包括例如确定来自癌症患者的样品中至少一种癌症标志物的水平，其中与给定癌症患者群体的中位数相比，标志物的较高的(或增加的)水平指示所述患者的免疫疗法的有益效果。
在所披露的方法、装置和系统的一些实施例中，第一细胞样品获得自不患有疾病或病况的人，并且第二细胞样品获得自患有所述疾病或病况的人。在一些实施例中，所述人是不同的。在一些实施例中，所述人是相同的，但是细胞样品是在不同时间点取的。在一些实施例中，所述人是患者，并且所述细胞样品是患者样品。在一些实施例中，所述疾病或病况是癌症、细菌感染、病毒感染、炎性疾病、神经退行性疾病、真菌疾病、寄生虫病、遗传性障碍或其任何组合。
在一些实施例中，所述细胞是从癌组织切除的癌细胞，例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌等。在一些情况下，所述细胞源自癌症，但是从体液(例如，循环肿瘤细胞)收集。癌症的非限制性实例可以包括腺瘤、腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、小细胞癌、大细胞未分化癌、软骨肉瘤以及纤维肉瘤。
在一些实施例中，所述细胞是已被病毒感染并含有病毒寡核苷酸的细胞。在一些实施例中，所述病毒感染可以由选自下组的病毒引起，该组由以下各项组成：双链DNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、单链(+链或“有义”)DNA病毒(例如细小病毒)、双链RNA病毒(例如呼肠孤病毒)、单链(+链或有义)RNA病毒(例如微小核糖核酸病毒、披膜病毒)、单链(-链或反义)RNA病毒(例如正粘病毒、弹状病毒)、单链((+链或有义)RNA病毒，在其生命周期中具有DNA中间体)RNA-RT病毒(例如逆转录病毒)和双链DNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒)。
在一些实施例中，所述细胞是细菌。这些可以包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。可以使用所披露的方法、装置和系统分析的细菌的实例包括但不限于马杜拉放线菌属(Actinomedurae)、衣氏放线菌、炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、棒状杆菌属、粪肠球菌、单核细胞增生李斯特菌、诺卡氏菌属、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epiderm)、变异链球菌、肺炎链球菌等。革兰氏阴性细菌包括但不局限于：猫阿菲波菌(Afipia felis)、类杆菌(Bacteriodes)、杆状巴尔通体、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)、伯氏疏螺旋体、回归热疏螺旋体、布鲁氏菌属、肉芽肿鞘杆菌、弯曲杆菌属、大肠杆菌、土拉热弗朗西丝菌、阴道加德纳菌、埃及嗜血杆菌(Haemophilius aegyptius)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilius ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilius influenziae)、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、脑膜炎奈瑟菌、牙龈卟啉单胞菌、斯氏普罗维登斯菌(Providencia sturti)、铜绿假单胞菌、肠炎沙门菌(Salmonella enteridis)、伤寒沙门菌、粘质沙雷菌、鲍氏志贺氏菌、念珠状链杆菌、化脓链球菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠疫耶尔森菌等。其他细菌可以包括鸟分枝杆菌(Myobacterium avium)、麻风分枝杆菌(Myobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Myobacterium tuberculosis)、汉式巴尔通体(Bartonella henseiae)、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、伯氏考克斯体、肺炎支原体、螨立克次体、普氏立克次体、立氏立克次体、姜虫病立克次体、斑疹伤寒立克次体、尿素分解脲原体、肺炎双球菌、查菲埃立克体(Ehrlichia chafensis)、屎肠球菌、脑膜炎球菌等。
在一些实施例中，所述细胞是真菌。可以使用所披露的方法、装置和系统分析的真菌的非限制性实例包括但不限于曲霉属、假丝酵母属(Candidae)、白色念珠菌、粗球孢子菌、隐球菌属(Cryptococci)及其组合。
在一些实施例中，所述细胞是原生动物或其他寄生虫。待使用本披露的方法、装置和系统分析的寄生虫的实例包括但不限于结肠小袋纤毛虫、微小隐孢子虫、卡晏环孢子虫(Cyclospora cayatanensis)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoa)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、比氏肠孢虫(Enterocytozoon bieneusi)、兰伯贾第虫、利什曼原虫(Leishmaniae)、疟原虫(Plasmodii)、鼠弓形体、锥体虫(Trypanosomae)、梯形阿米巴(trapezoidal amoeba)、蠕虫(worm)(例如，蠕虫(helminthes))，尤其是寄生蠕虫，包括但不限于线虫纲(蛔虫(roundworm)，例如鞭虫、钩虫、蛲虫、蛔虫(ascarid)、丝状虫(filarid)等)、绦虫纲(例如，绦虫)。
实例1-细胞捕获、标记和测序
制造微孔阵列：使用标准光刻法制造微孔阵列。将含有约150,000个微柱的阵列(约35mm x 15mm)在硅晶片上用SU-8模式化。将PDMS倾倒到所述晶片上以产生微孔的阵列。该晶片的复制品是使用PDMS微孔阵列作为模板用NOA63光学粘合剂制成的。在每个实验之前，根据NOA63复制品浇注琼脂糖(5％，IX-A型，西格玛公司(Sigma))微孔阵列。对于此处描述的实验，切割完整阵列的分段并使用，范围从约25,000至100,000个孔(表1)。可以仅通过增加光刻掩模上的微孔阵列模式的总面积来增加微孔阵列的大小，并用上述相同的步骤制造。例如，3”x2”显微镜载玻片可以容纳约140万个孔，用于捕获约140,000个单细胞。
表1.微孔阵列大小、加载的细胞数以及阵列上的细胞捕获效率。捕获效率被定义为基于血细胞计数器计数与加载到微孔阵列上的细胞量相比，在数据过滤之后保留的唯一性细胞条码的数目。注意，在目前的微孔阵列设计中，总孔面积占总表面积的约23％。未沉降在孔中的细胞被洗涤掉。另外，严格的过滤标准(见方法)倾向于低估测定的细胞总数，特别是对于相对较浅测序的样品。
Figure GDA0002954171600000871
珠文库的合成：使用分离-聚池组合方法制造珠。简言之，将用羧基官能化的二十微米直径的磁珠(Spherotech)分配到96个管中。使用碳二亚胺化学，将带有通用PCR引发序列、唯一性8核苷酸细胞标记和常见接头的5'胺修饰的寡核苷酸偶联到每个管中的珠上。然后将来自所有管的缀合珠聚池并分到第二组96个管中，用于退火至带有所述常见接头的互补物的模板寡核苷酸、另一个8核苷酸细胞标记和新的常见接头。在酶促聚合之后，再次将珠聚池并分到第三组96个管中，用于退火至5'端带有寡聚(dA)17的寡核苷酸，随后是充当分子索引的随机合成的8核苷酸序列，第三个8核苷酸细胞标记，以及所述第二个接头的互补序列。在酶促聚合之后，将珠聚池以得到最终文库。每个得到的珠涂覆有相同的克隆代表的细胞标记的数十至数亿的寡聚-dT寡核苷酸(884,736或96x96x96个可能的条码)，并且分子索引多样性为65,536(48)。通过线性增加在每个合成步骤的多样性，文库大小呈指数增长。
样品制备：将K562和拉莫斯细胞在具有10％FBS和1x抗生素-抗真菌剂的RPM1-1640中培养。来自健康供体的原代B细胞购自乐天生物科学(Sanguine Biosciences)。来自健康供体的PBMC分离自肝素钠管中的新鲜全血，其使用淋巴细胞分离剂溶液(干细胞公司(StemCell))采集自斯坦福血液中心。
单细胞捕获：通过血细胞计数器计数(SI表3)测量细胞密度，并进行调整以实现每10个或更多个微孔约1个捕获的细胞。将细胞悬浮液用移液管移取到微孔阵列上并允许重力沉降。通过显微镜检查证实微孔的细胞填充。将沉降在孔间表面(约为目前设计的总表面积的77％)的细胞去除，并且可以保存以备将来使用。然后以约5个珠/孔的密度加载珠文库，以使所有孔饱和。洗涤掉过量珠并将冷裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl pH 7.5、0.5MLiCl、1％LiSDS、10mM EDTA、5mM DTT)用移液管移取在所述微孔阵列的表面上。在磁体片上孵育10分钟后，除去覆盖阵列的裂解缓冲液，并用新鲜裂解缓冲液代替。通过将磁体放置在微孔阵列的顶部来收回捕获有mRNA的珠。将溶液中的珠通过移液而收集在微量离心管中，并且在管中用A洗涤缓冲液(0.1M Tris-HCl、0.5M LiCl、1mM EDTA)洗涤两次，并且用B洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5、50mM KCl、3mM MgCl2)洗涤一次。在不使用自动化的当前实施方式中，这个过程花费长达5小时，并行处理两个样品。
cDNA合成：将洗涤的珠重悬浮于微量离心管中的40μl RT混合物(生命技术公司(Life Technologies)，1x第一链缓冲液、20单位的SuperaseIN RNA酶抑制剂、200单位的SuperScript II或SuperScript III、3mM另外的MgCl2、1mM dNTP、0.2μg/ml BSA)中，所述微量离心管在箱中于16rpm旋转，在50℃持续50分钟(当使用用于K562和拉莫斯细胞的早期实验的SuperScript III时)或者在42℃持续90分钟(当使用用于所有其他实验的Superscript II时)。在cDNA合成后，通过用40μl的1x ExoI缓冲液中的20单位的ExoI(NEB)在37℃处理30分钟除去珠上的过量寡核苷酸，并且然后在80℃灭活15分钟。
多重PCR和测序：从RefSeq收回基因序列。每个标志物面板由使用Primer3设计的两组基因特异性引物组成。使用MATLAB选择每组内具有最少3'末端互补性的PCR引物(表2)。扩增方案示于图5中。用KAPA快速多重试剂盒(KAPA Fast Multiplex Kit)在珠上进行PCR，使用第一引物组中的50nM的每个基因特异性引物和50μl(针对K562和拉莫斯细胞混合物)、100μl(针对PBMC和B细胞实验)或200μl(针对T细胞实验)的400nM通用引物，遵循以下循环方案：在95℃下3min；在95℃下15s、在60℃下60s、在72℃下90s的15个循环；在72℃下5min。PCR体积的增加是为了减轻铁对磁珠的抑制作用。使用磁体回收珠，并用7x AmpureXP(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))纯化PCR产物。将一半的纯化产物用于下一轮巢式PCR，所述下一轮巢式PCR采用第二引物组，使用相同的KAPA试剂盒和循环方案。在用0.7xAmpure XP净化后，将前1/10的产物输入最终PCR反应，借此附加全长亿明达适配子(1xKAPA HiFi Ready Mix、200nM的引物P5、200nM的引物P7。95℃ 5min；98℃ 15s、60℃ 30s、72℃ 30s的8个循环；72℃ 5min)。在亿明达MiSeq仪器上，用150x2 bp化学物进行测序，中值深度为160万个读数/样品(表3)。
表2A.K562和拉莫斯细胞混合物的基因面板。
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表2B.B细胞基因面板。
Figure GDA0002954171600000902
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Figure GDA0002954171600000921
Figure GDA0002954171600000931
表3.测序和比对统计。
Figure GDA0002954171600000932
Figure GDA0002954171600000941
数据分析：在每个测序读数上检测细胞标记、分子索引和基因一致性(图5)。使用比对软件‘bowtie2’(44)(默认设置)进行第二配对读数(读数2)的基因定位。使用定制MATLAB脚本分析第一配对读数(读数1)上的细胞标记和分子索引。只保留完全匹配组合细胞条码的读数，但是这个要求可以进一步放宽，因为细胞条码被设计成允许纠错(M.Hamady,et al.(2008),Nat.Methods 5,235-237[M.Hamady等人(2008)，自然方法，5，235-237])。将读数首先通过细胞标记，然后通过基因一致性和分子索引来分组。为了计算唯一性分子数目/基因/细胞，对来自相同细胞的相同基因转录物的读数的分子索引进行聚簇。大于1个核苷酸的编辑距离被认为是唯一性簇，并且由此为唯一性转录物分子。对于每个样品构建含有每个细胞的数字基因表达谱的表-在所述表中的每行代表唯一性细胞，每列代表基因，并且所述表中的每个条目代表任何给定细胞内所述基因的唯一性转录物分子计数。对所述表进行过滤以去除进行仅一次(即冗余度＝1)测序的唯一性分子。对于K562和拉莫斯细胞混合物的实验，保留具有30个或更多个全部唯一性分子的细胞用于聚簇。对于其余的实验，保留具有总数为10个或更多个唯一性分子的细胞或者共表达面板中的4个或更多基因的细胞进行聚簇。然后将过滤的表用于聚簇分析。采用MATLAB中的内置函数对于经自然对数转换的转录物计数(其中添加1的假计数)进行主成分分析和分层聚簇。
使用替代方法测量单一拉莫斯细胞中的GAPDH拷贝数：在第一种方法中，通过RNeasy迷你试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取拉莫斯细胞的总RNA，并用Nanodrop定量。制备低至7pg的连续稀释物，并用1x EXPRESS SuperScript qPCR混合物(生命技术公司)、1xEXPRESS SuperScript酶混合物(生命技术公司)、1x GAPDH FAM测定(ABI)、1x加载试剂(富鲁达公司(Fluidigm))和1x ROX染料将其加载到12.765数字阵列(富鲁达公司)。在BioMark(富鲁达公司)上分析所述阵列，遵循以下方案：50℃ 15min，95℃2min，以及95℃ 15s和60℃ 60min的35个循环。测量GAPDH为34个拷贝/pg的总RNA。在第二种方法中，将拉莫斯细胞悬浮液在PBS中稀释至每10微升约1个细胞。将一微升悬浮液移液到多个0.2ml管中。通过显微镜检查证实管中单细胞的存在。使用在Fu,et al.(2014),Analytical Chemistry 86,2867-2870[Fu等人(2014)，分析化学，86，2867-2870]中概述的方法测定单细胞中的GAPDH计数。从8个细胞获得测量值。每个细胞获得214+/-36(S.E.)个拷贝的平均值(范围113至433个拷贝)。将每掺入拉莫斯细胞(18个单细胞)的GAPDH计数与这两种方法进行比较，以评价RNA检测效率。
结果：在图1和图2中概述了单细胞、随机标记和分子条码化程序。首先，将细胞悬浮液加载到具有高达100,000个微孔的微制作表面上。每个30微米直径的微孔含有约20皮升的体积。调整悬浮液中的细胞数，使得只有约十分之一的孔接收一个细胞。细胞仅借助于重力沉降到孔中。
接下来，将珠文库加载到微孔阵列上以达到饱和，使得大多数孔被填充。已经优化了珠和孔的尺寸以防止珠的双重占用。每个20微米的珠已经用数十至数亿的具有图1所示结构的寡核苷酸引物进行功能化。寡核苷酸由以下组成：通用PCR引发位点，随后是组合细胞标记、分子索引和寡聚(dT)的mRNA捕获序列。在每个珠上的所有引物享有相同的细胞标记但并入多种多样的分子索引。设计了组合分离-聚池合成方法，以产生达到接近100万的细胞标记多样性的珠文库。由于仅使用总可用细胞标记多样性的约1％，所以具有被相同标记标签化的两种单细胞的概率较低(为约10-4)。类似地，在单一珠上的分子标记的多样性是在105量级上，使得来自被相同分子索引标签化的相同细胞的相同基因的两个转录物分子的可能性较低。一旦单细胞和珠被共定位在微孔中，则将裂解缓冲液施加到表面上并允许其在内部扩散。释放的mRNA的高局部浓度(几十纳摩尔)有效地驱动其杂交到珠上。
在mRNA捕获后，从微孔阵列磁性收回所有珠。从此以后，在单一管中进行所有反应。在逆转录后，在每个珠上合成的cDNA分子用细胞和分子条码编码并充当扩增模板(图1和5A-D)。
扩增产物的测序揭示细胞标记、分子索引和基因一致性(图1和图5A-D)。计算分析将基于细胞标记的读数分类，并且将具有相同分子索引和基因序列的读数缩小到单一条目中以校正扩增偏倚，允许确定每个细胞中每个基因的绝对转录物数。
图3A描绘了捕获在微孔中的单细胞以及包括拴系随机标记的文库的珠(每孔一个细胞和一个珠)。图3B描绘了人外周血单核细胞随机条码化数据的主成分分析的实例。图3C描绘了罕见细胞群体的随机条码化数据的主成分分析的实例。
实例2-鉴定细胞混合物中的细胞类型
方法：用于本实例的方法与针对实例1所述的相同。
结果：为了证明单细胞随机标记或分子条码化鉴定两个细胞类型群体中的单个细胞的能力，向约25,000个微孔的部分阵列上加载K562(骨髓性白血病)和拉莫斯(伯基特淋巴瘤)细胞的约1:1混合物。选择具有12个基因的面板，并且从cDNA珠扩增这些基因并测序。所述面板由5个K562细胞特异性基因、6个拉莫斯细胞特异性基因、以及共同管家基因GAPDH组成(表2A)。大部分测序读数(约78％)与765个唯一性细胞标记相关。
使用主成分分析(PCA)，对每个细胞的基因表达谱进行聚簇(图4A)。第一主成分(PC)基于细胞类型将细胞分为两个主要簇。贡献于第一PC的正面的基因对于拉莫斯是特异性的，贡献于相同PC的负面的基因对于K562是特异性的。所述第二PC突出显示了在K562细胞内的胎血红蛋白(HBG1)表达的高度变异性，这在以前已经观察到(G.Fu,et al.(2014),Analytical Chemistry 86,2867-2870[G.Fu等人(2014)，分析化学，86，2867-2870]，R.D.Smith,et al.(2000),Nucleic Acids Res.28,4998-5004[R.D.Smith等人(2000)，核酸研究，28，4998-5004])。
接下来，我们将小数目的拉莫斯细胞加入来自健康个体的原代B细胞中。在1,198个细胞中分析已知涉及B细胞功能的一组111个基因(表2B)(D.A.Kaminski,et al.(2012),Frontiers in Immunology 3:302[D.A.Kaminski等人(2012)，免疫学前沿，3:302]；Y.Shenet al.(2004),BMC Immunol.5:20[Y.Shen等人(2004)，BMC免疫学，5:20]；J.A.Weinstein,et al.(2013),PloS One 8:e67624[J.A.Weinstein等人(2013)，公共科学图书馆·综合，8:e67624])。发现18个细胞(群体的约1.5％)具有不同的基因表达模式(图4B)。已知由这个组优先表达的基因与伯基特淋巴瘤相关联，并且包括MYC和IgM以及与伯基特淋巴瘤起源的滤泡性B细胞相关的标志物(CD10、CD20、CD22、BCL6)(图4C)。此外，这组细胞含有更高水平的CCND3和GAPDH，以及总体更高的mRNA含量(图4B)。本发现是与以下事实一致，淋巴瘤细胞在物理上比健康个体中的原代B细胞更大，并且它们快速增殖并且在转录上更活跃。
使用GAPDH的检测拷贝来估计单细胞的RNA捕获效率、随机标记或分子条码测定。使用数字RT-PCR测量10pg拉莫斯总RNA中的GAPDH为约343个拷贝。另外，我们使用敏感的分子索引技术测试单个拉莫斯细胞(G.Fu,et al.(2014)[G.Fu等人(2014)])并且确定214+/-36(S.E.)个GAPDH转录物/细胞的平均值，与通过单细胞、随机标记或分子条码化产生的152+/-10(S.E.)个拷贝相当。
实例3-具有拱形脊的微孔阵列的制造
在所披露的方法和系统的一些实施例中，可能希望的是制造在孔之间具有拱形脊(或其他特征)的微孔阵列，以便最小化沉降在孔之间的细胞或珠的数目。图7A显示了在孔之间具有拱形表面或脊的微孔阵列的显微照片。图7B显示了用于模制微孔的微柱阵列的侧视图，其中每个柱的顶表面使用回流工艺修圆(箭头指示一个微柱的弯曲边缘)。使用光刻技术和正性光刻胶(MicroChemicals
Figure GDA0002954171600000971
40XT)制造微柱阵列。在抗蚀剂显影后，使微柱阵列经受热(110℃至130℃)，持续范围从30秒至4分钟的时间间隔。通常，更高的热量和/或更长的曝光时间导致更大的曲率。将图7B所示的微柱阵列在130℃下加热30秒。将所得的微柱阵列用于铸造聚二甲基硅氧烷(PDMS)中间体结构，然后将其用于在琼脂糖、Norland光学粘合剂或其他聚合物中微成型所述微孔阵列。图7A所示的微孔阵列具有直径约30μm且深度为30至40μm的孔。在经受回流工艺之前，用于铸造微孔的微柱的直径是大约45μm。正如在图7A的显微照片中可以看出，在孔之间的基底表面上沉降的细胞或珠相对较少。在孔之间具有拱形脊的微孔阵列通常比在孔之间具有平坦表面的微孔阵列展现出显著更少的孔间细胞或珠沉降。
图8A-B显示了在使微柱阵列经受回流工艺之前和之后用微柱母体模制的微孔阵列的显微照片。图8A显示了在孔之间具有平坦基底表面的微孔阵列，如使用微柱母体在使其经受回流工艺之前制造的。将珠(直径22μm)加载到阵列上并允许其沉降，而不用进一步搅拌流体。正如在显微照片中可以看出，大量的珠沉降在孔之间的平坦基底表面上。图8B显示了在孔之间具有拱形脊的微孔阵列，如用已经经受回流工艺(包括在110℃加热1分钟)的微柱母体制造的。再次，将22μm直径的珠加载到阵列上并允许其沉降，而不用进一步搅拌流体。正如在显微照片中可以看出，基本上没有珠沉降在孔之间的基底表面上。
实例4-成像系统设计
在一些实施例中，所述仪器是使用透照法的明场显微镜。照明系统和成像系统彼此同轴并且位于样品的相对侧上。将所述仪器用于对细胞和珠进行计数，使得可以确定每个孔中的细胞数(通常为0、1或2)和珠数(通常为0或1)。不需要单个细胞的高分辨率图像。
照明系统的一个实施例在图40中示出。光源(LED Engin LZ4 20MA00)是4色源，由2x 2阵列的单色LED(蓝色、绿色、黄色、红色)组成，彼此靠近地安装在小电路板上。可以单独控制LED。在所述仪器的许多实施例中，一次仅使用一个LED。在一些实施例中，可以同时使用多于一个LED。透镜1(Thorlabs ACL2520-A)是焦距为20mm的非球面透镜。透镜2(Edmund Optics 66017)是焦距为40mm的非球面透镜。透镜3和4(Edmund Optics 66018)是焦距为50mm的非球面透镜。透镜5(Edmund Optics 47350)是焦距为100mm的球面透镜。孔径光阑和场光阑(Thorlabs SM1D12C)是虹膜式光圈，最大虹膜直径为12mm。漫射器(ThorlabsED1-C20)在从0至10度的角度处产生径向对称均匀散射，并且在较大角度处散射非常小。
由光源发出的光通过透镜1进行准直并通过透镜2聚焦到孔径光阑上。因为没有一个LED在光轴上居中，所以需要漫射器来确保发射的光均匀地充满孔径光阑。在其中足够大的1色LED在光轴上居中的一些实施例中，漫射器可以是不必要的。场光阑位于透镜2和孔径光阑之间。透镜3和4将场光阑成像到样品平面上。样品平面中的每个点被具有由孔径光阑设置的数值孔径的一束光线照射。在没有透镜5的情况下，照明器是远心的，意味着在场中的每个点处，主光线垂直于样品平面。对于场中的每个点，主光线是穿过孔径光阑的中心的光线。如果成像透镜是远心的，则远心照明器是适当的。在仪器的一些实施例中，成像透镜不是远心的。透镜5的目的是弯曲光束，使得在场中的每个点处，主光线瞄准成像透镜的孔径光阑的中心。除了添加漫射器和透镜5外，照明器类似于自1893年以来用于显微镜检查的柯勒照明器。
照明器设计的许多变化是可能的。例如，在一些实施例中，透镜1和2可以由单个透镜代替。在一些实施例中，透镜3、4和5可以由单个透镜代替。可以使用含有两个或更多个元件的消色差透镜来代替非消色差的单元件透镜。在一些实施例中，虹膜式光圈可以由具有固定直径的孔径代替。在一些实施例中，圆形场光阑可以由正方形或矩形场光阑(例如，与成像系统中使用的传感器的形状相匹配)代替，或者可以完全省略。在一些实施例中，可以使用阿贝照明而不是柯勒照明。
成像系统的一个实施例包括成像透镜(Edmund Optics 45760)，其是专门设计为以1的放大倍率使用的对称的10-元件中继透镜并且产生倒像。在这种情况下，对称意味着透镜含有垂直于光轴的对称平面。众所周知的是(参见，例如，Warren Smith,ModernOptical Engineering,3rd edition,p.401[Warren Smith，现代光学工程，第3版，第401页])当以1的放大倍率使用对称透镜时，彗差、畸变和横向色差为零。成像透镜的数值孔径在物方为0.12，并且在像方为0.12。在成像系统设计的这个实施例中，传感器是具有3856x2764像素的10兆像素单色CMOS传感器(Aptina MT9J003)。像素大小为1.67微米。由于成像透镜以1的放大倍率使用，因此在样品平面的有效像素大小为1.67微米。所述传感器含在具有8位或12位数字输出和USB 2.0或USB 3.0接口的摄像机(IDS Imaging UI-1490LE-M-GL或Basler acA3800-14um)中。
成像系统的许多变化是可能的。例如，在一些实施例中，放大倍率可以大于1或小于1。在一些实施例中，可以使用两个单独的透镜(例如，显微镜物镜和显微镜镜筒透镜)来代替单个多元件中继透镜。在一些实施例中，传感器可以具有多于或少于1000万像素。在一些实施例中，传感器像素的大小可以大于或小于1.67微米。使用的传感器可以是线性阵列而不是二维阵列(如果使用线性阵列，则将以扫描模式而不是步进模式使用具有平行于样品但垂直于传感器长轴的运动轴的平移台)。在一些实施例中，传感器可以是CCD而不是CMOS装置。
在明场显微镜中，如果选择照明系统的数值孔径等于成像系统的数值孔径，则图像质量通常最好。然而，在这些条件下，浸入缓冲溶液中的未染色细胞的图像具有差的对比度。我们发现部分相干照明和散焦的组合改善了对比度。当照明数值孔径小于成像数值孔径时，出现部分相干照明。我们发现，当部分相干因子(填充因子，σ，S)是大约0.5时，对比度最好。部分相干因子是照明数值孔径除以成像数值孔径。在我们的情况下，部分相干因子为0.5意指照明数值孔径为0.06。在这些条件下，在散焦几十微米的情况下，浸入缓冲溶液中的细胞的图像表现为被暗环包围的亮点。这显然是归因于细胞的折射率高于缓冲溶液的折射率的事实，并且因此每个细胞实际上用作微型球透镜。例如，如果细胞直径为5微米，细胞的折射率为1.376，并且缓冲溶液的折射率为1.336，则通过细胞透射的照明光到达细胞中心以外大约35微米的焦点。由于细胞不是完美的球体，并且不是内部均匀的，所以这种模式当然是粗略近似。相反方向上散焦几十微米的情况下，浸入缓冲溶液中的细胞表现为暗点。为了改善细胞计数的准确性，在成像系统的一些实施例中，可能是有利的是捕获和比较每个区域的两个图像-一个图像中细胞表现为被暗环包围的亮点，并且一个图像中细胞表现为暗点。可以使用图像处理软件将一个图像从另一个图像中减去，并且然后对差分图像中的亮点进行计数可替代地，可能是有利的是使用图像处理软件分别分析两个图像，并且然后比较结果。因为使用的磁珠是不透明的并且相对较大，浸入缓冲溶液中的珠的图像在宽范围的照明条件下具有良好的对比度。珠的图象表现为大的暗点，通常含有小的中心亮点。亮点可能是由菲涅耳衍射引起的阿拉果点(Arago spot)。珠在图像中清楚地显示出阿拉果点是存在还是不存在。
实例5-使用自动图像分析的细胞和珠检测
实验方法：铸造包括约150,000个孔(30μm直径)的琼脂糖微孔阵列并置于具有大约1.5ml体积的封闭流动池中(图12)。流动池高度为2mm。拉莫斯细胞的直径范围为5-10微米，平均值为8微米。将拉莫斯细胞以约53,000个细胞/ml的浓度(如由Muse Cell Analyzer测定的)悬浮于PBS中，通过入口注入琼脂糖微孔阵列上以填充流动池，并允许其在重力影响下沉降。随后移出未被捕获在孔中的细胞并通过将PBS注入室中将其洗掉。接下来，通过入口注入磁珠悬浮液(20μm直径的珠；如通过Muse Cell Analyzer测定的，大约33,000个珠/ml)，并允许珠在重力影响下沉降到孔中。为了检查随时间变化的阵列中的细胞和珠沉降，收集了微孔阵列的一系列明场图像。在Matlab中编写了定制图像分析程序，以检测微孔阵列中细胞和珠的存在。所述程序鉴定阵列中每个孔的位置，并确定每个孔中珠和细胞的存在。此外，还计算并记录每个孔中存在的细胞数和细胞半径。
分析算法：为了检测孔，所述程序首先使用侃尼方法检测图像中的边缘，这确定了图像中强度梯度的局部最大值。在边缘检测之后，所述程序然后通过使用圆形霍夫变换鉴定具有在指定范围内的半径的圆来检测孔。为了使孔的检测更加鲁棒，分析算法的一些实施例还可以利用图像中的模式的检测，例如对应于阵列上的孔的已知规则网格的模式。可使用这种方法帮助消除假阳性结果，并且也可以提高分析速度。适用于实现这种方法的算法的实例包括但不限于傅里叶变换、小波分析和自相关函数。
一旦检测到孔，所述程序则检查孔的内部以对珠和/或细胞进行计数。为了检测珠，将图像分成含有单个孔的较小子图像，通过应用使用大津法(Otsu’s Method)计算的强度阈值将其转换为二进制数据，并且基于珠和孔的已知大小确定每个孔中珠的存在，以及位于孔内的具有零值的像素部分。如果在孔内检测到珠的存在，则所述程序使用圆形霍夫变换来确定珠的位置和大小。为了检测细胞，所述程序首先使用侃尼方法检测每个孔内的边缘，并且然后通过使用圆形霍夫变换检测具有在指定范围内的半径的圆来鉴定细胞。
结果：使用一个或多个上述算法处理微孔阵列(对应于包括约1,500个孔的总阵列的一部分)的图像。在注入流动池后，含有细胞的孔数随时间逐渐增加，并且最终达到平稳的状态(图41)。在细胞注入后30分钟，含有细胞的孔数达到饱和值的90％以上。随着沉降到孔中的细胞数增加，含有两个或更多个细胞的孔数也增加(图42)。微孔中的细胞分配遵循泊松分布的预测，如通过与在60分钟处收集的实验数据比较所证明的(图43)。珠比细胞更快地沉降到微孔中。在珠注入流动池后2分钟达到饱和值(图44)。
实例6-用血细胞计数器的自动细胞计数
使用上述图像处理和分析软件以及血细胞计数器的自动细胞计数的实例在图45-46中示出。细胞计数在确定加载到含有微孔阵列的流动池中的细胞悬浮液的多少方面是有用的。在一些实施例中，细胞计数可以与细胞活力的同时测定相结合，例如，使用基于荧光的活细胞/死细胞测定。图45A(上)描绘了分配在血细胞计数器中的细胞的明场图像。图45A(下图)描绘了相同视野的相应荧光图像，其中细胞已预加载有钙黄绿素，钙黄绿素为钙浓度和细胞活力的荧光指示剂(激发和发射波长分别为495nm和515nm)。图像处理和自动细胞计数的工作流程包括几个步骤(图45A-C)，包括(i)选择待分析的明场图像，(ii)如果需要，选择相应的钙黄绿素染色图像(或使用其他荧光指示剂获得的图像)，(iii)输入所输出文本文件的名称(其将含有关于总细胞数、活细胞％、细胞半径等的基本统计)，(iv)输入使用的细胞悬浮液的稀释因子和总体积，(v)基于算法鉴定在血细胞计数器的角落的四个1mm x1mm网格，以及(vi)图像处理，以基于边缘检测和霍夫圆变换进行每个网格中的细胞的鉴定和计数。图像处理和分析过程大约需进行30秒的时间。输出结果的实例显示在图46中。列出了四个象限的每个中鉴定的细胞数及其平均半径，以及对细胞浓度、平均细胞半径、活细胞百分数等的统计。
实例7-使用自动图像分析的微孔、细胞和珠检测
使用上述图像处理和分析软件的自动微孔检测、细胞检测和珠检测的附加实例在图47-51中示出。图像处理和分析的工作流程包括几个步骤，包括(i)选择待分析的一个或多个明场图像，(ii)如果需要，选择相应的一个或多个钙黄绿素染色图像(或使用其他荧光指示剂获得的一个或多个图像)，(iii)输入所输出文本文件的名称(其将含有关于总细胞数、活细胞％、细胞半径等的基本统计)，(iv)选择是否检测珠、细胞或两者(具有选择小、中或大细胞的附加选项)，(v)输入待分析的一个或多个图像内的感兴趣区域(ROI)，以及(vi)图像处理和分析，以鉴定图像中的微孔和含在微孔内的细胞和/或珠。图47A-C说明了含有细胞的微孔阵列的明场图像(图47A)、其中细胞已预加载有钙黄绿素的相应荧光图像(图47B)和两个图像的叠加(图47C)。以四个步骤进行图像处理和分析(图48)：(1)通过使用边缘检测对微孔进行鉴定和编号，(2)珠鉴定，(3)微孔内的边缘检测，以及(4)细胞鉴定。通过放大图像(在4X放大倍率下，孔包围大约20x20像素的区域)，进行边缘检测和应用霍夫圆变换(图49A-B)来鉴定微孔的边缘。微孔检测步骤的结果可以用于创建掩模以从后续分析中排除位于微孔之外的图像特征(图49C；图50A-C)。通过对图像应用二进制强度阈值鉴定单个孔内的珠，并且基于每个孔内的暗像素的百分比来确定是否存在珠。如果存在，则可以使用霍夫圆变换(HCT)来确定孔内珠的位置(图48)。一旦已经检测到珠，则在每个孔的区域内进行另外的边缘检测(即，与检测到的珠相关联的孔的区域之外)，以鉴定细胞的存在并使用HCT确定细胞的位置(图48)。典型的图像(面积约6mmx4mm，约10,000个孔)需要花大约2分钟的时间来处理和分析。输出结果的一个实例如图51A-C所示。软件提供结果的图形显示(图51A-B)以及汇总表(图51C)。详细结果存储在文本文件中(包括孔数、细胞和珠分配数据等)。在一些实施例中，结果的图形显示包括叠加图形(例如不同颜色的圆)的原始明场图像，以指示不含细胞或珠的孔、含有单一珠的孔、含有单细胞的孔、含有单一珠和单细胞两者的孔、含有展现例如由荧光指示剂等指示的选定特性的多个细胞的孔。根据装置和系统设计参数的变化，使用图像处理和分析的自动微孔、珠和细胞检测可用于珠和细胞分配效率、珠收回效率等的定量分析。
实例8-细胞和珠分配和收回与流动池设计、
基底材料和孔直径
微孔阵列的制造：具有一定范围的直径的微孔阵列由几种不同的基底材料制成。图52A-C显示了由Norland光学粘合剂63(NOA63)制造的微孔的显微照片。使用UV活化的成型工艺从聚二甲基硅氧烷(PDMS)压模复制微孔基底(参见实例10)。微孔直径范围是从27.5μm到80μm，深度40μm，并且间距可变(最小中心间距＝15μm)。图53A-C显示了使用软压印工艺由环烯烃共聚物(COC)和如图52A-C所示的光学粘合剂结构作为母料制成的微孔的显微照片。图53A-C所示的COC微孔具有50μm的直径，深度为50μm，并且间距为60μm。还由COC制造了具有其他直径、深度和间距的微孔阵列并进行测试，与由环烯烃聚合物(COP)制造的微孔阵列一样。优选的实施例包括直径为55μm、深度为40μm、并且间距为70μm的微孔。
微孔阵列基底处理：在加载细胞之前，一般用Pluronic F108(磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，0.02％)将由NOA63、COC或COP制成的微孔阵列预处理至少一个半小时。将细胞悬浮于Pluronic F68(PBS中1％)中，用于加载微孔阵列。
在具有预加载珠的微孔阵列的珠收回效率的研究中，在加载珠之前，将一些微孔阵列基底用聚EGMA(乙醇或裂解缓冲液(0.1M Tris HCl(pH 7.5)、0.5M LiCl、1％十二烷基硫酸锂(LiDS)、10mM EDTA、5mM DTT)中，10-20mg/ml)进行预处理。
珠捕获和收回效率与微孔直径：图54显示了针对由NOA63制造的不同直径(50μm深，15μm最小孔间隔)的微孔的珠捕获和收回效率的数据的实例。将珠(直径33μm)悬浮在PBS中，加载到阵列上。如所期望的那样，直径大于所述珠的孔的珠捕获效率急剧上升。随着孔直径的增加，双联体(含有两个珠的孔)的百分比也增加。具有与珠大致相同大小的孔展现最小的珠收回效率，然后所述珠收回效率随着孔直径增加而增加。
图55A-D和56显示了针对由NOA63或COC制造的不同直径的微孔(针对光学粘合剂和COC孔的孔深度＝40μm)的珠捕获和收回的数据的实例。两种材料的珠加载性质相似(图55A-D)。相对于由光学粘合剂制造的微孔，由COC(和COP)制成的微孔的珠收回效率得到改善(图56)。
预加载珠的珠收回效率：图57显示如上所述用聚HEMA预处理的COC微孔的显微照片。微孔预加载有悬浮在PBS中的直径为35μm的珠。在加载后，将微孔基底在去离子水中冲洗3次以除去盐，并在真空下干燥过夜。加载到未处理的COC微孔阵列中的珠不能从孔中以磁力方式收回。加载到已经用聚HEMA预处理的COC微孔中的珠可以以基本上100％的效率以磁力方式收回。
珠加载和收回效率与流动池设计和基底上的位置：图58-60显示了针对在不同工艺步骤之后并且根据微孔基底上的位置的珠加载和收回的研究的数据的实例。图58A说明了装入微孔阵列并包括锥形入口和出口的流动池。图58B说明了加载和收回过程的步骤：(i)加载，(ii)磁场增强捕获，(iii)洗涤和(iv)基于磁场的收回。图59A-D显示了在图58B中概述的每个步骤之后的微孔阵列的显微照片。含有珠的孔的百分比指示在每个图像下方。图60显示了使用如之前所述的自动化图像处理和分析生成的数据的实例，以量化在每个工艺步骤之后根据基底上的位置(例如由距流动池出口的距离指定的)的含有珠的孔的数目。数据表明，磁场辅助加载和收回的效率相当高。在本实例中使用的流动池设计(图58A；锥形入口和出口)提供沿着微孔阵列基底的长度的珠的均匀分配。
图61显示了针对在不同工艺步骤(包括裂解步骤)之后根据微孔基底上的位置的珠加载和收回的研究的数据的另一个实例。将NOA63微孔阵列基底(33μm直径的孔)加载拉莫斯细胞，随后加载22μm直径的空白珠。如之前所述的自动化图像处理和分析，以量化在每个工艺步骤之后根据基底上的位置的含有珠的孔的数目。再次，磁场辅助加载和收回的效率相当高，珠沿着微孔阵列基底的长度分配相当均匀。
图62-66说明了用于确定根据流动池设计的微孔基底上的珠分配的均匀性以及在液体注入之间任选使用空气注入步骤以帮助最小化液-液界面处的分散的研究的结果。图62A-B描绘了测试的两种不同的流动池设计：单入口-单出口设计(图62A)和分支入口设计(图62B)。还测试了流动池内流体交换的两种不同方法。方法#1由以下步骤组成：启动流动池，加载细胞且加载珠，其中使用PBS进行所有步骤，并且每种溶液被下一种直接置换。方法#2由以下步骤组成：启动流动池，用空气注入置换启动缓冲液，加载细胞，用空气注入置换细胞悬浮液并加载珠。然后使用上述自动化图像处理和分析软件评估珠加载均匀性。图63显示了使用方法#1(12秒分配持续时间)，针对单入口-单出口流动池的叠加有珠填充效率数据的图像。数字指示局部填充百分比(即，有珠存在的孔数/成像的孔总数)。整体填充百分比是83％±10％(基底前半部分为87％±10％)。图64显示了使用方法#1(12秒分配持续时间)，针对分支入口流动池的叠加有珠填充效率数据的图像。整体填充百分比是83％±12％(基底前半部分为94％±6％)。图65显示了使用方法#2(即，液体分配之间使用空气注入)，针对单入口-单出口流动池的叠加有珠填充效率数据的图像。整体填充百分比是95％±3％。研究结果概述于图66中。在液体分配步骤之间使用空气注入在整个流动池中引起塞流式流体速度分布图，并且改善在微孔基底上珠分配的均匀性。以类似的方式，在液体分配步骤之间使用空气注入还可以改善流动池内细胞分配的均匀性。
在进行这些研究的过程中观察到，珠可能有时被捕获在半固体沉积物中，例如在细胞裂解期间产生的基因组DNA和/或交联蛋白质。这些沉积物可以使用‘机械’方法破碎或排出，例如注入气泡、剧烈流动和/或超声处理。可替代地，可以通过使用具有较低盐浓度的缓冲液(例如PBS(重量摩尔浓度约150mM))代替裂解缓冲液(重量摩尔浓度>500mM)、不同浓度的表面活性剂、不同的pH范围或用DNA酶和/或蛋白酶处理来防止沉积物形成或使其溶解。
流动池概念验证实验：图67提供了单细胞随机标记的测定工作流程的高级概述。所述测定包括13个步骤，包括：(1)计数和稀释待加载到微孔中的细胞，(2)加载细胞，并洗掉还未沉降在微孔中的任何细胞，(3)使用外部施加的磁场加载包括随机标记文库的珠，(4)加载裂解缓冲液，同时珠继续被磁场保留，并孵育，(5)用裂解缓冲液洗涤基底表面，(6)用外部施加的磁场收回珠，并将珠转移到管中，(7)洗涤珠以交换缓冲液，(8)在管中进行逆转录酶(RT)，(9)用外切核酸酶1处理，(10)进行三轮PCR，(11)对扩增产物进行测序，(12)进行数据分析，并且(13)提供数据可视化。图像处理和分析便于这些工艺步骤中的前六个。
使用具有50μm深度和60μm中心间距的50μm直径孔的COC微孔基底进行端对端的流动池概念验证研究。使用拉莫斯和K562细胞系和33μm直径的寡核苷酸官能化磁珠进行所述研究。将COC基底包装在总面积为225mm2的流动池中，其含有大约72,000个暴露的微孔。将流动池用99％乙醇启动，然后用PBS冲洗。将细胞加载入PBS(3,500个K562细胞和3500个拉莫斯细胞)中并允许其沉降20分钟。然后将带寡聚物的珠(100,000个珠)加载入PBS中并允许其沉降5分钟，随后引入裂解缓冲液以裂解细胞。在裂解期间，将磁体放置在流动池下面，以避免由于裂解期间的细胞扩增而将珠从微孔中推出。然后通过将磁体放置在流动池上方并用另外的裂解缓冲液冲洗从微孔中收回珠。使用上述自动图像处理和分析软件确定不同工艺步骤之后的细胞和珠加载和收回效率。然后在流动池外进行剩余的测定工艺步骤。
概念验证研究的结果示于图68-69中。这两种细胞类型的细胞加载效率(即，在孔内捕获的细胞数/总成像细胞)为约80％，这在一定程度上高于考虑到本研究中使用的微孔基底的44％的表面积为死空间的预期。更高的加载效率可能是由于在细胞加载期间在基底表面上的细胞翻转。珠加载效率(即，含有珠的孔数/总成像孔)为约84％(排除流动池内的流体死区为约90％)。在收回珠之后，大约6％的孔仍然含有珠，这意味着收回效率为约93％。通过收回珠和处理相应的寡核苷酸标记(即，进行逆转录、PCR扩增和测序反应)鉴定的细胞数显示在图69中。目前，可实现大约20％-50％的计数效率。在本研究中不清楚为什么借助于分子计数的拉莫斯细胞群的代表性不足。
实例9-细胞和珠分配和收回与流动池厚度、
自动磁回收和裂解缓冲液组成
进行一系列实验以检查根据流动池厚度(即流动池室的深度)和流速、裂解缓冲液组成和使用自动磁珠收回的细胞和珠分配和收回效率。自动磁珠收回机构包括小型固定磁体，当使用线性平移平台使流动池平移经过磁体时，所述磁体保持在静止位置(替代地，当磁体平移时流动池可以保持在静止位置)。
细胞和珠分配和收回与流动池深度和流速：使用具有间隔60μm的间距的50μm直径x 50μm深度的孔的COP微孔基底进行实验。将微孔基底包装在具有单入口-单出口对角线通道设计的流动池中，其具有：(a)1mm厚，5mm宽的通道，或(b)2mm厚，3mm宽的通道。将具有33μm直径的功能化珠用于珠加载。将K562细胞用于细胞加载。使用上述自动图像处理和分析软件确定根据沿着流动池的位置的珠和细胞加载效率。
图70A-B显示了在测定程序的不同步骤的根据沿着流动池的位置的珠加载数据的实例。图70A显示了1mm厚流动池的数据。在初始加载后，冲洗出流动池后，以及在使用磁铁将珠拉入孔中之后，含有珠的孔的百分比沿着流动池的长度相当均匀。在细胞裂解和珠回收步骤之后，流动池入口端的含有珠的孔的百分比低于出口处的所述百分比。图70B显示了2mm厚流动池的数据。再次，在初始加载后和冲洗出流动池后，含有珠的孔的百分比沿着流动池的长度相当均匀。含有珠的孔的百分比在流动池的入口端稍微较高，并且在细胞裂解和珠回收步骤后在出口端较低，表明珠回收过程可能受流动池几何形状、流体通道尺寸、以及微孔阵列室内流速和流型的相应变化影响。
图71A-B显示了根据沿着流动池的位置的在裂解步骤期间损失或在所述工艺结束时收回的珠的百分比的数据的实例。图71A所示的数据表明，对于1mm厚的流动池，在本实验中使用的条件下，在裂解步骤过程中观察到珠的显著位置依赖性损失。相应地，回收珠的总百分比相当低。图71B显示了2mm厚流动池的相应数据。在裂解步骤过程中损失的珠的百分比通常较低，并且收回的珠的相应百分比通常比1mm流动池情况下的百分比高。
图72A-F显示了在测定程序的不同步骤根据沿着流动池的位置的细胞加载数据的实例。图72A-C显示了1mm厚流动池的数据。图72D-F显示了2mm厚流动池的数据。对于2mm厚的流动池，含有两个或三个细胞的孔的百分比通常较低，并且与沿着流动池的长度的位置几乎无关。
自动磁珠收回：图73-76说明了使用自动磁珠收回系统进行的细胞和珠分配和收回研究的结果。使用用于相对于流动池移动磁体(或反之亦然)的运动控制机构(例如线性平移台)，提供了能够执行可重复的缓慢相对运动的优点，其可以被优化以更好地匹配将珠移动进出孔的时间尺度。使用具有50μm直径的微孔的COC基底进行实验。将3000个拉莫斯细胞加载入1％F68中。珠直径为33微米，并将200,000个珠加载到系统上。使用上述自动图像处理和分析软件确定根据沿着流动池的位置的珠和细胞加载效率。
图73显示了在测定过程的各个阶段，即在初始加载和沉淀珠之后，在用冲洗缓冲液冲洗流动池之后，在用外部磁体拉下珠之后，以及在引入裂解缓冲液之后，根据沿着流动池的长度的位置的含有珠的孔的百分比的数据。图74显示了在每个工艺步骤之后含有珠的孔的百分比(整组微孔的平均值)。这些研究中的总珠收回效率为大约48.8％。
图75A-C显示了初始细胞加载和沉降步骤之后(图75A)、初始珠加载和沉降步骤之后(图75B)、以及珠随后被磁体拉下之后(图75C)的细胞加载的数据。可以在图71C中观察到细胞的一些损失，可能是由于当珠被更深地拉入微孔时细胞移位的缘故。
图76提供了在工艺的不同步骤的细胞加载和珠加载数据的概述。含有单细胞的孔的百分比范围为从约8％至约11％。含有两个细胞的孔的百分比范围为从约0.2％至约0.8％。含有单细胞和单一珠的孔的百分比范围为从约41.％至约4.6％。含有珠的孔的百分比范围仅为从约55.5％至约66.7％。尽管含有珠的细胞的百分比略有增加，但是使用磁体分配珠对含有单细胞、两个细胞或单细胞和单一珠两者的孔的数目几乎没有影响。
珠收回与裂解缓冲液组成：进行一组实验以确定裂解缓冲液的修饰(例如，通过加入二硫苏糖醇(DTT)以还原硫醇化基因组DNA中的二硫键)，与磁场辅助珠分配组合，是否将提高珠收回效率。使用具有60μm间距的50μm直径x 50μm深度的微孔的COC微孔阵列基底进行研究。使用100％乙醇启动流动池，并用PBS冲洗3次。使用PBS中的1％Pluronic F68加载拉莫斯细胞(总共30,000个)，随后加载PBS中的33μm直径的功能化珠。在加载珠之后，用PBS冲洗流动池，并且使用置于基底下面的磁体将剩余的珠拉到微孔中。两次注入裂解缓冲液(DTT，1:20稀释)，随后是20分钟的孵育时间(磁体位于基底下面)，随后磁回收珠。使用上述自动图像处理和分析软件确定根据沿着流动池的位置的珠加载效率。
图77A-B显示了比较当使用添加和未添加DTT的裂解缓冲液时，在测定程序中的不同步骤的珠加载的数据的实例。在没有DTT的情况下，珠收回率(收回的珠/加载的珠*100％)为约65.5％(图77A)。当将DTT加入裂解缓冲液中时，珠收回率增加到约85.8％(图77B)。
图78A-B显示了比较当裂解缓冲液包括DTT时，在测定程序的不同步骤的磁场辅助珠分配对珠加载的影响的数据的实例。未使用磁场辅助珠分配时，珠收回率为约84.6％(图78A)。当采用磁场辅助珠分配时，珠收回率下降到约43.6％(图78B)。
珠加载和收回的流动池研究：图79和80显示了使用COC微阵列基底进行的珠加载和收回研究的数据的实例，所述COC微阵列基底具有包装在流动池中的50μm直径x 50μm深度的微孔(60μm间距)。将微孔加载细胞混合物(1:1:1:1的K562、THP1、拉莫斯、Jurkat细胞；总共20,000个细胞)和50μm直径的用寡核苷酸条码文库功能化的珠(总共100,000个珠)。
图79A显示了在珠加载步骤之后和珠收回之后含有珠的孔的百分比。图79B提供了个体实验的分析统计表。图80A和80B显示了在珠加载之后和珠收回步骤之后根据流动池内的位置的珠填充率(具有珠的孔的百分比)的热图。图80C显示了在珠收回步骤之后根据流动池内的位置的珠收回百分比(1-剩余珠/加载的珠)*100％)的热图。三次独立实验中，珠收回率范围为从77.2％至93.3％。
实例10-玻璃基底制造时的光学粘合剂
本实例说明了在玻璃显微镜载玻片上用光学粘合剂制造模式化基底所需的程序。使用3M胶带将显微镜载玻片固定在培养皿的内部。将大约300-350μl的NOA63分配到显微镜载玻片上，并使用P1000移液管尖端将NOA63均匀分配在载玻片上并消除气泡。慢慢将PDMS模具放置在显微镜载玻片上，使得PDMS的模式化侧面与NOA63接触，并注意避免在PDMS和NOA63之间捕获气泡。将载玻片NOA63-PDMS放置在铝合金夹具的基部，并在PDMS模具的顶部放置干净的显微镜载玻片。通过将夹具的顶部件放置在玻璃载玻片上并轻轻推动螺钉直到有阻力来完成夹具组装。然后，以一次增量不超过1/8圈的方式紧固螺钉。在每个螺钉紧固前，重复操作直到没有松弛为止。等待5分钟，以允许在PDMS模具的模式化部分的各处和周边均匀分配NOA63。使用与上述相同的紧固程序，再一次轻轻紧固螺丝。将组装的铝合金夹具放置在Maestro透射照明器上，并固化至少1小时。将UV源设置到高位置且为365nm。记录“第1固化”开始时间。记录“第1固化”完成时间。拆卸所述定制夹具。从模制的NOA63/显微镜载玻片对PDMS模具进行脱模。使用解剖刀和剃刀刀片，从基底的周边除去突出的NOA63。将基底固化至少另外6小时，基底的NOA63侧面向UV源，将基底放置在显微镜载玻片的任一端。将UV源设置到位置且为365nm。记录“第2固化”开始时间。记录“第2固化”完成时间。
实例11-使用光刻模式化母料和注塑成型来制造微孔
已经评价了制造微孔阵列的几种方法。在本实例中，使用光刻模式化母料和注塑成型来制造微孔阵列。所述方法包括：(i)使用UV光刻法和合适的基底(例如玻璃或硅)制造母模；选择UV剂量以仅部分地暴露孔间的基底壁，使得壁角是希望的拔模角度，并且孔间的基底表面具有希望的圆形轮廓；(ii)用耐用材料如镍涂覆模式化的母料；并且(iii)使用被涂覆的母料和COC或其他合适的聚合物进行注塑成型来制造微孔阵列。图81显示了使用本方法制造的微孔阵列的显微照片。
实例12-替代测定工作流程
检查在加载细胞之前将珠加载到微孔中的替代测定工作流程。这种替代工作流的潜在优势(即，首先加载珠而不是首先加载细胞)是：(a)简化工作流程(减少步骤数)和易化用户操作，(b)减少测定工作流程的自动化的复杂性、成本和开发时间，以及(c)在将可消耗柱体运送给客户之前，可能能够将珠预加载到微孔基底中。
在将细胞和微珠加载到微孔阵列的标准工作流程中，在加载珠之前加载细胞。本研究检查了在加载细胞之前将珠加载到微孔阵列的替代工作流程。由于预期的益处，例如由工艺步骤的减少导致的工作流程的简化、自动化的潜在易用性、以及在制造消耗品期间能够将珠预先加载到柱体的潜力，因此探索了本方法。除了这些潜在的益处之外，我们还发现了所述方法的一些意想不到的优点，例如，珠加载的效率得到提高(即，观察到珠双联体的频率降低)，并且细胞捕获效率(预期会随着这种替代方法而下降)表现为与首先加载细胞的标准工作流程实现的细胞捕获效率相似。
图82A-B比较了标准(“细胞第一”)和替代(“珠第一”)工作流程。替代工作流程有益于减少待进行的测定步骤数。使用由COC制造的微孔基底和具有降低的高度(深度)的流动池设计(修订14)，检查了“细胞第一”和“珠第一”工作流程的几个变化(图83A-B)。两种程序都包括乙醇启动步骤和在加载珠或细胞之前用0.02％吐温-20处理流动池10分钟。实验重复两次。
图84A-B分别显示了“珠第一”和“细胞第一”测定工作流程中每个步骤的珠加载效率的比较。“细胞第一”方法中观察到的双联体的频率是变化的，但通常在5％-15％的范围内。在细胞裂解之前的步骤中，观察到的珠双联体的频率在用于本实验的“珠第一”和“细胞第一”方法中均大致为5％。
图85显示了包括在这些研究中使用的微孔阵列的流动池的合成图像。图86A-C显示了针对“珠第一”测定工作流程的不同步骤的根据流动池内的位置的单一珠加载效率的热图。由于在流动池的出口支路中的流量阻抗增加，观察到珠双联体频率的“热点”(在图85中合成图像的右下角描绘出)。这种可靠性问题与工作流程无关，并且随着这种可靠性问题被解决，观察到的双联体频率预期会得到改善(即，减少)。至于在包括的合成图像中的所有视场(FOV)，观察到的双联体频率为约5％。排除合成图像右下角的孔，产生了约4％的“珠第一”测定工作流程的珠双联体频率。
图87A-F显示了针对“珠第一”(图87A-C)和“细胞第一”(图87D-F)测定工作流程的细胞捕获效率的比较。关键性能指标是在细胞裂解前的步骤中捕获的细胞数与在“细胞加载”步骤中成像的细胞数。对于“珠第一”方法，在“细胞洗涤”步骤过程(即细胞裂解前的步骤)中捕获的细胞几乎等于在“细胞加载”步骤过程中成像的细胞数。在“细胞第一”方法中，在“珠洗涤”步骤过程(即细胞裂解前的步骤)中捕获的细胞数低于在“细胞加载”步骤过程中成像的细胞数。“细胞第一”方法中细胞的净损失(“细胞第一”步骤与“珠第一”步骤)并非总是高的，并且一致的是，这种损失在“珠第一”方法中未观察到。
图88A-B显示了另一个重要性能度量的频率，即与单一珠相关联的细胞的百分比。针对该参数，两种方法都展现相似的性能。
图89A-D显示了针对另一个重要性能度量的数据，即在细胞裂解步骤之前含有单一珠的孔的百分比。对于本度量，“珠第一”方法(图89A-B)显示了相比“细胞第一”方法(图89C-D)的改善。
图90A-B分别显示了针对“珠第一”(图90A)和“细胞第一”(图90B)测定工作流程的相对于微孔中的细胞数的珠加载效率的图。
实例13-改良的移液管尖端接口
先前的移液管尖端接口设计在出口处利用单向鸭嘴阀，以消除从出口储器回流到柱体中(图91-92；显示了柱体出口上的鸭嘴阀)。发现鸭嘴阀与测定工作流程不相容，因为使用33um珠限制了阀门完全关闭，从而导致缓冲液从出口(例如，废物储器)储器回流到柱体。改良的设计消除了出口阀，而替代地在入口处使用了x-fragm分配阀(迷你阀有限公司)。x-fragm入口阀裂开，并且然后被移液管尖端穿透。流体(例如，珠加载缓冲液)流过移液管尖端而不是直接通过阀，因此避免了先前设计观察到的阀的不完全关闭问题。
改良的移液管尖端接口设计还包括在移液管尖端周围形成的密封的设计的变化。先前的设计利用了移液管尖端和柱体之间的摩擦配合密封(图91-92；显示了柱体入口上的摩擦配合移液管接口)。针对摩擦配合密封观察到的缺陷包括：(i)当移液管尖端以太大的力压入柱体中时移液管尖端的变形/挤夹，从而导致流体阻抗增加并且到柱体的流速降低；这对于手动柱体操作尤其成问题；(ii)当移液管尖端缩回时，摩擦配合不会将吸液管尖端从柱体平滑地释放，从而导致柱体抬起或移液管尖端从吸液管脱落；这对于用机器人移液器自动操作柱体尤其成问题；并且(iii)移液管尖端充分就位的位置由于摩擦配合而未予以良好限定，并且其随着施加到移液管尖端的力发生变化；如果在移液管尖端和柱体之间形成密封之后在移液管接口内存在气隙，则气泡可能被注入到柱体中。
更新的设计利用由顺应材料例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚异戊二烯、聚丁二烯或聚氨酯制成的定制模制垫圈。通过用垫圈接口代替摩擦配合接口，移液管尖端和柱体之间的气隙的大小显著减小。倘若在产生密封之前，在移液管尖端上存在一小滴液体(可以引入这样的液滴以进行自动移液)，则在垫圈和移液管尖端之间形成流体界面而不会向柱体中注入气泡。图93显示了具有模制顺应垫圈和x-fragm分配阀的更新的柱体接口。图94显示了两个移液管尖端接口设计的总结比较。
实例14-改良的“珠第一”测试工作流程，具有基于Ficoll的珠洗涤和细胞裂解步骤
评价了使用基于Ficoll的珠洗涤和细胞裂解步骤的改良的测定工作流程，其中在加载单细胞之前将磁性微珠加载到包括微孔阵列的可消耗柱体中(即，“珠第一”测定工作流程)。这种改良的测定工作流程的潜在优点是：(a)消除了在倾斜板上进行的用于从流动池中完全置换液体的空气置换步骤，，(b)消除了在倾斜板上进行的用于充分置换来自流动池的气泡的流体置换步骤(从而能够进行全自动工作流程)，以及(c)减少了微孔之间的RNA扩散和潜在的串扰。
在现有的“珠第一”测定工作流程中，在细胞之前加载珠，并用空气置换洗出珠，以减少微孔中珠双联体的百分比。用SiO2涂覆的基底的空气置换步骤导致显著的珠损失，并且需要在倾斜板上进行操作。评估了改良的工作流程，其中使用PBS中的75％Ficoll-Paque和0.01％Pluronic F68-PBS洗出珠而无需空气置换。预期使用75％Ficoll-Paque有效地降低珠双联体的频率，因为它的粘度较高(与0.90cP的PBS相比，约1.73cP，参见图98)。随后用0.01％F68-PBS洗涤有助于冲走在Ficoll洗涤过程中产生的浮珠。检查这种基于Ficoll的珠洗涤方法，这归因于预期的益处，例如降低珠双联体的频率，降低珠损失，降低气泡产生的风险以及通过无倾斜的测定工作流程提供的自动化的潜在易化。除了对珠洗涤缓冲液进行上述修饰之外，还将5％Ficoll PM400加入到裂解缓冲液中以增加缓冲液的密度和粘度(图98)。这预期会减慢细胞裂解后的RNA扩散并减少微孔之间的潜在串扰。
图95A-B显示了标准“珠第一”测定工作流程(图95A)和改良的基于Ficoll的测定工作流程(图95B)。图96A-B显示了说明使用基于Ficoll的珠洗涤步骤用SiO2涂覆的微孔基底实现的提高的珠加载效率的数据的实例。当使用空气置换时，我们观察到高百分比的空孔和高百分比的具有2个珠的孔。在珠洗涤步骤过程中，当空气置换被PBS中的75％Ficoll-Paque和0.01％F68-PBS替代时，空孔和具有2个珠的孔的百分比都降低。在珠洗涤步骤中增加PBS中75％Ficoll-Paque的体积预期将进一步提高珠加载效率，这将是进一步优化的目标。
图97A-F显示了使用基于Ficoll的测定工作流程实现的细胞捕获效率的数据的实例。随着Ficoll-Paque的引入，细胞活力得到很好的维持。由于填充微孔的PBS中的75％Ficoll-Paque的较高密度，微孔内的细胞捕获效率降低。需要进一步优化以增加基于Ficoll的测定工作流程的细胞捕获效率。
图98总结了在基于Ficoll的测定工作流程中使用的磁珠、细胞和溶液的估计密度和粘度值。
尽管在此已经显示并说明了本发明的优选实施例，但是本领域的普通技术人员将清楚的是仅作为举例而提供了此类实施例。本领域的普通技术人员现在将会想到众多变体、变化、以及替代，而不背离本发明。应该理解的是，在此说明的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实施本发明。预期的是以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。

Claims (198)

1.一种用于确定样品中靶分子数目的装置，所述装置包括：
基底，所述基底包括：至少100个微孔，其中每个微孔具有范围从1,000μm3至786,000μm3的体积；
与所述基底流体连通的流动池；
包括垫圈的移液管尖端接口，所述移液管尖端接口用于加载或从所述装置去除样品、测定试剂、珠悬浮液或废物；和
阀，所述阀防止流体在所述装置内流动，除非移液管尖端插入到所述移液管尖端接口的圆锥形特征中。
2.根据权利要求1所述的装置，
其中所述至少100个微孔的表面涂覆有表面涂层以改善润湿性。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述基底包括多个珠，其中所述至少100个微孔中的多个微孔各自含有单一珠，并且其中所述微孔的平均直径与所述珠的直径的比率在1.2至1.8的范围内。
4.根据权利要求2所述的装置，其中所述基底包括多个珠，其中所述至少100个微孔中的多个微孔各自含有单一珠，并且其中所述微孔的平均直径与所述珠的直径的比率在1.2至1.8的范围内。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，所述装置进一步包括至少一个入口和至少一个出口，其中所述至少一个入口和至少一个出口能够引导流体流通过所述流动池，从而使所述微孔与所述流体接触。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中微孔体积的变异系数小于5％。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述基底包括从1,000至5,000,000个微孔。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述基底包括从10,000至200,000个微孔。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中每个微孔具有范围从21,000μm3至170,000μm3的体积。
10.根据权利要求6所述的装置，其中每个微孔具有范围从21,000μm3至170,000μm3的体积。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中每个微孔具有144,000μm3的体积。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述微孔在所述基底平面中具有非圆形横截面。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述至少100个微孔的平均直径与深度的纵横比在从0.1至2的范围内。
14.根据权利要求6所述的装置，其中所述至少100个微孔的平均直径与深度的纵横比在从0.1至2的范围内。
15.根据权利要求9所述的装置，其中所述至少100个微孔的平均直径与深度的纵横比在从0.1至2的范围内。
16.根据权利要求1-4、10、14和15中任一项所述的装置，其中所述至少100个微孔的平均直径与深度的纵横比是0.9。
17.根据权利要求1-4、10、14和15中任一项所述的装置，其中选择所述至少100个微孔的尺寸，使得每个微孔可以含有至多一个珠。
18.根据权利要求1-4、10、14和15中任一项所述的装置，其中所述基底包括多个珠，其中所述至少100个微孔中的多个微孔各自含有单一珠，并且其中所述微孔的平均直径与所述珠的直径的比率是1.5。
19.根据权利要求6所述的装置，其中所述基底包括多个珠，其中所述至少100个微孔中的多个微孔各自含有单一珠，并且其中所述微孔的平均直径与所述珠的直径的比率是1.5。
20.根据权利要求9所述的装置，其中所述基底包括多个珠，其中所述至少100个微孔中的多个微孔各自含有单一珠，并且其中所述微孔的平均直径与所述珠的直径的比率是1.5。
21.根据权利要求13所述的装置，其中所述基底包括多个珠，其中所述至少100个微孔中的多个微孔各自含有单一珠，并且其中所述微孔的平均直径与所述珠的直径的比率是1.5。
22.根据权利要求1-4、10、14、15和19-21中任一项所述的装置，其中所述微孔的侧壁具有1至15度的正拔模角度。
23.根据权利要求6所述的装置，其中所述微孔的侧壁具有1至15度的正拔模角度。
24.根据权利要求9所述的装置，其中所述微孔的侧壁具有1至15度的正拔模角度。
25.根据权利要求13所述的装置，其中所述微孔的侧壁具有1至15度的正拔模角度。
26.根据权利要求18所述的装置，其中所述微孔的侧壁具有1至15度的正拔模角度。
27.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21和23-26中任一项所述的装置，其中所述微孔的侧壁具有3至7度的正拔模角度。
28.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21和23-26中任一项所述的装置，其中所述基底进一步包括围绕每个微孔或跨过所述至少100个微孔的微孔之间的表面的表面特征。
29.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21和23-26中任一项所述的装置，其中所述基底进一步包括围绕每个微孔或跨过所述至少100个微孔的微孔之间的表面的表面特征，其中所述表面特征选自下组，该组由以下各项组成：圆形的、半球形的、脊形的和尖形的表面特征，或其任何组合。
30.根据权利要求3所述的装置，其中含有单一珠的所述至少100个微孔的百分比是至少10％。
31.根据权利要求3所述的装置，其中含有单一珠的所述至少100个微孔的百分比是至少50％。
32.根据权利要求3所述的装置，其中含有单细胞的所述至少100个微孔的百分比是在0.01％和15％之间。
33.根据权利要求3所述的装置，其中含有单细胞的所述至少100个微孔的百分比是在1％和11％之间。
34.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26和30-33中任一项所述的装置，其中所述至少100个微孔的表面涂覆有聚乙二醇(PEG)、聚Hema、普朗尼克酸F68、普朗尼克酸F108、聚山梨醇酯20、二氧化硅(SiO2)或其任何组合。
35.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26和30-33中任一项所述的装置，其中所述至少100个微孔的表面包括经等离子体处理的表面。
36.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26和30-33中任一项所述的装置，其中所述至少一个入口和至少一个出口经由流体通道与所述流动池流体连通，所述流体通道具有相对于所述基底平面形成一定角度的轴线。
37.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26和30-33中任一项所述的装置，其中所述至少一个入口和至少一个出口经由流体通道与所述流动池流体连通，所述流体通道具有相对于所述基底平面形成一定角度的轴线，并且其中与所述入口和所述出口流体连通的流体通道的角度是相同的。
38.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26和30-33中任一项所述的装置，其中所述至少一个入口和至少一个出口经由流体通道与所述流动池流体连通，所述流体通道具有相对于所述基底平面形成一定角度的轴线，并且其中与所述入口和所述出口流体连通的流体通道的角度是不同的。
39.根据权利要求36所述的装置，其中所述流体通道的轴线和所述基底平面之间的角度在15度和75度之间。
40.根据权利要求36所述的装置，其中所述流体通道的轴线和所述基底平面之间的角度中的至少一个是45度。
41.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26、30-33、39和40中任一项所述的装置，其中所述基底由选自下组的材料制成，该组由以下各项组成：硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物、金属、弹性体、聚二甲基硅氧烷、琼脂糖和水凝胶或其任何组合。
42.根据权利要求6所述的装置，其中所述基底由选自下组的材料制成，该组由以下各项组成：硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物、金属、弹性体、聚二甲基硅氧烷、琼脂糖和水凝胶或其任何组合。
43.根据权利要求9所述的装置，其中所述基底由选自下组的材料制成，该组由以下各项组成：硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物、金属、弹性体、聚二甲基硅氧烷、琼脂糖和水凝胶或其任何组合。
44.根据权利要求13所述的装置，其中所述基底由选自下组的材料制成，该组由以下各项组成：硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物、金属、弹性体、聚二甲基硅氧烷、琼脂糖和水凝胶或其任何组合。
45.根据权利要求18所述的装置，其中所述基底由选自下组的材料制成，该组由以下各项组成：硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物、金属、弹性体、聚二甲基硅氧烷、琼脂糖和水凝胶或其任何组合。
46.根据权利要求22所述的装置，其中所述基底由选自下组的材料制成，该组由以下各项组成：硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物、金属、弹性体、聚二甲基硅氧烷、琼脂糖和水凝胶或其任何组合。
47.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26、30-33、39、40和42-46中任一项所述的装置，其中所述流动池包括所述基底，或其中所述流动池可以与所述基底脱离。
48.根据权利要求6所述的装置，其中所述流动池包括所述基底，或其中所述流动池可以与所述基底脱离。
49.根据权利要求9所述的装置，其中所述流动池包括所述基底，或其中所述流动池可以与所述基底脱离。
50.根据权利要求13所述的装置，其中所述流动池包括所述基底，或其中所述流动池可以与所述基底脱离。
51.根据权利要求18所述的装置，其中所述流动池包括所述基底，或其中所述流动池可以与所述基底脱离。
52.根据权利要求22所述的装置，其中所述流动池包括所述基底，或其中所述流动池可以与所述基底脱离。
53.根据权利要求41所述的装置，其中所述流动池包括所述基底，或其中所述流动池可以与所述基底脱离。
54.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26、30-33、39、40、42-46和48-53中任一项所述的装置，其中所述流动池由选自下组的材料制成，该组由以下各项组成：硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、环氧树脂、以及金属，或这些材料的任何组合。
55.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26、30-33、39、40、42-46和48-53中任一项所述的装置，其中所述基底或流动池进一步包括用于所述至少100个微孔的光学成像的透明窗。
56.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26、30-33、39、40、42-46和48-53中任一项所述的装置，所述装置进一步包括一个或多个样品储器、试剂储器、废物储器或其任何组合。
57.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26、30-33、39、40、42-46和48-53中任一项所述的装置，其中一个或多个试剂储器预加载有珠悬浮液或测定试剂。
58.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26、30-33、39、40、42-46和48-53中任一项所述的装置，其中所述圆锥形特征与移液管尖端配合以形成与所述入口或出口的流体连接。
59.根据权利要求58所述的装置，其中所述圆锥形特征由顺应材料构成，所述顺应材料与所述移液管尖端形成基本上防漏的密封。
60.根据权利要求6所述的装置，其中所述圆锥形特征与移液管尖端配合以形成与所述入口或出口的流体连接。
61.根据权利要求60所述的装置，其中所述圆锥形特征由顺应材料构成，所述顺应材料与所述移液管尖端形成基本上防漏的密封。
62.根据权利要求9所述的装置，其中所述圆锥形特征与移液管尖端配合以形成与所述入口或出口的流体连接。
63.根据权利要求62所述的装置，其中所述圆锥形特征由顺应材料构成，所述顺应材料与所述移液管尖端形成基本上防漏的密封。
64.根据权利要求13所述的装置，其中所述圆锥形特征与移液管尖端配合以形成与所述入口或出口的流体连接。
65.根据权利要求64所述的装置，其中所述圆锥形特征由顺应材料构成，所述顺应材料与所述移液管尖端形成基本上防漏的密封。
66.根据权利要求18所述的装置，其中所述圆锥形特征由顺应材料构成，所述顺应材料与所述移液管尖端形成基本上防漏的密封。
67.根据权利要求66所述的装置，其中所述圆锥形特征与移液管尖端配合以形成与所述入口或出口的流体连接。
68.根据权利要求22所述的装置，其中所述圆锥形特征与移液管尖端配合以形成与所述入口或出口的流体连接。
69.根据权利要求68所述的装置，其中所述圆锥形特征由顺应材料构成，所述顺应材料与所述移液管尖端形成基本上防漏的密封。
70.根据权利要求41所述的装置，其中所述圆锥形特征与移液管尖端配合以形成与所述入口或出口的流体连接。
71.根据权利要求70所述的装置，其中所述圆锥形特征由顺应材料构成，所述顺应材料与所述移液管尖端形成基本上防漏的密封。
72.根据权利要求47所述的装置，其中所述圆锥形特征与移液管尖端配合以形成与所述入口或出口的流体连接。
73.根据权利要求72所述的装置，其中所述圆锥形特征由顺应材料构成，所述顺应材料与所述移液管尖端形成基本上防漏的密封。
74.根据权利要求59所述的装置，其中所述顺应材料是聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚氨酯或其任何组合。
75.根据权利要求3所述的装置，其中含在所述至少100个微孔内的所述多个珠的每个单一珠包括能够以随机方式附接至靶核酸分子的多个拴系随机标记。
76.根据权利要求75所述的装置，其中所述多个拴系随机标记中的每个随机标记包括对于附接至所述珠的所有随机标记来说相同但对于附接至不同珠的随机标记来说不同的细胞标记。
77.根据权利要求75至76中任一项所述的装置，其中附接至单一珠的所述多个拴系随机标记进一步包括一组不同的分子标记。
78.根据权利要求75至76中任一项所述的装置，其中所述多个拴系随机标记中的每个随机标记进一步包括靶核酸分子结合区。
79.根据权利要求75至76中任一项所述的装置，其中所述多个拴系随机标记中的每个随机标记进一步包括通用引物序列。
80.根据权利要求75至76中任一项所述的装置，其中拴系于珠的所述多个随机标记的靶核酸分子结合区包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：基因特异性序列、寡聚-dT序列和随机多聚体或其任何组合。
81.根据权利要求75至76中任一项所述的装置，其中所述装置构成被配置为在多个单细胞上进行自动化随机标记测定的仪器系统的可消耗部件。
82.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26、30-33、39、40、42-46、48-53和59-76中任一项所述的装置，其中所述垫圈构造为与被插入所述移液管尖端接口中的移液管尖端形成密封。
83.根据权利要求6所述的装置，其中所述垫圈构造为与被插入所述移液管尖端接口中的移液管尖端形成密封。
84.根据权利要求9所述的装置，其中所述垫圈构造为与被插入所述移液管尖端接口中的移液管尖端形成密封。
85.根据权利要求13所述的装置，其中所述垫圈构造为与被插入所述移液管尖端接口中的移液管尖端形成密封。
86.根据权利要求18所述的装置，其中所述垫圈构造为与被插入所述移液管尖端接口中的移液管尖端形成密封。
87.根据权利要求22所述的装置，其中所述垫圈构造为与被插入所述移液管尖端接口中的移液管尖端形成密封。
88.根据权利要求41所述的装置，其中所述垫圈构造为与被插入所述移液管尖端接口中的移液管尖端形成密封。
89.根据权利要求47所述的装置，其中所述垫圈构造为与被插入所述移液管尖端接口中的移液管尖端形成密封。
90.根据权利要求58所述的装置，其中所述垫圈构造为与被插入所述移液管尖端接口中的移液管尖端形成密封。
91.根据权利要求59所述的装置，其中所述垫圈构造为与被插入所述移液管尖端接口中的移液管尖端形成密封。
92.根据权利要求1-4、10、14、15、19-21、23-26、30-33、39、40、42-46、48-53、59-76和83-91中任一项所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
93.根据权利要求6所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
94.根据权利要求9所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
95.根据权利要求13所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
96.根据权利要求18所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
97.根据权利要求22所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
98.根据权利要求41所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
99.根据权利要求47所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
100.根据权利要求58所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
101.根据权利要求59所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
102.根据权利要求82所述的装置，其中所述垫圈包括顺应材料。
103.根据权利要求92所述的装置，其中所述顺应材料选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丁二烯、聚异戊二烯或聚氨酯。
104.一种用于确定样品中靶分子数目的系统，所述系统包括：
根据权利要求1-103的任一项所述的装置；以及
流量控制器；其中所述流量控制器被配置为控制流体的递送。
105.根据权利要求104所述的系统，所述系统进一步包括流体，其中所述流体包括细胞样品、珠悬浮液、测定试剂或其任何组合。
106.根据权利要求104所述的系统，其中所述装置是所述系统的可移除的、可消耗的部件。
107.根据权利要求105所述的系统，其中由用户将所述细胞样品和珠悬浮液直接分配或注入所述装置。
108.根据权利要求105所述的系统，其中将除了细胞样品的珠悬浮液和测定试剂预加载进所述装置。
109.根据权利要求104所述的系统，其中所述流量控制器被配置为伴随空气注入将流体注入散布到所述流动池中。
110.根据权利要求105所述的系统，其中所述流量控制器被配置为伴随空气注入将流体注入散布到所述流动池中。
111.根据权利要求104-110中任一项所述的系统，所述系统进一步包括用于增强细胞和珠跨所述至少100个微孔的均匀分配的分配机构，其中所述分配机构进行选自下组的动作，该组由以下各项组成：振动、振荡、漩涡、再循环流、低频搅拌和高频搅拌或其任何组合。
112.根据权利要求104-110中任一项所述的系统，所述系统进一步包括细胞裂解机构，所述机构使用高频压电换能器，用于超声处理细胞。
113.根据权利要求111所述的系统，所述系统进一步包括细胞裂解机构，所述机构使用高频压电换能器，用于超声处理细胞。
114.根据权利要求104-110和113中任一项所述的系统，所述系统进一步包括温度控制器，用于维持用户指定温度，或用于经两个或更多个指定时间间隔，在两个或更多个指定温度之间升降温度。
115.根据权利要求111所述的系统，所述系统进一步包括温度控制器，用于维持用户指定温度，或用于经两个或更多个指定时间间隔，在两个或更多个指定温度之间升降温度。
116.根据权利要求112所述的系统，所述系统进一步包括温度控制器，用于维持用户指定温度，或用于经两个或更多个指定时间间隔，在两个或更多个指定温度之间升降温度。
117.根据权利要求104-110、113、115和116中任一项所述的系统，所述系统进一步包括磁场控制器，用于产生在从所述至少100个微孔洗脱珠中使用的磁场梯度或用于将珠输送通过所述装置。
118.根据权利要求111所述的系统，所述系统进一步包括磁场控制器，用于产生在从所述至少100个微孔洗脱珠中使用的磁场梯度或用于将珠输送通过所述装置。
119.根据权利要求112所述的系统，所述系统进一步包括磁场控制器，用于产生在从所述至少100个微孔洗脱珠中使用的磁场梯度或用于将珠输送通过所述装置。
120.根据权利要求114所述的系统，所述系统进一步包括磁场控制器，用于产生在从所述至少100个微孔洗脱珠中使用的磁场梯度或用于将珠输送通过所述装置。
121.根据权利要求104-110、113、115、116和118-120中任一项所述的系统，所述系统进一步包括被配置为捕获和处理所述至少100个微孔的全部或部分的图像的成像系统，其中所述成像系统进一步包括照明子系统、成像子系统和处理器。
122.根据权利要求111所述的系统，所述系统进一步包括被配置为捕获和处理所述至少100个微孔的全部或部分的图像的成像系统，其中所述成像系统进一步包括照明子系统、成像子系统和处理器。
123.根据权利要求112所述的系统，所述系统进一步包括被配置为捕获和处理所述至少100个微孔的全部或部分的图像的成像系统，其中所述成像系统进一步包括照明子系统、成像子系统和处理器。
124.根据权利要求114所述的系统，所述系统进一步包括被配置为捕获和处理所述至少100个微孔的全部或部分的图像的成像系统，其中所述成像系统进一步包括照明子系统、成像子系统和处理器。
125.根据权利要求117所述的系统，所述系统进一步包括被配置为捕获和处理所述至少100个微孔的全部或部分的图像的成像系统，其中所述成像系统进一步包括照明子系统、成像子系统和处理器。
126.根据权利要求121所述的系统，其中所述成像系统被配置为进行明场、暗场、荧光或定量相位成像。
127.根据权利要求121所述的系统，其中所述成像系统被配置为提供实时图像分析能力，并且其中使用所述实时图像分析来控制分配机构，以增强细胞或珠跨所述至少100个微孔的均匀分配，使得实现了预定的细胞或珠分配。
128.根据权利要求121所述的系统，所述系统进一步包括选择机构，其中使用从经处理的图像导出的信息来鉴定展现一个或多个指定特征的细胞亚群，并且所述选择机构被配置为在后续数据分析中包括或排除所述细胞亚群。
129.根据权利要求122所述的系统，所述系统进一步包括选择机构，其中使用从经处理的图像导出的信息来鉴定展现一个或多个指定特征的细胞亚群，并且所述选择机构被配置为在后续数据分析中包括或排除所述细胞亚群。
130.根据权利要求123所述的系统，所述系统进一步包括选择机构，其中使用从经处理的图像导出的信息来鉴定展现一个或多个指定特征的细胞亚群，并且所述选择机构被配置为在后续数据分析中包括或排除所述细胞亚群。
131.根据权利要求124所述的系统，所述系统进一步包括选择机构，其中使用从经处理的图像导出的信息来鉴定展现一个或多个指定特征的细胞亚群，并且所述选择机构被配置为在后续数据分析中包括或排除所述细胞亚群。
132.根据权利要求125所述的系统，所述系统进一步包括选择机构，其中使用从经处理的图像导出的信息来鉴定展现一个或多个指定特征的细胞亚群，并且所述选择机构被配置为在后续数据分析中包括或排除所述细胞亚群。
133.根据权利要求128所述的系统，其中所述选择机构包括从所述至少100个微孔中物理去除与所鉴定的细胞亚群的细胞共定位的珠。
134.根据权利要求128所述的系统，其中所述选择机构包括在所述至少100个微孔中物理截留与所鉴定的细胞亚群的细胞共定位的珠。
135.根据权利要求128所述的系统，其中所述选择机构包括使用双重编码的珠，其中每个单独的珠是光学编码的和由附接的寡核苷酸细胞标记编码的，并且附接至与所鉴定的细胞亚群的细胞共定位的珠上的细胞标记的测序产生进一步分析待包括或排除的序列数据的列表。
136.根据权利要求104-110、113、115、116、118-120和122-135中任一项所述的系统，其中所述流量控制器被配置为在第一时间将第一测试化合物递送到所述至少100个微孔，并且在第二时间将细胞裂解试剂递送至所述至少100个微孔。
137.根据权利要求136所述的系统，其中所述第一时间和所述第二时间是相同的。
138.根据权利要求128-135和137中任一项所述的系统，其中所述一个或多个指定特征选自下组，该组由以下各项组成：细胞大小、细胞形状、活细胞、死细胞、指定范围的细胞内pH、指定范围的膜电位、指定水平的细胞内钙、一种或多种指定细胞表面标志物的存在、以及一种或多种指定遗传标志物的表达。
139.根据权利要求104-110、113、115、116、118-120、122-135和137中任一项所述的系统，其中将所述系统中使用的流体的粘度调整为水的1.2倍和10倍之间，以便降低物质在微孔之间的扩散速率。
140.根据权利要求104-110、113、115、116、118-120、122-135和137中任一项所述的系统，其中将用于将细胞或珠分配到所述装置的所述至少100个微孔中的流体的粘度调整为水的1.2倍和10倍之间。
141.根据权利要求104-110、113、115、116、118-120、122-135和137中任一项所述的系统，其中将用于将细胞或珠分配到所述装置的所述至少100个微孔中的流体的密度调整为所述细胞或珠的0.8倍和1.25倍之间。
142.根据权利要求104-110、113、115、116、118-120、122-135和137中任一项所述的系统，其中将用于从所述装置的所述至少100个微孔中收回珠的流体的粘度调整为水的1.2倍和10倍之间。
143.根据权利要求104-110、113、115、116、118-120、122-135和137中任一项所述的系统，其中将用于从所述装置的所述至少100个微孔中收回珠的流体的密度调整为所述珠的0.8倍和1.25倍之间。
144.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
根据权利要求1-103中的任一项所述的装置。
145.根据权利要求144所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括用于进行逆转录反应的试剂。
146.根据权利要求144-145中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括用于进行核酸扩增反应的试剂。
147.根据权利要求144-145中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括用于进行一个或多个靶特异性核酸扩增反应的试剂。
148.根据权利要求146所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括用于进行一个或多个靶特异性核酸扩增反应的试剂。
149.根据权利要求144-145和148中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括细胞裂解缓冲液或杂交缓冲液。
150.根据权利要求146所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括细胞裂解缓冲液或杂交缓冲液。
151.根据权利要求147所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括细胞裂解缓冲液或杂交缓冲液。
152.一种用于确定来自所选细胞子群的单细胞中靶核酸分子出现次数的方法，所述方法包括：
在根据权利要求1-103中的任一项所述的装置的多个微孔中捕获单细胞和单一珠，其中单一珠包括多个拴系随机标记，并且其中所述多个拴系随机标记进一步包括：
珠特异性细胞标记；
一组不同的分子标记；和
能够与核酸分子杂交的多个靶结合区，其中附接至珠的靶结合区亚群对于定义所述子群的一组一个或多个核酸标志物是特异性的；
使从单细胞释放的靶核酸分子和核酸标志物与以随机方式拴系于单一珠的所述多个靶结合区杂交；
进行延伸反应以产生：
多个分子缀合物，各自包括随机标记和所述靶核酸分子的互补序列的一部分；和
多个分子缀合物，各自包括随机标记和核酸标志物的互补序列的一部分；
扩增和测序所述分子缀合物；
产生与定义所述子群的一个或多个核酸标志物的所述组相关联的细胞标记的列表；并且
确定所述细胞子群的单细胞中所述靶分子的出现次数。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述方法是多重的。
154.根据权利要求152所述的方法，其中使用与定义所述子群的一个或多个核酸标志物的所述组相关联的细胞标记的列表来从进一步的序列数据分析中排除来自所述细胞子群的数据。
155.根据权利要求152至154中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子是RNA分子。
156.根据权利要求152至154中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子是mRNA分子。
157.根据权利要求152至154中任一项所述的方法，其中所述多个拴系随机标记进一步包括通用引物序列。
158.根据权利要求152至154中任一项所述的方法，其中拴系于珠的所述多个随机标记的所述多个靶结合区包括选自下组的序列的混合物，该组由以下各项组成：基因特异性序列、寡聚-dT序列和随机多聚体序列或其任何组合。
159.一种用于将一个或多个细胞样品加载到根据权利要求1至103中的任一项所述的装置的微孔中的方法，所述方法包括：
a)将空气注入与包括至少100个微孔的基底流体连通的流动池中；
b)将细胞样品注入所述流动池中；并且
c)将空气注入所述流动池中。
160.根据权利要求159所述的方法，所述方法进一步包括在步骤c)之后将缓冲液或珠悬浮液注入所述流动池中。
161.根据权利要求159所述的方法，其中所述一个或多个细胞样品各自包括一个或多个单细胞。
162.根据权利要求159所述的方法，其中所述一个或多个细胞样品包括至少两种不同细胞类型的细胞。
163.根据权利要求159所述的方法，其中所述一个或多个细胞样品包括免疫细胞。
164.根据权利要求160所述的方法，其中所述珠悬浮液包括多个珠，并且每个单独的珠包括附接至所述珠的多个寡核苷酸。
165.根据权利要求159所述的方法，其中所述注入步骤置换了所述流动池的内容物。
166.根据权利要求159所述的方法，其中所述基底包括多个珠，其中所述至少100个微孔中的多个微孔各自含有单一珠，并且其中与不注入空气的加载相比，所述一个或多个细胞样品和所述珠跨所述至少100个微孔至少10％更均匀地分散。
167.根据权利要求159所述的方法，其中所述基底包括多个珠，其中所述至少100个微孔中的多个微孔各自含有单一珠，并且其中与不注入空气的加载相比，所述一个或多个细胞样品和所述珠跨所述至少100个微孔至少30％更均匀地分散。
168.根据权利要求159所述的方法，其中所述基底包括多个珠，其中所述至少100个微孔中的多个微孔各自含有单一珠，并且其中与不注入空气的加载相比，所述一个或多个细胞样品和所述珠跨所述至少100个微孔至少60％更均匀地分散。
169.根据权利要求159所述的方法，其中所述注入空气的步骤不会去除所述至少100个微孔的内容物。
170.根据权利要求159所述的方法，其中所述注入空气的步骤包括以0.08ml/秒至1.8ml/秒之间的速率注入空气。
171.根据权利要求159所述的方法，其中所述注入空气的步骤包括以0.01和0.25atm之间的压力注入空气。
172.根据权利要求159所述的方法，其中所述注入空气的步骤包括产生用于所述液体流通过所述流动池的均匀环境。
173.根据权利要求159至172中任一项所述的方法，所述方法进一步包括调整用于所述细胞样品或珠悬浮液的缓冲液的粘度，以改善所述细胞或珠分配到所述微孔中的均匀性。
174.根据权利要求173所述的方法，其中将所述缓冲液的粘度调整为水的1.2倍和水的10倍之间。
175.根据权利要求159-172和174中任一项所述的方法，所述方法进一步包括调整用于所述一个或多个细胞样品或珠悬浮液的缓冲液的密度，以改善所述细胞或珠分配到所述微孔中的均匀性。
176.根据权利要求175所述的方法，其中将用于注入珠的缓冲液的密度调整为所述珠的密度的0.8倍和0.99倍之间。
177.一种用于从根据权利要求1-103中的任一项所述的装置的微孔阵列的微孔中收回珠的方法，所述方法包括：
用珠加载所述微孔阵列；
将所述微孔阵列暴露于磁场；
使缓冲液流过所述微孔阵列；并且
使用磁场从所述微孔阵列收回所述珠。
178.根据权利要求177所述的方法，其中所述加载包括加载所述珠，使得所述微孔阵列的至少90％的微孔含有单一珠。
179.根据权利要求177所述的方法，其中所述加载包括加载所述珠，使得所述微孔阵列的至少95％的微孔含有单一珠。
180.根据权利要求177所述的方法，其中所述加载包括加载所述珠，使得所述微孔阵列的100％的微孔含有单一珠。
181.根据权利要求177所述的方法，其中所述加载跨所述微孔阵列基本上是均匀的。
182.根据权利要求177所述的方法，其中使用磁体产生所述磁场。
183.根据权利要求177所述的方法，其中所述暴露步骤包括以0.01毫米/秒和10毫米/秒之间的速率跨所述微孔阵列移动所述磁场。
184.根据权利要求177所述的方法，其中所述暴露步骤包括以0.5毫米/秒的速率跨所述微孔阵列移动所述磁场。
185.根据权利要求177所述的方法，其中所述暴露步骤包括将所述微孔阵列暴露于具有相对于所述基底平面形成非垂直角的场线的磁场。
186.根据权利要求185所述的方法，其中所述场线相对于所述基底平面形成45度和80度之间的角度。
187.根据权利要求177所述的方法，其中所述暴露步骤包括将所述珠拉入所述微孔阵列的孔中。
188.根据权利要求177所述的方法，其中所述缓冲液包括裂解缓冲液。
189.根据权利要求177所述的方法，其中所述缓冲液包括洗涤缓冲液。
190.根据权利要求177所述的方法，其中所述流动步骤基本上未从所述微孔阵列的微孔中除去所述珠。
191.根据权利要求177所述的方法，其中所述流动步骤将珠移动到所述微孔阵列的微孔中。
192.根据权利要求177所述的方法，其中所述收回步骤包括用磁体收回所述珠。
193.根据权利要求177所述的方法，其中所述收回步骤从所述微孔阵列中收回至少85％的珠。
194.根据权利要求177所述的方法，其中所述收回步骤从所述微孔阵列中收回至少95％的珠。
195.根据权利要求177-194中任一项所述的方法，所述方法进一步包括调整所述缓冲液的粘度以改善珠收回的效率。
196.根据权利要求195所述的方法，其中将所述缓冲液的粘度调整为水的1.2倍和水的10倍之间。
197.根据权利要求177-194和196中任一项所述的方法，所述方法进一步包括调整所述缓冲液的密度以改善珠收回的效率。
198.根据权利要求197所述的方法，其中将所述缓冲液的密度调整为所述珠的密度的0.8倍和0.99倍之间。
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