ES2784361T3 - Dispositivos y sistemas para la creación de códigos de barras moleculares de dianas de ácido nucleico en células individuales - Google Patents

Dispositivos y sistemas para la creación de códigos de barras moleculares de dianas de ácido nucleico en células individuales Download PDF

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David Stern
Janice Lai
Ari Chaney
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Abstract

Un dispositivo que comprende: un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 μm3 hasta aproximadamente 786.000 μm3, y una pluralidad de perlas, en donde una pluralidad de los al menos 100 micropocillos contienen cada uno una perla individual, y en donde la relación entre el diámetro promedio de los micropocillos y el diámetro de las perlas varía desde aproximadamente 1,2 hasta aproximadamente 1,8; y una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato; y una interfaz de punta de pipeta para cargar o retirar muestras, reactivos de ensayo, suspensiones de perlas, o residuos del dispositivo; y una válvula que previene el flujo de fluidos dentro del dispositivo a menos que una punta de pipeta se inserte en la característica cónica de la interfaz de punta de pipeta.

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivos y sistemas para la creación de códigos de barras moleculares de dianas de ácido nucleico en células individuales
ANTECEDENTES
La capacidad para detectar y cuantificar ácido nucleico específico y moléculas de proteínas en células individuales es crítica para el entendimiento de la diversidad de la función de celular en el desarrollo, la salud y la enfermedad. La citometría de flujo se ha convertido en una tecnología convencional para la detección de alto rendimiento de marcadores de proteína en células individuales y ha sido ampliamente adoptada en la investigación básica y los diagnósticos clínicos. A diferencia, las mediciones de ácido nucleico, tales como la expresión de ARNm, se realizan normalmente en muestras a granel, que ocultan las contribuciones de las células individuales. Para caracterizar la complejidad de los sistemas celulares, es altamente deseable desarrollar métodos, dispositivos y sistemas para monitorizar la expresión de un gran número de genes a través de muchos miles de células.
El documento de patente US2010/0300895 desvela un aparato y métodos para realizar reacciones electroquímicas. El documento de patente US2006/0040297 desvela un aparato y método para realizar la secuenciación rápida del ADN, tal como secuenciación genómica. El documento de patente WO2008/147428 desvela métodos y sistemas para proporcionar un sistema de soporte de células. El documento de patente WO2013/148525 desvela celdas de flujo para chip de matriz de alta densidad.
SUMARIO
La invención proporciona un dispositivo que comprende: un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, y una pluralidad de perlas, en donde una pluralidad de los al menos 100 micropocillos contienen cada uno una perla individual, y en donde la relación entre el diámetro promedio de los micropocillos y el diámetro de las perlas varía desde aproximadamente 1,2 hasta aproximadamente 1,8; y una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato; y una interfaz de punta de pipeta para cargar o retirar muestras, reactivos de ensayo, suspensiones de perlas, o residuos del dispositivo; y una válvula que previene el flujo de fluidos dentro del dispositivo a menos que una punta de pipeta se inserte en la característica cónica de la interfaz de punta de pipeta. La invención también proporciona un sistema que comprende: el dispositivo de la invención; y un controlador de flujo; en donde el controlador de flujo está configurado para controlar el suministro de fluidos.
La invención también proporciona un kit que comprende el dispositivo de la invención.
La invención también proporciona un método de carga de una o más muestras de células en los micropocillos del dispositivo de la invención, comprendiendo el método: a) inyectar aire en la celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato que comprende al menos 100 micropocillos; b) inyectar una muestra de células en la celda de flujo; y c) inyectar aire en la celda de flujo.
En el presente documento se desvelan dispositivos, sistemas y kits para determinar el número de moléculas diana en una muestra. En algunas realizaciones, los dispositivos de la presente divulgación comprenden: a) un sustrato que comprende: i) al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, y ii) una pluralidad de perlas, en donde una pluralidad de los al menos 100 micropocillos contienen cada uno una perla individual, y en donde la relación entre el diámetro promedio de los micropocillos y el diámetro de las perlas varía desde aproximadamente 1,2 hasta aproximadamente 1,8; y b) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato.
En algunas realizaciones, los dispositivos de la presente divulgación comprenden: a) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, y en donde una superficie de los al menos 100 micropocillos está recubierta con un recubrimiento superficial para mejorar la humectabilidad; y b) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato.
En algunas realizaciones, los dispositivos de la presente divulgación comprenden: a) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, una sección transversal no circular en el plano del sustrato, y una relación de aspecto entre el diámetro promedio y la profundidad varía desde aproximadamente 0,1 hasta 2; y b) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato.
En algunas realizaciones, los dispositivos de la presente divulgación comprenden: a) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, y un ángulo de inclinación positiva que varía desde aproximadamente 1 grado hasta aproximadamente 15 grados; y b) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato.
En algunas realizaciones, los dispositivos de la presente divulgación comprenden: a) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 |jm3 hasta aproximadamente 786.000 jm 3, y en donde el sustrato comprende además características superficiales que rodean cada micropocillo o cubren la superficie entre cada micropocillo de los al menos 100 micropocillos; y b) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato.
En algunas realizaciones, los dispositivos de la presente divulgación comprenden: a) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 jm 3 hasta aproximadamente 786.000 jm 3; b) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato; y c) al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida, en donde el al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida están en comunicación fluida con la celda de flujo por canales de fluido que tienen ejes que forman un ángulo con respecto al plano del sustrato, y en donde el al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida son capaces de dirigir un flujo de un fluido a través de la celda de flujo, poniendo así en contacto los micropocillos con el fluido.
En algunas realizaciones, los dispositivos comprenden además al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida, en donde el al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida son capaces de dirigir un flujo de un fluido a través de la celda de flujo, poniendo así en contacto los micropocillos con el fluido. En algunas realizaciones, el coeficiente de variación para el volumen del micropocillo es inferior a 5 %. En algunas realizaciones, el sustrato comprende desde 1.000 hasta 5.000.000 micropocillos. En algunas realizaciones, el sustrato comprende desde 10.000 hasta 200.000 micropocillos. En algunas realizaciones, cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 21.000 jm 3 hasta aproximadamente 170.000 jm 3. En algunas realizaciones, cada micropocillo tiene un volumen de aproximadamente 144.000 jm 3. En algunas realizaciones, los micropocillos tienen una sección transversal no circular en el plano del sustrato. En algunas realizaciones, la relación de aspecto entre el diámetro promedio y la profundidad para los al menos 100 micropocillos varía desde aproximadamente 0,1 hasta 2. En algunas realizaciones, la relación de aspecto entre el diámetro promedio y la profundidad para los al menos 100 micropocillos es aproximadamente 0,9. En algunas realizaciones, las dimensiones de los al menos 100 micropocillos se eligen de manera que cada micropocillo pueda contener como máximo una perla. En algunas realizaciones, la relación entre el diámetro promedio de los micropocillos y el diámetro de las perlas es aproximadamente 1,5. En algunas realizaciones, las paredes laterales de los micropocillos tienen un ángulo de inclinación positiva de aproximadamente 1 a 15 grados. En algunas realizaciones, las paredes laterales de los micropocillos tienen un ángulo de inclinación positiva de aproximadamente 3 a 7 grados. En algunas realizaciones, el sustrato comprende además características superficiales que rodean cada micropocillo o cubren la superficie entre los micropocillos de los al menos 100 micropocillos. En algunas realizaciones, el sustrato comprende además características superficiales que rodean cada micropocillo o cubren la superficie entre los micropocillos de los al menos 100 micropocillos, en donde las características superficiales se seleccionan del grupo que consiste en características superficiales redondeadas, abovedadas, en cresta y en pico, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el porcentaje de los al menos 100 micropocillos que contienen una perla individual es al menos aproximadamente 10 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de los al menos 100 micropocillos que contienen una perla individual es al menos aproximadamente 50 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de los al menos 100 micropocillos que contienen una célula individual es entre aproximadamente 0,01 % y aproximadamente 15 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de los al menos 100 micropocillos que contienen una célula individual es entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 11 %. En algunas realizaciones, una superficie de los al menos 100 micropocillos está recubierta con polietilenglicol (PEG), poli-Hema, ácido plurónico F68, ácido plurónico F108, polisorbato 20, dióxido de silicio (SiO2), o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, una superficie de los al menos 100 micropocillos comprende una superficie tratada con plasma. En algunas realizaciones, el al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida están en comunicación fluida con la celda de flujo por canales de fluido que tienen ejes que forman un ángulo con respecto al plano del sustrato. En algunas realizaciones, el al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida están en comunicación fluida con la celda de flujo por canales de fluido que tienen ejes que forman un ángulo con respecto al plano del sustrato, y en donde los ángulos para los canales de fluido que comunican con el puerto de entrada y el puerto de salida son los mismos. En algunas realizaciones, el al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida están en comunicación fluida con la celda de flujo por canales de fluido que tienen ejes que forman un ángulo con respecto al plano del sustrato, y en donde los ángulos para los canales de fluido que comunican con el puerto de entrada y el puerto de salida son diferentes. En algunas realizaciones, el ángulo entre los ejes de los canales de fluido y el plano del sustrato es entre aproximadamente 15 grados y aproximadamente 75 grados. En algunas realizaciones, al menos uno de los ángulos entre los ejes de los canales de fluido y el plano del sustrato es aproximadamente 45 grados. En algunas realizaciones, el sustrato se fabrica de un material seleccionado del grupo que consiste en silicio, sílice fundida, vidrio, un polímero, un metal, un elastómero, polidimetilsiloxano, agarosa y un hidrogel, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la celda de flujo comprende el sustrato. En algunas realizaciones, la celda de flujo se puede desprender del sustrato. En algunas realizaciones, la celda de flujo se fabrica de un material seleccionado del grupo que consiste en silicio, sílice fundida, vidrio, polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), policarbonato (PC), polipropileno (PP), polietileno (PE), polietileno de alta densidad (HDPE), poliimida, polímeros de olefina cíclica (COP), copolímeros de olefina cíclica (COC), poli(tereftalato de etileno) (PET), resina epoxi, y metal, o cualquier combinación de estos materiales. En algunas realizaciones, el sustrato o celda de flujo comprende además una ventana transparente para estudios de imágenes ópticas de los al menos 100 micropocillos. En algunas realizaciones, los dispositivos comprenden además uno o más recipientes de muestra, recipientes de reactivo, recipientes de residuos, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más recipientes de reactivo se pre-cargan con una suspensión de perlas o un reactivo de ensayo. En algunas realizaciones, los dispositivos comprenden además una interfaz de punta de pipeta para cargar o retirar muestras, reactivos de ensayo, suspensiones de perlas, o residuos del dispositivo. En algunas realizaciones, la interfaz de punta de pipeta comprende una característica cónica que se conecta a una punta de pipeta para formar una conexión fluida con el puerto de entrada o puerto de salida. En algunas realizaciones, la característica cónica comprende un material distensible que forma un sellado sustancialmente a prueba de fugas con la punta de pipeta. En algunas realizaciones, el material distensible es polidimetilsiloxano (PDMS), polibutadieno, poliisopreno, poliuretano, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los dispositivos que comprenden además una válvula que previene el flujo de fluidos dentro del dispositivo, a menos que una punta de pipeta se inserte en la característica cónica de la interfaz de punta de pipeta. En algunas realizaciones, cada perla individual de una pluralidad de perlas contenidas dentro de los al menos 100 micropocillos comprende una pluralidad de marcadores estocásticos anclados capaces de fijarse a una molécula de ácido nucleico diana en un modo estocástico. En algunas realizaciones, cada marcador estocástico en la pluralidad de marcadores estocásticos anclados comprende un marcador celular que es idéntico para todos los marcadores estocásticos fijados a esa perla, pero es diferente para marcadores estocásticos fijados a diferentes perlas. En algunas realizaciones, la pluralidad de marcadores estocásticos anclados fijados a una perla individual comprende además un conjunto variado de marcadores moleculares. En algunas realizaciones, cada marcador estocástico en la pluralidad de marcadores estocásticos anclados comprende además una región de unión a moléculas de ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, cada marcador estocástico en la pluralidad de marcadores estocásticos anclados comprende además una secuencia de cebador universal. En algunas realizaciones, las regiones de unión a moléculas de ácido nucleico diana de la pluralidad de marcadores estocásticos anclados a una perla comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una secuencia específica de gen, una secuencia de oligo-dT, y un multímero al azar, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el dispositivo constituye un componente consumible de un sistema de instrumentos configurado para realizar ensayos automatizados de marcadores estocásticos en una pluralidad de células individuales.
También se desvelan en el presente documento sistemas que comprenden: a) un dispositivo que comprende: i) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, y en donde el sustrato comprende además características superficiales que rodean cada micropocillo o cubren la superficie entre los micropocillos de los al menos 100 micropocillos; ii) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato; y iii) al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida, en donde el al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida son capaces de dirigir un flujo de un fluido a través de la celda de flujo, poniendo así en contacto los micropocillos con el fluido; y b) un controlador de flujo; en donde el controlador de flujo está configurado para controlar el suministro de fluidos.
En algunas realizaciones, los sistemas de la presente divulgación comprenden: a) un dispositivo que comprende: i) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, una sección transversal no circular en el plano del sustrato, y una relación de aspecto entre el diámetro promedio y la profundidad que varía desde aproximadamente 0,1 hasta 2; ii) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato; y iii) al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida, en donde el al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida son capaces de dirigir un flujo de un fluido a través de la celda de flujo, poniendo así en contacto los micropocillos con el fluido; y b) un controlador de flujo; en donde el controlador de flujo está configurado para controlar el suministro de fluidos.
En algunas realizaciones, los sistemas comprenden además fluidos en donde los fluidos comprenden muestras de células, suspensiones de perlas, reactivos de ensayo, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el dispositivo es un componente consumible retirable del sistema. En algunas realizaciones, las muestras de células y suspensiones de perlas se dispensan o inyectan directamente en el dispositivo por el usuario. En algunas realizaciones, las perlas y reactivos de ensayo distintos de las muestras de células se precargan en el dispositivo. En algunas realizaciones, el controlador de flujo está configurado para intercalar inyecciones de fluido en la celda de flujo con inyecciones de aire. En algunas realizaciones, los sistemas comprenden además un mecanismo de distribución para potenciar la distribución uniforme de células y perlas a través de los al menos 100 micropocillos, en donde el mecanismo de distribución realiza una acción seleccionada del grupo que consiste en balanceo, agitación, turbulencia, flujo recirculante, agitación de baja frecuencia, y agitación de alta frecuencia, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los sistemas comprenden además un mecanismo de lisis celular que usa un transductor piezoeléctrico de alta frecuencia para sonicar las células. En algunas realizaciones, los sistemas comprenden además un controlador de temperatura para mantener una temperatura especificada por el usuario, o para incrementar la temperatura entre dos o más temperaturas especificadas durante dos o más intervalos de tiempo especificados. En algunas realizaciones, los sistemas comprenden además un controlador de campo magnético para crear gradientes de campo magnético usados en la elución de perlas de los al menos 100 micropocillos o para transportar perlas a través del dispositivo. En algunas realizaciones, los sistemas comprenden además un sistema de obtención de imágenes configurado para capturar y procesar imágenes de todos o una porción de los al menos 100 micropocillos, en donde el sistema de obtención de imágenes comprende además un subsistema de iluminación, un subsistema de obtención de imágenes, y un procesador. En algunas realizaciones, el sistema de obtención de imágenes está configurado para realizar obtención de imágenes de campo brillante, de campo oscuro, de fluorescencia, o de fase cuantitativa. En algunas realizaciones, el sistema de obtención de imágenes está configurado para proporcionar capacidad de análisis de imágenes en tiempo real, y en donde el análisis de imágenes en tiempo real se usa para controlar un mecanismo de distribución para potenciar la distribución uniforme de células o perlas a través de los al menos 100 micropocillos de manera que se logre una distribución predeterminada de células o perlas. En algunas realizaciones, la distribución predeterminada de células y perlas es una en la que al menos 10 % de los micropocillos contienen tanto una célula individual como una perla individual. En algunas realizaciones, la distribución predeterminada de células y perlas es una en la que al menos 25 % de los micropocillos contienen tanto una célula individual como una perla individual. En algunas realizaciones, los sistemas comprenden además un mecanismo de selección, en donde se usa información derivada de imágenes procesadas para identificar un subconjunto de células que presentan una o más características especificadas, y el mecanismo de selección está configurado para o incluir o excluir el subconjunto de células del posterior análisis de datos. En algunas realizaciones, el mecanismo de selección comprende la retirada física de perlas co-localizadas con células del subconjunto identificado de células de los al menos 100 micropocillos. En algunas realizaciones, el mecanismo de selección comprende el atrapamiento físico de perlas co-localizadas con células del subconjunto identificado de células en los al menos 100 micropocillos. En algunas realizaciones, el mecanismo de selección comprende el uso de perlas de doble codificación en donde cada perla individual está tanto codificada ópticamente como codificada por un marcador celular de oligonucleótidos fijado, y la secuenciación de los marcadores celulares fijados a perlas co-localizadas con células del subconjunto identificado de células genera una lista de datos de secuencia a incluir o excluir del análisis adicional. En algunas realizaciones, el controlador de flujo está configurado para suministrar un primer compuesto de prueba a los al menos 100 micropocillos en un primer momento, y para suministrar un reactivo de lisis celular a los al menos 100 micropocillos en un segundo momento. En algunas realizaciones, el primer momento y el segundo momento son los mismos. En algunas realizaciones, la una o más características especificadas se seleccionan del grupo que consiste en tamaño de la célula, forma de la célula, células vivas, células muertas, un intervalo especificado de pH intracelular, un intervalo especificado de potencial de membrana, un nivel especificado de calcio intracelular, la presencia de uno o más marcadores de la superficie celular especificados, y la expresión de uno o más marcadores genéticos especificados. En algunas realizaciones, las muestras de células comprenden muestras de paciente y los resultados del ensayo se usan por un profesional de la salud para diagnosticar una enfermedad o tomar decisiones informadas de tratamiento sanitario. En algunas realizaciones, la viscosidad de un fluido usado en el sistema se ajusta para estar entre aproximadamente 1,2x y 10x la del agua para reducir la tasa de difusión de sustancias entre micropocillos. En algunas realizaciones, la viscosidad de un fluido usado para distribuir células o perlas en los al menos 100 micropocillos del dispositivo se ajusta para estar entre aproximadamente 1,2x y 10x la del agua. En algunas realizaciones, la densidad de un fluido usado para distribuir células o perlas en los al menos 100 micropocillos del dispositivo se ajusta para estar entre aproximadamente 0,8x y 1,25x la de las células o perlas. En algunas realizaciones, la viscosidad de un fluido usado para recuperar perlas de los al menos 100 micropocillos del dispositivo se ajusta para estar entre aproximadamente 1,2x y 10x la del agua. En algunas realizaciones, la densidad de un fluido usado para recuperar perlas de los al menos 100 micropocillos del dispositivo se ajusta para estar entre aproximadamente 0,8x y 1,25x la de las perlas.
En el presente documento se desvela software que se encuentra en un medio legible por ordenador programado para realizar uno o más de las siguientes etapas de análisis de datos de secuencias: a) decodificación o demultiplexado de código de barras de muestras, código de barras de células, código de barras molecular, y datos de secuencia diana; b) agrupamiento automatizado de marcadores celulares para compensar los errores de amplificación o secuenciación, en donde se recogen datos de secuencia para una biblioteca de moléculas de oligonucleótidos diana estocásticamente marcadas; c) alineamiento de datos de secuencia con secuencias de referencia conocidas; d) determinación del número de lecturas por gen por célula, y el número de moléculas de transcrito único por gen por célula; e) análisis estadístico para predecir intervalos de confianza para determinaciones del número de moléculas de transcrito por gen por célula; y f) análisis estadístico para agrupar células según datos de expresión génica o para identificar subpoblaciones de células raras.
En el presente documento se desvela software que se encuentra en un medio legible por ordenador programado para realizar las siguientes etapas de procesamiento de imágenes y de control de instrumentos: a) detección de micropocillos en una o más imágenes de una pluralidad de micropocillos; b) detección de micropocillos que contienen células individuales en una o más imágenes de una pluralidad de micropocillos; c) detección de micropocillos que contienen dos o más células en una o más imágenes de una pluralidad de micropocillos, y determinación del número de células en cada uno de los micropocillos detectados; d) detección de micropocillos que contienen perlas individuales en una o más imágenes de una pluralidad de micropocillos; e) detección de micropocillos que contienen dos o más perlas en una o más imágenes de una pluralidad de micropocillos, y determinación del número de perlas en cada uno de los micropocillos detectados; f) determinación del número de micropocillos que contienen células individuales después de realizar la etapa (b); g) determinación del número de micropocillos que contienen perlas individuales después de realizar la etapa (d); y h) determinación del número de micropocillos que contienen células individuales y perlas individuales después de realizar las etapas (b) y (d), en donde los números determinados en las etapas (f) - (h) se usan para controlar un aparato configurado para distribuir células y perlas a través de una pluralidad de micropocillos.
En el presente documento se desvela software que se encuentra en un medio legible por ordenador programado para realizar las siguientes etapas de procesamiento de imágenes y de control de instrumentos: a) detección de un subconjunto de células que presentan una o más características especificadas en una o más imágenes de una pluralidad de micropocillos, en donde una fracción de los micropocillos contienen células; b) determinación de las localizaciones de los micropocillos que contienen el subconjunto de células; y c) uso de las localizaciones determinadas en la etapa (b) para controlar un aparato de selección configurado para excluir el subconjunto de células del posterior análisis de datos de secuencias.
En algunas realizaciones, el aparato de selección de la etapa c) está configurado para incluir solo el subconjunto de células en el posterior análisis de datos de secuencias. En algunas realizaciones, la una o más imágenes de una pluralidad de micropocillos son imágenes seleccionadas del grupo que consiste en imágenes de campo brillante, imágenes de campo oscuro, imágenes de fluorescencia, imágenes de luminiscencia e imágenes de fosforescencia. En algunas realizaciones, el software comprende además el uso de uno o más algoritmos seleccionados del grupo que consiste en el método de detección de bordes de Canny, el método de detección de bordes de Canny-Deriche, el método del operador de Sobel, un método de detección de gradientes de primer orden, un método de detección de bordes por diferencial de segundo orden, un método de detección de bordes por coherencia de fases, un método de umbral de intensidad, un método de agrupamiento de intensidad, un método basado en histogramas de intensidad, la transformada de Hough generalizada, la transformada de Hough circular, la transformada de Fourier, la transformada rápida de Fourier, el análisis de ondículas y el análisis de auto-correlación. En algunas realizaciones, la una o más características especificadas se seleccionan del grupo que consiste en tamaño de la célula, forma de la célula, células vivas, células muertas, un intervalo especificado de pH intracelular, un intervalo especificado de potencial de membrana, un nivel especificado de calcio intracelular, la presencia de uno o más marcadores de la superficie celular especificados, y la expresión de uno o más marcadores genéticos especificados.
Se desvelan en el presente documento kits que comprenden: a) un dispositivo que comprende: i) un sustrato, en donde el sustrato comprende además: 1) al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3; y 2) una pluralidad de perlas, en donde una pluralidad de los al menos 100 micropocillos contienen cada uno una perla individual, y en donde la relación entre el diámetro promedio de los micropocillos y el diámetro de las perlas varía desde aproximadamente 1,2 hasta aproximadamente 1,8; y ii) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato.
Se desvelan en el presente documento kits que comprenden a) un dispositivo que comprende: i) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, y en donde una superficie de los al menos 100 micropocillos está recubierta con un recubrimiento superficial para mejorar la humectabilidad; y ii) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato.
Se desvelan en el presente documento kits que comprenden: a) un dispositivo que comprende: i) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, una sección transversal no circular en el plano del sustrato, y una relación de aspecto entre el diámetro promedio y la profundidad de aproximadamente 0,9; y ii) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato.
Se desvelan en el presente documento kits que comprenden: a) un dispositivo que comprende: i) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, y un ángulo de inclinación positiva de entre aproximadamente 1 grado y 15 grados; y ii) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato.
Se desvelan en el presente documento kits que comprenden: a) un dispositivo que comprende: i) un sustrato que comprende al menos 100 micropocillos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 pm3 hasta aproximadamente 786.000 pm3, y en donde el sustrato comprende además características superficiales que rodean cada micropocillo o cubren la superficie entre los micropocillos de los al menos 100 micropocillos; y ii) una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato.
En algunas realizaciones, el dispositivo comprende además al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida, en donde el al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida son capaces de dirigir un flujo de un fluido a través de la celda de flujo, poniendo así en contacto los micropocillos con el fluido. En algunas realizaciones, una pluralidad de los al menos 100 micropocillos contienen una perla individual. En algunas realizaciones, el porcentaje de los al menos 100 micropocillos que contienen una perla individual es al menos aproximadamente 10 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de los al menos 100 micropocillos que contienen una perla individual es al menos aproximadamente 50 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de los al menos 100 micropocillos que contienen una perla individual es al menos aproximadamente 80 %. En algunas realizaciones, cada perla individual en la pluralidad de perlas contenidas en micropocillos comprende una pluralidad de marcadores estocásticos anclados capaces de fijarse a una molécula de ácido nucleico diana en un modo estocástico. En algunas realizaciones, el kit comprende además reactivos para realizar una reacción de transcripción inversa. En algunas realizaciones, el kit comprende además reactivos para realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el kit comprende además reactivos para realizar una o más reacciones de amplificación específicas de ácidos nucleicos diana. En algunas realizaciones, el kit comprende además un tampón de lisis celular o tampón de hibridación. En algunas realizaciones, una superficie de los al menos 100 micropocillos está recubierta con polietilenglicol (PEG), poli-Hema, ácido plurónico F68, ácido plurónico F108, polisorbato 20, dióxido de silicio (SiO2), o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, una superficie de los al menos 100 micropocillos comprende una superficie tratada con plasma. En algunas realizaciones, el sustrato comprende además características superficiales que rodean cada micropocillo o cubren la superficie entre cada micropocillo de los al menos 100 micropocillos. En algunas realizaciones, las características superficiales se seleccionan del grupo que consiste en características superficiales redondeadas, abovedadas, en cresta y en pico, o cualquier combinación de los mismos.
Se desvelan en el presente documento métodos de determinación de varias apariciones de una molécula de ácido nucleico diana en células individuales de una subpoblación seleccionada de células, comprendiendo los métodos: a) capturar células individuales y perlas individuales en una pluralidad de micropocillos, en donde una perla individual comprende una pluralidad de marcadores estocásticos anclados, y en donde la pluralidad de marcadores estocásticos anclados comprende además: i) un marcador celular específico de perla; ii) un conjunto variado de marcadores moleculares; y ii) una pluralidad de regiones de unión a diana capaces de hibridarse con moléculas de ácidos nucleicos, en donde un subconjunto de las regiones de unión a diana fijadas a una perla son específicas para un conjunto de uno o más marcadores de ácido nucleico que definen la subpoblación; b) hibridar moléculas de ácidos nucleicos diana y marcadores de ácido nucleico liberados de células individuales con la pluralidad de regiones de unión a diana ancladas a perlas individuales en un modo estocástico; c) realizar una reacción de extensión para crear: i) una pluralidad de conjugados moleculares que comprende cada uno un marcador estocástico y una porción de una secuencia complementaria de la molécula de ácido nucleico diana; y ii) una pluralidad de conjugados moleculares que comprende cada uno un marcador estocástico y una porción de una secuencia complementaria de un marcador de ácido nucleico; d) amplificar y secuenciar los conjugados moleculares; e) generar una lista de marcadores celulares asociados al conjunto de uno o más marcadores de ácido nucleico que define la subpoblación; y f) determinar el número de apariciones de la molécula diana en células individuales de la subpoblación de células.
En algunas realizaciones, el método es multiplexado. En algunas realizaciones, se usa la lista de marcadores celulares asociados al conjunto de uno o más marcadores de ácido nucleico que define la subpoblación para excluir datos de la subpoblación de células de análisis de datos de secuencias adicionales. En algunas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos diana son moléculas de ARN. En algunas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos diana son moléculas de ARNm. En algunas realizaciones, la pluralidad de marcadores estocásticos anclados comprende además una secuencia de cebador universal. En algunas realizaciones, la pluralidad de regiones de unión a diana de la pluralidad de marcadores estocásticos anclados a una perla comprenden una mezcla de secuencias seleccionadas del grupo que consiste en secuencias específicas de gen, secuencias de oligo-dT y secuencias de multímeros al azar, o cualquier combinación de los mismos.
Se desvelan en el presente documento métodos de carga de una o más muestras de células en los micropocillos del dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el método: a) inyectar aire en la celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato que comprende al menos 100 micropocillos; b) inyectar una muestra de células en la celda de flujo; y c) inyectar aire en la celda de flujo.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden además inyectar un tampón o suspensión de perlas en la celda de flujo tras la etapa c). En algunas realizaciones, la una o más muestras de células cada una comprenden una o más células individuales. En algunas realizaciones, la una o más muestras de células comprenden células de al menos dos tipos diferentes de células. En algunas realizaciones, la una o más muestras de células comprenden células inmunitarias. En algunas realizaciones, la suspensión de perlas comprende una pluralidad de perlas, y cada perla individual comprende una pluralidad de oligonucleótidos fijados a perla. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos fijados a cada perla individual comprende un conjunto variado de marcadores moleculares. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos fijados a cada perla individual comprende un marcador celular que es el mismo para todos los oligonucleótidos fijados a la perla individual, y en donde los marcadores celulares de las pluralidades de oligonucleótidos fijados a diferentes perlas son diferentes entre sí. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos fijados a cada perla individual comprende una región de unión a diana. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos fijados a cada perla individual comprende una secuencia de unión a cebador universal. En algunas realizaciones, las etapas de inyección desplazan el contenido de la celda de flujo. En algunas realizaciones, la una o más muestras de células y las perlas se dispersan al menos 10 % más uniformemente a través de los al menos 100 micropocillos en comparación con cargar sin inyectar aire. En algunas realizaciones, la una o más muestras de células y las perlas se dispersan al menos 30 % más uniformemente a través de los al menos 100 micropocillos en comparación con cargar sin inyectar aire. En algunas realizaciones, la una o más muestras de células y las perlas se dispersan al menos 60 % más uniformemente a través de los al menos 100 micropocillos en comparación con cargar sin inyectar aire. En algunas realizaciones, las etapas de inyectar aire no retiran el contenido de los al menos 100 micropocillos. En algunas realizaciones, las etapas de inyectar aire comprenden inyectar aire a una tasa entre aproximadamente 0,08 mL por segundo y aproximadamente 1,8 mL por segundo. En algunas realizaciones, las etapas de inyectar aire comprenden inyectar aire a una presión entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,25 atm. En algunas realizaciones, las etapas de inyectar aire comprenden generar un entorno uniforme para el flujo de líquido a través de la celda de flujo. En algunas realizaciones, el método comprende además ajustar la viscosidad del tampón usado para la muestra de células o suspensión de perlas para mejorar la uniformidad de distribución de las células o perlas en los micropocillos. En algunas realizaciones, la viscosidad del tampón se ajusta a entre aproximadamente 1,2 veces la del agua y aproximadamente 10 veces la del agua. En algunas realizaciones, el método comprende además ajustar la densidad del tampón usado para la una o más muestras de células o suspensión de perlas para mejorar la uniformidad de distribución de las células o perlas en los micropocillos.
En algunas realizaciones, la densidad del tampón usado para la inyección de perlas se ajusta a entre aproximadamente 0,8 veces y aproximadamente 0,99 veces la densidad de las perlas.
Se desvelan en el presente documento métodos de recuperación de perlas de los micropocillos de una matriz de micropocillos, comprendiendo los métodos: a) cargar la matriz de micropocillos con perlas; b) exponer la matriz de micropocillos a un campo magnético; c) hacer circular un tampón sobre la matriz de micropocillos; y d) recuperar las perlas de la matriz de micropocillos usando un campo magnético.
En algunas realizaciones, la carga comprende cargar las perlas de forma que al menos 90 % de los micropocillos de la matriz de micropocillos contengan una perla individual. En algunas realizaciones, la carga comprende cargar las perlas de forma que al menos 95 % de los micropocillos de la matriz de micropocillos contengan una perla individual. En algunas realizaciones, la carga comprende cargar las perlas de forma que aproximadamente 100% de los micropocillos de la matriz de micropocillos contengan una perla individual. En algunas realizaciones, la carga es sustancialmente uniforme a través de la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, cada perla comprende una pluralidad de oligonucleótidos fijados. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos fijados por una perla dada comprende un conjunto variado de marcadores moleculares. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos fijados por una perla dada comprende un marcador celular que es el mismo para todos los oligonucleótidos fijados a la perla. En algunas realizaciones, las pluralidades de oligonucleótidos fijados por diferentes perlas comprenden diferentes marcadores celulares. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos fijados por cada perla comprende una región de unión a diana. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos fijados por cada perla comprende una secuencia de unión a cebador universal. En algunas realizaciones, el campo magnético se genera usando un imán. En algunas realizaciones, la etapa de exposición comprende mover el campo magnético a través de la matriz de micropocillos a una tasa de entre 0,01 milímetros por segundo y 10 milímetros por segundo. En algunas realizaciones, la etapa de exposición comprende mover el campo magnético a través de la matriz de micropocillos a una tasa de aproximadamente 0,5 milímetros por segundo. En algunas realizaciones, la etapa de exposición comprende exponer la matriz de micropocillos a un campo magnético que tiene líneas de campo que forman un ángulo no perpendicular con respecto al plano del sustrato. En algunas realizaciones, las líneas de campo forman un ángulo de entre 45 grados y 80 grados con respecto al plano del sustrato. En algunas realizaciones, la etapa de exposición comprende extraer las perlas en los pocillos de la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, el tampón comprende un tampón de lisis. En algunas realizaciones, el tampón comprende un tampón de lavado. En algunas realizaciones, la etapa de hacer circular no retira sustancialmente las perlas de los micropocillos de la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, la etapa de hacer circular mueve las perlas en los micropocillos de la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, la etapa de recuperación comprende recuperar las perlas con un imán. En algunas realizaciones, la etapa de recuperación recupera al menos 85 % de las perlas de la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, la etapa de recuperación recupera al menos 95 % de las perlas de la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, el método comprende además ajustar la viscosidad del tampón para mejorar la eficiencia de recuperación de perlas. En algunas realizaciones, la viscosidad del tampón se ajusta a entre aproximadamente 1,2 veces la del agua y aproximadamente 10 veces la del agua. En algunas realizaciones, el método comprende además ajustar la densidad del tampón para mejorar la eficiencia de recuperación de perlas. En algunas realizaciones, la densidad del tampón se ajusta a entre aproximadamente 0,8 veces y aproximadamente 0,99 veces la densidad de las perlas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las novedosas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá un mejor entendimiento de las características y ventajas de la presente invención por referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos de los cuales:
La FIG. 1 ilustra la estructura de los oligonucleótidos fijados a las perlas, y el flujo de trabajo del ensayo para el marcado estocástico y el indexado molecular de oligonucleótidos diana de células individuales.
Las FIGS. 2A-B ilustran la carga de células y perlas en matrices de micropocillos. La FIG. 2A muestra micrografías de una matriz de micropocillos después de cargar con una suspensión diluida de células (arriba) y después de cargar con una suspensión de perlas (abajo). La FIG. 2B muestra vistas ampliadas de dos micropocillos que contienen tanto una célula individual como una perla individual.
Las FIGS. 3A-C ilustran una realización de los métodos, dispositivos y sistemas desvelados para realizar la creación en paralelo a gran escala de códigos de barras estocásticos del contenido de ARN de miles de células individuales. La FIG. 3A representa células individuales atrapadas en micropocillos junto con perlas que comprenden bibliotecas de marcadores estocásticos anclados (una célula y una perla por pocillo). La FIG. 3B representa el análisis de componentes principales de datos de códigos de barras estocásticos para células mononucleares de sangre periférica humana. La FIG. 3C representa el análisis de componentes principales de datos de códigos de barras estocásticos para una población de células raras.
Las FIGS. 4A-C ilustran el agrupamiento de datos para células individuales en mezclas controladas que contienen dos tipos distintos de células. La FIG. 4A muestra el agrupamiento de datos para una mezcla de células K562 y Ramos por el análisis de componentes principales de los datos de expresión para 12 genes. El diagrama de dispersión de dos variables muestra dos agrupaciones distintas, con una agrupación que expresa genes específicos de Ramos (CD74, CD79a, IGJ, TCL1A, SEPT9, CD27) y la otra que expresa genes específicos de K562 (CD41, GYPA, Ga TA1, GATA2, HBG1) separados por el primer componente principal (horizontal). El segundo componente principal (vertical) indica la variabilidad en la hemoglobina fetal (HBG1) dentro de las células K562. La FIG. 4B muestra un análisis de componentes principales de una mezcla que contiene un pequeño porcentaje de células Ramos en un contexto de linfocitos B primarios de un individuo sano usando un panel de 111 genes. El color de cada punto de datos indica el número total de moléculas de transcrito único detectado a través de todo el panel de genes. Un conjunto de 18 células (circuladas) de las 1.198 células muestra un perfil de expresión génica distinto con niveles de transcripción mucho más altos. La FIG. 4C es un mapa de calor que muestra niveles de expresión para cada gen en las 100 primeras células en la muestra de la FIG. 4B, clasificadas por el número total de moléculas de transcrito detectadas en el panel de genes. Las primeras 18 células, indicadas por la barra roja horizontal, expresaron preferencialmente un conjunto de genes conocidos por asociarse a linfoma folicular, como se indica por las flechas.
Las FIGS. 5A-D ilustran una realización de un esquema de amplificación y secuenciación para su uso en métodos de la presente divulgación. La FIG. 5A ilustra la amplificación por p Cr multiplexada de códigos de barras moleculares asociados a genes específicos de interés. La FIG 5B ilustra la amplificación por PCR anidada multiplexada del producto de amplificación previo que introduce un segundo cebador de secuenciación en las moléculas codificadas por barras amplificadas. La FIG. 5C ilustra una tercera amplificación por reacción de PCR que se usa para añadir secuencias de adaptador de la secuencia de longitud completa, así como un índice muestra opcional. La FIG. 5D ilustra la secuenciación de extremos emparejados de los conjugados de código de barras molecular amplificado - secuencia de genes.
La FIG. 6 proporciona una ilustración esquemática de un micropocillo que contiene una perla individual y una célula individual.
Las FIGS. 7A-B muestran micrografías de una matriz de micropocillos y los micropilares modificados usados para fabricar la matriz de micropocillos usando un proceso de micromoldeo. La FIG. 7A muestra una micrografía de una matriz de micropocillos que tiene crestas abovedadas entre micropocillos adyacentes. La FIG. 7B muestra una micrografía de la vista lateral de micropilares modificados que tienen superficies curvadas que se pueden usar para crear crestas abovedadas entre los pocillos micromoldeados.
Las FIGS. 8A-B muestran micrografías de matrices de micropocillos moldeadas con un patrón de micropilares antes y después de someter la matriz de micropilares a un proceso de reflujo. La FIG. 8A muestra una matriz de micropocillos que tiene superficies de sustrato planas entre los pocillos, como se fabrican usando un patrón de micropilares antes someterlo a un proceso de reflujo. La FIG. 8B muestra una matriz de micropocillos que tiene crestas abovedadas entre los pocillos, como se fabrica con un patrón de micropilares que había sido sometido a un proceso de reflujo.
Las FIGS. 9A-B ilustran un elemento fijo mecánico dentro del que se pueden sujetar sustratos de matrices de micropocillos, formando así una cámara de reacción o pocillo en el que se pueden pipetear muestras y reactivos para realizar experimentos de marcado estocástico multiplexado de células individuales o de creación de códigos de barras moleculares. FIG. 9A: vista en despiece ordenado que muestra las partes superior e inferior del elemento fijo y una junta elastomérica para formar un sellado a prueba de fugas con el sustrato de matrices de micropocillos. FIG. 9B: vista lateral en despiece ordenado del elemento fijo.
La FIG. 10 ilustra un elemento fijo mecánico que crea dos cámaras de reacción o pocillos cuando un sustrato de matrices de micropocillos se sujeta dentro del elemento fijo.
La FIG. 11 ilustra un elemento fijo mecánico abisagrado para facilitar los ensayos de marcado estocástico de células individuales y de creación de códigos de barras moleculares cuando se realiza manualmente. El sustrato que comprende la matriz de micropocillos se sujeta entre una junta elastomérica y el elemento fijo para crear un pocillo de reacción en el que se pueden pipetear muestras de células, muestras de perlas, y otros reactivos de ensayo.
La FIG. 12 ilustra una celda de flujo que incorporó una matriz de micropocillos y una ventana ópticamente transparente para su uso en obtención de imágenes de toda o una porción de la matriz de micropocillos. Recuadro de la FIG. 12: micrografías de matrices de micropocillos en las que un subconjunto de micropocillos contienen células y/o perlas.
La FIG. 13A ilustra ejemplos de diferentes diseños de capa fluídica para su uso en construir una celda de flujo.
Las FIGS. 13B-C proporcionan ilustraciones esquemáticas de un diseño de celda de flujo que incorpora canales de fluido de entrada y salida inclinados decrecientes en comunicación fluida con una cámara que comprende una matriz de micropocillos. FIG. 13B: vista desde arriba. FIG. 13C: vista lateral en sección transversal.
La FIG. 14A representa una vista en despiece ordenado de un ensamblaje de cartucho que incluye una celda de flujo que comprende una capa de interfase, una capa fluídica y un sustrato.
La FIG. 14B representa una vista parcialmente en despiece ordenado de un ensamblaje de cartucho en el que se han unido las capas que forman la celda de flujo (por ejemplo, una capa de interfase, una capa fluídica y un sustrato).
La FIG. 15 muestra un diseño de cartucho a modo de ejemplo.
La FIG. 16 muestra una vista en despiece ordenado de un diseño de cartucho a modo de ejemplo.
La FIG. 17 representa una vista en despiece ordenado de un diseño de celda de flujo a modo de ejemplo. La FIG. 18 representa un diseño de celda de flujo a modo de ejemplo.
La FIG. 19A ilustra una parte de celda de flujo impresa 3D que incorpora una junta tórica como característica de diseño.
La FIG. 19B ilustra una parte de celda de flujo fabricada de un material de polímero.
La FIG. 20A ilustra un enfoque de ensamblaje de cartucho en el que se sujetan juntas mecánicamente múltiples partes.
La FIG. 20B ilustra un enfoque de ensamblaje de cartucho que comprende tanto partes unidas y/o consumibles como partes adicionales que se sujetan juntas mecánicamente para formar el ensamblaje completo.
La FIG. 20C ilustra un cartucho consumible pre-ensamblado.
Las FIGS. 21A-C representan una realización de un cartucho dentro del que se empaqueta una matriz de micropocillos. FIG. 21A: Una vista del cartucho ensamblado que muestra puertos de entrada y salida, un alivio para poner un imán de recuperación en estrecha proximidad con la matriz de micropocillos, y recipientes de reactivo a bordo. FIG. 21B: Una vista parcialmente en despiece ordenado del ensamblaje de cartucho. FIG. 21C: Una vista en despiece ordenado del cartucho que ilustra (de abajo a arriba) el sustrato de matrices de micropocillos, un plástico moldeado por inyección unido al sustrato y cuerpo de cartucho que define la celda de flujo o cámara de matriz, un cuerpo de cartucho que define recipientes de muestra, reactivo o de residuos que pueden contener reactivos de ensayo precargados o almacenar reactivos gastados, y una cubierta para sellar los recipientes de reactivo y de residuos.
Las FIGS. 22A-B representan otra realización de un cartucho dentro del que se empaqueta una matriz de micropocillos. FIG. 22A: Una vista del cartucho ensamblado. FIG. 22B: Una vista en despiece ordenado del ensamblaje de cartucho que ilustra (de abajo a arriba) el sustrato de matrices de micropocillos, una capa fluídica (por ejemplo, parte de la celda de flujo) que define la celda de flujo o cámara de matriz, y un cuerpo de cartucho que define recipientes de muestra, reactivo o de residuos. En esta realización, los recipientes no son visibles externamente.
La FIG. 23A ilustra componentes de una celda de flujo o ensamblaje de cartucho que comprende 4 puertos de fluido que pueden incorporar opcionalmente conectores de puertos de fluido de entrada y salida, por ejemplo conectores roscados, conectores de Luer lock, conectores Luer slip o "slip tip", conectores de ajuste por presión, y similares.
La FIG. 23B ilustra componentes de una celda de flujo o ensamblaje de cartucho que comprende puertos de fluido diseñados para acomodar micropipetas convencionales para la introducción conveniente de fluidos. La FIG. 24A ilustra componentes de una celda de flujo o ensamblaje de cartucho que comprende puertos de fluido diseñados para acomodar micropipetas convencionales para la introducción conveniente de fluidos. La FIG. 24B ilustra una celda de flujo o ensamblaje de cartucho en el que la(s) entrada(s) en ángulo diseñadas para acomodar micropipetas convencionales pueden incorporar características rígidas o distensibles para formar un sellado sustancialmente a prueba de fugas con la punta de micropipeta.
La FIG. 24C ilustra una celda de flujo o ensamblaje de cartucho en el que la(s) entrada(s) en ángulo diseñadas para acomodar micropipetas convencionales pueden incorporar características tales como juntas tóricas para formar un sellado sustancialmente a prueba de fugas con la punta de micropipeta.
La FIG. 25A ilustra un diseño de cartucho que comprende una interfaz de punta de pipeta modular que se puede modificar independientemente del resto del diseño del cartucho.
La FIG. 25B ilustra una interfaz de punta de pipeta modular para incorporación en diseños del cartucho.
La FIG. 26 ilustra un ensamblaje de cartucho que incorpora un conector de jeringa y válvula(s) de retención, así como una interfaz de punta de pipeta y un tubo de recogida de muestras que guarda perlas después de su recuperación de la matriz de micropocillos. Puede tener dos entradas y una salida. El cartucho incorpora válvulas externas conectadas a una entrada del tubo de entrada y una salida del tubo de salida, y una interfaz de pipeta en la segunda entrada.
La FIG. 27 ilustra una variación del diseño de cartucho mostrado en la FIG. 26.
La FIG. 28 ilustra un diseño de cartucho que incorpora conectores Upchurch Nanoport™ (Upchurch Scientific, División de IDEX Health and Science, Oak Harbor, WA) para crear conexiones de bajo volumen muerto entre el tubo externo y el cartucho. El diseño de cartucho también incorpora conectores de jeringa, válvulas de retención e interfaces de punta de pipeta opcionales.
La FIG. 29A representa una vista en despiece ordenado de un diseño de cartucho que incorpora puertos de fluido (con interfaz de pipeta), canales de fluido, recipientes de fluido y válvulas de retención adyacentes a todos o algunos de los puertos de fluido o recipientes de fluido. La vista muestra una vista en despiece ordenado del cartucho y representa cuatro cilindros (rojo) que representan válvulas, una capa de interfase (arriba, verde), una capa fluídica (centro, azul) que forma la trayectoria fluídica de la celda de flujo, y la capa de sustrato (abajo, verde) que incorpora la matriz de micropocillos y que también es la base del cartucho.
La FIG. 29B representa una vista ensamblada de un diseño de cartucho que incorpora puertos de fluido (con interfaz de pipeta), canales de fluido, recipientes de fluido, una interfaz de pipeta en la entrada y la salida, un recipiente en la entrada y la salida, y una válvula que controla cada entrada y salida, y válvulas de retención adyacentes a todos o algunos de los puertos de fluido o recipientes de fluido.
La FIG. 30 proporciona una ilustración esquemática de un sistema de instrumentos para realizar un ensayo de marcado estocástico de células individuales multiplexado o de creación de códigos de barras moleculares. El sistema de instrumentos puede proporcionar una variedad de capacidades de control y análisis, y se puede empaquetar como módulos individuales o como un sistema completamente integrado. Las matrices de micropocillos se pueden integrar con celdas de flujo que son o un componente del sistema fijo o son extraíbles, o se pueden empaquetar dentro de cartuchos extraíbles que comprenden además recipientes de reactivo de ensayo precargados y otra funcionalidad.
La FIG. 31 proporciona un diagrama de bloques para un sistema de instrumentos que realiza un ensayo de marcado estocástico de células individuales multiplexado o de creación de códigos de barras moleculares. El sistema de instrumentos puede proporcionar una variedad de capacidades de control y análisis, y se puede empaquetar como módulos individuales o como un sistema completamente integrado. El ordenador de control se puede incorporar como se muestra, o conectar operativamente por un cable o interfaz inalámbrica. Las matrices de micropocillos se pueden integrar con celdas de flujo que son o un componente del sistema fijo o son extraíbles, o se pueden empaquetar dentro de cartuchos consumibles extraíbles que comprenden además recipientes de reactivo de ensayo precargados y otra funcionalidad.
La FIG. 32 ilustra una realización de un diagrama de flujo de proceso para un cartucho y sistema de instrumentos donde muestras de células, suspensiones de perlas y otros reactivos de ensayo se cargan en un cartucho consumible por el usuario y se inserta en el instrumento. Todas las etapas de proceso no enumeradas en el encabezado "Usuario" se realizan por el instrumento en un modo semiautomatizado o completamente automatizado.
La FIG. 33 ilustra otra realización de un diagrama de flujo de proceso para un cartucho y sistema de instrumentos donde muestras de células y suspensiones de perlas se cargan en un cartucho consumible por el usuario y se insertan en el instrumento. Otros reactivos de ensayo se precargan en el cartucho y/o se guardan en el instrumento. Todas las etapas de proceso no enumeradas en el encabezado "Usuario" se realizan por el instrumento en un modo semiautomatizado o completamente automatizado.
La FIG. 34 ilustra otra realización de un diagrama de flujo de proceso para un cartucho y sistema de instrumentos donde suspensiones de perlas y otros reactivos de ensayo se precargan en un cartucho consumible y/o se guardan en el instrumento. Las muestras de células se cargan en el cartucho por el usuario y se insertan en el instrumento. Todas las etapas de proceso no enumeradas en el encabezado "Usuario" se realizan por el instrumento en un modo semiautomatizado o automatizado.
La FIG. 35 ilustra otra realización más de un diagrama de flujo de proceso para un cartucho y sistema de instrumentos donde perlas y otros reactivos de ensayo se precargan en un cartucho consumible, y donde las perlas se distribuyen previamente entre los micropocillos de una matriz de micropocillos contenidos dentro del cartucho. Las muestras de células se cargan en el cartucho por el usuario y se insertan en el instrumento. Todas las etapas de proceso no enumeradas en el encabezado "Usuario" se realizan por el instrumento en un modo semiautomatizado o automatizado.
La FIG. 36 ilustra una realización de un sistema informático o procesador para proporcionar capacidades de control del instrumento y análisis de datos para el sistema de ensayo actualmente desvelado.
La FIG. 37 muestra un diagrama de bloques que ilustra un ejemplo de una arquitectura de sistema informático que se puede usar a propósito de las realizaciones de ejemplo de los sistemas de ensayo de la presente divulgación.
La FIG. 38 representa un diagrama que muestra una red con una pluralidad de sistemas informáticos, teléfonos móviles, asistentes de datos personales y almacenamiento conectado en red (NAS), que se puede usar con realizaciones de ejemplo de los sistemas de ensayo de la presente divulgación.
La FIG. 39 representa un diagrama de bloques de un sistema informático de multiprocesador que se puede usar con realizaciones de ejemplo de los sistemas de ensayo de la presente divulgación.
La FIG. 40 ilustra una realización de un diseño óptico para un sistema de iluminación para su uso en los sistemas desvelados para realizar ensayos de marcado estocástico de células individuales multiplexados y de creación de códigos de barras moleculares.
La FIG. 41 muestra datos de un estudio de sedimentación de células en el que el porcentaje de pocillos en una matriz de micropocillos que contiene células Ramos se determinó usando software de análisis de imágenes automatizado como una función del tiempo tras el llenado de una celda de flujo tal como la ilustrada en la FIG. 12 con la suspensión de células.
La FIG. 42 muestra datos de estudios de distribución de células en los que se representa el número de micropocillos que contienen un número especificado de células frente al número de células por pocillo para datos recogidos en diferentes tiempos tras el llenado de una celda de flujo tal como la ilustrada en la FIG. 12 con una suspensión de células Ramos.
La FIG. 43 muestra una comparación de datos de distribución de células con las predicciones de la estadística de Poisson. Se representa el número observado de micropocillos que contienen un número especificado de células frente al número de células por pocillo, junto con el valor calculado a partir de la distribución de Poisson.
La FIG. 44 muestra datos de un estudio de sedimentación de perlas en el que se determinó el porcentaje de pocillos en una matriz de micropocillos que contiene perlas usando software de análisis de imágenes automatizado como una función del tiempo tras el llenado de una celda de flujo tal como la ilustrada en la FIG. 12 con la suspensión de perlas.
Las FIGS. 45A-C ilustran el flujo de trabajo para el procesamiento de imágenes y el recuento automatizado de células.
La FIG. 46 muestra un ejemplo de los resultados de salida para el procesamiento de imágenes y los algoritmos de recuento automatizado de células desvelados en el presente documento.
Las FIGS. 47A muestran una imagen de campo brillante de una matriz de micropocillos que contiene células.
La FIG. 47B muestra una imagen de fluorescencia correspondiente al campo de vista mostrado en la FIG. 47A, donde las células se han precargado con calceína.
La FIG. 47C muestra una superposición de las imágenes mostradas en las FIGS. 47A y 47B.
La FIG. 48 ilustra las etapas usadas para la detección de micropocillos, identificación de perlas e identificación de células en el procesamiento de imágenes y los algoritmos de recuento automatizado de células descritos en el presente documento.
La FIG. 49A muestra una imagen de campo brillante de una matriz de micropocillos donde algunos de los micropocillos contienen perlas o células.
La FIG. 49B ilustra el resultado de realizar el procesamiento de imágenes usando detección de bordes y la transformación circular de Hough para identificar los micropocillos en la imagen de campo brillante mostrada en la FIG. 49A.
La FIG. 49C ilustra una máscara binaria creada usando la imagen procesada de la FIG. 49B, en la que las áreas fuera de los pocillos se establecen "negras" (es decir, un valor de "0") y las áreas dentro de los pocillos se establecen "blancas" (es decir, un valor de "1").
Las FIGS. 50A-C ilustran el uso de una máscara binaria para eliminar algunas partes de la imagen y centrar el posterior procesamiento y análisis de imágenes en las regiones dentro de los pocillos para identificar perlas y células.
Las FIGS. 51A-C muestran un ejemplo de los resultados de salida obtenidos usando las etapas de procesamiento de imágenes ilustradas en las FIGS. 49A-C y 50A-C.
Las FIGS. 52A-C muestran micrografías de una matriz de micropocillos con un ángulo de inclinación sobre la pared lateral fabricado de Norland Optical Adhesive 63 (NOA63). FIG. 52A: vista desde arriba. FIG. 52B: vista desde abajo. FIG. 52C: vista en sección transversal. El diámetro superior del pocillo es mayor que el diámetro inferior del pocillo.
Las FIGS. 53A-C muestran micrografías de una matriz de micropocillos con un ángulo de inclinación negativo fabricado de copolímero de olefina cíclica (COC). FIG. 53A: vista desde arriba. FIG. 53B: vista desde abajo. FIG. 53C: vista en sección transversal. El diámetro superior del pocillo es más pequeño que el diámetro inferior del pocillo.
La FIG. 54 muestra ejemplos de datos para la eficiencia de captura y recuperación de perlas para micropocillos de diferente diámetro (50 pm de profundidad, 60 pm de paso) fabricados de COC. Los pocillos mostrados tienen un ángulo de inclinación positiva.
Las FIGS. 55A-D muestran ejemplos de datos para la eficiencia de captura de perlas (FIGS. 55A y 55C) y el porcentaje de dobletes de perlas (FIGS. 55B y 55D) para micropocillos de diferente diámetro fabricados de NOA63 o COC (profundidad de pocillo = 40 pm para los pocillos adhesivos ópticos y 50 pm para los pocillos de COC).
La FIG. 56 muestra ejemplos de datos para la captura y recuperación de perlas de micropocillos de diferente diámetro fabricados de NOA63 o COC (profundidad de pocillo = 40 pm para los pocillos adhesivos ópticos, y 50 pm para los pocillos de COC).
La FIG. 57 muestra micrografías de micropocillos COC de PDMS seccionados pretratados con poli-HEMA.
Las FIGS. 58A ilustran una celda de flujo que encierra la matriz de micropocillos e incluye una entrada y salida decreciente.
La FIG. 58B ilustra las etapas del proceso de carga y recuperación: (i) carga, (ii) atrapamiento potenciado por campo magnético, (iii) lavado, y (iv) recuperación basada en campo magnético.
Las FIGS. 59A-D muestran micrografías de una matriz de micropocillos después de cada una de las etapas brevemente expuestas en la FIG. 58B. El porcentaje de pocillos que contienen una perla se indica debajo de cada imagen.
La FIG. 60 muestra ejemplos de datos generados usando procesamiento y análisis automatizado de imágenes como se describe para cuantificar el número de micropocillos que contienen perlas después de cada etapa de proceso en función de la posición sobre el sustrato.
La FIG. 61 muestra un ejemplo de datos para estudios de carga y recuperación de perlas después de diferentes etapas de proceso, que incluye la etapa de lisis, en función de la posición sobre el sustrato de micropocillos.
Las FIGS. 62A-B ilustran dos ejemplos no limitantes de diseño de celda de flujo. La FIG. 62A ilustra un diseño de celda de flujo de entrada única - salida única. La FIG. 62B ilustra un diseño de celda de flujo de entrada ramificada.
La FIG. 63 muestra una superposición de imágenes de celdas de flujo con datos de eficiencia de llenado de perlas para el diseño de celda de flujo de entrada única - salida única.
La FIG. 64 muestra una superposición de imágenes de celdas de flujo con datos de eficiencia de llenado de perlas para el diseño de celda de flujo de entrada ramificada.
La FIG. 65 muestra una superposición de imágenes de celdas de flujo con datos de eficiencia de llenado de perlas para el diseño de celda de flujo de entrada única - salida única, donde se usaron inyecciones de aire entre las etapas de llenado de líquido.
La FIG. 66 resume los datos de estudios de eficiencia de llenado de perlas.
La FIG. 67 proporciona una visión general de alto nivel del flujo de trabajo del ensayo para marcador estocástico de células individuales.
La FIG. 68 resume los datos de un estudio de prueba de concepto para demostrar la carga de células, carga de perlas y recuperación de perlas de una matriz de micropocillos encerrada en una celda de flujo.
La FIG. 69 resume los datos de un estudio de prueba de concepto para demostrar la carga de células, carga de perlas y recuperación de perlas de una matriz de micropocillos encerrada en una celda de flujo.
La FIG. 70A muestra ejemplos de datos de carga de perlas en función de la posición a lo largo de la celda de flujo para una celda de flujo de 1 mm de espesor en diferentes etapas en el procedimiento de ensayo.
La FIG. 70B muestra ejemplos de datos de carga de perlas en función de la posición a lo largo de la celda de flujo para una celda de flujo de 2 mm de espesor en diferentes etapas en el procedimiento de ensayo.
La FIG. 71A muestra ejemplos de datos para el porcentaje de perlas perdidas durante la etapa de lisis o recuperadas al final del proceso en función de la posición a lo largo de una celda de flujo de 1 mm de profundidad. La FIG. 71B muestra ejemplos de datos para el porcentaje de perlas perdidas durante la etapa de lisis o recuperadas al final del proceso en función de la posición a lo largo de una celda de flujo de 1 mm de profundidad. Las FIGS. 72A-F muestran ejemplos de datos para la carga de células en función de la posición a lo largo de la celda de flujo en diferentes etapas en el procedimiento de ensayo.
La FIG. 73 muestra datos para el porcentaje de pocillos que contienen perlas en función de la posición a lo largo de la longitud de la celda de flujo en diversas etapas del proceso de ensayo.
La FIG. 74 muestra ejemplos de datos para el porcentaje de pocillos que contienen perlas (promediado en todo el conjunto de micropocillos) después de cada etapa de proceso.
Las FIGS. 75A-C muestran datos para la carga de células después de la carga de células inicial y la etapa de sedimentación (FIG. 75A), después de la carga de perlas inicial y la etapa de sedimentación (FIG. 75b ), y después de que las perlas se bajen posteriormente con el imán (FIG. 75C).
La FIG. 76 proporciona un resumen de la carga de células y los datos de carga de perlas en diferentes etapas en el proceso.
Las FIGS. 77A-B muestran ejemplos de datos que comparan la carga de perlas en diferentes etapas en el procedimiento de ensayo cuando se usa tampón de lisis con y sin DTT añadido.
Las FIGS. 78A-B muestran ejemplos de datos que comparan el impacto de la distribución de perlas asistida por campo magnético sobre la carga de perlas en diferentes etapas en el procedimiento de ensayo cuando el tampón de lisis incluye DTT.
La FIG. 79A muestra ejemplos de datos para el porcentaje de pocillos que contienen perlas después de la etapa de carga de perlas y después de la recuperación de perlas.
La FIG. 79B proporciona una tabla de datos estadísticos del análisis para la carga de células y la carga de perlas en un experimento individual.
La FIG. 80A muestra un mapa de calor para la tasa de llenado de perlas (% de pocillos con perlas) en función de la posición dentro de la celda de flujo después de la etapa de carga de perlas.
La FIG. 80B muestra un mapa de calor para la tasa de llenado de perlas (% de pocillos con perlas) en función de la posición dentro de la celda de flujo después de la etapa de recuperación de perlas.
La FIG. 80C muestra un mapa de calor de la recuperación de perlas porcentaje (1 - perlas restantes/perlas cargadas)*100 %) en función de la posición con la celda de flujo después de la etapa de recuperación de perlas. La FIG. 81 muestra una micrografía de una matriz de micropocillos a modo de ejemplo con superficies redondeadas entre los pocillos.
Las FIGS. 82A-B muestran una comparación de los flujos de trabajo del ensayo convencional ("células primero") y alternativo ("perlas primero").
Las FIGS. 83A-B muestran varias variaciones de los flujos de trabajo del ensayo convencional y alternativo que han sido evaluados.
Las FIGS. 84A-B muestran una comparación de la eficiencia de carga de perlas para cada etapa en los flujos de trabajo del ensayo "perlas primero" y "células primero", respectivamente.
La FIG. 85 muestra una imagen compuesta de la celda de flujo que comprende una matriz de micropocillos. El rectángulo en la esquina inferior derecha de la imagen compuesta muestra una región de elevada impedancia de flujo en una rama de salida de la celda de flujo.
Las FIGS. 86A-C muestran mapas de calor de la eficiencia de carga de perlas individuales en función de la posición dentro de la celda de flujo para diferentes etapas del flujo de trabajo del ensayo "perlas primero".
Las FIGS. 87A-F muestran una comparación de la eficiencia de captura de células para los flujos de trabajo del ensayo "perlas primero" (FIGS. 87A-C) y "células primero" (FIGS. 87D-F).
Las FIGS. 88A-B muestran gráficos de la frecuencia de una importante métrica de rendimiento del ensayo, es decir, el porcentaje de células asociadas a una perla individual dentro de la matriz de micropocillos.
Las FIGS. 89A-D muestran ejemplos de datos para una importante métrica de rendimiento del ensayo, es decir, el porcentaje de micropocillos que contienen una perla individual antes de la etapa de lisis celular.
Las FIGS. 90A-B muestran gráficos de la eficiencia de carga de perlas frente al número de células en el micropocillo para los flujos de trabajo del ensayo "perla primero" (FIG. 90A) y "células primero" (FIG. 90B), respectivamente.
La FIG. 91 ilustra un diseño para una interfaz de punta de pipeta que utiliza una junta de ajuste por fricción entre una punta de pipeta y un cartucho, así como una válvula de pico de pato en la salida del cartucho.
La FIG. 92 muestra una vista lateral en sección transversal de una interfaz de punta de pipeta que utiliza una junta de ajuste por fricción entre una punta de pipeta y un cartucho, así como una válvula de pico de pato en la salida del cartucho.
La FIG. 93 muestra una interfaz de punta de pipeta alternativa que tiene una junta distensible moldeada y una válvula de dispensación x-fram.
La FIG. 94 muestra una comparación resumen de dos diseños de interfaz de punta de pipeta.
Las FIGS. 95A-B ilustran las etapas de los flujo de trabajo del ensayo convencional "perlas primero" (FIG. 95A) y el flujo de trabajo del ensayo modificado basado en Ficoll (FIG. 95B).
Las FIGS. 96A-B muestran ejemplos de datos que ilustran la eficiencia de carga de perlas mejorada lograda usando las etapas de lavado de perlas basadas en Ficoll en vez de una técnica de desplazamiento de aire con sustratos de micropocillos recubiertos con SiO2.
Las FIGS. 97A-F muestran ejemplos de datos para la eficiencia de captura de células lograda usando un flujo de trabajo del ensayo basado en Ficoll.
La FIG. 98 resume los valores estimados de densidad y viscosidad de perlas magnéticas, células y disoluciones usadas en un flujo de trabajo del ensayo basado en Ficoll.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se desvelan en el presente documento métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y kits para la creación de códigos de barras moleculares de una pluralidad de moléculas diana en células individuales.
Visión general del marcado estocástico para la creación de códigos de barras moleculares y recuento:
La metodología subyacente a los métodos, dispositivos y sistemas de la presente divulgación utiliza una estrategia de Poisson recursiva para implementar ensayos de creación de códigos de barras moleculares de células individuales para grandes números de células individuales. Por ejemplo, dianas moleculares de células individuales pueden ser estocásticamente marcadas con un marcador celular (también denominado un índice celular, código de barras, o marcador) y un marcador molecular (también denominado un índice molecular, código de barras, o marcador) asociando aleatoriamente células individuales con perlas individuales, en donde cada perla individual comprende una pluralidad de marcadores estocásticos fijados. Los marcadores estocásticos fijados a una perla dada se pueden usar para marcar aleatoriamente dianas de proteína o ácido nucleico de una célula asociada. En algunas realizaciones, las células individuales se distribuyen aleatoriamente en una pluralidad de micropocillos (por ejemplo, una matriz de micropocillos). Una biblioteca combinatoria de perlas, cada una que comprende una pluralidad de marcadores estocásticos anclados, también se distribuye aleatoriamente en la pluralidad de micropocillos de manera que un subconjunto de los micropocillos contenga tanto una célula individual como una perla individual. En algunas realizaciones, las perlas se depositan antes de la deposición de las células. En otras realizaciones, las perlas se depositan después de la deposición de las células. Los marcadores estocásticos que comprenden los códigos de barras celulares y moleculares pueden comprender además una región de reconocimiento diana que es capaz de fijar a o hibridar con dianas moleculares, por ejemplo, moléculas de ácidos nucleicos. Las moléculas diana pueden ser liberadas de cada célula, por ejemplo lisando la célula, y entonces se fijan a o hibridan con los marcadores estocásticos en una perla correspondiente. En algunas realizaciones, las moléculas diana son liberadas de las células por escisión, por ejemplo escisión enzimática. En algunas realizaciones, por ejemplo, cuando las moléculas diana son moléculas de ARNm, las perlas se recuperan de los micropocillos tras la hibridación de las moléculas de ARNm diana con los marcadores estocásticos, y se reúnen antes de realizar las reacciones de transcripción inversa, amplificación y secuenciación.
En algunas realizaciones, la pluralidad de marcadores estocásticos fijados a una perla dada comprende un marcador celular que es idéntico a todos los marcadores estocásticos fijados a la perla, mientras que los marcadores celulares para las pluralidades de marcadores estocásticos fijados a diferentes perlas son diferentes. En algunas realizaciones, la pluralidad de marcadores estocásticos fijados a una perla dada comprende un conjunto variado de marcadores moleculares seleccionados de un conjunto que comprende un número especificado de secuencias de marcadores moleculares únicos. En algunas realizaciones, la pluralidad de marcadores estocásticos fijados a una perla dada puede comprender la misma región de reconocimiento diana. En algunas realizaciones, la pluralidad de marcadores estocásticos fijados a una perla dada puede comprender dos o más regiones de reconocimiento diana diferentes.
En algunas realizaciones, la biblioteca de perlas tiene una diversidad de marcadores celulares (es decir, varias secuencias de marcadores celulares únicos) que es al menos uno o dos órdenes de magnitud superior al número de células a marcar, de forma que es muy alta la probabilidad que cada célula esté emparejada con un código de barras de células único. Por ejemplo, la probabilidad que cada célula esté emparejada con un código de barras de células único puede ser superior a 80 %, superior a 90 %, superior a 95 %, superior a 99 %, superior a 99,9 %, superior a 99,99 %, o superior a 99,999 %.
En algunas realizaciones, la diversidad de marcadores moleculares (es decir, el número de secuencias de marcadores moleculares únicos) para la pluralidad de marcadores estocásticos fijados a una perla es al menos uno o dos órdenes de magnitud superior al número estimado de apariciones de una especie de molécula diana a marcar, de forma que es muy alta la probabilidad de que cada aparición de una molécula diana (por ejemplo, una molécula de ARNm) dentro de una célula se marque únicamente. Por ejemplo, la probabilidad de que cada aparición de una molécula diana esté emparejada con un código de barras molecular único puede ser superior a 80 %, superior a 90 %, superior a 95 %, superior a 99 %, superior a 99,9 %, superior a 99,99 %, o superior a 99,999 %. En estas realizaciones, se puede contar (o estimar) el número de apariciones de una especie de molécula diana en cada célula determinando el número de secuencias de marcadores moleculares únicos que están unidas a la secuencia de la molécula diana. En muchas realizaciones, la etapa de determinación se puede realizar a través de secuenciación de una biblioteca amplificada de moléculas diana marcadas (o sus secuencias complementarias).
En algunas realizaciones, la diversidad de marcadores moleculares para la pluralidad de marcadores estocásticos fijados a una perla es comparable a o baja en comparación con el número estimado de apariciones de una especie de molécula diana a marcar, de forma que existe una significativa probabilidad de que las múltiples apariciones de un tipo dado de molécula diana se marquen por más de una copia de un marcador molecular dado. En estas realizaciones, el número de moléculas diana en cada célula se puede calcular a partir del número de secuencias de marcadores moleculares únicos fijadas a la secuencia de la molécula diana con el uso de estadística de Poisson.
En muchas realizaciones, las moléculas diana de interés son moléculas de ARNm expresadas dentro de una célula individual. Puesto que las copias de ADNc de toda o una porción de las moléculas de ARNm poliadeniladas en cada célula se archivan covalentemente sobre la superficie de una perla correspondiente, se puede analizar posteriormente cualquier selección de transcritos de genes. Se puede reconstruir un perfil de expresión génica digital para cada célula cuando los transcritos codificados por barras se secuencian y se asignan a la célula de origen (basándose en el marcador celular identificado) y se cuentan (basándose en el número de marcadores moleculares únicos identificados). Una descripción a modo de ejemplo de la metodología de ensayo se puede encontrar en Fan, et al., "Combinatorial Labeling of Single Cells for Gene Expression Cytometry", Science 347(6222):628; y Science 347(6222):1258367.
Dianas de ensayo, muestras, componentes y métodos:
Moléculas diana: Moléculas diana adecuadas para análisis por los métodos, dispositivos y sistemas desvelados incluyen moléculas de oligonucleótido, moléculas de ADN, moléculas de ARN, moléculas de ARNm, moléculas de microARN, moléculas de ARNt, y similares. En algunas realizaciones, las moléculas diana pueden ser péptidos o proteínas. Las moléculas diana pueden ser cadenas de polipéptidos pesadas y ligeras de anticuerpos, y/o cadenas de polipéptidos de receptores (por ejemplo, las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T).
Muestras de células: Muestras adecuadas para el análisis por los métodos, dispositivos y sistemas desvelados incluyen cualquier muestra que comprende una pluralidad de células, por ejemplo, cultivos celulares, muestras de sangre, muestras de tejido en los que la matriz extracelular ha sido digerida o disuelta para liberar células individuales en suspensión, y similares. La pluralidad de células puede derivar de una única muestra, o de dos o más muestras que han sido combinadas, y pueden comprender una pluralidad de células del mismo tipo, o una pluralidad de células de tipo mixto.
En algunas realizaciones, cualquier célula, estructura subcelular, u otra partícula que contiene ácido nucleico puede comprender muestras adecuadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las muestras pueden comprender orgánulos celulares (por ejemplo, mitocondrias, núcleos, exosomas, etc.), liposomas, agrupaciones de células, u organismos multicelulares, y similares.
En algunas realizaciones, las células son células normales, por ejemplo, células humanas en diferentes etapas de desarrollo, o células humanas de diferentes órganos o tipos de tejido (por ejemplo, glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas, células epiteliales, células endoteliales, neuronas, células de la glía, fibroblastos, células de músculo esquelético, células de músculo liso, gametos, o células del corazón, pulmones, cerebro, hígado, riñón, bazo, páncreas, timo, vejiga, estómago, colon, intestino delgado). En algunas realizaciones, las células pueden ser células madre humanas no diferenciadas, o células madre humanas que han sido inducidas para diferenciarse. En algunas realizaciones, las células pueden ser células humanas fetales. Las células humanas fetales se pueden obtener de una madre embarazada del feto.
En algunas realizaciones, las células son células raras. Una célula rara puede ser, por ejemplo, una célula tumoral circulante (CTC), célula epitelial circulante, célula endotelial circulante, célula endometrial circulante, célula madre circulante, célula madre, célula madre no diferenciada, célula madre de cáncer, célula de la médula ósea, célula progenitora, macrófago espumoso, célula mesenquimatosa, trofoblasto, célula del sistema inmunitario (hospedador o injerto), fragmento celular, orgánulo celular (por ejemplo, mitocondrias o núcleos), célula infectada patógena, y similares.
Las células tumorales circulantes pueden ser células cancerosas. Las CTCs pueden ser CD45-. Las CTCs pueden expresar citoqueratinas tales como 8, 18, y/o 19, o ser negativas para citoqueratinas. Las CTCs pueden ser células madre de cáncer y/o células que experimentan transición de epitelial a mesenquimatosa (EMT). Una CTC puede ser una célula metastásica.
En algunas realizaciones, la muestra comprende una célula inmunitaria. Una célula inmunitaria puede incluir, por ejemplo, linfocito T, linfocito B, célula madre linfoide, célula progenitora mieloide, linfocito, granulocito, linfocito B progenitor, linfocito T progenitor, linfocito citolítico espontáneo, célula Tc, La célula, célula plasmática, célula de memoria, neutrófilo, eosinófilo, basófilo, mastocito, monocito, célula dendrítica y/o macrófago, o cualquier combinación de los mismos.
Una célula puede ser un linfocito T. Un linfocito T puede ser un clon de linfocito T, que se puede referir a linfocitos T derivados de un linfocito T individual o los que tienen TCRs idénticos. Un linfocito T puede ser parte de una línea de linfocitos T que puede incluir clones de linfocitos T y poblaciones mixtas de linfocitos T con diferentes TCRs, todos los cuales pueden reconocer la misma diana (por ejemplo, un antígeno, un tumor, o un virus). Los linfocitos T se pueden obtener de varias fuentes, que incluyen células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglio linfático, tejido de bazo y tumores. Los linfocitos T se pueden obtener de una unidad de sangre recogida de un sujeto, tal como un individuo o paciente, usando técnicas de separación de Ficoll. Las células de la sangre circulante de un individuo se pueden obtener por aféresis o leucaféresis. El producto de la aféresis puede comprender linfocitos, que incluyen linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. Las células se pueden lavar y resuspender en medios para aislar la célula de interés.
Los linfocitos T se pueden aislar de linfocitos de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y empobreciendo los monocitos, por ejemplo, por centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL™. Se puede aislar adicionalmente una subpoblación específica de linfocitos T, tal como linfocitos T CD28+, CD4+, CDC, CD45RA+ y CD45RO+, por técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, los linfocitos T se pueden aislar por incubación con perlas conjugadas con anti-CD3/anti-CD28 (es decir, 3*28), tales como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, o XCYTE DYNABEADS™ durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de los linfocitos T deseados. Las células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T y linfocitos B) pueden ser específicas de antígeno (por ejemplo, específicas para un tumor.
En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula presentadora de antígenos (APC), tal como un linfocito B, un linfocito B activado de un ganglio linfático, una célula linfoblastoide, un linfocito B en reposo, o un linfocito B neoplásico, por ejemplo de un linfoma. Una APC se puede referir a un linfocito B o una célula dendrítica folicular que expresa al menos una de las proteínas BCRC sobre su superficie.
En algunas realizaciones, las células son células no humanas, por ejemplo, otros tipos de células de mamífero (por ejemplo, ratón, rata, cerdo, perro, vaca, o caballo). En algunas realizaciones, las células son otros tipos de animal o células vegetales. En otras realizaciones, las células pueden ser cualquier célula procariota o eucariota.
En algunas realizaciones, las células se clasifican antes de asociar una célula con una perla. Por ejemplo, las células se pueden clasificar por citometría de flujo activada por fluorescencia o citometría de flujo activada magnéticamente, o más, en general, por citometría de flujo. Las células se pueden filtrar por tamaño. En algunos casos, un concentrado contiene las células a asociar a las perlas. En algunos casos, el flujo continuo contiene las células a asociar a las perlas.
Cuando se cargan las células, la concentración de la suspensión de células (es decir, el número de células por mL) se ajusta normalmente tal que sea muy pequeña la probabilidad de tener más de una célula sedimentada en un micropocillo dado. Normalmente, la concentración de la suspensión de células se ajustará tal que el volumen de suspensión de células usado para carga, por ejemplo una matriz de micropocillos, contenga aproximadamente un décimo del número de células que el número de pocillos en la matriz de micropocillos. La probabilidad que más de un célula sedimente en un micropocillo dado está gobernada por la estadística de Poisson.
Estructura química de marcadores estocásticos: En algunas realizaciones de los métodos desvelados, los marcadores estocásticos (también denominados códigos de barras, marcadores, o índices) usados para estudios de creación de códigos de barras moleculares de células individuales comprenden oligonucleótidos, por ejemplo, oligodesoxirribonudeótidos (ADN), oligorribonucleótidos (ARN), ácido nucleico peptídico (PNA), polímeros sustituidos con ARN 2'-O-metilo, polímeros de ácido nucleico bloqueado (LNA), polímeros de ácido nucleico en puente (BNA), y similares.
Los marcadores estocásticos se pueden unir a soportes sólidos: En muchas realizaciones, los marcadores estocásticos usados en los métodos desvelados se pueden anclar a perlas, por ejemplo, a perlas de resina de síntesis, u otros soportes sólidos como se describirá más abajo en más detalle. Como se usa en el presente documento, las expresiones "anclado", "fijado" y "inmovilizado" se usan indistintamente, y se pueden referir a medios covalentes o no covalentes para fijar marcadores estocásticos a soportes sólidos tales como perlas. Un ejemplo no limitante de la estructura de marcadores estocásticos se ilustra esquemáticamente en la FIG. 1. En esta realización, los marcadores estocásticos comprenden una pluralidad de oligonucleótidos modificados por 5'-amina fijados a una perla. Los oligonucleótidos comprenden un grupo amina en 5', un cebador universal, un marcador celular, un marcador molecular, y una región de unión a diana. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden comprender opcionalmente además uno o más marcadores adicionales, por ejemplo, un marcador de muestra para su uso en el marcado de todas las células de una muestra dada cuando dos o más muestras se procesan simultáneamente. En algunas realizaciones, las secuencias de oligonucleótidos de marcadores estocásticos se pueden unir a un soporte sólido en su extremo 5'. En algunas realizaciones, las secuencias de oligonucleótidos de marcadores estocásticos se pueden unir a un soporte sólido en su extremo 3'.
Los marcadores estocásticos pueden comprender uno o más marcadores universales: En algunas realizaciones, los marcadores estocásticos usados en los métodos desvelados, composiciones, dispositivos, kits y sistemas pueden comprender uno o más marcadores universales. En algunas realizaciones, el uno o más marcadores universales pueden ser el mismo para todos los oligonucleótidos en el conjunto de oligonucleótidos fijados a una perla dada. En algunas realizaciones, el uno o más marcadores universales pueden ser el mismo para todos los oligonucleótidos fijados a una pluralidad de perlas. En algunas realizaciones, un marcador universal puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridarse con un cebador de secuenciación. Los cebadores de secuenciación se pueden usar para la secuenciación de oligonucleótidos que comprenden un marcador universal. Los cebadores de secuenciación (por ejemplo, cebadores de secuenciación universales) pueden comprender cebadores de secuenciación asociados a plataformas de secuenciación de alto rendimiento. En algunas realizaciones, un marcador universal puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridarse con un cebador de PCR. En algunas realizaciones, el marcador universal puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridarse con un cebador de secuenciación y un cebador de PCR. La secuencia de ácidos nucleicos del marcador universal que es capaz de hibridarse con un cebador de secuenciación o de PCR se puede denominar un sitio de unión al cebador. Un marcador universal puede comprender una secuencia que se puede usar para iniciar la transcripción del oligonucleótido. Un marcador universal puede comprender una secuencia que se puede usar para la extensión del oligonucleótido o una región dentro del oligonucleótido. Un marcador universal puede tener al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Un marcador universal puede comprender al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Un marcador universal puede tener como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un conector escindible o nucleótido modificado puede ser parte de la secuencia de marcador universal para permitir que los oligonucleótidos del marcador estocástico se escindir del soporte sólido.
Los marcadores estocásticos pueden comprender un marcador celular: En algunas realizaciones, los marcadores estocásticos pueden comprender un marcador celular, por ejemplo una secuencia de ácidos nucleicos que proporciona información para determinar qué ácido nucleico diana se origino de qué célula. En muchas realizaciones, el marcador celular es idéntico para todos los oligonucleótidos fijados a una perla dada o soporte sólido, pero diferente para diferentes perlas o soportes sólidos. En algunas realizaciones, al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de los oligonucleótidos sobre el mismo soporte sólido pueden comprender el mismo marcador celular. En algunas realizaciones, al menos 60 % de los oligonucleótidos sobre el mismo soporte sólido pueden comprender el mismo marcador celular. En alguna realización, al menos 95 % de los oligonucleótidos sobre el mismo soporte sólido pueden comprender el mismo marcador celular. En algunas realizaciones, puede tener tanto como 103 o más secuencias de marcadores celulares únicos representados en una pluralidad de perlas o soportes sólidos. En algunas realizaciones, puede tener tanto como 104 o más secuencias de marcadores celulares únicos representados en una pluralidad de perlas o soportes sólidos. En algunas realizaciones, puede tener tanto como 105 o más secuencias de marcadores celulares únicos representados en una pluralidad de perlas o soportes sólidos. En algunas realizaciones, puede tener tanto como 106 o más secuencias de marcadores celulares únicos representados en una pluralidad de perlas o soportes sólidos. Un marcador celular puede tener al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Un marcador celular puede tener como máximo aproximadamente 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o menos nucleótidos de longitud. Un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nucleótidos. Un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 nucleótidos. Un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.
Los marcadores celulares pueden comprender códigos de corrección de errores: En algunas realizaciones, el marcador celular puede comprender además un conjunto único de sub-secuencias de ácido nucleico de longitud definida, por ejemplo 7 nucleótidos cada una (equivalente al número de bits usados en algunos códigos de corrección de errores de Hamming), que se diseñan para proporcionar capacidad de corrección de errores. En algunas realizaciones, el conjunto de sub-secuencias de corrección de errores comprende 7 secuencias de nucleótidos diseñadas tal que cualquier combinación de secuencias por parejas en el conjunto presente una "distancia genética" definida (o número de bases desapareadas), por ejemplo, se puede diseñar un conjunto de sub-secuencias de corrección de errores que presente una distancia genética de 3 nucleótidos. En este caso, la revisión de las secuencias de corrección de errores en el conjunto de datos de secuencia para moléculas de ácidos nucleicos diana marcadas (descritas más completamente más adelante) puede permitir que se detecten o corrijan los errores de amplificación o secuenciación. En algunas realizaciones, la longitud de las sub-secuencias de ácido nucleico usadas para crear códigos de corrección de errores puede variar, por ejemplo, pueden tener 3 nucleótidos, 7 nucleótidos, 15 nucleótidos, o 31 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, se pueden usar sub-secuencias de ácido nucleico de otras longitudes para crear códigos de corrección de errores.
Los marcadores celulares pueden comprender dos o más subunidades: En algunas realizaciones, el marcador celular puede comprender un ensamblaje de dos o más subunidades (también denominadas subpartes o componentes) que se ensamblan (o sintetizan) en un modo combinatorio de conjunto fraccionado para crear un gran número de secuencias de marcadores celulares únicos en un número mínimo de etapas de ensamblaje o síntesis. Por ejemplo, tres rondas de conjunto fraccionado realizado usando un conjunto de 6 subunidades de marcador celular único darán 63 = 216 secuencias de marcadores celulares únicos, donde cada marcador celular comprende un ensamblaje de tres subunidades. Más generalmente, una secuencia de marcador celular que comprende subunidades M que se han ensamblado en un modo combinatorio de conjunto fraccionado usando un conjunto de N subunidades únicas en cada etapa dará NM combinaciones únicas. En algunas realizaciones, donde los marcadores estocásticos son oligonucleótidos, las secuencias de subunidades celulares se pueden ensamblar a través del uso de reacciones de extensión o ligación de polimerasa. En algunas realizaciones, se pueden usar una o más secuencias conectoras para facilitar el ensamblaje de las subunidades de la secuencia de marcador celular.
Los marcadores estocásticos pueden comprender un marcador molecular. Un marcador molecular puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que proporciona información para identificar el tipo específico de especie de ácido nucleico diana hibridada con el oligonucleótido. Un marcador molecular puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que proporciona un contador para la aparición específica de la especie de ácido nucleico diana hibridada con el oligonucleótido. En muchas realizaciones, un conjunto variado de marcadores moleculares está unido a una perla dada. En algunas realizaciones, puede tener tanto como 106 o más secuencias de marcadores moleculares únicos fijados a una perla dada. En algunas realizaciones, puede tener tanto como 105 o más secuencias de marcadores moleculares únicos fijados a una perla dada. En algunas realizaciones, puede tener tanto como 104 o más secuencias de marcadores moleculares únicos fijados a una perla dada. En algunas realizaciones, puede tener tanto como 103 o más secuencias de marcadores moleculares únicos fijados a una perla dada. En algunas realizaciones, puede tener tanto como 102 o más secuencias de marcadores moleculares únicos fijados a una perla dada. Un marcador molecular puede tener al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Un marcador molecular puede tener como máximo aproximadamente 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o menos nucleótidos de longitud.
Los marcadores estocásticos pueden comprender una región de unión a diana: En algunas realizaciones, las regiones de unión a diana pueden comprender una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida específicamente con un ácido nucleico diana (por ejemplo, un ácido nucleico celular a analizar), por ejemplo con una secuencia de genes específica. En algunas realizaciones, una región de unión a diana puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que se puede fijar (por ejemplo, hibridar) a una localización específica de un ácido nucleico diana específico. En algunas realizaciones, la región de unión a diana puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridarse de forma específica con un nucleótido protuberante del sitio de restricción (por ejemplo, un nucleótido protuberante de extremos cohesivos de EcoRI). El marcador estocástico se puede ligar entonces a cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia complementaria al nucleótido protuberante del sitio de restricción. En algunas realizaciones, una región de unión a diana puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos diana no específica. Una secuencia de ácidos nucleicos diana no específica se puede referir a una secuencia que se puede unirse a múltiples ácidos nucleicos diana, independiente de la secuencia específica del ácido nucleico diana. Por ejemplo, la región de unión a diana puede comprender una secuencia de multímero al azar, o una secuencia de oligodT que se hibrida con la cola de poli-A en moléculas de ARNm (FIG. 1). Una secuencia de multímero al azar puede ser, por ejemplo, un dímero al azar, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, septámero, octámero, nonámero, decámero, o secuencia de multímero superior de cualquier longitud. En algunas realizaciones, una región de unión a diana puede tener al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una región de unión a diana puede tener como máximo aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Una región de unión a diana puede comprender cualquier número de nucleótidos dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente una región de unión a diana puede tener aproximadamente 18 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, la región de unión a diana es la misma para todos los oligonucleótidos fijados a una perla dada. En algunas realizaciones, las regiones de unión a diana para la pluralidad de oligonucleótidos fijados a una perla dada pueden comprender dos o más secuencias de unión a diana diferentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las regiones de unión a diana para la pluralidad de oligonucleótidos fijados a una perla dada pueden comprender una mezcla de secuencias de oligo-dT y copias de una secuencia específica de diana única. En algunas realizaciones, las regiones de unión a diana para la pluralidad de oligonucleótidos fijados a una perla dada pueden comprender una mezcla de una secuencia de oligo-dT y copias de dos secuencias específicas de diana diferentes. En algunas realizaciones, las regiones de unión a diana para la pluralidad de oligonucleótidos fijados a una perla dada pueden comprender una mezcla de una secuencia de oligo-dT y copias de tres secuencias específicas de diana diferentes. En general, las regiones de unión a diana para la pluralidad de oligonucleótidos fijados a una perla dada pueden comprender una mezcla de entre una y cien, o más, secuencias de unión a diana diferentes, que incluyen, pero no se limitan a, secuencias específicas de diana, secuencias de multímeros al azar, secuencias capaces de hibridación específica con un nucleótido protuberante del sitio de restricción, o secuencias de oligo-dT, en cualquier combinación de secuencias y en cualquier combinación de proporciones relativas.
Marcadores estocásticos anclados a perlas: En algunas realizaciones, los marcadores estocásticos desvelados en el presente documento se pueden unir a soportes sólidos tales como perlas. Como se usa en el presente documento, los términos "anclado", "fijado" e "inmovilizado" se usan indistintamente, y se pueden referir a medios covalentes o no covalentes para fijar marcadores estocásticos a soportes sólidos tales como perlas. En algunas realizaciones, los marcadores estocásticos se pueden inmovilizar dentro de un pequeño volumen de reacción, por ejemplo, fijados a una superficie en un pocillo o micropocillo, o a una forma diferente de soporte sólido en vez de fijados a una perla.
Los marcadores estocásticos presintetizados se pueden unir a perlas u otros soportes sólidos a través de cualquiera de una variedad de técnicas de inmovilización que implican pares de grupos funcionales sobre el soporte sólido y el oligonucleótido. En algunas realizaciones, el grupo funcional del oligonucleótido y el grupo funcional del soporte sólido se seleccionan individualmente del grupo que consiste en biotina, estreptavidina, amina(s) primaria(s), carboxilo(s), hidroxilo(s), aldehído(s), cetona(s), y cualquier combinación de los mismos. Un oligonucleótido de marcador estocástico se puede anclar a un soporte sólido, por ejemplo, acoplando (por ejemplo, usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) un grupo amino de 5' sobre el oligonucleótido al grupo carboxilo del soporte sólido funcionalizado. Los oligonucleótidos no acoplados residuales se pueden retirar de la mezcla de reacción realizando múltiples etapas de aclarado. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos del marcador estocástico y soporte sólido se unen indirectamente por moléculas conectoras (por ejemplo, moléculas de hidrocarburo funcionalizado corto o moléculas de poli(óxido de etileno)) usando químicas de unión similares. En algunas realizaciones, los conectores pueden ser conectores escindibles, por ejemplo conectores lábiles a ácidos o conectores fotoescindibles.
En alguna realización, los marcadores estocásticos se sintetizan sobre soportes sólidos tales como perlas de resina de síntesis usando cualquiera de varias técnicas de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, los nucleótidos individuales se pueden acoplar en el modo escalonado al oligonucleótido anclado en crecimiento. En algunas realizaciones, una secuencia presintetizada corta (o bloque) de varios oligonucleótidos se puede acoplar al oligonucleótido anclado en crecimiento. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos se pueden sintetizar intercalando reacciones de acoplamiento escalonadas o de bloques con uno o más rondas de síntesis de conjuntos fraccionados, en la que el conjunto total de perlas de síntesis se divide en varios conjuntos individuales más pequeños que entonces se someten cada uno a una reacción de acoplamiento diferente, seguido por recombinación y mezcla de los conjuntos individuales para aleatorizar la secuencia de oligonucleótidos en crecimiento a través del conjunto total de perlas. La síntesis de conjuntos fraccionados es un ejemplo de un proceso de síntesis combinatorio en el que se sintetizan un número máximo de compuestos químicos usando un número mínimo de etapas de acoplamiento químico. La posible diversidad de la biblioteca de compuestos así creada se determina por el número de elementos estructurales únicos (por ejemplo, nucleótidos) disponibles para cada etapa de acoplamiento, y el número de etapas de acoplamiento usadas para crear la biblioteca. Por ejemplo, una síntesis de conjuntos fraccionados que comprende 10 rondas de acoplamiento usando 4 nucleótidos diferentes en cada etapa dará 410 = 1.048.576 secuencias de nucleótidos únicas. En algunas realizaciones, se puede realizar síntesis de conjuntos fraccionados usando métodos enzimáticos tales como reacciones de extensión o ligación de polimerasas en vez de acoplamiento químico. Por ejemplo, en cada ronda de una reacción de extensión de polimerasas de conjuntos fraccionados, los extremo 3' de los oligonucleótidos del marcador estocástico anclados a perlas en un conjunto dado se pueden hibridar con los extremos 5' de un conjunto de cebadores semialeatorios, por ejemplo cebadores que tienen una estructura de 5'-(M)k-(X)i-(N)j-3', donde (X)i es una secuencia de nucleótidos al azar que tiene i nucleótidos de largo (comprendiendo el conjunto de cebadores todas las posibles combinaciones de (X)i), (N)j es un nucleótido específico (o serie de j nucleótidos), y (M)k es un nucleótido específico (o serie de k nucleótidos), en donde se añade un trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTP) diferente a cada conjunto y se incorpora en los oligonucleótidos fijados por la polimerasa.
En algunas realizaciones, el número de oligonucleótidos conjugados con o sintetizados sobre un soporte sólido tal como una perla puede comprender 100 o más moléculas de oligonucleótido. En algunas realizaciones, el soporte sólido puede comprender 1.000 o más moléculas de oligonucleótido. En algunas realizaciones, el soporte sólido puede comprender 10.000 o más moléculas de oligonucleótido. En algunas realizaciones, el soporte sólido puede comprender 100.000 o más oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el soporte sólido puede comprender 1.000.000 o más oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, el número de oligonucleótidos conjugados con o sintetizados sobre un soporte sólido tal como una perla puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces superior al número de ácidos nucleicos diana en una célula. En algunas realizaciones, el número de oligonucleótidos conjugados con o sintetizados sobre un soporte sólido tal como una perla puede ser 100 veces superior al número de ácidos nucleicos diana en una célula. En algunas realizaciones, el número de oligonucleótidos conjugados con o sintetizados sobre un soporte sólido tal como una perla puede ser 1.000 veces superior al número de ácidos nucleicos diana en una célula. En algunos casos, al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % de los oligonucleótidos están unidos por un ácido nucleico diana. En algunos casos, como máximo 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % de los oligonucleótidos están unidos por un ácido nucleico diana. En algunos casos, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más ácidos nucleicos diana diferentes se capturan por los oligonucleótidos sobre un soporte sólido. En algunos casos, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más ácidos nucleicos diana diferentes se capturan por los oligonucleótidos sobre un soporte sólido.
En algunas realizaciones de los métodos, dispositivos y sistemas desvelados, la pluralidad de marcadores estocásticos anclados a un conjunto dado de perlas se puede diseñar para centrar el análisis en la dirección 3' de datos de secuencia en subpoblaciones de células seleccionadas. En algunas realizaciones, la pluralidad de marcadores estocásticos anclados a un conjunto de perlas se puede diseñar para excluir subpoblaciones de células seleccionadas del análisis en la dirección 3' de datos de secuencia. Un ejemplo de un enfoque adecuado para implementar estas realizaciones sería la inclusión de un subconjunto de marcadores anclados fijados a cada perla que comprenden una o más regiones específicas de unión a diana, donde la una o más dianas de ácido nucleico (por ejemplo, marcadores de ácidos nucleicos, marcadores genéticos) se eligen para definir el subconjunto de células a incluir en o excluir del análisis adicional en la etapa de análisis de datos de secuencias. Las moléculas de marcador fijado del subconjunto comprenderían cada una el marcador celular (la misma secuencia para todos los marcadores fijados a una perla dada), un marcador molecular (por ejemplo, una secuencia única individual seleccionada al azar de un conjunto variado de secuencias de marcadores moleculares o códigos de barras incluidas en el subconjunto de moléculas de marcador anclado fijados a una perla dada), y una región específica de unión a diana, así como una o más secuencias de cebador adicionales, secuencias de marcador de muestra, etc., como se ha descrito anteriormente. Se puede elegir un conjunto de dianas de ácido nucleico (marcadores de ácido nucleico o marcadores genéticos), por ejemplo, dianas de ARNm, para identificar, por ejemplo, células que sufren apoptosis (por ejemplo, monitorizando la expresión de Bax, Bcl-2, caspasa-3, y caspasa-7, o la expresión de otros genes potencialmente implicados en la apoptosis, o combinaciones de los mismos), proliferación rápida (por ejemplo, monitorizando la expresión de CKS1B, CCNB2, CDC2, DLG7, BUB3, MAD2L1, DLG7, PLK4, KIF2C, MKI67, BRRN1, NUSAP1, ASPM o KLF7, o la expresión de otros genes potencialmente implicados en la proliferación celular, o combinaciones de los mismos), o cualquier otra subpoblación de células que se pueda definir basándose en marcadores de ácido nucleico. Los análisis de datos de secuencias generados realizando el ensayo de marcado estocástico o de creación de códigos de barras moleculares proporciona entonces una lista de los códigos de barras celulares asociados a la subpoblación especificada de células de manera que el análisis adicional se pueda centrar en la subpoblación de células seleccionada, o la subpoblación de células seleccionada se pueden excluir del análisis adicional.
Perlas y otros soportes sólidos codificados. Se puede usar cualquiera de una variedad de diferentes perlas como soportes sólidos para fijar oligonucleótidos del marcador estocástico presintetizados o para la síntesis en fase sólida in situ de oligonucleótidos de marcadores estocásticos. Una perla puede englobar cualquier tipo de esfera sólida, porosa, o hueca, bola, cojinete, cilindro, u otra configuración similar compuesta de plástico, cerámica, metal, o material polimérico sobre el que se puede inmovilizar un ácido nucleico (por ejemplo, covalentemente o no covalentemente). Una perla puede comprender una partícula discreta que puede ser esférica (por ejemplo, microesferas) o tener una forma no esférica o irregular, tal como cúbica, cuboide, piramidal, cilíndrica, cónica, oblonga, o con forma de disco, y similares. Las perlas pueden comprender una variedad de materiales que incluyen, pero no se limitan a, materiales paramagnéticos (por ejemplo, magnesio, molibdeno, litio y tántalo), materiales superparamagnéticos (por ejemplo, nanopartículas de ferrita (Fe3O4 ; magnetita)), materiales ferromagnéticos (por ejemplo, hierro, níquel, cobalto, algunas aleaciones de los mismos, y algunos compuestos de metales de las tierras raras), cerámica, plástico, vidrio, poliestireno, sílice, metilestireno, polímeros acrílicos, titanio, látex, Sepharose, agarosa, hidrogel, polímero, celulosa, nailon, y cualquier combinación de los mismos. Una perla se puede referir a cualquier estructura tridimensional que puede proporcionar un aumento de área superficial para la inmovilización de partículas biológicas y macromoléculas, tales como ADN y ARN.
En general, el diámetro de las perlas puede variar desde aproximadamente 1 pm hasta aproximadamente 100 pm, o más. En algunas realizaciones, el diámetro de las perlas pueden ser al menos 1 pm, al menos 5 pm, al menos 10 pm, al menos 20 pm, al menos 25 pm, al menos 30 pm, al menos 35 pm, al menos 40 pm, al menos 45 pm, al menos 50 pm, al menos 60 pm, al menos 70 pm, al menos 80 pm, al menos 90 pm, o al menos 100 pm. En alguna realización, el diámetro de las perlas puede ser como máximo 100 pm, como máximo 90 pm, como máximo 80 pm, como máximo 70 pm, como máximo 60 pm, como máximo 50 pm, como máximo 45 pm, como máximo 40 pm, como máximo 35 pm, como máximo 30 pm, como máximo 25 pm, como máximo 20 pm, como máximo 15 pm, como máximo 10 pm, como máximo 5 pm, o como máximo 1 pm. El diámetro de las perlas puede tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, las perlas pueden tener un diámetro en el intervalo de aproximadamente 20 a 50 pm. En algunas realizaciones, las perlas pueden tener un diámetro de aproximadamente 33 pm. En algunas realizaciones, se puede desear usar las perlas más pequeñas posibles (es decir, que son compatibles con el proceso de síntesis usado para crear la pluralidad de marcadores estocásticos fijados a las perlas y con otros requisitos de ensayo y dispositivo), ya que las perlas más grandes tenderán a sedimentar más rápido que las perlas más pequeñas de la misma densidad, y por tanto pueden dar como resultado distribuciones menos uniformes de perlas a través de la matriz de micropocillos. Para perlas esféricas, la velocidad de sedimentación se puede calcular usando la ley de Stokes:
y = 2Ga2(.Pi ~ Pz)
9 r¡
donde V = velocidad de sedimentación (cm/s), G = la aceleración debida a la gravedad (cm/s2), a = radio de la perla (cm), p1 = densidad de la perla (g/cm3), p2 = densidad del medio de suspensión (g/cm3), y n = coeficiente de viscosidad (poise; g/cm-s). Así, una perla de 50 pm de diámetro puede sedimentar 25 veces más rápido que una perla de 10 pm de diámetro de la misma densidad.
Una perla se puede unir a, situar dentro de, o incorporar en uno o más soportes. Por ejemplo, una perla se puede unir a un gel o hidrogel. Una perla se puede unir a una matriz. Una perla se puede incorporar en una matriz. Una perla se puede unir a un polímero. Una perla se puede incorporar en un polímero. La posición espacial de una perla dentro del soporte (por ejemplo, gel, matriz, armazón, o polímero) se puede identificar usando el oligonucleótido presente sobre la perla que sirve de dirección de localización.
Los ejemplos de perlas incluyen, pero no se limitan a, perlas de estreptavidina, perlas de agarosa, perlas magnéticas, Dynabeads®, microperlas MACS®, perlas conjugadas con anticuerpo (por ejemplo, microperla anti-inmunoglobulina), perlas conjugadas con proteína A, perlas conjugadas con proteína G, perlas conjugadas con proteína A/G, perlas conjugadas con proteína L, perlas conjugadas con oligo-dT, perlas de sílice, perlas de tipo sílice, microperla antibiotina, microperla anti-fluorocromo y perlas magnéticas terminadas en carboxi BcMag™.
Una perla se puede asociar a (por ejemplo, impregnar con) puntos cuánticos o colorantes fluorescentes para hacerla fluorescente en un canal de óptico de fluorescencia o múltiples canales ópticos. Una perla se puede asociar a óxido de hierro u óxido de cromo para hacerla paramagnética o ferromagnética. Por tanto, las perlas pueden ser de forma no esférica. Se puede usar una perla de tipo disco plana en algunas realizaciones. En algunas realizaciones, la perla de tipo disco puede ocluir sustancialmente el volumen de pocillo en algunas orientaciones pero permiten que las células se muevan libremente el pocillo en otras orientaciones. Esta perlas de tipo disco grande es beneficiosa para lograr dos funciones diferentes, siendo la primera el confinamiento de la célula y materiales de dentro de la célula después de la lisis, y siendo la segunda la capacidad de que una célula sea fácilmente cargada durante el ensayo. La orientación también se puede controlar durante la operación, que incluye automáticamente por el instrumento, usando un campo magnético aplicado. Se pueden usar otras formas de perla, usadas en combinación con otras formas de pocillo (que pueden ser diferentes de simples cilindros), para mejorar la eficiencia y velocidad del cartucho, de la carga de perla y de carga, y de realizar el ensayo.
Perlas de doble codificación para el marcado estocástico y la creación de códigos de barras moleculares: En algunas realizaciones de los métodos de marcado estocástico y de creación de códigos de barras moleculares descritos anteriormente, se puede desear que perlas asociadas a células individuales presenten un conjunto predefinido de propiedades, o perlas asociadas a más de una célula, se retiren de procesamiento adicional, o que los datos de secuencia que surgen de dichas perlas se usen para centrar el análisis de datos de secuencias en la dirección 3'. En algunas realizaciones, los datos de secuencia que surgen de dichas perlas se pueden excluir de cualquier análisis de datos de secuencias adicional. En algunas realizaciones, el análisis de datos de secuencias adicional pueden incluir solo aquellos datos de secuencia que surgen de dichas perlas. En algunas realizaciones, esto se puede lograr a través del uso de perlas codificadas ópticamente en un esquema de codificación doble, por ejemplo donde perlas individuales son únicamente identificadas tanto por un código óptico (por ejemplo, impregnando las perlas con un conjunto espectralmente distinto de fluoróforos, puntos cuánticos, marcadores de Raman, fósforos de conversión ascendente, y similares; o por síntesis de un código óptico fijado a través del uso de metodologías de síntesis de conjuntos fraccionados de fase sólida y un conjunto de elementos estructurales fluorescentes espectralmente distintos), así como una secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, el marcador celular) que se incorpora en la pluralidad de marcadores estocásticos anclados fijados a una perla dada. Las perlas co-localizadas con células que presentan un conjunto de propiedades predefinidas, o con más de un célula, se identificarían cada una basándose en su código óptico, y la datos de secuencia que surgen de dichas perlas se identificarían posteriormente por la secuencia de marcador celular correspondiente, generando así una lista de datos de secuencia a incluir o excluir del análisis adicional. Las células individuales o sub-poblaciones de células que presentan un conjunto predefinido de características, por ejemplo que expresan un receptor de la superficie celular (marcador) particular o conjunto de receptores de la superficie celular, se pueden identificar a través de cualquiera de una variedad de técnicas adecuadas, por ejemplo a través de tinción inmunohistoquímica de células individuales en un formato de matriz de micropocillos usando anticuerpos fluorescentemente marcados dirigidos hacia los marcadores de la superficie celular y técnicas de obtención de imágenes de fluorescencia, o a través del uso de métodos de citometría de flujo y citometría de flujo activada por fluorescencia. En algunas realizaciones, si se puede identificar y registrar la localización de cada secuencia de marcador celular en un espacio bidimensional, el ensayo puede proporcionar información espacial para la expresión génica de células individuales, y puede ser particularmente útil para analizar la expresión génica en, por ejemplo, las delgadas secciones de tejido rutinariamente recogidas para estudios patológicos.
Codificación doble usando códigos de dirección de matrices: En algunas realizaciones, se pueden implementar esquemas de codificación doble usando códigos de dirección de matrices previamente depositados (por ejemplo, códigos de barras de ácidos nucleicos que codifican la localización de un pocillo específico en la matriz) en lugar de perlas codificadas ópticamente para implementar esquemas de codificación doble. En algunas realizaciones, los códigos de dirección de matrices se pueden depositar en pocilios usando técnicas de impresión por chorro de tinta, técnicas de impresión de micromatrices, técnicas de nanolitografía Dip-pen, y similares. En algunas realizaciones, los códigos de dirección de matrices pueden no ser específicamente adsorbidos a una o más superficies internas de los micropocillos. En algunas realizaciones, los códigos de dirección de matrices pueden ser covalentemente fijados a una o más superficies internas de los micropocillos. En algunas realizaciones, los códigos de dirección de matrices se pueden sintetizar in situ por medio de técnicas de síntesis en fase sólida, en donde una o más superficies internas de los micropocillos se usan como soporte sólido. En las realizaciones donde los códigos de dirección de matrices se fijan covalentemente a una o más superficies internas de los micropocillos, la unión puede comprender el uso de conectores escindibles, por ejemplo conectores lábiles a ácidos, lábiles a bases, o fotoescindibles, de manera que los códigos de dirección de matrices se puedan liberar cuando se desee y se permita que se hibriden con un subconjunto de los marcadores estocásticos anclados fijados a una perla. En algunas realizaciones, los códigos de dirección de matrices se pueden usar en combinación con la pluralidad de marcadores estocásticos fijados a una perla que comprende un marcador celular. En algunas realizaciones, se pueden usar los códigos de dirección de matrices en lugar de una pluralidad de marcadores estocásticos fijados a una perla, y ellos mismos pueden comprender un marcador celular, un marcador molecular, y una o más secuencias de cebador o adaptador. Los códigos de dirección de matrices se pueden usar en modo similar a los descritos anteriormente para perlas codificadas ópticamente en identificar subconjuntos de células a incluir o excluir de los análisis de datos de secuencias en la dirección 3'.
Estimulación de células: En algunas realizaciones, las células se pueden poner en contacto con un agente de activación, estímulo físico o químico, o compuesto de prueba en momentos ajustables conocidos antes de realizar la lisis celular y las posteriores etapas de ensayo. De este modo, el ensayo se puede usar para medir cambios dependientes del tiempo o transitorios en la expresión génica inducida por estímulo, por ejemplo, o la curva de dosisrespuesta dependiente del tiempo para un candidato a fármaco. Los ejemplos de agentes de activación celular incluyen, pero no se limitan a, agentes de activación de linfocitos T tales como agentes farmacológicos (por ejemplo, 12-miristato 13-acetato de forbol), anticuerpos monoclonales anti-CD3/TCR o anti-Thy-1, enterotoxinas y lectinas. Los ejemplos de estímulos físicos y químicos incluyen, pero no se limitan a, saltos de temperatura, cambios de pH, cambios de fuerza iónica, y similares.
Lisis celular: Siguiendo la distribución de células aleatoria y los marcadores estocásticos basados en perlas, de forma que una célula individual y perla individual se confinen juntas dentro de un pequeño volumen de reacción, por ejemplo un pocillo o micropocillo, las células se pueden lisar para liberar las moléculas diana (FIG. 1). La lisis celular se puede llevar a cabo por cualquiera de una variedad de medios, por ejemplo, por medios químicos o bioquímicos, por choque osmótico, o por medio de lisis térmica, lisis mecánica, o lisis óptica. En algunas realizaciones, por ejemplo, las células se pueden lisar mediante la adición de un tampón de lisis celular que comprende un detergente (por ejemplo, SDS, dodecilsulfato de Li, Triton X-100, Tween-20, o NP-40), un disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetona), o enzimas digestivas (por ejemplo, proteinasa K, pepsina o tripsina), o cualquier combinación de los mismos.
Unión de marcadores estocásticos a moléculas de ácidos nucleicos diana: Tras la lisis de las células y la liberación de moléculas de ácidos nucleicos de las mismas, las moléculas de ácidos nucleicos se pueden fijar aleatoriamente a los oligonucleótidos del marcador estocástico de la perla co-localizada. En algunas realizaciones, la unión puede comprender hibridación de una región de reconocimiento diana del marcador a una porción complementaria de la molécula de ácido nucleico diana (FIG. 1). Las condiciones de ensayo usadas para la hibridación (por ejemplo, pH del tampón, fuerza iónica, temperatura, etc.) se eligen para promover la formación de híbridos estables específicos, como se conoce bien por los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, la unión puede comprender además la ligación de una región de reconocimiento diana de marcados y una porción de la molécula de ácido nucleico diana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región de unión a diana puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridación específica a un nucleótido protuberante del sitio de restricción (por ejemplo, un nucleótido protuberante de extremos cohesivos de EcoRI). En algunas realizaciones, el procedimiento de ensayo comprende además tratar los ácidos nucleicos diana con una enzima de restricción (por ejemplo, EcoRI) para crear un nucleótido protuberante del sitio de restricción. El marcador estocástico se puede entonces ligar a cualquier molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria al nucleótido protuberante del sitio de restricción. Se puede usar una ligasa (por ejemplo, ADN T4 ligasa) se para unir los dos fragmentos de oligonucleótidos.
En algunas realizaciones de los métodos desvelados, las moléculas de ácidos nucleicos diana marcadas de una pluralidad de células (o una pluralidad de muestras) se reúnen posteriormente, por ejemplo, recuperando las perlas a las que se unen las moléculas de ácidos nucleicos marcadas estocásticamente (FIG. 1). En algunas realizaciones, la distribución y/o recuperación de conjuntos basados en perlas de moléculas de ácidos nucleicos fijadas se pueden implementar usando perlas magnéticas y un campo magnético externamente aplicado. Una vez se han reunido las moléculas de ácidos nucleicos marcadas estocásticamente, todo el procesamiento adicional puede avanzar en un único recipiente de reacción. En algunas realizaciones, el procesamiento adicional (por ejemplo, reacciones de transcripción inversa (u otras reacciones de extensión de ácidos nucleicos) y reacciones de amplificación) se puede realizar dentro de los micropocillos, es decir, sin reunir primero las moléculas de ácidos nucleicos diana marcada de una pluralidad de células.
Transcripción inversa: En algunas realizaciones de los métodos desvelados, se realiza una reacción de transcripción inversa (FIG. 1) para crear un conjugado de marcador estocástico - ácido nucleico diana (por ejemplo, un complejo molecular covalentemente enlazado o conjugado molecular) que comprende el marcador estocástico y una secuencia complementaria de todo o una porción del ácido nucleico diana (es decir, una molécula de ADNc marcada). La transcripción inversa se puede realizar usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas para los expertos en la técnica. La transcripción inversa de la molécula de ARN marcada puede ocurrir mediante la adición de un cebador de transcripción inversa junto con la transcriptasa inversa. En algunas realizaciones, el cebador de transcripción inversa es un cebador de oligo-dT, un cebador de hexanucleótido al azar, o un cebador de oligonucleótidos específico de diana. En general, los cebadores de oligo-dT tienen 12-18 nucleótidos de longitud y se unen a la cola de poli-A endógena en el extremo 3' del ARNm de mamífero. Se puede unir cebadores de hexa-nucleótido al azar a ARNm en una variedad de sitios complementarios. Los cebadores de oligonucleótidos específicos de diana normalmente ceban selectivamente el ARNm de interés.
Amplificación: En algunas realizaciones de los métodos desvelados, se pueden realizar una o más ácido reacciones de amplificación de ácidos nucleicos para crear múltiples copias de las moléculas de ácidos nucleicos diana marcadas (FIGS. 1 y 5A-D). La amplificación se puede realizar en un modo multiplexado, en donde múltiples secuencias de ácidos nucleicos diana se amplifican simultáneamente. La reacción de amplificación se puede usar para añadir adaptadores de secuenciación a las moléculas de ácidos nucleicos. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos una porción de un marcador de muestra, si está presente. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos una porción del marcador celular y o molecular. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos una porción de un marcador de muestra, un marcador celular, un marcador molecular, un ácido nucleico diana, o una combinación de los mismos. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, o 100 % de la pluralidad de ácidos nucleicos. El método puede comprender además realizar una o más reacciones de síntesis de ADNc para producir una o más copias de ADNc de ácidos nucleicos marcados con marcadores de muestra, ácidos nucleicos marcados con marcadores celulares, o ácidos nucleicos marcados con marcadores moleculares.
En algunas realizaciones, la amplificación se puede realizar usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se usa en el presente documento, p Cr se pueden referir a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas por la extensión simultánea de cebadores de hebras complementarias de ADN. Como se usa en el presente documento, la PCR puede englobar formas derivadas de la reacción, que incluyen, pero no se limitan a, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, PCR digital y PCR de ensamblaje.
En algunas realizaciones, la amplificación de los ácidos nucleicos marcados comprende métodos no basados en PCR. Los ejemplos de métodos no basados en PCR incluyen, pero no se limitan a, amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), amplificación mediada por transcripción (Tm a ), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación con desplazamiento de cadena (SDA), SDA en tiempo real, amplificación por círculo rodante, o amplificación círculo a círculo. Otros métodos de amplificación no basados en PCR incluyen múltiples ciclos de amplificación por transcripción de ARN dirigida por ARN polimerasa dependiente de ADN o síntesis y transcripción de ADN dirigida por ARN para amplificar dianas de ADN o ARN, una reacción en cadena de la ligasa (LCR), un método de Qp replicasa (Qp), uso de sondas palindrómicas, amplificación con desplazamiento de cadena, amplificación dirigida por oligonucleótidos usando una endonucleasa de restricción, un método de amplificación en el que una sonda se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos y el dúplex resultante se escinde antes de la reacción de extensión y amplificación, ión con desplazamiento de cadena usando una polimerasa de ácido nucleico que carece de actividad de exonucleasa en 5', amplificación por círculo rodante, y amplificación por ramificación de extensiones (RAM).
En algunos casos, los métodos desvelados en el presente documento comprenden además realizar una reacción en cadena de la polimerasa en el ácido nucleico marcado (por ejemplo, ARN marcado, ADN marcado, ADNc marcado) para producir un amplicón marcado. El amplicón marcado puede ser una molécula bicatenaria. La molécula bicatenaria puede comprender un molécula de ARN bicatenario, una molécula de ADN bicatenario, o una molécula de ARN hibridada con una molécula de ADN. Una o ambas de las cadenas de la molécula bicatenaria puede comprender un marcador de muestra, un marcador celular, o un marcador molecular. Alternativamente, el amplicón marcado es una molécula monocatenaria. La molécula monocatenaria puede comprender ADN, ARN, o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden comprender ácidos nucleicos sintéticos o alterados.
En alguna realización, la amplificación puede comprender el uso de uno o más nucleótidos no naturales. Los nucleótidos no naturales pueden comprender nucleótidos fotolábiles o desencadenantes. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico glicólico (GNA) y ácido nucleico treósico (TNA). Los nucleótidos no naturales se pueden añadir a uno o más ciclos de una reacción de amplificación. La adición de los nucleótidos no naturales se puede usar para identificar productos como ciclos específicos o momentos de tiempo en la reacción de amplificación.
La realización de una o más reacciones de amplificación puede comprender el uso de uno o más cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender uno o más oligonucleótidos. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender al menos aproximadamente 7-9 nucleótidos. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender menos de 12-15 nucleótidos. El uno o más cebadores se pueden hibridar con al menos una porción de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores se pueden hibridar con el extremo 3' o extremo 5' de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores se pueden hibridar con una región interna de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. La región interna puede ser al menos aproximadamente 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1000 nucleótidos desde los extremo 3' de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden comprender un panel de cebadores fijo. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores a medida. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de control. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de genes de mantenimiento. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal. El cebador universal se puede hibridar con un sitio de unión al cebador universal. El uno o más cebadores a medida se pueden hibridar con un primer marcador de muestra, un segundo marcador de muestra, un marcador celular, un marcador molecular, un ácido nucleico diana, o una combinación de los mismos. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal y un cebador a medida. El cebador medida se puede diseñar para amplificar uno o más ácidos nucleicos diana. Los ácidos nucleicos diana pueden comprender un subconjunto de los ácidos nucleicos totales en una o más muestras. Los ácidos nucleicos diana pueden comprender un subconjunto de los ácidos nucleicos marcados totales en una o más muestras. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 96 o más cebadores a medida. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 960 o más cebadores a medida. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 9600 o más cebadores a medida. El uno o más cebadores a medida se pueden hibridar con dos o más ácidos nucleicos marcados diferentes. Los dos o más ácidos nucleicos marcados diferentes pueden corresponden a uno o más genes.
Las FIGS. 5A-D ilustran una realización de un esquema de amplificación para su uso en los métodos de la presente divulgación. La primera reacción de PCR amplifica moléculas fijadas a la perla usando un cebador específico de gen y un cebador contra la secuencia del cebador de secuenciación 1 Illumina universal (FIG. 5A). La segunda reacción de PCR amplifica los primeros productos de PCR usando un cebador específico de gen anidado flanqueado por la secuencia del cebador de secuenciación 2 Illumina, y un cebador contra la secuencia del cebador de secuenciación 1 Illumina universal (FIG. 5B). La tercera reacción de PCR añade P5 y P7 y el índice muestra para convertir productos de PCR en una biblioteca de secuenciación Illumina (FIG. 5C). La secuenciación usando 150 pb x 2 secuenciación revela el marcador celular y el índice molecular en la lectura 1, el gen en la lectura 2, y el índice de muestra en la lectura del índice 1 (FIG. 5D).
En algunas realizaciones, el en análisis la dirección 3' de datos de secuencias se puede centrar en subpoblaciones seleccionadas de células realizando una reacción de amplificación usando uno o más cebadores específicos de diana, en donde el uno o más cebadores específicos de diana son capaces de hibridación específica con, por ejemplo, uno o más genes o productos génicos que definen una subpoblación de células. Se puede elegir un conjunto de dianas de ácido nucleico (marcadores de ácido nucleico o marcadores genéticos), por ejemplo, dianas de ARNm, para identificar, por ejemplo, células que sufren apoptosis (por ejemplo, monitorizando la expresión de Bax, Bcl-2, caspasa-3, y caspasa-7, o la expresión de otros genes potencialmente implicados en la apoptosis, o combinaciones de los mismos), proliferación rápida (por ejemplo, monitorizando la expresión de CKS1B, CCNB2, CDC2, DLG7, BUB3, MAD2L1, DLG7, PLK4, KIF2C, MKI67, BRRN1, NUSAP1, ASPM, o KLF7, o expresión de otros genes potencialmente implicados en la proliferación celular, o combinaciones de los mismos), o cualquier otra subpoblación de células que se pueda definir basándose en marcadores de ácido nucleico. Se usa una reacción de amplificación multiplexada realizada usando the uno o más cebadores específicos de diana para crear múltiples copias de las moléculas de ácidos nucleicos diana marcadas fijadas a perlas, que entonces se pueden secuenciar para generar una lista de células que comprenden la una o más moléculas de ácidos nucleicos diana especificadas.
Secuenciación: La determinación del número de diferentes ácidos nucleicos marcados puede comprender determinar la secuencia del ácido nucleico marcado o cualquier producto del mismo (por ejemplo, amplicones marcados, moléculas de ADNc marcadas). En algunos casos, un ácido nucleico diana amplificado se puede someter a secuenciación (FIGS. 1 y 5A-D). La determinación de la secuencia de ácido nucleico marcado o cualquier producto del mismo puede comprender realizar una reacción de secuenciación para determinar la secuencia de al menos una porción de un marcador de muestra, un marcador celular, un marcador molecular, al menos una porción del ácido nucleico marcado diana, un complemento de los mismos, un complemento inverso de los mismos, o cualquier combinación de los mismos.
La determinación de la secuencia de un ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico amplificado, ácido nucleico marcado, copia de ADNc de un ácido nucleico marcado, etc.) se pueden realizar usando una variedad de métodos de secuenciación que incluyen, pero no se limitan a, secuenciación por hibridación (SBH), secuenciación por ligación (SBL), secuenciación incremental cuantitativa por adición de nucleótidos fluorescentes (QIFNAS), ligación y escisión escalonadas, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), balizas moleculares, digestión con sondas indicadoras TaqMan, pirosecuenciación, secuenciación fluorescente in situ (FISSEQ), perlas FISSEQ, secuenciación por titubeo, secuenciación múltiplex, secuenciación de colonias polimerizadas (POLONY); secuenciación en círculo rodante en nanorejilla (ROLONY), ensayos de ligación de oligonucleótidos específicos de alelo (por ejemplo, ensayos de ligación de oligonucleótidos (OLA), molécula de molde individual OLA usando una sonda lineal ligada y una lectura de amplificación por círculo rodante (RCA), sondas candado ligadas, o molécula de molde individual OLA usando una sonda candado circular ligada y una lectura de amplificación por círculo rodante (RCA)), y similares.
En algunos casos, la determinación de la secuencia del ácido nucleico marcado o cualquier producto del mismo comprende secuenciación de extremos emparejados, secuenciación de nanoporos, secuenciación de alto rendimiento, secuenciación aleatoria, secuenciación con terminador colorante, secuencia de ADN de múltiples cebadores, paseo con cebador, secuenciación de didesoxi de Sanger, secuenciación de Maxim-Gilbert, pirosecuenciación, secuenciación de moléculas individuales verdaderas, o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, la secuencia del ácido nucleico marcado o cualquier producto de los mismos se pueden determinar por microscopía electrónica o una matriz de transistores de efecto de campo sensible a productos químicos (chemFET).
También se pueden utilizar métodos de secuenciación de alto rendimiento, tales como secuenciación de matrices cíclicas usando plataformas tales como Roche 454, Illumina Solexa, ABI-SOLiD, ION Torrent, Complete Genomics, Pacific Bioscience, Helicos, o la plataforma Polonator. En alguna realización, la secuenciación puede comprender secuenciación de MiSeq. En alguna realización, la secuenciación puede comprender secuenciación de HiSeq.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos marcados comprenden ácidos nucleicos que representan desde aproximadamente 0,01 % de los genes del genoma de un organismo hasta aproximadamente 100 % de los genes del genoma de un organismo. Por ejemplo, se pueden secuenciar aproximadamente 0,01 % de los genes del genoma de un organismo a aproximadamente 100% de los genes del genoma de un organismo usando una región complementaria diana que comprende una pluralidad de multímeros capturando los genes que contienen una secuencia complementaria de la muestra. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos marcados comprenden ácidos nucleicos que representan desde aproximadamente 0,01 % de los transcritos del transcriptoma de un organismo hasta aproximadamente 100% de los transcritos del transcriptoma de un organismo. Por ejemplo, se pueden secuenciar aproximadamente 0,501 % de los transcritos del transcriptoma de un organismo a aproximadamente 100% de los transcritos del transcriptoma de un organismo usando una región complementaria diana que comprende una cola de poli-T capturando los ARNms de la muestra.
La secuenciación puede comprender la secuenciación al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado. En algunos casos, la secuenciación comprende la secuenciación de al menos aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado. En otros casos, la secuenciación comprende la secuenciación de al menos aproximadamente 1,500; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; 9.000; o 10.000 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado.
La secuenciación puede comprender al menos aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más lecturas de secuenciación por serie. En algunos casos, la secuenciación comprende la secuenciación de al menos aproximadamente 1,500; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; 9.000; o 10.000 o más lecturas de secuenciación por serie. La secuenciación puede comprender menor o igual a aproximadamente 1.600.000.000 lecturas de secuenciación por serie. La secuenciación puede comprender menor o igual a aproximadamente 200.000.000 lecturas por serie.
Micropocillos usados para atrapamiento: Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones se usan micropocillos para atrapar células y perlas individuales (una perla por célula) dentro de una pequeña cámara de reacción de volumen definido (FIG. 6A). Cada perla comprende una biblioteca de sondas de oligonucleótidos para su uso en marcado estocástico y recuento digital de dianas de ácido nucleico (por ejemplo, todo el complemento de moléculas de ARNm celular) que son liberadas tras la lisis de la célula.
En algunas realizaciones de los métodos, dispositivos y sistemas desvelados, se usan una pluralidad de micropocillos que se distribuyen aleatoriamente a través de un sustrato. En algunas realizaciones, la pluralidad de micropocillos se distribuyen a través de un sustrato en un patrón ordenado, por ejemplo, una matriz ordenada. En algunas realizaciones, la pluralidad de micropocillos se distribuyen a través de un sustrato en un patrón aleatorio, por ejemplo, una matriz aleatoria. En una realización de la presente divulgación, la pluralidad de micropocillos (por ejemplo, una matriz de micropocillos) es un componente consumible del sistema de ensayo. En otras realizaciones, la pluralidad de micropocillos (por ejemplo, una matriz de micropocillos) puede ser reutilizable. En cualquier caso, se pueden configurar para su uso como un dispositivo autónomo para realizar ensayos manualmente, o se pueden configurar para comprender un componente fijo o extraíble de un sistema de instrumentos que proporciona automatización completa o parcial del procedimiento de ensayo.
En algunas realizaciones de los métodos desvelados, las bibliotecas basadas en perlas de marcadores estocásticos (por ejemplo, sondas de oligonucleótidos) se depositan en los micropocillos como parte del procedimiento de ensayo. En algunas realizaciones, las perlas pueden ser cargadas previamente en los micropocillos y proporcionadas al usuario como parte de, por ejemplo, un kit para realizar el marcado estocástico y el recuento digital de dianas de ácido nucleico. En algunas realizaciones, se pueden proporcionar dos matrices emparejadas de micropocillos, una cargada previamente con perlas que se mantienen en su sitio por un primer imán y la otra para su uso por el usuario en cargar las células individuales. Tras la distribución de células en la segunda matriz de micropocillos, las dos matrices se pueden colocar cara a cara y retirar el primer imán mientras que se usa un segundo imán para meter las perlas de la primera matriz en los micropocillos correspondientes de la segunda matriz, asegurando así que las perlas reposen encima de las células en la segunda matriz de micropocillos y así se minimice la pérdida difusional de moléculas diana tras la lisis celular, mientras que se maximiza la eficiente unión de moléculas diana a los marcadores estocásticos sobre la perla. Se puede usar cualquiera de una variedad de procesos de carga y recuperación de perlas, como se describe en más detalle a continuación.
Geometrías y dimensiones de los micropocillos: Los micropocillos se pueden fabricar en una variedad de formas y tamaños. Las geometrías y dimensiones de micropocillos pueden afectar la carga de células y la carga de perlas/eficiencias de recuperación, y en general se eligen para minimizar las probabilidades de cargar más de un perla por pocillo. Las geometrías de pocillos apropiadas incluyen, pero no se limitan a, cilíndrica, elíptica, cúbica, cónica, semiesférica, rectangular o poliédrica (por ejemplo, geometrías tridimensionales comprendidas de varias caras planares, por ejemplo, cuboide rectangular, columnas hexagonales, columnas octagonales, pirámides triangulares invertidas, pirámides cuadradas invertidas, pirámides pentagonales invertidas, pirámides hexagonales invertidas, o pirámides truncadas invertidas). En algunas realizaciones, micropocillos no cilíndricos, por ejemplo, pocillos que tienen una huella elíptica o cuadrada, pueden ofrecer ventajas en términos de ser capaces de alojar células más grandes. En algunas realizaciones, los bordes superiores y/o inferiores de las paredes de los pocillos pueden ser redondeados para evitar esquinas afiladas y así disminuir las fuerzas electrostáticas que pueden surgir en bordes afilados o puntos debido a la concentración de campos electrostáticos. Así, el uso de esquinas redondeadas puede mejorar la capacidad de recuperación de perlas de los micropocillos.
En algunas realizaciones, las paredes laterales de los micropocillos pueden tener un ángulo de inclinación distintos de cero (es decir, el ángulo entre la pared lateral y un eje vertical que es perpendicular al plano del sustrato de micropocillos). En otras palabras, las paredes del micropocillo pueden ser inclinadas en vez de verticales, y un ángulo de inclinación positiva da lugar a una abertura más grande en la parte superior del pocillo. En algunas realizaciones, las paredes pueden estar inclinadas positiva o negativamente en al menos 1 grado, al menos 2 grados, al menos 3 grados, al menos 4 grados, al menos 5 grados, al menos 6 grados, al menos 7 grados, al menos 8 grados, al menos 9 grados, al menos 10 grados, al menos 11 grados, al menos 12 grados, al menos 13 grados, al menos 14 grados, o al menos 15 o más grados. En algunas realizaciones, las paredes pueden estar inclinadas positiva o negativamente en como máximo 1 grado, como máximo 2 grados, como máximo 3 grados, como máximo 4 grados, como máximo 5 grados, como máximo 6 grados, como máximo 7 grados, como máximo 8 grados, como máximo 9 grados, como máximo 10 grados, como máximo 11 grados, como máximo 12 grados, como máximo 13 grados, como máximo 15 grados, o como máximo 15 o más grados. En estas realizaciones, por tanto, la parte superior del micropocillo puede tener un diámetro diferente (o diámetro promedio) que la parte inferior del micropocillo. En realizaciones preferidas, las paredes están inclinadas un ángulo de inclinación positiva en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 grados.
En algunas realizaciones, los micropocillos pueden comprender una forma que combina dos o más geometrías. Por ejemplo, en una realización puede ser parcialmente cilíndrica, teniendo el resto la forma de un cono invertido. En otra realización, puede incluir dos cilindros uno al lado del otro, uno de mayor diámetro (por ejemplo, que corresponde aproximadamente al diámetro de las perlas) que el otro (por ejemplo, que corresponde aproximadamente al diámetro de las células), que están conectados por un canal vertical o ranura (es decir, paralelo a los ejes del cilindro) que se extiende la longitud completa (profundidad) de los cilindros. En general, un extremo abierto de los micropocillos se localizará en una superficie superior del sustrato que comprende la pluralidad de micropocillos, pero en algunas realizaciones, las aberturas se pueden localizar en una superficie inferior del sustrato. En algunas realizaciones, las aberturas se pueden localizar en un lado del sustrato, por ejemplo, que no es ni una superficie superior ni inferior, por ejemplo, si un sustrato planar sustancialmente plano está orientado con un eje largo en la dirección vertical. En general, el extremo cerrado (o fondo) de los micropocillos será plano, pero también son posibles superficies curvas (por ejemplo, convexas o cóncavas). En general, la forma (y tamaño) de los micropocillos se determinará basándose en los tipos de células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos.
Las dimensiones de los micropocillos se pueden caracterizar en términos del diámetro promedio y la profundidad del pocillo. Como se usa en el presente documento, el diámetro promedio del micropocillo se refiere al círculo más grande que puede ser inscrito dentro de la sección transversal planar de la geometría del micropocillo. En una realización de la presente divulgación, el diámetro promedio de los micropocillos puede variar desde aproximadamente 1 vez hasta aproximadamente 10 veces el diámetro de las células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos. En otras realizaciones, el diámetro promedio del micropocillo es al menos 1 vez, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, o al menos 10 veces el diámetro de las células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos. En aún otras realizaciones, el diámetro promedio del micropocillo es como máximo 10 veces, como máximo 5 veces, como máximo 4 veces, como máximo 3 veces, como máximo 2 veces, como máximo 1,5 veces, o como máximo 1 vez el diámetro de las células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos. En una realización, el diámetro promedio del micropocillo es aproximadamente 2,5 veces el diámetro de las células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos. Los expertos en la técnica apreciarán que el diámetro promedio de los micropocillos puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 1,2 veces hasta aproximadamente 3,5 veces el diámetro de las células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos). En algunas realizaciones, el diámetro promedio para cada micropocillo en la pluralidad de micropocillos puede ser el mismo. En otras realizaciones, los diámetros promedio para los micropocillos individuales de la pluralidad de micropocillos pueden ser diferentes.
Alternativamente, el diámetro de los micropocillos se puede especificar en términos de dimensiones absolutas. En una realización de la presente divulgación, el diámetro promedio de los micropocillos puede variar desde aproximadamente 5 |jm hasta aproximadamente 100 jm . En otras realizaciones, el diámetro promedio del micropocillo es al menos 5 jm , al menos 10 jm , al menos 15 jm , al menos 20 jm , al menos 25 jm , al menos 30 jm , al menos 35 jm , al menos 40 jm , al menos 45 jm , al menos 50 jm , al menos 60 jm , al menos 70 jm , al menos 80 jm , al menos 90 jm , o al menos 100 jm . En aún otras realizaciones, el diámetro promedio del micropocillo es como máximo 100 jm , como máximo 90 jm , como máximo 80 jm , como máximo 70 jm , como máximo 60 jm , como máximo 50 jm , como máximo 45 jm , como máximo 40 jm , como máximo 35 jm , como máximo 30 jm , como máximo 25 jm , como máximo 20 jm , como máximo 15 jm , como máximo 10 jm , o como máximo 5 jm . En una realización, el diámetro promedio del micropocillo es aproximadamente 50 jm . Los expertos en la técnica apreciarán que el diámetro promedio de los micropocillos puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 34 jm hasta aproximadamente 64 jm).
La profundidad del micropocillo se puede elegir para proporcionar el eficiente atrapamiento de células y perlas. La profundidad del micropocillo se puede elegir para proporcionar el eficiente intercambio de tampones de ensayo y otros reactivos contenidos dentro de los pocillos. La relación entre la profundidad del micropocillo y el diámetro promedio (es decir, la relación de aspecto) se puede elegir de forma que una vez una célula y perla sedimenten dentro de un micropocillo, no se desplazarán por el movimiento del fluido encima del micropocillo. Las dimensiones del micropocillo se pueden elegir de forma que el micropocillo tenga espacio suficiente para acomodar una perla y una célula de diversos tamaños sin ser sacadas por el movimiento del fluido encima del micropocillo. En una realización de la presente divulgación, la profundidad de los micropocillos puede variar desde aproximadamente 1 vez hasta aproximadamente 10 veces el diámetro de las células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos. En otras realizaciones, la profundidad del micropocillo es al menos 1 vez, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, o al menos 10 veces el diámetro de las células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos. En aún otras realizaciones, la profundidad del micropocillo es como máximo 10 veces, como máximo 5 veces, como máximo 4 veces, como máximo 3 veces, como máximo 2 veces, como máximo 1,5 veces, o como máximo 1 vez el diámetro de las células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos. En una realización, la profundidad del micropocillo es aproximadamente 2,5 veces el diámetro de las células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos. Los expertos en la técnica apreciarán que la profundidad del micropocillo puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 1,2 veces hasta aproximadamente 3,5 veces el diámetro de las células o perlas a atrapar dentro de los micropocillos).
Para micropocillos de geometría cilindrica, las relaciones adecuadas entre diámetro de perla y diámetro de micropocillo pueden variar desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1,0. En algunas realizaciones, la relación entre diámetro de perla y diámetro de micropocillo es al menos 0,1, al menos 0,2, al menos 0,3, al menos 0,4, al menos 0,5, al menos 0,6, al menos 0,7, al menos 0,9, al menos 0,95, o al menos 0,99. En algunas realizaciones, la relación entre diámetro de perla y diámetro de micropocillo es como máximo 0,99, como máximo 0,95, como máximo 0,9, como máximo 0,8, como máximo 0,7, como máximo 0,6, como máximo 0,5, como máximo 0,4, como máximo 0,3, como máximo 0,2, o como máximo 0,1. En algunas realizaciones, la relación entre diámetro de perla y diámetro de micropocillo puede tener un valor de 0,67. Los expertos en la técnica reconocerán que la relación entre diámetro de perla y diámetro de micropocillo puede tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente 075.
Para micropocillos de geometría cilindrica, las relaciones de aspecto adecuadas entre profundidad y diámetro de pocillo pueden variar desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 2. En algunas realizaciones, la relación de aspecto entre profundidad y diámetro de micropocillo es al menos 0,1, al menos 0,2, al menos 0,3, al menos 0,4, al menos 0,5, al menos 0,6, al menos 0,7, al menos 0,9, al menos 0,95, al menos 1,0, o al menos 1,05, al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos 1,4, al menos 1,5, al menos 1,6, al menos 1,7, al menos 1,8, al menos 1,9, o al menos 2,0. En algunas realizaciones, la relación de aspecto entre profundidad y diámetro de micropocillo es como máximo 2, como máximo 1,9, como máximo 1,8, como máximo 1,7, como máximo 1,6, como máximo 1,5, como máximo 1,4, como máximo 1,3, como máximo 1,2, como máximo 1,1, como máximo 1,1, como máximo 1,05, como máximo 1,0, como máximo 0,95, como máximo 0,9, como máximo 0,8, como máximo 0,7, como máximo 0,6, como máximo 0,5, como máximo 0,4, como máximo 0,3, como máximo 0,2, o como máximo 0,1. En algunas realizaciones, la relación de aspecto entre profundidad y diámetro de micropocillo puede tener un valor de 0,9. Los expertos en la técnica reconocerán que la relación de aspecto entre profundidad y diámetro de micropocillo puede tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente 0,94.
Alternativamente, la profundidad de los micropocillos se puede especificar en términos de dimensiones absolutas. En una realización de la presente divulgación, la profundidad de los micropocillos puede variar desde aproximadamente 5 jm hasta aproximadamente 100 jm . En otras realizaciones, la profundidad del micropocillo es al menos 5 jm , al menos 10 jm , al menos 20 jm , al menos 25 jm , al menos 30 jm , al menos 35 jm , al menos 40 jm , al menos 50 jm , al menos 60 jm , al menos 70 jm , al menos 80 jm , al menos 90 jm , o al menos 100 jm . En aún otras realizaciones, la profundidad del micropocillo es como máximo 100 jm , como máximo 90 jm , como máximo 80 jm , como máximo 70 jm , como máximo 60 jm , como máximo 50 jm , como máximo 40 jm , como máximo 35 jm , como máximo 30 jm , como máximo 25 jm , como máximo 20 jm , como máximo 10 jm , o como máximo 5 jm . En una realización, la profundidad del micropocillo es aproximadamente 30 jm . Los expertos en la técnica apreciarán que la profundidad del micropocillo puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 24 |jm hasta aproximadamente 36 |jm).
Los volúmenes de los micropocillos usados en los métodos, dispositivos y sistemas de la presente divulgación pueden variar desde aproximadamente 200 jm 3 hasta aproximadamente 800.000 jm 3. En algunas realizaciones, el volumen del micropocillo es al menos 200 jm 3, al menos 500 jm 3, al menos 1.000 jm 3, al menos 10.000 jm 3, al menos 25.000 jm 3, al menos 50.000 jm 3, al menos 100.000 jm 3, al menos 200.000 jm 3, al menos 300.000 jm 3, al menos 400.000 jm 3, al menos 500.000 jm 3, al menos 600.000 jm 3, al menos 700.000 jm 3, o al menos 800.000 jm 3. En otras realizaciones, el volumen del micropocillo es como máximo 800.000 jm 3, como máximo 700.000 jm 3, como máximo 600.000 jm 3, 500.000 jm 3, como máximo 400.000 jm 3, como máximo 300.000 jm 3, como máximo 200.000 jm 3, como máximo 100.000 jm 3, como máximo 50.000 jm 3, como máximo 25.000 jm 3, como máximo 10.000 jm 3, como máximo 1.000 jm 3, como máximo 500 jm 3, o como máximo 200 jm 3. En una realización, el volumen del micropocillo es aproximadamente 119.000 jm 3. Los expertos en la técnica apreciarán que el volumen del micropocillo puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 18.000 jm 3 hasta aproximadamente 350.000 jm 3).
Los volúmenes de los micropocillos usados en los métodos, dispositivos y sistemas de la presente divulgación se pueden caracterizar además en términos de la variación en volumen de un micropocillo a otro. En algunas realizaciones, el coeficiente de variación (expresado como un porcentaje) para el volumen del micropocillo puede variar desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 10%. En algunas realizaciones, el coeficiente de variación para el volumen del micropocillo puede ser al menos 1 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 4 %, al menos 5 %, al menos 6 %, al menos 7 %, al menos 8 %, al menos 9 %, o al menos 10 %. En algunas realizaciones, el coeficiente de variación para el volumen del micropocillo puede ser como máximo 10 %, como máximo 9 %, como máximo 8 %, como máximo 7 %, como máximo 6 %, como máximo 5 %, como máximo 4 %, como máximo 3 %, como máximo 2 %, o como máximo 1 %. El coeficiente de variación para el volumen del micropocillo puede tener cualquier valor dentro de un intervalo englobado por estos valores, por ejemplo, entre aproximadamente 1,5% y aproximadamente 6,5 %. En algunas realizaciones, el coeficiente de variación del volumen del micropocillo puede ser aproximadamente 2,5 %.
La relación entre el volumen de los micropocillos y el área superficial de las perlas (o y el área superficial de un soporte sólido al que se pueden unir los oligonucleótidos del marcador estocástico) usada en los métodos, dispositivos, kits y sistemas de la presente divulgación puede variar desde aproximadamente 2,5 y aproximadamente 2.500 (en unidades de micrómetros). En algunas realizaciones, la relación es al menos 2,5, al menos 5, al menos 10, al menos 100, al menos 500, al menos 750, al menos 1.000, al menos 1.250, al menos 1.500, al menos 1.750, al menos 2.000, al menos 2.250, o al menos 2.500. En otras realizaciones, la relación es como máximo 2.500, como máximo 2.250, como máximo 2.000, como máximo 1.750, como máximo 1.500, como máximo 1.250, como máximo 1.000, como máximo 750, como máximo 500, como máximo 100, como máximo 10, como máximo 5, o como máximo 2,5. En una realización, la relación es aproximadamente 67,5. Los expertos en la técnica apreciarán que la relación de volumen entre el micropocillo y el área superficial de la perla (o soporte sólido usado para inmovilización) puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 120).
Matrices aleatorias y ordenadas de micropocillos: En algunas realizaciones, los pocillos de la pluralidad de micropocillos se pueden disponer en una matriz unidimensional, bidimensional o tridimensional, donde las matrices tridimensionales se pueden lograr, por ejemplo, apilando una serie de dos o más matrices bidimensionales (es decir, por apilamiento de dos o más sustratos que comprenden matrices de micropocillos). En general, el patrón y la separación entre los pocillos se eligen para optimizar la eficiencia de atrapamiento de una célula individual y perla individual en cada pocillo, así como para maximizar el número de pocillos por unidad de área del sustrato. Los micropocillos se pueden distribuir según una variedad de patrones aleatorios o no aleatorios, por ejemplo, se pueden distribuir completamente al azar a través de la superficie del sustrato, o se pueden disponer en una rejilla cuadrada, rejilla rectangular, rejilla hexagonal, patrón circular, o similares.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la distancia centro a centro (o "paso", o "separación") entre los pocillos puede variar desde aproximadamente 15 jm hasta aproximadamente 75 jm . En otras realizaciones, la separación entre los pocillos es al menos 15 jm , al menos 20 jm , al menos 25 jm , al menos 30 jm , al menos 35 jm , al menos 40 jm , al menos 45 jm , al menos 50 jm , al menos 55 jm , al menos 60 jm , al menos 65 jm , al menos 70 jm , o al menos 75 jm . En aún otras realizaciones, la separación de micropocillos es como máximo 75 jm , como máximo 70 jm , como máximo 65 jm , como máximo 60 jm , como máximo 55 jm , como máximo 50 jm , como máximo 45 jm , como máximo 40 jm , como máximo 35 jm , como máximo 30 jm , como máximo 25 jm , como máximo 20 jm , o como máximo 15 jm . En una realización, la separación de micropocillos es aproximadamente 55 jm . Los expertos en la técnica apreciarán que la separación de micropocillos puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 18 jm hasta aproximadamente 72 jm ).
El número total de pocillos en la pluralidad de micropocillos se determina por el patrón y la separación de los pocillos y las dimensiones globales del sustrato. En una realización de la presente divulgación, el número de micropocillos en la matriz puede variar desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 5.000.000 o más. En otras realizaciones, el número de micropocillos en la matriz es al menos 10, al menos 96, al menos 384, al menos 1.536, al menos 2.500, al menos 5.000, al menos 10.000, al menos 25.000, al menos 50.000, al menos 75.000, al menos 100.000, al menos 200.000, al menos 300.000, al menos 400.000, al menos 500.000, al menos 600.000, al menos 700.000, al menos 800.000, al menos 900.000, al menos 1.000.000, al menos 2,500.000, o al menos 5.000.000. En aún otras realizaciones, el número de micropocillos en la matriz es como máximo 5.000.000, como máximo 2.500.000, como máximo 1.000.000, como máximo 900.000, como máximo 800.000, como máximo 700.000, como máximo 600.000, como máximo 500.000, como máximo 400.000, como máximo 300.000, como máximo 200.000, como máximo 100.000, como máximo 75.000, como máximo 50.000, como máximo 25.000, como máximo 10.000, como máximo 5.000, como máximo 2.400, como máximo 1.536, como máximo 384, como máximo 96 pocillos, o como máximo 10 pocillos. En una realización, el número de micropocillos en la pluralidad de micropocillos es aproximadamente 96. En una realización, el número de micropocillos en la pluralidad de micropocillos es aproximadamente 10.000. En otra realización más, el número de micropocillos es aproximadamente 150.000. Los expertos en la técnica apreciarán que el número de micropocillos en la pluralidad de micropocillos puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, aproximadamente 144.000 micropocillos).
Características superficiales del sustrato de micropocillos: En algunas realizaciones, la pluralidad de micropocillos pueden comprender características superficiales entre los micropocillos que se diseñan para ayudar a guiar las células y perlas en los pocillos o prevenir que sedimenten sobre las superficies del sustrato entre los pocillos. Los ejemplos de características superficiales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, características superficiales redondeadas, abovedadas, en cresta, o en pico que rodean los pocillos o cubren la superficie entre los pocillos. Las FIGS. 7A-B y 8A-B muestran micrografías de matrices de micropocillos en las que los pocillos se separan por crestas abovedadas (FIG. 7B, 501) para minimizar el número de células o perlas que sedimentan sobre las superficies entre los pocillos.
Fabricación de micropocillos: Los micropocillos se pueden fabricar usando cualquiera de varias técnicas de fabricación conocidas para los expertos en la técnica. Los ejemplos de métodos de fabricación que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, técnicas de micromecanizado en volumen tales como fotolitografía y ataque químico en húmedo, ataque con plasma, o ataque profundo con iones reactivos; micromoldeo y micro-estampado en relieve; micromecanizado láser; impresión 3d u otros procesos de fabricación por escritura directa usando materiales curables; y técnicas similares.
Los micropocillos se pueden fabricar a partir de cualquiera de varios materiales de sustrato conocidos para los expertos en la técnica, donde la elección de material normalmente depende de la elección de la técnica de fabricación, y viceversa. Los ejemplos de materiales adecuados incluyen, pero no se limitan a, silicio, sílice fundida, vidrio, polímeros (por ejemplo, agarosa, gelatina, hidrogeles, polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), policarbonato (PC), poliestireno (PS), polipropileno (PP), polietileno (PE), polietileno de alta densidad (HDPE), poliimida, polímeros de olefina cíclica (COP), copolímeros de olefina cíclica (COC), poli(tereftalato de etileno) (PET), adhesivos ópticos (por ejemplo, Norland Optical Adhesive 63), resinas epoxi, resinas basadas en tiol-eno, metales o películas metálicas (por ejemplo, aluminio, acero inoxidable, cobre, níquel, cromo y titanio), y similares. Normalmente, se desea un material hidrófilo para la fabricación de las matrices de micropocillos (por ejemplo, para potenciar la humectabilidad y minimizar la unión no específica de células y otro material biológico), pero también se pueden usar materiales hidrófobos que se pueden tratar o recubrir (por ejemplo, por tratamiento con plasma de oxígeno, o injertando una capa superficial de poli(óxido de etileno)). Se puede desear el uso de materiales hidrófilo porosos para la fabricación de la matriz de micropocillos para facilitar el ascenso capilar /ventilación de burbujas de aire atrapadas en el dispositivo. En algunas realizaciones, los micropocillos se fabrican de un único material. En otras realizaciones, los micropocillos pueden comprender dos o más materiales diferentes que se han unido juntos o se han unido mecánicamente.
Los micropocillos se pueden fabricar usando sustratos de cualquiera de una variedad de tamaños y formas. En algunas realizaciones, por ejemplo, la forma (o huella) del sustrato dentro del que se fabrican los micropocillos puede ser de forma cuadrada, rectangular, circular, o irregular. En algunas realizaciones, la huella del sustrato de los micropocillos será similar a la de una placa de microtitulación. En algunas realizaciones, la huella del sustrato de micropocillos será similar a la de portaobjetos convencionales de microscopio, por ejemplo, aproximadamente 75 mm de largo x 25 mm de ancho (aproximadamente 3" de largo x 1" de ancho), o aproximadamente 75 mm de largo x 50 mm de ancho (aproximadamente 3" de largo x 2" de ancho).
En algunas realizaciones, el espesor del sustrato dentro del que se fabrican los micropocillos puede variar desde aproximadamente 0,1 mm de espesor hasta aproximadamente 10 mm de espesor, o más. En algunas realizaciones, el espesor del sustrato de los micropocillos puede ser al menos 0,1 mm de espesor, al menos 0,5 mm de espesor, al menos 1 mm de espesor, al menos 2 mm de espesor, al menos 3 mm de espesor, al menos 4 mm de espesor, al menos 5 mm de espesor, al menos 6 mm de espesor, al menos 7 mm de espesor, al menos 8 mm de espesor, al menos 9 mm de espesor, o al menos 10 mm de espesor. En algunas realizaciones, el espesor del sustrato de los micropocillos puede ser como máximo 10 mm de espesor, como máximo 9 mm de espesor, como máximo 8 mm de espesor, como máximo 7 mm de espesor, como máximo 6 mm de espesor, como máximo 5 mm de espesor, como máximo 4 mm de espesor, como máximo 3 mm de espesor, como máximo 2 mm de espesor, como máximo 1 mm de espesor, como máximo 0,5 mm de espesor, o como máximo 0,1 mm de espesor. En algunas realizaciones, el espesor del sustrato de los micropocillos será aproximadamente 1 mm de espesor. Como será evidente para los expertos en la técnica, el espesor del sustrato de los micropocillos puede ser cualquier valor dentro de estos intervalos, por ejemplo, el espesor del sustrato de los micropocillos puede ser entre aproximadamente 0,2 mm y aproximadamente 9,5 mm.
En algunas realizaciones, el sustrato en el que se fabrican los micropocillos puede él mismo comprender una geometría tridimensional, por ejemplo, el sustrato puede ser esférico, cilíndrico, elíptico, cónico, semiesférico, cúbico, rectangular, o poliédrico, o puede tener una geometría tridimensional irregular.
Recubrimientos de micropocillos y sustratos: Se puede usar una variedad de tratamientos superficiales y técnicas de modificación superficial para alterar las propiedades de las superficies de micropocillos, por ejemplo, para mejorar la humectabilidad de y/o reducir adherencia de perlas y células a superficies de micropocillos o sustratos. Los ejemplos de tratamientos superficiales adecuados incluyen, pero no se limitan a, tratamientos con plasma de oxígeno para convertir las superficies de material hidrófobo en más hidrófilas, el uso de técnicas de ataque en húmedo o seco para suavizar (o rugosificar) superficies de vidrio y silicio, y adsorción (por ejemplo, adsorción no específica o adsorción electrostática) o injerto covalente de poli(óxido de etileno), polietilenglicol (PEG), poli-L-lisina-PEG, u otras capas de polímero (por ejemplo, un poliol pluronic, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (pHEMA o poli-HEMA)), polisorbatos (por ejemplo, tWeen 20, tween 80, tween 60), o proteínas (por ejemplo, albúmina de suero bovino), a superficies de sustrato para convertirlas en más hidrófilas (o más hidrófobas en algunos casos) y menos propensas a la incrustación a través de la adsorción no específica de biomoléculas y células. En algunas realizaciones, se puede usar la aplicación de recubrimientos superficiales para convertir las superficies del sustrato en tanto no tóxicas y como no adherentes a las células. En algunas realizaciones, se puede usar la aplicación de recubrimiento superficial o técnicas de modificación para neutralizar las superficies cargadas. En algunas realizaciones, se puede usar la aplicación de recubrimiento superficial o técnicas de modificación para añadir carga a superficies de otro modo neutras. En algunas realizaciones, se pueden usar reacciones de silano para injertar grupos funcionales químicamente reactivos en superficies de silicio y vidrio de otro modo inertes, etc. Se pueden usar técnicas de fotodesprotección para activar selectivamente grupos funcionales químicamente reactivos en localizaciones específicas en la estructura de micropocillos, por ejemplo, se puede usar la adición selectiva o activación de grupos funcionales químicamente reactivos tales como aminas primarias o grupos carboxilo sobre las paredes internas de los micropocillos para acoplar covalentemente sondas de oligonucleótidos, péptidos, proteínas, u otras biomoléculas a las paredes de los micropocillos. En general, la elección del tratamiento superficial o modificación superficie utilizada dependerá tanto del tipo de la propiedad superficial que se desea como del tipo de material del que están hechos los micropocillos.
Los polioles Pluronic® son tensioactivos de copolímeros de bloque basados en óxido de etileno y óxido de propileno que pueden proporcionar ventajas en términos de humectabilidad mejorada. Los ejemplos de productos Pluronic® comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a, Pluronic® 10R5, Pluronic® 17R2, Pluronic® 17R4, Pluronic® 25R2, Pluronic® 25R4, Pluronic® 31R1, Pluronic® F 108 Cast Solid Surfactant, Pluronic® F 108 NF, Pluronic® F 108 Pastille, Pluronic® F 108NF Prill Poloxamer 338, Pluronic® F 127 NF, Pluronic® F 127 NF 500 BHT Prill, Pluronic® F 127 NF Prill Poloxamer 407, Pluronic® F 38, Pluronic® F 38 Pastille, Pluronic® F 68, Pluronic® F 68 LF Pastille, Pluronic® F 68 NF, Pluronic® F 68 NF Prill Poloxamer 188, Pluronic® F 68 Pastille, Pluronic® F 77, Pluronic® F 77 Micropastille, Pluronic® F 87, Pluronic® F 87 NF, Pluronic® F 87 NF Prill Poloxamer 237, Pluronic® F 88, Pluronic® F 88 Pastille, Pluronic® FT L 61, Pluronic® L 10, Pluronic® L 101, Pluronic® L 121, Pluronic® L 31, Pluronic® L 35, Pluronic® L 43, Pluronic® L 61, Pluronic® L 62, Pluronic® L 62 LF, Pluronic® L 62D, Pluronic® L 64, Pluronic® L 81, Pluronic® L 92, Pluronic® L44 NF INH surfactant Poloxamer 124, Pluronic® N 3, Pluronic® P 103, Pluronic® P 104, Pluronic® P 105, Pluronic® P 123 Surfactant, Pluronic® P 65, Pluronic® P 84 y Pluronic® P 85, disponibles de BASF (Florham Park, NJ).
Los ejemplos de detergentes de ión bipolar que pueden ser ventajosos para mejorar la humectabilidad y/o reducir la adherencia de perlas y células a superficies de micropocillos o sustratos cuando se incluyen en tampones de ensayo incluyen, pero no se limitan a, 1-dodecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 3-(4-terc-butil-1-piridinio)-1-propanosulfonato, 3-(N,N-dimetilmirisilamonio)propanosulfonato, 3-(N,N-dimetilmirisilamonio)propanosulfonato, 3-(N,N-dimetilmirisilamonio)propanosulfonato, 3-(N,N-dimetiloctadecilamonio)propanosulfonato, sal interna de 3-(N,N-dimetiloctilamonio)propanosulfonato, 3-(N,N-dimetilpalmitilamonio)propanosulfonato, 3-(1-piridinio)-1-propanosulfonato, 3-(bencildimetilamonio)propanosulfonato BioXtra, detergente de ión bipolar de la sal interna de 3-(decildimetilamonio)-propano-sulfonato, 3-(N,N-dimetiloctilamonio)propanosulfonato, 3-[N,N-dimetil(3-palmitoilaminopropil)amonio]-propanosulfonato, L-a-lisofosfatidilcolina de Glycine m ax(soja), L-a-lisofosfatidilcolina de cerebro bovino, L-a-lisofosfatidilcolina de yema de huevo, L-a-lisofosfatidilcolina de soja, ASB-14, ASB-C80, C7BzO, CHAPS, hidrato de CHAPS, hidrato de CHAPS BioReagent, hidrato de CHAPS BioXtra, CHAPSO, CHAPSO BioXtra, DDMAB, sulfonato de dimetiletilamoniopropano, detergente EMPIGEN® BB, hidrato de miltefosina, miltefosina, disolución de N-óxido de N,N-dimetildodecilamina BioUltra, N-óxido de N,N-dimetildodecilamina, N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato, N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato, O-(decilfosforil)colina, O-(octilfosforil)colina, poli(anhídrido maleico-alt-1-deceno), derivado 3-de (dimetilamino)-1-propilamina BioReagent, poli(anhídrido maleico-alt-1-tetradeceno), derivado de 3-(dimetilamino)-1-propilamina BioReagent, monohidrato de 2,3-dimercaptopropanosulfonato de sodio, y Surfactin de Bacillus subtilis, disponible de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Los ejemplos de otros detergentes que pueden ser ventajosos para mejorar la humectabilidad y/o reducir la adherencia de perlas y células a superficies de micropocillos o sustratos cuando se incluyen en tampón de ensayos incluyen, pero no se limitan a, detergentes aniónicos, catiónicos y no iónicos. Los detergentes no iónicos incluyen éteres de poli(oxietileno) y polímeros relacionados (por ejemplo, Brij®, TWEEN®, TRITON®, TRITON X-100 e IGEPAL® CA-630), sales biliares y detergentes glucosídicos.
Sellado de micropocillos: En algunas realizaciones, puede ser ventajoso sellar las aberturas de los micropocillos durante, por ejemplo, las etapas de lisis celular, para prevenir la hibridación cruzada del ácido nucleico diana entre micropocillos adyacentes. Se puede sellar o tapar un micropocillo (o pluralidad de micropocillos) usando, por ejemplo, una membrana flexible u hoja de material sólido (es decir, una placa o bandeja) que se sujeta contra la superficie del sustrato del micropocillo, o una perla adecuada, donde el diámetro de la perla es mayor que el diámetro del micropocillo. Un sellado formado usando una membrana flexible u hoja de material sólido puede comprender, por ejemplo, membranas nanoporosas inorgánicas (por ejemplo, óxidos de aluminio), membranas de diálisis, portaobjetos de vidrio, cubreobjetos, películas elastoméricas (por ejemplo, PDMS), o películas de polímero hidrófilo (por ejemplo, una película de polímero recubierta con una película delgada de agarosa que se ha hidratado con tampón de lisis).
En algunas realizaciones, los micropocillos (o pocillos) se pueden sellar desplazando el fluido sobre los pocillos con un fluido inmiscible o material que experimenta un cambio de fase tras un estímulo físico o químico apropiado. Los ejemplos de fluidos y materiales adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, ceras, disoluciones de polímero, adhesivos ópticos (por ejemplo, Norland 63 o 81) que responden a luz UV, y disoluciones del poliol pluronic que pueden experimentar transiciones de fase disolución-gel con Tms próximas a temperatura ambiente dependiendo de la concentración y peso molecular del polímero.
La perlas usadas para tapar los micropocillos pueden comprender, por ejemplo, perlas de dextrano reticulado (por ejemplo, Sephadex). El dextrano reticulado puede variar desde aproximadamente 10 micrómetros hasta aproximadamente 80 micrómetros. Las perlas de dextrano reticulado usadas para tapar pueden tener desde 20 micrómetros hasta aproximadamente 50 micrómetros. En algunas realizaciones, las perlas pueden ser, por ejemplo, al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % más grandes que el diámetro de los micropocillos. Alternativamente, las perlas usadas para tapar pueden ser como máximo aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % más grandes que el diámetro de los micropocillos.
En algunas realizaciones, el sellado o tapa puede permitir que el tampón entre y salga de los micropocillos, mientras que previene que las macromoléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos) migren fuera del pocillo. En algunas realizaciones, se puede bloquear que una macromolécula de al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos migre dentro o fuera de los micropocillos por el sellado o tapa. En algunas realizaciones, se puede bloquear que una macromolécula de como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos migre dentro o fuera de los micropocillos por el sellado o tapa.
Alternativas a los micropocillos: En algunas realizaciones, se pueden compartimentalizar las células individuales y perlas usando alternativas a los micropocillos, por ejemplo, se podrían confinar una perla individual y célula individual dentro de una única gotita en una emulsión (por ejemplo, en un sistema microfluídico digital de gotitas). Alternativamente, las células se podrían confinar posiblemente dentro de perlas porosas que ellas mismas comprenden la pluralidad de marcadores estocásticos anclados. Como se entenderá por los expertos en la técnica, las células y perlas individuales pueden ser compartimentalizadas en cualquier tipo de recipiente, microrecipiente, cámara de reacción, recipiente de reacción, o similares. Así, en algunas realizaciones, se pueden realizar ensayos de marcado estocástico de células individuales o de creación de códigos de barras moleculares sin el uso de micropocillos. En algunas realizaciones, se pueden realizar ensayos de marcado estocástico de células individuales o de creación de códigos de barras moleculares sin el uso de ningún recipiente físico, por ejemplo, incorporando las células y perlas en estrecha proximidad entre sí dentro de una capa de polímero o capa de gel para crear una barrera difusional entre diferentes pares de célula/perla.
Distribución de perlas dentro de micropocillos: En algunas realizaciones, las perlas que comprenden bibliotecas de marcadores estocásticos anclados se pueden distribuir entre una pluralidad de micropocillos como parte del procedimiento de ensayo. En algunas realizaciones, las perlas se pueden cargar previamente en una pluralidad de micropocillos como parte del proceso de fabricación para o celdas de flujo o cartuchos que incorporan un sustrato que comprende una pluralidad de micropocillos. En algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen una perla individual puede estar entre 1 % y 100 %. En algunas realizaciones, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos puede contener una perla individual. En algunas realizaciones, como máximo 100 %, como máximo 99 %, como máximo 95 %, como máximo 90 %, como máximo 80 %, como máximo 70 %, como máximo 60 %, como máximo 50 %, como máximo 40 %, como máximo 30 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener una perla individual.
Distribución de células dentro de micropocillos: En muchas realizaciones, las células se pueden distribuir entre una pluralidad de micropocillos como parte del procedimiento de ensayo. En algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen una célula individual puede ser entre 1 % y 100 %. En algunas realizaciones, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos puede contener una célula individual. En algunas realizaciones, como máximo 100 %, como máximo 99 %, como máximo 95 %, como máximo 90 %, como máximo 80 %, como máximo 70 %, como máximo 60 %, como máximo 50 %, como máximo 40 %, como máximo 30 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener una célula individual.
Micropocillos que contienen tanto una célula individual como una perla individual: En muchas realizaciones, las células y perlas se pueden distribuir entre una pluralidad de micropocillos de forma que una fracción de los micropocillos contenga tanto una célula individual como una perla individual. En algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen tanto una célula individual como una perla individual puede estar entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 100 %. En algunas realizaciones, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener tanto una célula individual como una perla individual. En algunas realizaciones, como máximo 100%, como máximo 99%, como máximo 95 %, como máximo 90 %, como máximo 80 %, como máximo 70 %, como máximo 60 %, como máximo 50 %, como máximo 40 %, como máximo 30 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener tanto una célula individual como una perla individual.
Elementos fijos mecánicos que comprenden sustratos con micropocillos:
Cuando se realizan manualmente ensayos de marcado estocástico de células individuales multiplexados o de creación de códigos de barras moleculares, puede ser conveniente montar el sustrato de los micropocillos en un elemento fijo mecánico (FIGS. 9A-B, 10, 11) para crear una cámara de reacción que facilita el pipeteado o la dispensación de suspensiones de células y reactivos de ensayo sobre el sustrato. En el ejemplo ilustrado en la FIG. 11, el elemento fijo abisagrado acepta una matriz de micropocillos fabricada sobre un espesor de 1 mm de espesor, y proporciona soporte mecánico en forma de una junta de silicona para confinar los reactivos de ensayo a una cámara de reacción que tiene 16 mm de ancho x 35 mm de largo x aproximadamente 1 mm de profundidad, permitiendo así el uso de 800 uL a 1 mL de suspensión de células y suspensión de perlas (que comprende marcadores estocásticos basados en perlas) para realizar el ensayo.
El elemento fijo puede consistir, por ejemplo, en placas rígidas superior e inferior mecanizadas (por ejemplo, aluminio) y una junta compresible (por ejemplo, silicona, polidimetilsiloxano) para crear las paredes de la cámara o pocillo. Las características de diseño incluyen: (i) bordes de abertura achaflanados y espacio libre para girar los objetivos del microscopio dentro y fuera de posición según se necesite (para ver la matriz de micropocillos a diferentes aumentos), (ii) compresión controlada de la junta de silicona para garantizar la formación uniforme repetible de un sellado a prueba de fugas con el sustrato de matrices de micropocillos, (iii) sujetadores cautivos para la conveniente operación, (iv) un mecanismo de abrazadera de localización para el posicionamiento seguro y repetible de la matriz, y (v) abertura conveniente para la retirada de la matriz durante las etapas de aclarado.
Las placas superior e inferior se fabricar usando cualquiera de una variedad de técnicas (por ejemplo, mecanizado convencional, mecanizado por CNC, moldeo por inyección, impresión 3D, etc.) usando una variedad de materiales (por ejemplo, aluminio, aluminio anodizado, acero inoxidable, teflón, poli(metacrilato de metilo) (PMMA), policarbonato (PC), o materiales de polímero rígidos similares).
Las placas superior e inferior y la junta de silicona (polidimetilsiloxano; PDMS) se pueden configurar para crear múltiples cámaras (véase la FIG. 10) para realizar controles y experimentos (o repetir experimentos) en paralelo. La junta se puede moldear de PDMS o material elastomérico similar usando, por ejemplo, un molde de teflón que incluye ángulos de inclinación para las paredes verticales de la junta para proporcionar buenas características de liberación. Alternativamente, los moldes se pueden mecanizar de aluminio u otros materiales (por ejemplo, delrin negro, poliéterimida (ultem), etc.), y recubrir con un material tal como teflón, si fuera necesario, para proporcionar buenas características de liberación. Los diseños del molde de la junta pueden ser invertidos, es decir, de manera que la superficie superior de la parte moldeada (es decir, la superficie en la interfase con un portaobjetos de vidrio u oblea de silicio usada para cubrir el molde durante la colada) se vuelva la superficie para crear una junta con el sustrato de los micropocillos durante uso, evitando así los posibles problemas con la rugosidad superficial del molde y la contaminación superficial en crear una superficie de junta lisa (para garantizar un sellado a prueba de fugas con el sustrato), y proporcionando también una elección flexible de materiales de sustrato y la opción de pre-ensamblaje usando el sustrato de los micropocillos como base durante la colada. Los diseños del molde de la junta también pueden incluir crestas que concentran la fuerza en los límites de las áreas del pocillo, es decir, la(s) mesa(s) central(es) en el molde (que forman el (los) pocillo(s)) tienen crestas elevadas en las localizaciones que llegan a ser el perímetro del (de los) pocillo(s), de manera que una cubierta situada encima del molde después del llenado descansa sobre una pequeña área de contacto en la localización precisa donde el buen perfil del borde es crítico para formar un sellado a prueba de fugas entre la junta y el sustrato durante de uso.
Dispositivos y sistemas de instrumentos:
La presente divulgación también incluye dispositivos, sistemas de instrumentos y consumibles para soportar la automatización de ensayos de marcado estocástico de células individuales duplexados y de creación de códigos de barras moleculares. Dichos sistemas pueden incluir cartuchos consumibles que incorporan micropocillos integrados con celdas de flujo, así como la instrumentación necesaria para proporcionar control y funcionalidad de análisis tal como (i) control fluídico, (ii) distribución de células o perlas y mecanismos de recogida, (iii) mecanismos de lisis celular, (iv) control de campo magnético, (v) control de temperatura, (vi) capacidad de obtención de imágenes, y (vii) procesamiento de imágenes. En algunas realizaciones, la entrada para el sistema comprende una muestra de células y la salida comprende una suspensión de perlas que comprende perlas que tienen oligonucleótidos fijados que incorporan marcadores de muestra, marcadores celulares, o marcadores moleculares. En otras realizaciones, el sistema de instrumentos puede incluir funcionalidad adicional, tal como capacidad de ciclado térmico para realizar amplificación por PCR, en cuyo caso la entrada para el sistema comprende una muestra de células y la salida comprende un biblioteca de oligonucleótidos resultante de la amplificación de los oligonucleótidos incorporando marcadores de muestra, marcadores celulares, o marcadores moleculares que se fijaron originalmente a perlas. En aún otras realizaciones, el sistema también puede incluir la capacidad de secuenciación, con o sin la necesidad de amplificación de oligonucleótidos, en cuyo caso la entrada para el sistema es una muestra de células y la salida comprende un conjunto de datos que comprende además las secuencias de todos los marcadores de muestra, marcadores celulares, o marcadores moleculares asociados a las secuencias diana de interés.
Celdas de flujo: En muchas realizaciones del sistema de ensayo automatizado, el sustrato de los micropocillos se empaquetará dentro de una celda de flujo (FIG. 12) que proporciona interfaz conveniente con el resto del sistema de manipulación de fluidos y facilitan el intercambio de fluidos, por ejemplo, suspensiones de células y de perlas, tampones de lisis, tampones de aclarado, etc., que se suministran a los micropocillos. En muchas realizaciones, la celda de flujo se puede diseñar para facilitar la distribución uniforme de células y perlas a través de la pluralidad de micropocillos. Las características de diseño pueden incluir: (i) uno o más puertos de entrada para introducir muestras de células, suspensiones de perlas, u otros reactivos de ensayo, (ii) una o más cámaras de micropocillos diseñadas para proporcionar llenado uniforme e intercambio de fluidos eficiente mientras se minimizan remolinos de retorno o zonas muertas, y (iii) uno o más puertos de salida para el suministro de fluidos a un punto de recogida de muestras o un recipiente de residuos. En algunas realizaciones, el diseño de la celda de flujo puede incluir una pluralidad de cámaras de micropocillos que interconectan con una pluralidad de matrices de micropocillos sobre un sustrato individual, o con una pluralidad de sustratos de matrices de micropocillos, de forma que se pueden procesar en paralelo una o más muestras de células diferentes. En algunas realizaciones, el diseño de la celda de flujo, por ejemplo, la disposición de los canales de fluido y cámaras, se puede ajustar de manera que los fluidos tengan acceso a diferentes patrones de micropocillos (es decir, patrones configurables de micromatrices) en un diseño dado.
En algunas realizaciones, el diseño de la celda de flujo puede incluir además características para crear perfiles de velocidades de flujo uniformes, es decir, "flujo pistón", a través de la anchura de la cámara de micropocillo para proporcionar suministro más uniforme de células y perlas a los micropocillos, por ejemplo, usando una barrera porosa situada cerca de la entrada de la cámara y aguas arriba de los micropocillos como un "difusor de flujo", o dividiendo cada cámara de micropocillo en varias subsecciones que cubren conjuntamente la misma área de matriz total, pero a través de la que circula en paralelo la corriente de fluido de entrada dividida.
Los ejemplos no limitantes de diseños de celda de flujo se ilustran en la FIG. 13A, e incluyen diseños que tienen entradas y salidas centradas en donde las entradas y las salidas son decrecientes en o dos o tres dimensiones; los diseños que tienen entradas y salidas que están descentradas y en donde las entradas y salidas son decrecientes en o dos o tres dimensiones; y diseños que tienen múltiples entradas y/o salidas, en donde algunas o todas de las entradas y salidas pueden estar descentradas. En algunas realizaciones, las entradas también pueden servir de salidas para facilitar la facilidad de diseño y ensamblaje, así como proporcionar mejoras relacionadas con la simetría en la eficiencia de recuperación de perlas.
Las FIGS. 13B-C ilustran esquemáticamente un diseño alternativo de celda de flujo en el que puertos de entrada y de salida conectan con una cámara de matriz de micropocillos por canales de fluido de entrada y salida inclinados decrecientes. La FIG. 13B ilustra una vista desde arriba del diseño de celda de flujo. La FIG. 13C ilustra una vista lateral en sección transversal de la celda de flujo, en la que los canales de entrada y salida forman cada uno un ángulo con respecto al plano del sustrato de micropocillos. En algunas realizaciones, la altura vertical (es decir, la profundidad) de cámara de matriz de micropocillos está normalmente en el orden de aproximadamente 1 mm (pero puede tomar cualquier valor dentro de los intervalos especificados en cualquier parte en la presente divulgación), y por tanto permite perfiles de velocidad de flujo parabólico cuando se usa presión para guiar el flujo de fluidos (FIG. 13c ). El uso de flujo parabólico en combinación con inyecciones intercaladas de aire, como se describe en cualquier parte en la presente divulgación, permite que la interfase líquido/aire barra la superficie del sustrato de micropocillos entre inyecciones de fluido, y pueda proporcionar ventajas en términos de mejorar la eficiencia de carga de células y/o perlas. En algunas realizaciones, los ángulos formados por los canales de entrada y salida pueden ser los mismos. En algunas realizaciones, los ángulos formados por los canales de entrada y salida pueden ser diferentes. En algunas realizaciones, el ángulo formado por los canales de fluido de entrada y/o salida pueden variar desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 75 grados con respecto al plano del sustrato de micropocillos. En algunas realizaciones, el ángulo puede ser al menos 15 grados, al menos 20 grados, al menos 25 grados, al menos 30 grados, al menos 35 grados, al menos 40 grados, al menos 45 grados, al menos 50 grados, al menos 55 grados, al menos 60 grados, al menos 65 grados, al menos 70 grados, o al menos 75 o más grados. En algunas realizaciones, el ángulo puede ser como máximo 75 grados, como máximo 70 grados, como máximo 65 grados, como máximo 60 grados, como máximo 55 grados, como máximo 50 grados, como máximo 45 grados, como máximo 40 grados, como máximo 35 grados, como máximo 30 grados, como máximo 25 grados, como máximo 20 grados, o como máximo 15 grados. En algunas realizaciones, el ángulo formado por los canales de fluido de entrada y/o salida puede variar desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 60 grados con respecto al plano del sustrato de micropocillos. En algunas realizaciones, el ángulo formado por los canales de fluido de entrada y/o salida puede ser aproximadamente 45 grados.
En algunas realizaciones, la celda de flujo puede constituir un componente fijo del sistema de instrumentos. En algunas realizaciones, la celda de flujo puede ser extraíble del sistema de instrumentos. En algunas realizaciones, la celda de flujo puede ser un dispositivo de un solo uso. En otras realizaciones, la celda de flujo puede ser un dispositivo multiuso.
Dimensiones del canal de fluido de la celda de flujo: En general, las dimensiones de los canales de fluido y la(s) cámara(s) de micropocillos en los diseños de celda de flujo se pueden optimizar para (i) proporcionar suministro uniforme de células y perlas a los micropocillos, y (ii) para minimizar el consumo de muestra y reactivo. En algunas realizaciones, la anchura de los canales de fluido o las cámaras de micropocillos será entre 50 pm y 20 mm. En otras realizaciones, la anchura de los canales de fluido o las cámaras de micropocillos pueden ser al menos 50 pm, al menos 100 pm, al menos 200 pm, al menos 300 pm, al menos 400 pm, al menos 500 pm, al menos 750 pm, al menos 1 mm, al menos 2,5 mm, al menos 5 mm, al menos 10 mm, al menos 20 mm, al menos 50 mm, al menos 100 mm, o al menos 150 mm. En aún otras realizaciones, la anchura de los canales de fluido o las cámaras de micropocillos puede ser como máximo 150 mm, como máximo 100 mm, como máximo 50 mm, como máximo 20 mm, como máximo 10 mm, como máximo 5 mm, como máximo 2,5 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 pm, como máximo 500 pm, como máximo 400 pm, como máximo 300 pm, como máximo 200 pm, como máximo 100 pm, o como máximo 50 pm. En una realización, la anchura de los canales de fluido es aproximadamente 2 mm. Los expertos en la técnica apreciarán que la anchura de los canales de fluido o las cámaras de micropocillos puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 250 pm hasta aproximadamente 10 mm).
En algunas realizaciones, la profundidad de los canales de fluido será entre 50 pm y 5 mm. En otras realizaciones, la profundidad de los canales de fluido puede ser al menos 50 pm, al menos 100 pm, al menos 200 pm, al menos 300 pm, al menos 400 pm, al menos 500 pm, al menos 750 pm, al menos 1 mm, al menos 1,25 mm, al menos 1,5 mm, al menos 1,75 mm, al menos 2 mm, al menos 2,25 mm, al menos 2,5 mm, al menos 2,75 mm, al menos 3 mm, al menos 4 mm, o al menos 5 mm. En aún otras realizaciones, la profundidad de los canales de fluido puede ser como máximo 5 mm, como máximo 4 mm, como máximo 3 mm, como máximo 2,75 mm, como máximo 2,5 mm, como máximo 2,25 mm, como máximo 2 mm, como máximo 1,75 mm, como máximo 1,5 mm, como máximo 1,25 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 pm, como máximo 500 pm, como máximo 400 pm, como máximo 300 pm, como máximo 200 pm, como máximo 100 pm, o como máximo 50 pm. En una realización, la profundidad de los canales de fluido es aproximadamente 1 mm. Los expertos en la técnica apreciarán que la profundidad de los canales de fluido puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 800 pm hasta aproximadamente 3 mm).
Fabricación de celdas de flujo: La celda de flujo se puede fabricar como una parte separada y posteriormente o se sujeta mecánicamente con o se une permanentemente al sustrato de matrices de micropocillos. Los ejemplos de técnicas de fabricación adecuadas incluyen mecanizado convencional, mecanizado CNC, moldeo por inyección, impresión 3D, alineamiento y laminación de una o más capas de películas de polímero cortadas por láser o hilera, o cualquiera de varias técnicas de microfabricación tales como fotolitografía y ataque químico en húmedo, ataque en seco, ataque profundo de iones reactivos, o micromecanizado láser. En algunas realizaciones, la capa fluídica se imprime 3D de un material elastomérico.
Las celdas de flujo se pueden fabricar usando una variedad de materiales conocidos por los expertos en la técnica. En general, la elección del material usado dependerá de la elección de la técnica de fabricación usada, y viceversa. Los ejemplos de materiales adecuados incluyen, pero no se limitan a, silicio, sílice fundida, vidrio, cualquiera de una variedad de polímeros, por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), policarbonato (PC), poliestireno (PS), polipropileno (PP), polietileno (PE), polietileno de alta densidad (HDPE), poliimida, polímeros de olefina cíclica (COP), copolímeros de olefina cíclica (COC), poli(tereftalato de etileno) (PET), adhesivo óptico (NOA), resinas epoxi, metales (por ejemplo, aluminio, acero inoxidable, cobre, níquel, cromo y titanio), un material no adherente tal como teflón (PTFE), o una combinación de estos materiales. En algunas realizaciones, las diferentes capas en una celda de flujo que comprende múltiples capas se pueden fabricar de diferentes materiales, por ejemplo, la capa del canal de fluido se puede fabricar de un material elastomérico mientras que el sustrato de los micropocillos y la placa de cubierta (superior) se puede fabricar de vidrio u otro material adecuado. En algunas realizaciones, el (los) material(es) elegido(s) para la fabricación de celdas de flujo serán compatibles con el etanol de forma que se pueda usar el cebado del dispositivo fluídico con etanol o etanol:disoluciones acuosas para facilitar la humectación superficial y la retirada de aire atrapado del dispositivo.
En algunas realizaciones, la celda de flujo puede comprender una estructura de tres capas que incluye el sustrato de matrices de micropocillos, una capa del canal de fluido (capa fluídica) y una placa de cubierta (es decir, una capa superior o de interfase), por lo que el volumen de la cámara de matriz de micropocillos se determina por el área en sección transversal de la matriz de micropocillos y el espesor de la capa del canal de fluido (véanse las FIGS. 14A-B). En algunas realizaciones, el ensamblaje de celda de flujo - sustrato de matrices de micropocillos puede comprender dos capas, tres capas, cuatro capas, cinco capas, o más de cinco capas.
Como se indica anteriormente, en algunas realizaciones el espesor de la capa del canal de fluido determinará la profundidad de los canales de fluido y la cámara de matriz de micropocillos, e influirá en el volumen total de la cámara de matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, el espesor de la capa del canal de fluido será entre 50 pm y 3 mm. En otras realizaciones, el espesor de la capa del canal de fluido puede ser al menos 50 pm, al menos 100 pm, al menos 200 pm, al menos 300 pm, al menos 400 pm, al menos 500 pm, al menos 750 pm, al menos 1 mm, al menos 1,25 mm, al menos 1,5 mm, al menos 1,75 mm, al menos 2 mm, al menos 2,25 mm, al menos 2,5 mm, al menos 2,75 mm, o al menos 3 mm. En aún otras realizaciones, el espesor de la capa del canal de fluido puede ser como máximo 3 mm, como máximo 2,75 mm, como máximo 2,5 mm, como máximo 2,25 mm, como máximo 2 mm, como máximo 1,75 mm, como máximo 1,5 mm, como máximo 1,25 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 pm, como máximo 500 pm, como máximo 400 pm, como máximo 300 pm, como máximo 200 pm, como máximo 100 pm, o como máximo 50 pm. En una realización, el espesor de la capa del canal de fluido es aproximadamente 0,8 mm. En otra realización, el espesor de la capa del canal de fluido es aproximadamente 1,2 mm, 2 mm, o 3 mm. Los expertos en la técnica apreciarán que la profundidad de los canales de fluido puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 800 pm hasta aproximadamente 1,6 mm).
En algunas realizaciones, se pueden fabricar múltiples capas en una única parte integrada, por ejemplo, impresión 3D de una parte integrada de celda de flujo y junta como se muestra en las FIGS. 15-18. En casos en los que la parte impresa 3D no es suficientemente plana para lograr la buena unión con un sustrato o placa de cubierta, se pueden incorporar las características de diseño tales como una junta tórica (también impresa 3D) (véase la FIG. 19A). En algunas realizaciones, se puede usar más de un material en la impresión 3D de una única parte o ensamblaje, por ejemplo, la capa fluídica se puede imprimir de un polímero de baja adhesión, e integrarse directamente con una junta de sellado impresa hecha de un material elastomérico para prevenir fugas (FIG. 19B).
Una vez se ha fabricado la parte de la celda de flujo, se puede unir al sustrato de los micropocillos mecánicamente, por ejemplo, sujetándola con el sustrato de los micropocillos (con o sin el uso de una junta), o se puede unir directamente al sustrato de los micropocillos usando cualquiera de una variedad de técnicas (dependiendo de la elección de materiales usados) conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, a través del uso de unión anódica, unión térmica, o cualquiera de una variedad de adhesivos o películas adhesivas, que incluyen adhesivos basados en epoxi, basados en acrílicos, basados en silicona, curables por UV, basados en poliuretano, o basados en cianoacrilato.
Cartuchos: En muchas realizaciones del sistema de ensayo automatizado, el sustrato de micropocillos, con o sin un celda de flujo fijada, se empaquetará dentro de un cartucho consumible que interconecta con el sistema de instrumentos y que puede incorporar funcionalidad adicional. Las FIGS. 14A-B y 20A-C ilustran una variedad de enfoques para incorporar celdas de flujo (o sustratos de matrices de micropocillos) en ensamblajes de cartucho, donde los enfoques varían de sujeción mecánica de una pila de partes individuales, a sujeción mecánica de partes individuales y componentes pre-ensamblados, a cartuchos consumibles completamente ensamblados que proporcionan facilidad de uso para los usuarios finales del sistema de ensayo automatizado. Las características de diseño de los cartuchos pueden incluir (i) uno o más puertos de entrada para crear conexiones de fluido con el instrumento o introducir manualmente muestras de células, suspensiones de perlas, u otros reactivos de ensayo en el cartucho, (ii) uno o más canales de derivación, es decir, para auto-dosificar las muestras de células y suspensiones de perlas, para evitar el desbordamiento o flujo de retorno, (iii) uno o más ensamblajes integrados de sustrato de micropocillos / celda de flujo, o una o más cámaras dentro de las que se sitúan el (los) sustrato(s) de micromatrices, (iv) integrados bombas miniatura integradas u otros mecanismos de activación de fluidos para controlar el flujo de fluidos a través del dispositivo, (v) válvulas miniatura integradas (u otros mecanismos de contención) para compartimentalizar los reactivos cargados previamente (por ejemplo, suspensiones de perlas) o controlar el flujo de fluidos a través del dispositivo, (vi) una o más ventilaciones para proporcionar una vía de escape para aire atrapado, (vii) uno o más recipientes de muestra y de residuos de reactivos, (viii) uno o más puertos de salida para crear conexiones de fluido con el instrumento o proporcionar un punto de recogida de muestras procesadas, (ix) características de interfase mecánica para posicionar reproduciblemente el cartucho consumible extraíble con respecto al sistema de instrumentos, y para proporcionar el acceso de manera que imanes externos puede ser puestos en estrecha proximidad con los micropocillos, (x) componentes de control de temperatura integrados o una interfaz térmica para proporcionar buen contacto térmico con el sistema de instrumentos, (xi) marcas de alineamiento óptico para determinar la posición del cartucho o pocillos dentro del instrumento, y (xii) características de interfaz óptica, por ejemplo, una ventana transparente, para su uso en el interrogatorio óptico de los micropocillos. En algunas realizaciones, el cartucho se diseña para procesar más de una muestra en paralelo. En algunas realizaciones del dispositivo, el cartucho puede comprender además uno o más tubo(s) de recogida de muestras extraíble(s) o cámara(s) que son adecuados para su uso en los procedimientos de ensayo aguas abajo o para su uso en la interconexión con cicladores térmicos de PCR autónomos o instrumentos de secuenciación. En algunas realizaciones del dispositivo, el cartucho en sí es adecuado para interconectar con cicladores térmicos de PCR autónomos o instrumentos de secuenciación. El término "cartucho" como se usa en la presente divulgación pretende incluir cualquier ensamblaje de partes que contiene la muestra y las perlas durante la realización del ensayo.
En algunas realizaciones, el diseño del cartucho puede incluir una pluralidad de celdas de flujo o cámaras de micropocillos individuales, cada una comprendiendo una pluralidad de micropocillos, tal que se puedan procesar en paralelo una pluralidad de muestras de células. En algunas realizaciones, se puede usar una pluralidad de cámaras de micropocillos dentro del cartucho para dividir una muestra de células individuales en alícuotas que son cada una analizadas por separado. En algunas realizaciones, se puede usar una pluralidad de cámaras de micropocillos dentro del cartucho para dividir una muestra de células individuales en alícuotas, algunas de las cuales se pueden usar como controles, y algunos de las cuales se pueden tratar con un agente de activación, estímulo, o compuesto de prueba antes de realizar el ensayo de creación de códigos de barras moleculares.
Las FIGS. 21A-C ilustran una realización de un cartucho diseñado para incluir recipientes de reactivo a bordo. El cartucho comprende un patrón de micropocillo 809 fabricado en sustrato 2110, una capa fluídica 2108, un cuerpo de cartucho 2106 que comprende uno o más recipientes de reactivo a bordo 2107, y una o más juntas de recipiente de reactivo 2105, que pueden incluir opcionalmente ventilaciones, como se muestra en la vista en despiece ordenado del ensamblaje a la derecha. El cartucho ensamblado se muestra a la izquierda, que ilustra los puertos de entrada 2101 y salida 2102, un alivio 2103 para proporcionar acceso por un imán de recuperación, y los recipientes sellados 2104, que pueden ser visibles si se sellan con un sellado o cubierta transparente o semi-transparente.
Las FIGS. 22A-B ilustran otra realización de un cartucho diseñado para incluir recipientes de reactivo a bordo. En esta realización, los recipientes de reactivo se ocultan de la vista en virtud de estar completamente encerrados por el cuerpo de cartucho. El cartucho comprende un patrón de micropocillos 2206 fabricado en sustrato 2207, una capa fluídica 2205 y un cuerpo de cartucho 2203 que comprende uno o más recipientes de reactivo a bordo y un alivio 904 para proporcionar acceso por un imán de recuperación, como se muestra en la vista en despiece ordenado del ensamblaje a la derecha. El cartucho ensamblado se muestra a la izquierda, que ilustra los puertos de entrada 2201 y salida 2202, así como el alivio para proporcionar acceso por un imán de recuperación.
Dimensiones de los canales de fluido del cartucho: En general, las dimensiones de los canales de fluido y la(s) cámara(s) de micropocillos en diseños del cartucho se optimizarán para (i) proporcionar suministro uniforme de células y perlas a los micropocillos, y (ii) para minimizar el consumo de muestra y reactivo. En algunas realizaciones, la anchura de los canales de fluido será entre 50 um y 20 mm. En otras realizaciones, la anchura de los canales de fluido o cámaras de micropocillos puede ser al menos 50 pm, al menos 100 pm, al menos 200 pm, al menos 300 pm, al menos 400 pm, al menos 500 pm, al menos 750 pm, al menos 1 mm, al menos 2,5 mm, al menos 5 mm, al menos 10 mm, o al menos 20 mm. En aún otras realizaciones, la anchura de los canales de fluido o cámaras de micropocillos puede ser como máximo 20 mm, como máximo 10 mm, como máximo 5 mm, como máximo 2,5 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 pm, como máximo 500 pm, como máximo 400 pm, como máximo 300 pm, como máximo 200 pm, como máximo 100 pm, o como máximo 50 pm. En una realización, la anchura de los canales de fluido o cámaras de micropocillos es aproximadamente 2 mm. Los expertos en la técnica apreciarán que la anchura de los canales de fluido o las cámaras de micropocillos puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 250 pm hasta aproximadamente 10 mm).
En algunas realizaciones, la profundidad de los canales de fluido en diseños del cartucho será entre 50 pm y 4 mm. En otras realizaciones, la profundidad de los canales de fluido puede ser al menos 50 pm, al menos 100 pm, al menos 200 pm, al menos 300 pm, al menos 400 pm, al menos 500 pm, al menos 750 pm, al menos 1 mm, al menos 1,25 mm, al menos 1,5 mm, al menos 1,75 mm, al menos 2 mm, al menos 3 mm, al menos 4 mm, o al menos 5 mm. En aún otras realizaciones, la profundidad de los canales de fluido puede ser como máximo 5 mm, como máximo 4 mm, como máximo 3 mm, como máximo 2 mm, como máximo 1,75 mm, como máximo 1,5 mm, como máximo 1,25 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 pm, como máximo 500 pm, como máximo 400 pm, como máximo 300 pm, como máximo 200 pm, como máximo 100 pm, o como máximo 50 pm. En una realización, la profundidad de los canales de fluido es aproximadamente 1 mm. Los expertos en la técnica apreciarán que la profundidad de los canales de fluido puede entrar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 800 pm a aproximadamente 3 mm).
Fabricación de cartuchos: Los cartuchos se pueden fabricar usando una variedad de técnicas y materiales conocidos por los expertos en la técnica. En general, los cartuchos se fabricarán como una serie de partes de componentes separadas (FIGS. 21A-C y 22A-B) y posteriormente se ensamblarán usando cualquiera de varias técnicas de ensamblaje mecánico o unión. Los ejemplos de técnicas de fabricación adecuadas incluyen, pero no se limitan a, mecanizado convencional, mecanizado CNC, moldeo por inyección, termoconformado e impresión 3D. Una vez se han fabricado los componentes del cartucho, se pueden ensamblar mecánicamente usando tornillos, pernos y similares, o unir permanentemente usando cualquiera de una variedad de técnicas (dependiendo de la elección de materiales usados), por ejemplo, a través del uso de unión/soldadura térmica o cualquiera de una variedad de adhesivos o películas adhesivas, que incluyen adhesivos basados en epoxi, basados en acrílicos, basados en silicona, curables por UV, basados en poliuretano, o basados en cianoacrilato.
Los componentes del cartucho se pueden fabricar usando cualquiera de varios materiales adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, silicio, sílice fundida, vidrio, cualquiera de una variedad de polímeros, por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), policarbonato (PC), poliestireno (PS), polipropileno (PP), polietileno (PE), polietileno de alta densidad (HDPE), poliimida, polímeros de olefina cíclica (COP), copolímeros de olefina cíclica (COC), poli(tereftalato de etileno) (PET), resinas epoxi, materiales no adherentes tales como teflón (PTFE), metales (por ejemplo, aluminio, acero inoxidable, cobre, níquel, cromo y titanio), o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el (los) material(es) elegido(s) para la fabricación de celdas de flujo serán compatibles con el etanol de forma que se pueda usar el cebado del dispositivo fluídico con etanol o etanol:disoluciones acuosas para facilitar la humectación superficial y la retirada de aire atrapado del dispositivo.
Barreras de difusión del cartucho: En algunas realizaciones del dispositivo, la celda de flujo o cartucho puede comprender además componentes que se diseñan para crear barreras físicas o químicas que previenen la difusión de (o aumento del paso óptico y tiempos de difusión para) moléculas grandes para minimizar la contaminación cruzada entre micropocillos. Los ejemplos de dichas barreras incluyen, pero no se limitan a, un patrón de canales en sinuosos usados para el suministro de células y perlas a los micropocillos, una bandeja retraíble o membrana deformable que se comprime en contacto con la superficie del sustrato de los micropocillos durante las etapas de lisis o de incubación, el uso de perlas más grandes, por ejemplo, perlas Sephadex como se describe previamente, para bloquear las aberturas de los micropocillos, o la liberación de un fluido hidrófobo inmiscible de un recipiente dentro del cartucho durante las etapas de lisis o de incubación, para separar eficazmente y compartimentabilizar cada micropocillo en el sustrato. En algunas realizaciones, se pueden usar aditivos para ajustar la viscosidad del tampón de ensayo para reducir la tasa de difusión de sustancias entre micropocillos. Los ejemplos de aditivos de tampón que se pueden usar para ajustar la viscosidad del tampón incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, polietilenglicol (PEG), Ficoll, glicerina, glicerol, sulfato de dextrano, Histopaque, albúmina de suero bovino u otras proteínas, y similares.
Cartuchos que comprenden bombas: Como se indica anteriormente, en algunas realizaciones el cartucho puede incluir bombas miniatura integradas u otros mecanismos de impulsión de fluidos para el control de flujo de fluidos a través del dispositivo. Los ejemplos de bombas miniatura integradas adecuadas o mecanismos de impulsión de fluidos incluyen, pero no se limitan a, mecanismos de jeringa o émbolo miniatura electromecánica o neumáticamente activados, bombas de diafragma de membrana impulsadas neumáticamente o por un pistón externo, bolsas o vejigas de reactivo impulsadas neumáticamente, o bombas electro-osmóticas.
Cartuchos que comprenden válvulas: Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones el cartucho puede incluir válvulas miniatura integradas para compartimentalizar los reactivos previamente cargados o controlar el flujo de fluidos a través del dispositivo. Los ejemplos de válvulas miniatura integradas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, "válvulas" de un solo uso fabricadas usando tapones de cera o polímero que se pueden fundir o disolver, o membranas de polímero que se pueden perforar; válvulas de manguito construidas usando una membrana o tubo deformable y válvulas de una vía de accionamiento neumático, magnético, electromagnético o electromecánico (solenoide) construidas usando solapas de membrana deformables, y válvulas de compuerta miniatura. En algunas realizaciones, todas las entradas y salidas del cartucho pueden incluir válvulas de retención integradas para controlar la direccionalidad del flujo de fluidos, como se indica en las FIGS. 29A-B. En algunas realizaciones, las válvulas de retención integradas pueden comprender válvulas de retención de silicona moldeadas miniatura de "pico de pato", por ejemplo, Minivalve DU039.005 (Minivalve, Inc., Cleveland, OH).
Cartuchos que comprenden ventilaciones: Como se indica anteriormente, en algunas realizaciones el cartucho puede incluir ventilaciones para proporcionar una vía de escape para aire atrapado. Las ventilaciones se pueden construir según una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, usando un tapón poroso de polidimetilsiloxano (PDMS) u otro material hidrófobo que permite el ascenso capilar de aire pero bloquea la penetración por agua.
Conexiones de cartuchos: Como se ha descrito anteriormente, las características de entrada y salida del cartucho se pueden diseñar para proporcionar conexiones de fluido convenientes y estancas con el instrumento, o pueden servir de recipientes abiertos para el pipeteado manual de muestras y reactivos dentro o fuera del cartucho. Los ejemplos de diseños mecánicos convenientes para los conectores de los puertos de entrada y salida incluyen, pero no se limitan a, conectores roscados, conectores de Luer lock, conectores Luer slip o "slip tip", conectores de ajuste por presión, conectores de tubos, y similares (FIG. 23A).
Interfaz de micropipeta del cartucho: Los ejemplos de interfaces de micropipeteadores (o "interfaces de punta de pipeta") para facilitar la introducción de fluidos en el dispositivo de celda de flujo o cartucho usando micropipeteadores convencionales se ilustran en la FIG. 23B y las FIGS. 24A-C. Las interfaces se diseñan para proporcionar un sellado fiable entre una punta de pipeta y el dispositivo de celda de flujo o cartucho, minimizando así el volumen muerto y la introducción de burbujas de aire, y proporcionando un llenado coherente usando pipetas manuales o automatizadas (por ejemplo, puntas de pipeta Eppendorf de 1 mL y 5 mL, o puntas de pipeta Tecan de 5 mL). La interfaz de punta de pipeta también minimiza el número de etapas de transferencia requeridas para intercambiar completamente fluidos, y además, simplifica la manipulación de fluidos eliminando el flujo de fluidos dentro y fuera del cartucho cuando una punta de pipeta no se inserta en el puerto de entrada.
En algunas realizaciones, la interfaz de punta de pipeta comprende una característica recta o vertical que se puede usar para evitar diferencias de mano dominante en los usuarios. En algunas realizaciones, la interfaz de punta de pipeta comprende un característica cónica en ángulo que se acopla con o se conforma a la forma de una punta de pipeta. En algunas realizaciones, las puntas de pipeta precortadas se pueden pegar en el sitio dentro de la(s) entrada(s) cónica(s) en ángulo para reducir el contacto con etanol durante las etapas de cebado. En algunas realizaciones, la interfaz de punta de pipeta comprende una característica cónica que se conecta a una punta de pipeta para formar una conexión de bajo volumen muerte con un puerto de entrada o puerto de salida de un dispositivo de celda de flujo o cartucho. En algunas realizaciones, las características cónicas o entrada(s) en ángulo pueden incorporar características tales como juntas tóricas (FIG. 24B) u otras características internas rígidas o distensibles (FIG. 24C) contra las que la punta de pipeta se acopla para formar un sellado sustancialmente a prueba de fugas. En algunas realizaciones, las características cónicas o entradas en ángulo comprenden un material distensible que forma un sellado sustancialmente a prueba de fugas con la punta de pipeta. En algunas realizaciones, el material distensible es polidimetilsiloxano (PDMS), poliisopreno, polibutadieno, o poliuretano. En algunas realizaciones, la interfaz de punta de pipeta comprende una unidad modular que se puede modificar independientemente del resto del diseño del cartucho (FIG. 25B).
Tapas de conectores del cartucho: En algunas realizaciones, los puertos de entrada y de salida del cartucho puede comprender además tapas, cubiertas o cierres de accionamiento con muelle, o membranas de polímero que se pueden abrir o perforar cuando el cartucho se pone en el instrumento, y que sirven para prevenir la contaminación de las superficies internas del cartucho durante el almacenamiento o que previenen que los fluidos se viertan cuando el cartucho se retira del instrumento.
Tubos de recogida de muestras extraíbles: Como se indica anteriormente, en algunas realizaciones, los uno o más puertos de salida del cartucho pueden comprender además tubos de recogida de muestras extraíbles o cámaras que son adecuadas para su uso en los procedimientos de ensayo aguas abajo o para interconectar con cicladores térmicos de PCR autónomos o instrumentos de secuenciación. Las FIGS. 25-28 ilustran diferentes diseños del cartucho que incorpora tubos de recogida de muestras. La FIG. 26 ilustra un ensamblaje de cartucho que incorpora un conector de jeringa Luer lock y válvula de retención, así como una interfaz de punta de pipeta y un tubo de recogida de muestras que guarda perlas después de su recuperación de la matriz de micropocillos. La FIG. 27 ilustra una variación del diseño de cartucho mostrado en la FIG. 26. Las FIGS. 25 y 28 ilustran ensamblajes de cartucho que incorporan conectores Upchurch Nanoport™ (Upchurch Scientific, División de IDEX Health and Science, Oak Harbor, WA) para crear conexiones de bajo volumen muerto entre el tubo externo y el cartucho. Los diseños del cartucho también incorporan conectores de jeringa, válvulas de retención e interfaces de punta de pipeta opcionales.
Se puede incorporar cualquiera de una variedad de diferentes tubos de recogida de muestras en el diseño, por ejemplo, un tubo de recogida de muestras de 5 mL como se muestra, o tubos de recogida de muestras de volumen más pequeño, por ejemplo, 1,5 mL. En general, el volumen del tubo de recogida de muestras puede variar desde aproximadamente 10 pL hasta aproximadamente 5 mL. En algunas realizaciones, el volumen del uno o más tubos de recogida de muestras puede ser al menos 10 pL, al menos 25 pL, al menos 50 pL, al menos 75 pL, al menos 100 pL, al menos 250 pL, al menos 500 pL, al menos 750 pL, al menos 1 mL, al menos 2 mL, al menos 3 mL, al menos 4 mL, o al menos 5 mL. En algunas realizaciones, el volumen del uno o más tubos de recogida de muestras puede ser como máximo 5 mL, como máximo 4 mL, como máximo 3 mL, como máximo 2 mL, como máximo 1 mL, como máximo 750 pL, como máximo 500 pL, como máximo 250 pL, como máximo 100 pL, como máximo 75 pL, como máximo 50 pL, como máximo 25 pL, o como máximo 10 pL. Los expertos en la técnica reconocerán que el volumen del uno o más tubos de recogida de muestras puede variar independientemente entre sí y pueden tener volúmenes de cualquier valor dentro de los intervalos de volumen anteriormente especificados, por ejemplo, aproximadamente 900 pL.
Interfaz mecánica de cartuchos: En general, las características de la interfaz mecánica del cartucho proporcionan la colocación fácilmente extraíble pero altamente precisa y repetible del cartucho con respecto al sistema de instrumentos. Las características adecuadas de la interfaz mecánica incluyen, pero no se limitan a, pernos de alineamiento, guías de alineamiento, topes mecánicos, y similares. En algunas realizaciones, las características de diseño mecánicas incluirán características de alivio para poner el aparato externo, por ejemplo, imanes o componentes ópticos, en estrecha proximidad con la cámara de micropocillos (FIG. 21A, FIG. 22B).
Control de temperatura del cartucho o interfaz térmica: En algunas realizaciones, el cartucho también incluirá componentes de control de la temperatura o características de interfaz térmica para acoplar con los módulos de control de la temperatura externa. Los ejemplos de elementos de control de la temperatura adecuados incluyen, pero no se limitan a, elementos de calentamiento resistivo, fuentes de luz emisoras de infrarrojos en miniatura, dispositivos de calentamiento o enfriamiento de Peltier, sumideros de calor, termistores, termopares, y similares. Las características de la interfaz térmica serán fabricadas normalmente de materiales que sean buenos conductores térmicos (por ejemplo, cobre, oro, plata, etc.) y normalmente comprenderán una o más superficies planas capaces de hacer un buen contacto térmico con bloques externos de calentamiento o bloques de enfriamiento.
Interfaz óptica del cartucho: En muchas realizaciones, el cartucho incluirá características de interfaz óptica para su uso en estudios de imágenes ópticas o interrogación espectroscópica de la matriz de micropocillos. Normalmente, el cartucho incluirá una ventana ópticamente transparente, por ejemplo, el sustrato de los micropocillos en sí o el lado de la celda de flujo o cámara de micropocillos que es opuesta al sustrato de micropocillos, fabricada de un material que cumple los requisitos espectrales para la obtención de imágenes o técnica espectroscópica usada para sondar los micropocillos. Los ejemplos de materiales adecuados de ventana óptica incluyen, pero no se limitan a, vidrio, sílice fundida, poli(metacrilato de metilo) (PMMA), policarbonato (PC), polímeros de olefina cíclica (COP), o copolímeros de olefina cíclica (COC).
Módulos y sistemas de instrumentos: La presente divulgación también incluye módulos y sistemas de instrumentos para su uso en la automatización de los ensayos de marcado estocástico de células individuales multiplexados o de creación de códigos de barras moleculares. Como se indica anteriormente, estos instrumentos pueden proporcionar control y funcionalidad de análisis tal como (i) control fluídico, (ii) distribución de células o perlas y mecanismos de recogida, (iii) mecanismos de lisis celular, (iv) control de campo magnético, (v) control de temperatura, (vi) capacidad de obtención de imágenes, y (vii) procesamiento de imágenes. En algunas realizaciones, el sistema de instrumentos puede comprender uno o más módulos (ilustrados esquemáticamente en la FIG. 30), donde cada módulo proporciona uno o más conjuntos de características funcionales específicas al sistema. En otras realizaciones, el sistema de instrumentos se puede empaquetar tal que toda la funcionalidad del sistema resida dentro de uno o más envases (FIG. 30; conjunto interno de líneas discontinuas) o dentro del mismo envase (FIG. 30; línea discontinua externa). Como se indica anteriormente, en algunas realizaciones, el sistema puede comprender unidades funcionales adicionales, o como componentes integrados o como componentes modulares del sistema, que amplían las capacidades funcionales del sistema para incluir amplificación por PCR (u otros tipos de técnicas de amplificación de oligonucleótidos) y secuenciación de oligonucleótidos.
La FIG. 31 ilustra un ejemplo no limitante de la configuración del sistema de instrumentos. En la FIG. 31, el usuario pipetea una muestra de células en el puerto de entrada o pocillo de muestra de un cartucho extraíble que se precarga con todos los otros reactivos de ensayo, inserta el cartucho en el sistema de instrumentos a procesar, y recoge la salida (por ejemplo, una suspensión de perlas que comprende bibliotecas de oligonucleótidos marcados) de un puerto de salida o pocillo del cartucho. El sistema de instrumentos automatiza las etapas de ensayo, que incluye la distribución de células en los micropocillos, distribución de perlas de un pocillo de reactivo a bordo (si no está ya previamente cargado en los micropocillos), etapas de aclarado, etapas de lisis celular, etapas de hibridación para dianas de ARN o ADN, y recuperación de perlas asistida por imán. En algunas realizaciones, el sistema de instrumentos comprende además capacidad de obtención de imágenes y de análisis, y retroalimentación en tiempo real y control de algunas etapas de ensayo, por ejemplo, etapas de distribución de células y perlas para garantizar la cobertura óptima del patrón de micropocillos mientras que se minimiza el número de pocillos que contienen más de una célula o más de una perla. En algunas realizaciones, el sistema de obtención de imágenes proporciona la monitorización óptica de las células en micropocillos para identificar subconjuntos especificados de células, por ejemplo, células muertas, células que presentan marcadores de la superficie celular específicos, etc., y entonces proporciona retroalimentación usada para permitir que los mecanismos retiren físicamente, atrapen, o destruyan células seleccionadas (o perlas co­ localizadas) de manera que se puedan incluir o excluir del análisis aguas debajo de datos de la secuencia de ácidos nucleicos. En muchas realizaciones, el sistema de instrumentos incluye un ordenador o procesador integrado (aunque en algunas realizaciones se puede usar un ordenador o procesador periférico) que ejecuta software para controlar y coordinar las actividades de obtención de imágenes, control de movimientos, control magnético, control fluídico (por ejemplo, aplicación de presión o vacío a líneas de fluido), y otros subsistemas funcionales.
Etapas del proceso de ensayo automatizado y flujo de trabajo: Las FIGS. 32-35 proporcionan ilustraciones esquemáticas de diferentes realizaciones para las etapas de proceso realizadas por el usuario y el sistema de ensayo automatizado.
La FIG. 32 ilustra una realización del flujo de trabajo del ensayo automatizado en el que se proporciona al usuario un cartucho de ensayo consumible que no contiene perlas u otros reactivos. El usuario carga perlas y reactivos en el cartucho de ensayo (incluyendo un tampón de lisis y un tampón de hibridación) al mismo tiempo que la muestra de células. El sistema de instrumentos automatiza las etapas de distribución de células y perlas en los micropocillos. En algunas realizaciones, se usa el sistema de obtención de imágenes y el procesamiento de imágenes en tiempo real y análisis para monitorizar los procesos de distribución de células y perlas y se usa retroalimentación para ajustar las etapas de proceso en consecuencia, por ejemplo, prolongando o repitiendo algunas etapas, activando mecanismos de distribución de células o perlas alternativos, y similares. El sistema de instrumentos realiza entonces las etapas de lisis e hibridación de células en la secuencia, seguido por la recuperación asistida por campo magnético de las perlas de los micropocillos. Al final del proceso, la muestra de salida (por ejemplo, una suspensión de perlas que comprende bibliotecas de oligonucleótidos marcados) se recoge de un puerto en el cartucho de ensayo. En algunas realizaciones del diseño del cartucho de ensayo, el puerto de salida del cartucho de ensayo puede comprender un tubo partible por comodidad.
La FIG. 33 ilustra otra realización del flujo de trabajo del ensayo automatizado en el que se suministra al usuario un cartucho de ensayo consumible que comprende reactivos de ensayo precargados. El usuario carga muestras de células y perlas en el cartucho, y el sistema de instrumentos realiza las tareas de distribución de las células y las perlas a través de una pluralidad de micropocillos, así como las etapas de ensayo adicionales como se explica resumidamente anteriormente. En algunas realizaciones, las células se pueden distribuir en micropocillos primero, seguido por la distribución de perlas. En otras realizaciones, las perlas se pueden distribuir primero, seguido por la distribución de células.
La FIG. 34 ilustra otra realización del flujo de trabajo del ensayo automatizado en el que se suministra al usuario un cartucho de ensayo consumible con perlas y reactivos cargados previamente en recipientes de reactivo dentro del cartucho. En algunas realizaciones, las perlas y reactivos puede estar contenidos dentro del instrumento, por ejemplo, dentro de botellas sustituibles o cartuchos de reactivo, en vez de en el cartucho de ensayo. Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones, las células se pueden distribuir en micropocillos primero, seguido por la distribución de perlas. En otras realizaciones, las perlas se pueden distribuir primero, seguido por la distribución de células.
La FIG. 35 ilustra otra realización más del proceso de ensayo automatizado en el que se suministra al usuario un cartucho de ensayo consumible que tiene perlas precargadas en los micropocillos y otros reactivos de ensayo precargados en los recipientes de reactivo del cartucho. Tras la distribución de las células en los micropocillos (donde nuevamente el sistema de obtención de imágenes y el procesamiento de imágenes en tiempo real se usa para monitorizar el proceso de distribución de células, y se usa retroalimentación para ajustar las etapas de proceso en consecuencia para lograr una distribución previamente especificada), se pueden ajustar las posiciones relativas de células y perlas, por ejemplo, usando uno o más imanes para manipular campos magnéticos locales y/o usando agitación.
Fluídica: En general, el sistema de instrumentos proporcionará capacidad fluídica para suministrar muestras o reactivos al uno o más cámara(s) de micropocillos o celda(s) de flujo dentro de uno o más cartucho(s) de ensayo conectados al sistema. Los reactivos y tampones del ensayo se pueden almacenar en botellas, cartuchos de reactivo y tampón, u otros recipientes adecuados que están conectados a las entradas del cartucho. En algunas realizaciones, los reactivos y tampones del ensayo se pueden cargar previamente y almacenar en recipientes situados dentro del propio cartucho. El sistema también puede incluir recipientes de muestra procesada y de residuos en forma de botellas, cartuchos, u otros recipientes adecuados para recoger fluidos aguas abajo del (de los) cartucho(s) de ensayo. En algunas realizaciones, las muestras procesadas y los fluidos residuales se pueden recoger en recipientes situados dentro del propio cartucho. En algunas realizaciones, el módulo fluídico puede proporcionar conmutación de flujo entre diferentes fuentes, por ejemplo, recipientes de muestra o de reactivo situados en el cartucho, o botellas de reactivo situadas en el instrumento, y la(s) entrada(s) de la cámara de micropocillos. En algunas realizaciones, el módulo fluídico puede proporcionar poner en contacto las células en la matriz con un agente de activación, estímulo químico, o compuesto de prueba en un momento ajustable especificado antes de realizar la lisis celular y las etapas de ensayo aguas abajo. En algunas realizaciones, el módulo fluídico puede proporcionar conmutación de flujo entre la(s) entrada(s) de la cámara de micropocillos y diferentes puntos de recogida, por ejemplo, recipientes de muestra procesada situados dentro del cartucho, recipientes de residuos situados dentro del cartucho, o botellas de residuos situadas dentro del instrumento.
Control de flujo usando bombas y válvulas: El control de flujo de fluidos a través del sistema se realizará normalmente a través del uso de bombas (u otros mecanismos de impulsión de fluidos) y válvulas. Los ejemplos de bombas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, bombas de jeringa, bombas de jeringa programables, bombas peristálticas, bombas de diafragma, y similares. En algunas realizaciones, el flujo de fluidos a través del sistema se puede controlar por medio de la aplicación de presión neumática positiva en la una o más entradas de los recipientes de reactivo y tampón, o en las entradas del (de los) cartucho(s) de ensayo. En algunas realizaciones, el flujo de fluidos a través del sistema se puede controlar por medio de la extracción a vacío en la una o más salidas de los recipientes de residuos, o en las salidas del (de los) cartucho(s) de ensayo. Los ejemplos de válvulas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, válvulas de retención, válvulas electromecánicas de dos vías o de tres vías, válvulas neumáticas de dos vías o de tres vías, y similares.
Modos de flujo de fluidos: Se pueden utilizar diferentes modos de control del flujo de fluidos en diferentes puntos en el procedimiento de ensayo, por ejemplo, se pueden usar todos de flujo directo (con respecto a la entrada y salida para una cámara de micropocillos dada), flujo inverso, flujo oscilante o pulsátil, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, se pueden usar flujo oscilante o pulsátil, por ejemplo, durante las etapas de carga de micropocillos para facilitar la distribución uniforme de células y perlas. En algunas realizaciones, se pueden aplicar flujo oscilante o pulsátil durante las etapas de lavado/aclarado del ensayo para facilitar el completo y eficiente intercambio de fluidos dentro de la uno o más celda(s) de flujo o cámara(s) de micropocillos.
Se pueden utilizar diferentes caudales de fluido en diferentes puntos en el proceso de flujo de trabajo del ensayo, por ejemplo, en algunas realizaciones de los módulos de instrumentos y sistema desvelados, el caudal volumétrico puede variar desde -100 mL/s hasta 100 mL/s. En alguna realización, el valor absoluto del caudal volumétrico puede ser al menos 0,001 mL/s, al menos 0,01 mL/s, al menos 0,1 mL/s, al menos 1 mL/s, al menos 10 mL/s, o al menos 100 mL/s. En algunas realizaciones, el valor absoluto del caudal volumétrico puede ser como máximo 100 mL/s, como máximo 10 mL/s, como máximo 1 mL/s, como máximo 0,1 mL/s, como máximo 0,01 mL/s, o como máximo 0,001 mL/s. El caudal volumétrico en un punto dado en el tiempo puede tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, un caudal directo de 2,5 mL/s, un caudal inverso de -0,05 mL/s, o un valor de 0 mL/s (es decir, flujo parado).
Inyección de aire: En algunas realizaciones del sistema fluídico, puede ser ventajoso insertar inyecciones de aire entre inyecciones de disolución cuando se cambia de una disolución a otra, por ejemplo, entre el cebado de la celda de flujo y la inyección de una suspensión de células, o entre una etapa de tampón de aclarado y la inyección de una suspensión de perlas. Las posibles ventajas de este enfoque incluyen dispersión reducida (eliminando las interfases líquido/líquido), y consumo reducido de muestra y reactivo (menos volumen de fluido requerida para llenar o vaciar la celda de flujo).
En algunas realizaciones, se puede inyectar aire en la propia celda de flujo (por ejemplo, que comprende la capa fluídica). En algunas realizaciones, se puede inyectar aire en el espacio en la celda de flujo por encima de la matriz de micropocillos (por ejemplo, una cámara de micropocillos). En algunas realizaciones, la inyección de aire puede no retirar sustancialmente el contenido de los micropocillos en la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, la inyección de aire puede retirar como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 % o más del contenido de los micropocillos de la matriz de micropocillos.
La inyección de aire se pueden usar para crear un entorno uniforme para inyecciones posteriores (por ejemplo, carga) de líquidos (por ejemplo, que comprende una suspensión de células o de perlas). En algunas realizaciones, la carga de líquidos después de la inyección de aire puede ser al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% más uniformemente dispersada que la carga sin inyección previa de aire. En algunas realizaciones, la carga de líquidos después de la inyección de aire puede ser como máximo 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % más uniformemente dispersada que la carga sin inyección previa de aire.
La inyección de aire puede reducir el volumen muerto (o espacio muerto) en la celda de flujo y/o matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, el volumen muerto se puede reducir con inyección o aire en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 %. En algunas realizaciones, el volumen muerto se puede reducir con inyección de aire en como máximo 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 %.
En algunas realizaciones, la inyección de aire se puede realizar usando una pipeta automatizada, una bomba de jeringa, o similares. En algunas realizaciones, la inyección de aire se puede realizar a una tasa que varía entre 0,08 mL por segundo y 1,8 mL por segundo. En algunas realizaciones, la tasa de inyección de aire es al menos 0,08 mL por segundo, al menos 0,1 mL por segundo, al menos 0,2 mL por segundo, al menos 0,3 mL por segundo, al menos 0,4 mL por segundo, al menos 0,5 mL por segundo, al menos 0,6 mL por segundo, al menos 0,7 mL por segundo, al menos 0,8 mL por segundo, al menos 0,9 mL por segundo, al menos 1,0 mL por segundo, al menos 1,2 mL por segundo, al menos 1,4 mL por segundo, al menos 1,6 mL por segundo, o al menos 1,8 mL por segundo. En algunas realizaciones, la tasa de inyección de aire es como máximo 1,8 mL por segundo, como máximo 1,6 mL por segundo, como máximo 1,4 mL por segundo, como máximo 1,2 mL por segundo, como máximo 1,0 mL por segundo, como máximo 0,8 mL por segundo, como máximo 0,6 mL por segundo, como máximo 0,4 mL por segundo, como máximo 0,2 mL por segundo, como máximo 0,1 mL por segundo, o como máximo 0,08 mL por segundo. Los expertos en la técnica reconocerán que la tasa de inyección de aire puede tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente 1,25 mL por segundo. En algunos casos, la tasa de inyección es aproximadamente 0,36 mL por segundo.
En algunas realizaciones, la presión de inyección de aire puede ser entre 0,01 y 0,25 atm. En algunas realizaciones, la tasa de inyección de aire es al menos 0,01 atm, al menos 0,05 atm, al menos 0,10 atm, al menos 0,15 atm, al menos 0,2 atm, o al menos 0,25 atm. En algunas realizaciones, la tasa de inyección de aire es como máximo 0,25 atm, como máximo 0,2 atm, como máximo 0,15 atm, como máximo 0,1 atm, como máximo 0,05 atm, o como máximo 0,01 atm. Los expertos en la técnica reconocerán que la presión de la inyección de aire puede tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente 0,11 atm.
Mecanismos de distribución de células y perlas: Como se indica anteriormente, en algunas realizaciones el sistema de instrumentos puede incluir mecanismos para distribuir y facilitar más la distribución uniforme de células y perlas sobre la pluralidad de micropocillos. Los ejemplos de dichos mecanismos incluyen, pero no se limitan a, transporte magnético, balanceo, agitación, turbulencia, flujo recirculante, flujo oscilatorio o pulsátil, agitación de baja frecuencia (por ejemplo, a través de pulsos de una membrana flexible (por ejemplo, silicona) que forma una pared de la cámara o canal de fluido cercano), o agitación de alta frecuencia (por ejemplo, a través del uso de transductores piezoeléctricos). En algunas realizaciones, uno o más de estos mecanismos se utiliza en combinación con estructuras o características físicas en las paredes interiores de la celda de flujo o cámara de micropocillos, por ejemplo, estructuras de entreplanta/sombrero superior, chevrones, o matrices de crestas, para facilitar la mezcla o para ayudar a prevenir la agrupación de células o perlas dentro de la cámara de matriz. Se pueden usar nervios que potencian el flujo sobre las superficies superiores e inferiores de la celda de flujo o cámara de micropocillos para controlar los perfiles de la velocidad de flujo y reducir el cizallamiento a través de las aberturas de micropocillos (es decir, para prevenir que las células o perlas sean sacadas de los micropocillos durante las etapas de intercambio y aclarado de reactivo.
Dianas de distribución de células y perlas: Cuando se distribuyen perlas entre una pluralidad de micropocillos, se puede elegir como diana cualquiera de una variedad de niveles predeterminados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen una perla individual puede ser entre 1 % y 100%. En algunas realizaciones, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener una perla individual. En algunas realizaciones, como máximo 100%, como máximo 99%, como máximo 95%, como máximo 90%, como máximo 80%, como máximo 70 %, como máximo 60 %, como máximo 50 %, como máximo 40 %, como máximo 30 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener una perla individual.
Cuando se distribuyen perlas entre una pluralidad de micropocillos, en algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen dos perlas puede ser al menos 1 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 4 %, al menos 5 %, al menos 6 %, al menos 7 %, al menos 8 %, al menos 9 %, o al menos 10 % o más. En otras realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen dos perlas puede ser como máximo 10 %, como máximo 9 %, como máximo 8 %, como máximo 7 %, como máximo 6 %, como máximo 5 %, como máximo 4 %, como máximo 3 %, como máximo 2 %, o como máximo 1 %.
Cuando se distribuyen células entre una pluralidad de micropocillos, se puede elegir como diana cualquiera de una variedad de niveles predeterminados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen una célula individual puede ser entre 1 % y 100 %. En algunas realizaciones, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener una célula individual. En algunas realizaciones, como máximo 100 %, como máximo 99 %, como máximo 95 %, como máximo 90 %, como máximo 80 %, como máximo 70 %, como máximo 60 %, como máximo 50 %, como máximo 40 %, como máximo 30 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener una célula individual.
Cuando se distribuyen células entre una pluralidad de micropocillos, en algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen dos células puede ser al menos 1 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 4 %, al menos 5 %, al menos 6 %, al menos 7 %, al menos 8 %, al menos 9 %, o al menos 10 % o más. En otras realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen dos células puede ser como máximo 10 %, como máximo 9 %, como máximo 8 %, como máximo 7 %, como máximo 6 %, como máximo 5 %, como máximo 4 %, como máximo 3 %, como máximo 2 %, o como máximo 1 %.
Cuando se distribuyen tanto células como perlas entre una pluralidad de micropocillos, se puede elegir como diana cualquiera de una variedad de niveles predeterminados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen tanto una célula individual como una perla individual puede ser entre 1 % y 100 %. En algunas realizaciones, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener tanto una célula individual como una perla individual. En algunas realizaciones, como máximo 100 %, como máximo 99 %, como máximo 95 %, como máximo 90 %, como máximo 80 %, como máximo 70 %, como máximo 60 %, como máximo 50 %, como máximo 40 %, como máximo 30 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener tanto una célula individual como una perla individual.
La distribución de perlas y/o células puede ser dependiente del tamaño y/o la densidad. Por ejemplo, perlas y/o células más grandes pueden sedimentar (es decir, en pocillos) a una velocidad más rápida que perlas y/o células más pequeñas. Por ejemplo, las perlas que tienen 33 micrómetros de diámetro pueden sedimentar aproximadamente 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 o 3 o más veces más rápido que las perlas que tienen 22 micrómetros de diámetro (suponiendo densidad igual o similar). En algunos casos, las perlas que tienen 33 micrómetros de diámetro sedimentan aproximadamente 2,25 veces más rápido que las perlas que tienen 22 micrómetros de diámetro.
Células de diferentes tamaños y/o densidades pueden sedimentar a diferentes velocidades en los pocillos del sustrato. Por ejemplo, los glóbulos rojos pueden sedimentar al menos 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, o 3 o más veces más rápido que los glóbulos blancos. Los glóbulos rojos pueden sedimentar más rápido que los glóbulos blancos debido a su mayor densidad a pesar de su tamaño más pequeño.
En algunas realizaciones, se puede hacer circular un tampón sobre la matriz de micropocillos antes y/o después de que se hayan cargado las células o perlas. El tampón puede ser un tampón de lisis y/o un tampón de lavado. En muchas realizaciones, el flujo del tampón no retirará sustancialmente el contenido de los micropocillos. En algunas realizaciones, el flujo del tampón puede retirar el contenido de como máximo 1 %, como máximo 2 %, como máximo 3 %, como máximo 4 %, como máximo 5 %, como máximo 6 %, como máximo 7 %, como máximo 8 %, como máximo 9 %, o como máximo 10 % o más de los micropocillos.
En algunas realizaciones, la viscosidad y/o densidad de un tampón se puede ajustar para optimizar la carga uniforme de perlas y/o células en micropocillos. Variar la viscosidad o densidad del tampón de carga puede, por ejemplo, ayudar a proteger las células de las fuerzas de cizallamiento o proporcionan flotabilidad positiva o negativa a las células y/o perlas para facilitar la carga uniforme. Por ejemplo, en algunas realizaciones de los métodos desvelados, la viscosidad de un tampón usado de carga de perlas y/o células puede variar desde aproximadamente 1x hasta aproximadamente 10x la del agua. En algunas realizaciones, la viscosidad del tampón puede ser al menos 1x, al menos 1,1x, al menos 1,2x, al menos 1,3x, al menos 1,4x, al menos 1,5x, al menos 1,6x, al menos 1,7x, al menos 1,8x, al menos 1,9x, al menos 2x, al menos 3x, al menos 4x, al menos 5x, al menos 6x, al menos 7x, al menos 8x, al menos 9x, o al menos 10x o más veces la viscosidad del agua. En algunas realizaciones, la viscosidad del tampón puede ser como máximo 10x, como máximo 9x, como máximo 8x, como máximo 7x, como máximo 6x, como máximo 5x, como máximo 4x, como máximo 3x, como máximo 2x, como máximo 1,9x, como máximo 1,8x, como máximo 1,7x, como máximo 1,6x, como máximo 1,5x, como máximo 1,4x, como máximo 1,3x, como máximo 1,2x, como máximo 1,1x, o como máximo 1x la del agua. Los expertos en la técnica reconocerán que la viscosidad del tampón puede tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente 1,75x la del agua.
Similarmente, en algunas realizaciones, la densidad de un tampón usado de carga de perlas y/o células puede variar desde aproximadamente 0,8x hasta aproximadamente 1,25x la de la densidad de las perlas y/o células a cargar. En algunas realizaciones, la densidad de un tampón usado de carga de perlas y/o células puede ser al menos 0,8x, al menos 0,9x, al menos 1,0x, al menos 1,1x, al menos 1,2x, o al menos 1,25x que de las perlas y/o células, o mayor. En algunas realizaciones, la densidad de un tampón usado de carga de perlas y/o células puede ser como máximo 1,25x, como máximo 1,2x, como máximo 1,1x, como máximo 1,0x, como máximo 0,9x, o como máximo 0,8x la de las perlas y/o células, o abajo. Los expertos en la técnica reconocerán que la densidad del tampón usado de carga de perlas y/o células puede tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente 0,85x la de las perlas y/o células.
En algunas realizaciones, la viscosidad y/o densidad de un tampón se puede ajustar para optimizar la eficiencia de recuperación de perlas de los micropocillos. Variando la viscosidad o densidad del tampón de recuperación de perlas puede, por ejemplo, proporcionan fuerzas de arrastre viscoso o proporcionar flotabilidad positiva o menos negativa a perlas para facilitar la eficiente recuperación de perlas. Por ejemplo, en algunas realizaciones de los métodos desvelados, la viscosidad de un tampón usado para la recuperación de perlas puede variar desde aproximadamente 1x hasta aproximadamente 10x la del agua. En algunas realizaciones, la viscosidad del tampón puede ser al menos 1x, al menos 1,1x, al menos 1,2x, al menos 1,3x, al menos 1,4x, al menos 1,5x, al menos 1,6x, al menos 1,7x, al menos 1,8x, al menos 1,9x, al menos 2x, al menos 3x, al menos 4x, al menos 5x, al menos 6x, al menos 7x, al menos 8x, al menos 9x, o al menos 10x o más veces la viscosidad del agua. En algunas realizaciones, la viscosidad del tampón puede ser como máximo 10x, como máximo 9x, como máximo 8x, como máximo 7x, como máximo 6x, como máximo 5x, como máximo 4x, como máximo 3x, como máximo 2x, como máximo 1,9x, como máximo 1,8x, como máximo 1,7x, como máximo 1,6x, como máximo 1,5x, como máximo 1,4x, como máximo 1,3x, como máximo 1,2x, como máximo 1,1x, o como máximo 1x la del agua. Los expertos en la técnica reconocerán que la viscosidad del tampón puede tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente 2,3x la del agua.
Similarmente, en algunas realizaciones, la densidad de un tampón usado para la recuperación de perlas puede variar desde aproximadamente 0,8x hasta aproximadamente 1,25x la de la densidad de las perlas. En algunas realizaciones, la densidad de un tampón usado para la recuperación de perlas puede ser al menos 0,8x, al menos 0,9x, al menos 1,0x, al menos 1,1x, al menos 1,2x, o al menos 1,25x que de las perlas y/o células, o mayor. En algunas realizaciones, la densidad de un tampón usado para la recuperación de perlas puede ser como máximo 1,25x, como máximo 1,2x, como máximo 1,1x, como máximo 1,0x, como máximo 0,9x, o como máximo 0,8x que la de las perlas y/o células, o abajo. Los expertos en la técnica reconocerán que la densidad del tampón usado para la recuperación de perlas puede tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente 1,1x la de las perlas.
Los ejemplos de aditivos de tampón que se pueden usar para ajustar la viscosidad y/o densidad del tampón incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, polietilenglicol (PEG), Ficoll, glicerina, glicerol, sulfato de dextrano, histopaque, albúmina de suero bovino, y similares.
Transporte y manipulación de perlas asistido por campo magnético: En algunas realizaciones, se pueden distribuir células o perlas entre los micropocillos, retirar de los micropocillos, o transportar de otro modo a través de una celda de flujo o cartucho de un sistema de instrumentos usando perlas magnéticas (por ejemplo, conjugadas con anticuerpos dirigidos contra marcadores de la superficie celular, o como soportes sólidos para bibliotecas de marcadores estocásticos) y gradientes externamente aplicados de campo magnético. En algunas realizaciones, por ejemplo, cuando se usan campos magnéticos para atrapar perlas magnéticas en micropocillos o para eluir perlas magnéticas de micropocillos, se puede aplicar simultáneamente un gradiente de campo magnético externamente aplicado a todo el patrón de micropocillos. En algunas realizaciones, se puede aplicar un gradiente de campo magnético externamente aplicado a un área seleccionada del patrón de micropocillos. En algunas realizaciones, se puede aplicar un gradiente de campo magnético externamente aplicado a un micropocillo individual. En algunas realizaciones, se pueden usar imanes permanentes para aplicar gradientes de campo magnético variables con el tiempo moviendo la posición de uno o más imanes permanentes con respecto a la matriz de micropocillos o viceversa. En estas realizaciones, la velocidad del movimiento relativo se puede ajustar de manera que corresponda el gradiente de dependencia del campo magnético del tiempo con la escala de tiempo en las que las perlas magnéticas experimentan magnetoforesis en o sobre los micropocillos. En alguna realización, se pueden proporcionar campos magnéticos variables con el tiempo variando la corriente aplicada a uno o más electroimanes. En algunas realizaciones, se puede usar una combinación de uno o más imanes permanentes y uno o más electroimanes para proporcionar gradientes de campo magnético para transportar perlas magnéticas en micropocillos, de los micropocillos, o a través del dispositivo. En algunas realizaciones, se pueden distribuir células o perlas entre los micropocillos, retirar de los micropocillos, o transportar de otro modo a través de una celda de flujo o cartucho de un sistema de instrumentos por medio de centrifugación u otros medios no magnéticos.
En algunas realizaciones, se pueden retirar perlas (soportes sólidos) de los micropocillos usando uno o más campos magnéticos. En algunas realizaciones, se pueden retirar perlas después de la lisis de células en los micropocillos y/o unión de ácidos nucleicos a las pluralidades de oligonucleótidos inmovilizados sobre las perlas individuales. Se puede situar un imán encima del cartucho y se pueden retirar perlas de los pocillos usando el campo magnético resultante. En algunas realizaciones, se pueden retirar al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 100 % de las perlas. En algunas realizaciones, se pueden retirar como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, como máximo 95 %, o como máximo 100 % de las perlas.
Obtención de imágenes en tiempo real y retroalimentación para mejorar la distribución de células y/o perlas: En algunas realizaciones, se usa un sistema de obtención de imágenes y procesamiento y análisis de imágenes en tiempo real para monitorizar los procesos de distribución de células y perlas (es decir, la distribución de células y/o perlas dentro de la pluralidad de micropocillos) y se usa retroalimentación para ajustar la etapas de proceso en consecuencia, por ejemplo, prolongando o repitiendo algunas etapas, activando los mecanismos de distribución alternativos de células o perlas, y similares, para mejorar las distribuciones de células y/o perlas, o para lograr las distribuciones de dianas previamente especificadas.
Obtención de imágenes en tiempo real y retroalimentación para seleccionar sub-poblaciones de células: En algunas realizaciones, se puede usar procesamiento y análisis de imágenes en tiempo real para identificar pocillos que contienen células que presentan una o más características especificadas (como se describe en más detalle a continuación), seguido por selección o exclusión de un subconjunto de células del análisis adicional. En algunas realizaciones, se usa procesamiento y análisis de imágenes en tiempo real para identificar pocillos que contienen dos o más células, seguido por la exclusión de las células en los pocillos del análisis adicional. Los ejemplos de mecanismos que se pueden usar para seleccionar o excluir un subconjunto de células del análisis adicional (por ejemplo, mecanismos de selección) incluyen, pero no se limitan a, (i) la retirada física de células o perlas seleccionadas de la matriz, (ii) el atrapamiento físico de células o perlas seleccionadas dentro de la matriz, (iii) destrucción física de células o perlas seleccionadas dentro de la matriz, o (iv) uso de esquemas de codificación doble por el cual los datos de secuencia que se generan para una célula dada se seleccionan o se excluyen del análisis adicional.
Un ejemplo no limitante de un mecanismo de selección para la retirada física de perlas seleccionadas (en donde las perlas son perlas magnéticas) de micropocillos (previniendo así el análisis de secuencias aguas abajo de moléculas diana de ácido nucleico de la(s) célula(s) correspondiente(s)) es el uso de sondas magnéticas miniaturizadas (por ejemplo, cabezales de escritura de disco duro de ordenador de ordenador modificados) para coger perlas de pocillos que contienen células que se han identificado que se corresponden con un conjunto previamente especificado de características celulares. Los discos duros modernos pueden alcanzan densidades de bits de más de 800 Gbit/in2, que corresponde a un área de bit de 8,1 x 10-4 pm2. La tecnología de discos duros que data desde los años 80 tuvo áreas de bit de aproximadamente 50 pm2 o menos, por tanto, en algunas realizaciones de los dispositivos y sistemas desvelados se puede adaptar tecnología de cabezales de escritura magnéticos con el fin de retirar perlas de pocillos especificados.
Otro ejemplo de un mecanismo de selección para la retirada física de células o perlas seleccionadas de micropocillos es el uso de micropipetas y micromanipuladores. En realizaciones donde los micropocillos están accesibles, por ejemplo, a través del uso de una pared cámara extraíble o ventana óptica, se pueden usar un micromanipulador para situar una o más micropipetas, extraer células o perlas seleccionadas de micropocillos (por ejemplo, aplicando succión suave a la una o más micropipetas), y moverlas hasta una posición en el cartucho o instrumento (por ejemplo, un recipiente) donde pueden ser secuestradas para la posterior eliminación o posterior procesamiento y análisis. Los micromanipuladores comercialmente disponibles proporcionan resolución de etapas micrométricas para el preciso posicionamiento, mientras que los extractores de micropipetas comercialmente disponibles permiten la fabricación de diámetros de punta de aproximadamente 5 pm y más pequeños.
Otro ejemplo de un mecanismo de selección para la retirada física de células o perlas seleccionadas de micropocillos es el uso de trampas de fuerza de gradiente de haz de luz único (por ejemplo, "pinzas ópticas"). Estos aparatos usan un haz de láser altamente enfocado para crear una trampa óptica (por ejemplo, generando fuerzas de atracción o repulsión, dependiendo del desapareamiento en el índice de refracción entre un objeto y el medio circundante) para sujetar físicamente y mover objetos dieléctricos microscópicos. En algunas realizaciones, se pueden usar pinzas ópticas para extraer células o perlas seleccionadas de micropocillos y moverlas, o directamente usando las pinzas ópticas o a través del control simultánea de flujo de fluidos a través de la celda de flujo o cámara de micropocillos, hasta una posición en el cartucho (por ejemplo, un depósito) donde pueden ser secuestradas para posterior eliminación o posterior procesamiento y análisis.
Otro ejemplo de un mecanismo de selección para la retirada física de células o perlas seleccionadas de micropocillos puede ser el uso de expulsión acústica de gotitas. La expulsión acústica de gotitas se ha usado para dispensar con precisión pequeñas gotitas de líquido (que varía en volumen de varios cientos de picolitros a varios cientos de nanolitros), y también se ha usado para dispensar células, perlas y microcristales de proteína. Se podría usar energía acústica enfocada generada por un transductor ultrasónico para expulsar y capturar células o perlas seleccionadas de micropocillos para excluirlos de las etapas ensayo y análisis aguas abajo. Normalmente, el tamaño de las gotitas se puede controlar ajustando parámetros de ultrasonidos tales como frecuencia de pulsos y amplitud. En algunas realizaciones, las células o perlas expulsadas podrían ser retenidas para uso selectivo en las etapas ensayo y análisis aguas abajo.
Un ejemplo relacionado de un mecanismo de selección para asegurar que datos para células seleccionadas se eliminan del procesamiento aguas abajo, sin requerir la retirada física de células o perlas de micropocillos, sería el uso de conectores fotoescindibles para la unión de marcadores estocásticos a perlas. Se iluminarían perlas co-localizadas con células especificadas con una haz de luz de enfoque (normalmente luz UV) para liberar los marcadores fijados y permitir que se aclaren y eliminen de etapas de ensayo adicionales. Este enfoque requerirá probablemente que se identifiquen condiciones adecuadas para lograr la eficiente fotólisis, mientras que las células restantes quedan intactas en el patrón de micropocillos.
Un ejemplo de un mecanismo de selección para la destrucción física de células o perlas seleccionadas en micropocillos es el uso de fotoablación láser, en la que luz de láser de enfoque, por ejemplo, que enfoca CO2 o pulsos de láser de excímeros, se usa para romper selectivamente enlaces y retirar material mientras que causa poco o ningún daño a materiales circundantes.
Un ejemplo no limitante de un mecanismo de selección para el atrapamiento físico de perlas magnéticas dentro de micropocillos es el uso de sondas magnéticas miniaturizadas, por ejemplo, la tecnología de cabezales de escritura magnéticos originalmente desarrollados para discos duros de ordenador se puede adaptar en algunas realizaciones de los dispositivos y sistemas desvelados con el fin de atrapar perlas en pocillos especificados. Se podrían instalar en proximidad uno o más cabezales de escritura magnéticos microfabricados modificados con uno o más micropocillos especificados y activar para mantener las perlas correspondientes en su sitio, previniendo así que eluyan y etapas de ensayo aguas abajo. En algunas realizaciones, se puede fabricar una matriz de electroimanes microfabricados sobre una superficie de un sustrato de matrices de micropocillos (o dentro del propio sustrato) para crear una matriz direccionable de sondas magnéticas que se puede usar para atrapar perlas seleccionadas.
Otros ejemplos de mecanismos de selección para el atrapamiento físico de células o perlas incluyen el uso de materiales de sustrato de perlas o micropocillos que se encogen o expanden tras la exposición a un estímulo físico o químico localizado. En algunas realizaciones, por ejemplo, se fabrican perlas de un material adecuado de forma que las perlas seleccionadas, es decir, las asociadas a un subconjunto especificado de células en los micropocillos, se someten a un estímulo local y se expanden de forma que no se pueden retirar de los micropocillos dentro de los que se localizan, retirándolos así eficazmente de etapas de proceso del ensayo adicionales. Alternativamente, en algunas realizaciones, los micropocillos se fabrican de un material adecuado de forma que pocillos seleccionados, es decir, los pocillos que contienen un subconjunto especificado de células, se someten a un estímulo local y se encogen de forma que no se pueden retirar las perlas contenidas dentro, retirándolas así eficazmente de las etapas de proceso del ensayo adicionales. Los ejemplos de materiales hinchables o encogibles adecuados pueden incluir geles de polímero termosensibles (que presentan un cambio discontinuo en el grado de hinchamiento con la temperatura), polímeros sensibles al pH (que se encogen o hinchan dependiendo del pH local), polímeros electro-sensibles (que se encogen o hinchan en respuesta a campos eléctricos locales) y polímeros sensibles a la luz (que se encogen o hinchan en respuesta a exposición a luz UV o visible).
Distribución de más de un tipo de célula: En algunas realizaciones, el sistema puede incluir funcionalidad para distribuir más de un tipo de célula sobre la matriz de micropocillos. Por ejemplo, el sistema puede cargar la matriz de micropocillos con un primer tipo de célula A, seguido por aclarado y posterior carga con un segundo tipo de célula B, de forma que una pluralidad de micropocillos contiene una célula individual de tipo A y una célula individual de tipo B. Dicha funcionalidad del sistema puede ser útil en el estudio de interacciones célula-célula y otras aplicaciones. En general, el sistema se puede configurar para distribuir al menos un tipo de célula, al menos dos tipos de células, al menos tres tipos de células, al menos cuatro tipos de células, o al menos cinco tipos de células sobre la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, el sistema se puede configurar para distribuir como máximo cinco tipos de células, como máximo cuatro tipos de células, como máximo tres tipos de células, como máximo dos tipos de células, o como máximo un tipo de célula sobre la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, el sistema se puede configurar para distribuir mezclas complejas de células sobre la matriz de micropocillos. En todas estas configuraciones, el sistema se puede configurar para optimizar la distribución de células en micropocillos, y para identificar pocillos que tienen un mayor o menor número de células que un número especificado de células, usando distribución de células, obtención de imágenes en tiempo real, y mecanismos de retroalimentación como se ha descrito anteriormente. En general, el porcentaje de micropocillos que contienen más de un tipo de célula, por ejemplo, una célula de cada uno de los tipos A y B, o una célula de cada uno de los tipos A, B, y C, puede variar desde aproximadamente 1 % a aproximadamente 100%. En algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen más de un tipo de célula puede ser al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 40 %, al menos 60 %, al menos 80 %, o al menos 90 %. En otras realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen más de un tipo de célula puede ser como máximo 100 %, como máximo 90 %, como máximo 80 %, como máximo 60 %, como máximo 40 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 %. En una realización específica, el porcentaje de micropocillos que contienen más de un tipo de célula puede tener un valor que se encuentra en cualquier parte dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente 8,5 %.
Mecanismos de lisis celular: En algunas realizaciones de los métodos, dispositivos y sistemas desvelados, se pueden llevar a cabo la lisis celular por medios químicos o bioquímicos, por choque osmótico, o por medio de lisis térmica, lisis mecánica, o lisis óptica. En algunas realizaciones, por ejemplo, las células se pueden lisar mediante adición de un tampón de lisis celular que comprende un detergente (por ejemplo, SDS, dodecilsulfato de Li, Triton X-100, Tween-20, o NP-40), un disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetona), o enzimas digestivas (por ejemplo, proteinasa K, pepsina o tripsina), o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones del sistema de instrumentos, uno o más de estos reactivos (por ejemplo, suspensiones de perlas) se pueden almacenar en botellas o recipientes que se conectan a la celda de flujo de micropocillos o cartucho cuando se insertan en el instrumento. En algunas realizaciones, los reactivos (por ejemplo, suspensiones de perlas) se pueden cargar previamente en el cartucho.
En algunas realizaciones, el sistema de instrumentos puede incluir capacidad de lisis celular mecánica como una alternativa al uso de detergentes u otros reactivos. La sonicación usando un transductor piezoeléctrico de alta frecuencia es un ejemplo de una técnica adecuada.
Control de campo magnético: Como se indica en cualquier parte en la presente divulgación, muchas realizaciones de los métodos desvelados utilizan campos magnéticos para retirar perlas de los micropocillos tras completarse el ensayo. En algunas realizaciones, el sistema de instrumentos puede comprender además el uso de campos magnéticos para transportar perlas dentro o fuera de la celda de flujo de micropocillos o cámara, o a través de otras partes del sistema de instrumentos, o para retener o atrapar perlas en localizaciones particulares después de que se hayan cargado o distribuido antes del ensayo o durante el ensayo. Los ejemplos de medios adecuados para proporcionar control de campos magnéticos incluyen, pero no se limitan a, el uso de electroimanes en posición (posiciones) fija(s) con respecto al cartucho, o el uso de imanes permanentes que son mecánicamente reposicionados según sea necesario. En algunas realizaciones del sistema de instrumentos, la intensidad del (de los) campo(s) aplicado(s) variará variando la cantidad de corriente aplicada a uno o más electroimanes. En algunas realizaciones del sistema de instrumentos, la intensidad de los campos magnéticos aplicados variará cambiando la posición de uno o más imanes permanentes con respecto a la posición de la(s) cámara(s) de micropocillos usando, por ejemplo, actuadores lineales accionados por motores de pasos, actuadores lineales accionados por servomotores, o mecanismos de árbol de levas. En otras realizaciones, las posiciones de los imanes se pueden controlar en un modo lineal (o no lineal), con velocidades elegidas para maximizar la eficiencia de recogida de perlas, a diferencia de realizar transiciones entre solo dos posiciones fijas. En algunas realizaciones del sistema de instrumentos, puede ser ventajoso el uso de campos magnéticos pulsados, por ejemplo, para prevenir el agrupamiento de perlas magnéticas.
Además de la consideración de la intensidad y localización de campos magnéticos para manipular perlas y otros materiales, es importante diseñar el sistema de forma que el gradiente de campo magnético sea adecuado para la tarea que se realiza. Son gradientes espaciales en campo magnético los que ejercen fuerza translacional sobre los materiales magnéticos y partículas. Se pueden lograr gradientes adecuados en campos usando múltiples imanes, el uso de imanes o materiales magnetizados con geometrías de bordes y caras particulares, y diseñando imanes con escala espacial apropiada. Aquí, el término "imanes" se refiere a imanes permanentes o electroimanes. Se pueden usar ensamblajes de imanes que comprenden múltiples dominios magnéticos, formados intrínsecamente o por diseño, para generar campos magnéticos con intensidades de campo y variaciones espaciales deseables. Por ejemplo, se pueden colocar patrones de pequeños imanes con ejes de campo paralelos o antiparalelos, u otros ángulos relativos, adyacentes al patrón de pocillos y fluídica, para lograr el atrapamiento óptimo o la manipulación de perlas durante la carga y operación del dispositivo. En algunas realizaciones de los sistemas desvelados, por ejemplo, cuando se usan campos magnéticos para atrapar perlas magnéticas en micropocillos o para eluir perlas magnéticas de micropocillos, se pueden aplicar simultáneamente un gradiente de campo magnético externamente aplicado a todo el patrón de micropocillos. En algunas realizaciones, se pueden aplicar gradientes externamente aplicados de campo magnético a un área seleccionada del patrón de micropocillos. En algunas realizaciones, se puede aplicar un gradiente de campo magnético externamente aplicado a un micropocillo individual. En algunas realizaciones, las líneas de campo magnético para un campo magnético externamente aplicado pueden encontrarse a un ángulo con respecto al plano del sustrato de los micropocillos de entre aproximadamente 30 grados y 89 grados. En algunas realizaciones, el ángulo de las líneas de campo magnético con respecto al plano del sustrato de los micropocillos puede ser entre aproximadamente 45 grados y 80 grados. En algunas realizaciones, el ángulo de las líneas de campo magnético con respecto al plano del sustrato de los micropocillos puede ser al menos 45 grados, al menos 50 grados, al menos 55 grados, al menos 60 grados, al menos 65 grados, al menos 70 grados, al menos 75 grados, o al menos 80 grados, o superior. En algunas realizaciones, el ángulo de las líneas de campo magnético con respecto al plano del sustrato de los micropocillos puede ser como máximo 80 grados, como máximo 75 grados, como máximo 70 grados, como máximo 65 grados, como máximo 60 grados, como máximo 55 grados, como máximo 50 grados, o como máximo 45 grados, o más pequeños. Los expertos en la técnica reconocerán que el ángulo de las líneas de campo magnético con respecto al plano del sustrato de los micropocillos pueden tener cualquier valor dentro de este intervalo, por ejemplo, aproximadamente 52 grados.
Control de temperatura: En algunas realizaciones, el sistema de instrumentos incluirá funcionalidad de control de la temperatura con el fin de facilitar la exactitud y reproducibilidad de los resultados del ensayo, por ejemplo, puede ser ventajoso el enfriamiento de la celda de flujo de micropocillos o cámara para minimizar la difusión molecular entre micropocillos. Los ejemplos de componentes de control de la temperatura que se pueden incorporar en el diseño del sistema de instrumentos (o cartucho) incluyen, pero no se limitan a, elementos de calentamiento resistivo, fuentes de luz infrarroja, dispositivos de calentamiento o enfriamiento de Peltier, sumideros de calor, termistores, termopares, y similares. En algunas realizaciones del sistema, el controlador de temperatura puede proporcionar un cambio de temperatura programable en un momento ajustable especificado antes de realizar las etapas de lisis celular y ensayo aguas abajo. En algunas realizaciones del sistema, el controlador de temperatura puede proporcionar cambios programables en la temperatura durante intervalos de tiempo especificados. En algunas realizaciones, el controlador de temperatura puede proporcionar además el ciclado de temperaturas entre dos o más temperaturas fijas con tasas de frecuencia y rampa específicas de manera que se pueda realizar el ciclado térmico para reacciones de amplificación.
Capacidad de obtención de imágenes: Como se indica anteriormente, en muchas realizaciones el sistema de instrumentos incluirá estudios de imágenes ópticas u otras capacidades espectroscópicas. Dicha funcionalidad puede ser útil, por ejemplo, para inspección del sustrato de los micropocillos para determinar si el patrón de micropocillos ha sido o no uniformemente y óptimamente poblado con células o perlas. Se puede utilizar cualquiera de una variedad modos de obtención de imágenes, que incluye, pero no se limitan a, obtención de imágenes de campo brillante, de campo oscuro, fluorescencia, luminiscencia o fosforescencia. La elección del modo de obtención de imágenes afectará el diseño de matrices de micropocillos, celdas de flujo y cámaras de cartucho en los que el sustrato de los micropocillos o pared opuesta de la celda de flujo o cámara de micropocillos necesitarán ser necesariamente transparentes por encima del intervalo espectral de interés. En algunas realizaciones, se puede usar luz de iluminación parcialmente coherente para mejorar el contraste de células sin teñir en imágenes de campo brillante.
En algunas realizaciones, se puede usar obtención de imágenes de fase cuantitativa para mejorar el rendimiento de software automatizado de procesamiento y análisis de imágenes en la determinación del número de células situadas en cada micropocillo. Las células sin teñir normalmente absorben muy poca luz, pero provocan retrasos de fase medibles en luz transmitida. La obtención de imágenes de fase cuantitativa se puede referir a cualquiera de los varios métodos para calcular la información de fase a partir de una serie de dos o más imágenes (que capturan datos de intensidad) recogidas usando luz coherente o parcialmente coherente. Se puede capturar una serie de imágenes de intensidad adecuadas, por ejemplo, capturando imágenes a diferentes distancias de desenfoque. Las imágenes se procesan entonces para recuperar la información de fase usando, por ejemplo, usando el algoritmo de "Transporte de Intensidad" o técnicas iterativas basadas en el enfoque de Gerchberg-Saxton, para crear una forma y mapa de densidad de las células en el campo de visión.
En algunas realizaciones, se pueden obtener imágenes de cada pluralidad de micropocillos en su totalidad dentro de una imagen individual. En algunas realizaciones, se puede "embaldosas" una serie de imágenes para crear una imagen de alta redisolución de todo el patrón de micropocillos. En alguna realización, se puede usar una imagen individual que representa una subsección del patrón para evaluar propiedades, por ejemplo, distribuciones de células o perlas, para el patrón en conjunto.
En algunas realizaciones, se puede realizar la obtención de imágenes de excitación y emisión de longitud de onda doble (o excitación o emisión multi-longitud de onda).
Fuentes de luz: Se puede usar cualquiera de una variedad de fuentes de luz para proporcionar la obtención de imágenes o excitación luz, que incluyen, pero no se limitan a, lámparas de tungsteno, lámparas de tungstenohalógenos, lámparas de arco, láseres, diodos emisores de luz (LEDs), o diodos láser. En muchas realizaciones, una combinación de una o más fuentes de luz, y componentes ópticos adicionales, por ejemplo, lentes, filtros, aberturas, diafragmas, espejos, y similares, comprenderá un sistema de iluminación (o sub-sistema).
Detectores: Se puede usar cualquiera de una variedad de sensores de imagen para fines de obtención de imágenes, que incluyen, pero no se limitan a, matrices de fotodiodos, cámaras de dispositivo de carga (CCD), o sensores de imagen CMOS. Los sensores de obtención de imágenes pueden ser sensores de matriz unidimensionales (lineales) o sensores de matriz bidimensionales. En muchas realizaciones, una combinación de uno o más sensores de imagen, y componentes ópticos adicionales, por ejemplo, lentes, filtros, aberturas, diafragmas, espejos, y similares, comprenderán un sistema de obtención de imágenes (o sub-sistema).
Otros componentes ópticos: El sistema óptico normalmente incluirá una variedad de componentes ópticos para dirigir, moldear, filtrar o enfocar haces de luz a través del sistema. Los ejemplos de componentes ópticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, lentes, espejos, prismas, redes de difracción, filtros de vidrio coloreado, filtros de interferencia de banda estrecha, filtros de interferencia de banda ancha, reflectores dicroicos, fibras ópticas, guías de onda óptica, y similares. En algunas realizaciones, el sistema de obtención de imágenes comprenderá además una o más etapas de traducción u otros mecanismos de control del movimiento con el fin de mover el (los) sustrato(s) de micropocillos con respecto a los sistemas de iluminación y/u obtención de imágenes, o viceversa. En algunas realizaciones, el sistema de instrumentos puede usar un sustrato de micromatrices ópticamente transparente como guía de onda óptica para suministrar luz de excitación a los micropocillos.
Técnicas de ensayo complementarias: La elección del modo de obtención de imágenes también puede permitir el uso de otros tipos de ensayos para ser realizados en paralelo con los ensayos de marcado estocástico e indexado molecular, por ejemplo, el uso de ensayos Live cell / Dead cell con azul de tripano con obtención de imágenes de campo brillante, el uso de ensayos Live cell / Dead cell basados en fluorescencia con obtención de imágenes de fluorescencia, etc. La correlación de datos de viabilidad para células individuales con el marcador celular asociado a cada perla en el micropocillo asociado puede proporcionar un nivel de discriminación adicional en analizar los datos de ensayos multiplexados de células individuales.
Capacidades adicionales del sistema: En algunas realizaciones, el sistema puede comprender capacidades no de obtención de imágenes o no ópticas para sondar la matriz de micropocillos. Los ejemplos de técnicas no de obtención de imágenes o no ópticas para detectar burbujas de aire atrapadas, determinación de la distribución de células o perlas sobre la matriz, etc., incluyen pero no se limitan a, mediciones de la dispersión de la luz, mediciones de absorción de ultravioleta/visible/infrarrojos (por ejemplo, usando células o perlas teñidas que incorporan colorantes), dispersión coherente de Raman y mediciones de conductancia (por ejemplo, usando matrices de electrodos microfabricadas en registro con matrices de micropocillos). En algunas realizaciones, se puede usar la información obtenida sobre la condición o contenidos de pocillos particulares para determinar que los pocillos deben ser secuestrados, escindidos o prevenidos de otro modo de contribuir a los resultados del ensayo. Por ejemplo, se pueden usar elementos de calentamiento eléctrico para formar una burbuja o desnaturalizar los contenidos del pocillo, o se puede aplicar energía óptica para deformar las paredes del pocilio y así atrapar el contenido, o se podría aplicar un campo magnético local de forma que la perla a eliminar quedara atrapada en el sustrato en lugar de eluirse para análisis.
Interfaces con termocicladores de PCR, secuenciadores e instrumentos de FACS: En algunas realizaciones, los sistemas de instrumentos de la presente divulgación pueden comprender además interfaces con termocicladores de PCR, secuenciadores, citómetros de flujo, instrumentos de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS), u otros tipos de equipo automatizado de laboratorio.
En algunas realizaciones, se proporciona una interfaz para termocicladores de PCR de forma que el sistema de instrumentos genere bibliotecas de oligonucleótidos marcados directamente en tubos, tiras, o placas que son compatibles con los instrumentos de PCR comercialmente disponibles, por ejemplo, la serie LightCycler® de Roche de instrumentos de PCR en tiempo real, y similares.
En algunas realizaciones, se proporciona una interfaz para clitómetros de flujo o instrumentos de FACS de forma que las células clasificadas se depositen directamente en una matriz de micropocillos o cartucho. La interfaz para los instrumentos de FACS puede incluir, por ejemplo, tanto componentes de hardware como de software, donde el software proporciona la capacidad de control simultáneo del instrumento de FACS y el sistema de marcado estocástico de células individuales o de creación de códigos de barras moleculares. En algunas realizaciones, el software puede proporcionar capacidad de análisis para identificar correlaciones entre los datos de FACS (por ejemplo, la presencia o ausencia de marcadores de la superficie celular especificados) y los números de copias para uno o más genes en una sub-población de células especificada. Se pueden usar máquinas de FACS para clasificar células individuales directamente en la matriz de micropocillos de la divulgación.
En algunas realizaciones, se proporciona en general una interfase con equipo automatizado de laboratorio, por ejemplo, se pueden configurar cartuchos para su uso con los sistemas de instrumentos desvelados para que tengan puertos de entrada de la dimensión y separación apropiadas de forma que las muestras y reactivos puedan ser dispensados directamente en el cartucho usando estaciones de pipeteado comercialmente disponibles y robótica para la manipulación de líquidos. Similarmente, en algunas realizaciones, los cartuchos para su uso con los sistemas de instrumentos desvelados se pueden configurar para tener dimensiones que son compatibles con la robótica de manipulación de placas comercialmente disponible para almacenamiento automatizado, recuperación o movimiento entre otras estaciones de trabajo de laboratorio.
Procesador y software del sistema:
En general, los sistemas de instrumentos diseñados para soportar la automatización de ensayos de marcado estocástico de células individuales duplexados y de creación de códigos de barras moleculares incluirán un procesador u ordenador, junto con software para proporcionar (i) funcionalidad de control del instrumento, (ii) capacidad de procesamiento y análisis de imágenes, y (iii) funcionalidad de almacenamiento, análisis y visualización de datos.
Procesador del sistema y software de control: En muchas realizaciones, el sistema de instrumentos comprenderá un ordenador (o procesador) y medios legibles por ordenador que incluyen código para proporcionar una interfaz de usuario, así como control manual, semiautomatizado o completamente automatizado de todas las funciones del sistema, por ejemplo, control del sistema fluídico, el sistema de control de la temperatura, distribución de funciones de células o perlas, funciones de manipulación de perlas magnéticas, y el sistema de obtención de imágenes. En algunas realizaciones, el ordenador o procesador del sistema puede ser un componente integrado del sistema de instrumentos (por ejemplo, un microprocesador o placa base incorporado dentro del instrumento). En algunas realizaciones, el ordenador o procesador del sistema puede ser un módulo independiente, por ejemplo, un ordenador personal u ordenador portátil. Los ejemplos de funciones de control de fluidos proporcionadas por el software de control del instrumento incluyen, pero no se limitan a, caudales volumétricos de fluido, velocidades de flujo de fluidos, el momento exacto y la duración para la adición de muestra y perla, adición de reactivo, y etapas de aclarado. Los ejemplos de las funciones de control de la temperatura proporcionadas por el software de control del instrumento incluyen, pero no se limitan a, especificar el (los) punto(s) de consigna de temperatura y control del momento exacto, duración y tasas de incremento para cambios de temperatura. Los ejemplos de funciones de distribución de células o perlas proporcionadas por el software de control del instrumento incluyen, pero no se limitan a, control de los parámetros de agitación tales como amplitud, frecuencia y duración. Los ejemplos de funciones de campo magnético proporcionadas por el software de control del instrumento incluyen, pero no se limitan a, el momento exacto y la duración del (de los) campo(s) magnético(s) aplicado(s), y en el caso de electroimanes, también la intensidad del campo magnético. Los ejemplos de las funciones de control del sistema de obtención de imágenes proporcionadas por el software de control del instrumento incluyen, pero no se limitan a, capacidad de autoenfoque, control de la iluminación o los tiempos de exposición e intensidades de la luz de excitación, control de la tasa de adquisición de imágenes, tiempo de exposición y opciones de almacenamiento de datos.
Software de procesamiento de imágenes: En algunas realizaciones del sistema de instrumentos, el sistema comprenderá además medios legibles por ordenador que incluyen código para proporcionar capacidad de procesamiento y análisis de imágenes. Los ejemplos de capacidad de procesamiento y análisis de imágenes proporcionada por el software incluyen, pero no se limitan a, ajuste de la exposición de imágenes manual, semiautomatizado o completamente automatizado (por ejemplo, balance de blancos, ajuste de contraste, promediado de señales, y otra capacidad de reducción del ruido, etc.), detección automatizada de la identificación de bordes y objetos (es decir, para identificar células y perlas en la imagen), análisis estadístico automatizado (es decir, para determinar el número de células o perlas identificadas por micropocillo o por unidad área del sustrato de micropocillos, o para identificar pocillos que contienen más de una célula o más de una perla), y capacidades de medición manual (por ejemplo, para medir distancias entre objetos, etc.). En algunas realizaciones, el software de control del instrumento y de procesamiento/análisis de imágenes será escrito como módulos de software separados. En algunas realizaciones, el software de control del instrumento y de procesamiento/análisis de imágenes se incorporará en un paquete integrado.
En algunas realizaciones, el software del sistema puede proporcionar análisis integrado de imágenes en tiempo real y control del instrumento, de manera que las etapas de carga de muestras de células y perlas se pueda prolongar, modificar o repetir hasta que se logren distribuciones óptimas de células y perlas (por ejemplo, uniformemente distribuidas a través del patrón de micropocillos en un nivel predeterminado para el número de pocillos que contienen una célula individual, el número de pocillos que contienen una perla individual, o el número de pocillos que contienen tanto una célula individual como una perla individual). Se puede usar cualquiera de varios algoritmos de procesamiento y análisis de imágenes conocidos por los expertos en la técnica para implementar la capacidad de análisis de imágenes en tiempo real o post-procesamiento. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el método de detección de bordes de Canny, el método de detección de bordes de Canny-Deriche, el método de detección de bordes de gradiente de primer orden (por ejemplo, el operador de Sobel), método de detección de bordes por diferencial de segundo orden, métodos de detección de bordes por congruencia de fases (coherencia de fases), otros algoritmos de segmentación de imágenes (por ejemplo, umbral de intensidad, métodos de agrupamiento de intensidad, métodos basados en histogramas de intensidad, etc.), algoritmos de reconocimiento de características y patrones (por ejemplo, la transformada de Hough generalizada para detectar formas arbitrarias, la transformada de Hough circular, etc.), y algoritmos de análisis matemático (por ejemplo, transformada de Fourier, transformada rápida de Fourier, análisis de ondículas, auto-correlación, etc.), o combinaciones de los mismos. Como se explica resumidamente anteriormente, los ejemplos de mecanismos para facilitar la distribución de células y perlas que se puede controlar a través de retroalimentación de análisis de imágenes en tiempo real incluyen, pero no se limitan a, balanceo, agitación, turbulencia, flujo recirculante, flujo oscilatorio o pulsátil, agitación de baja frecuencia (por ejemplo, a través de pulsación de un membrana flexible (por ejemplo, silicona) que forma una pared de la cámara o canal de fluido cercano), o agitación de alta frecuencia (por ejemplo, a través del uso de transductores piezoeléctricos). En algunas realizaciones, el sistema de instrumentos puede monitorizar el número total de células capturadas en los micropocillos, como se ha determinado por procesamiento y análisis de imágenes, y cortar el suministro de células cuando se alcance un número predeterminado de células para evitar cargar un número excesivo de pocillos con dos o más células. En algunas realizaciones, el sistema de instrumentos puede monitorizar el número de pocillos que contienen células individuales, y cortar el suministro de células cuando se alcance un número predeterminado de pocillos para evitar cargar un número excesivo de pocillos con dos o más células. En algunas realizaciones, el sistema de instrumentos puede monitorizar el número de pocillos que contienen perlas individuales, y cortar el suministro de perlas cuando se alcance un número predeterminado de pocillos para evitar cargar un número excesivo de pocillos con dos o más perlas. En algunas realizaciones, el sistema de instrumentos puede monitorizar el número de pocillos que contienen tanto una célula individual como una perla individual, y cortar el suministro de células o perlas (o ambos) para evitar cargar un número excesivo de pocillos con dos o más células o perlas.
Cuando se usa análisis integrado de imágenes en tiempo real y control del instrumento para lograr distribuciones óptimas de perlas, se puede elegir como diana cualquiera de una variedad de niveles predeterminados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen una perla individual puede ser entre 1 % y 100 %. En algunas realizaciones, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener una perla individual. En algunas realizaciones, como máximo 100%, como máximo 99%, como máximo 95%, como máximo 90%, como máximo 80 %, como máximo 70 %, como máximo 60 %, como máximo 50 %, como máximo 40 %, como máximo 30 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener una perla individual.
Cuando se usa análisis integrado de imágenes en tiempo real y control del instrumento para lograr distribuciones óptimas de células, se puede elegir como diana cualquiera de una variedad de niveles predeterminados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen una célula individual puede ser entre 1 % y 100 %. En algunas realizaciones, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener una célula individual. En algunas realizaciones, como máximo 100%, como máximo 99%, como máximo 95%, como máximo 90%, como máximo 80 %, como máximo 70 %, como máximo 60 %, como máximo 50 %, como máximo 40 %, como máximo 30 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener una célula individual.
El análisis de imágenes en tiempo real puede comprender monitorizar la eficiencia de captura de células en los micropocillos (es decir, determinar el número de pocillos que tienen una célula en ellos y/o determinar el porcentaje de células que están entre los pocillos). La captura de células se puede mejorar por métodos tales como agitación, fluido de lavado (es decir, descarga), y/o métodos magnéticos. Por ejemplo, el porcentaje de células que puede estar entre los micropocillos puede ser entre 1 % y 100 %. En algunas realizaciones, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de las células pueden estar entre los micropocillos (por ejemplo, sobre la superficie entre los micropocillos). En algunas realizaciones, como máximo 100 %, como máximo 99 %, como máximo 95 %, como máximo 90 %, como máximo 80 %, como máximo 70 %, como máximo 60 %, como máximo 50 %, como máximo 40 %, como máximo 30 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 % de las células puede estar entre los micropocillos (por ejemplo, sobre la superficie entre micropocillos).
Cuando se usa análisis integrado de imágenes en tiempo real y control del instrumento para lograr distribuciones óptimas de células y perlas, por ejemplo, para maximizar el porcentaje de micropocillos que contienen tanto una célula individual como una perla individual, se puede elegir como diana cualquiera de una variedad de niveles predeterminados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el porcentaje de micropocillos que contienen tanto una célula individual como una perla individual puede estar entre 1 % y 100 %. En algunas realizaciones, al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener tanto una célula individual como una perla individual. En algunas realizaciones, como máximo 100 %, como máximo 99 %, como máximo 95 %, como máximo 90 %, como máximo 80 %, como máximo 70 %, como máximo 60 %, como máximo 50 %, como máximo 40 %, como máximo 30 %, como máximo 20 %, como máximo 10 %, como máximo 5 %, o como máximo 1 % de los micropocillos en la pluralidad de micropocillos pueden contener tanto una célula individual como una perla individual.
En algunas realizaciones, el software del sistema puede proporcionar análisis integrado de imágenes en tiempo real y control del instrumento, de manera que las células se puedan monitorizar y clasificar ópticamente según un conjunto predeterminado de características, y posteriormente se incluyen o excluyen del análisis de datos de secuencias aguas abajo. Los ejemplos de características celulares que se pueden monitorizar ópticamente y usar para fines de clasificación incluyen, pero no se limitan a, tamaño de la célula, forma de la célula, determinación Live cell / Dead cell (por ejemplo, usando cromóforos selectivamente absorbidos tales como azul de tripano, o colorantes fluorescentes tales como calceínaAM, homodímero-1 de etidio, DiOC2(3), D¡OCs(3), DiOC6(3), D¡s Cs(5), DNC-i(5), DiOC1s(3), yoduro de propidio, SYBR® 14, SYTOX® Green, etc.), células que presentan un intervalo especificado de pH intracelular (por ejemplo, usando sondas fluorescentes sensibles al pH intracelular tales como 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(y-6-)carboxifluoresceína (BCECF), 2',7'-bis-(2-carboxipropil)-5-(y-6-)-carboxifluoresceína (BCPCF), etc.), células que presentan un intervalo especificado de potencial de membrana (por ejemplo, usando fluoróforos sensibles al potencial de membrana tales como FluoVolt™, di-3-ANEPPDHQ, ácido bis-(1,3-dibutilbarbitúrico) trimetina oxonol (D¡Ba C4(3)), D¡BAC4(5), D¡SBAC2(3), merocianina 540, JC-1, JC-9, Oxonol V, Oxonol VI, ésteres metílico y etílicos de tetrametilrodamina, Rhodamine 123, Di-4-ANEPPS, Di-8-ANEPPS, di-2-ANEPEQ, Di-3-ANEPPDHQ, Di-4-ANEPPDHQ, etc.), células que presentan un nivel especificado de calcio intracelular (por ejemplo, usando colorantes fluorescentes sensibles al Ca2+ tales como fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, Calcium Green-1, Quin 2, etc.), células que presentan uno o más marcadores de la superficie celular especificados (por ejemplo, usando anticuerpos fluorescentemente marcados dirigidos hacia los marcadores de la superficie celular), células que expresan proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP, proteína fluorescente inducible por bilirrubina, UnaG, dsRed, eqFP611, Dronpa, TagRFPs, KFP, EosFP, Dendra, IrisFP, etc.), y similares. En muchas realizaciones, se pueden seleccionar dos o más colorantes, fluoróforos, u otras sondas ópticas que tienen propiedades espectrales no superponibles (por ejemplo, picos de excitación no superponibles, picos de absorción o emisión no superponibles, etc.) de manera que las células puedan ser simultáneamente caracterizadas con respecto a dos o más propiedades. En algunas realizaciones, se usa procesamiento y análisis de imágenes en tiempo real para identificar pocillos que contienen células que presentan una o más características especificadas, seguido por selección o exclusión de un subconjunto de células sobre la matriz del análisis adicional. En algunas realizaciones, se usa procesamiento y análisis de imágenes en tiempo real para identificar pocillos que contienen dos o más células, seguido por la exclusión de las células en los pocillos del análisis adicional. Como se ha descrito anteriormente con más detalle, los ejemplos de mecanismos que se pueden usar para seleccionar o excluir un subconjunto de células del análisis adicional incluyen, pero no se limitan a, (i) la retirada física de células o perlas seleccionadas de micropocillos por medio de sondas magnéticas miniaturizadas, aparato de pinzas ópticas, micromanipuladores, fotoablación, etc., (ii) el atrapamiento físico de células o perlas seleccionadas dentro de micropocillos por medio de sondas magnéticas miniaturizadas, perlas hinchables, pocillos encogibles, o (¡ii) uso de esquemas de codificación doble por lo que los datos de secuencia que se generan para una célula dada se seleccionan para o se excluyen del análisis adicional.
En algunas realizaciones, el software del sistema (o un módulo de software independiente) puede proporcionar capacidad de análisis de imágenes para recuento automatizado de células usando un hemocitómetro, permitiendo así que los usuarios determinen cuánta suspensión células se carga sobre el sustrato de matrices de micropocillos. En algunas realizaciones, la capacidad de recuento automatizado de células se puede acoplar con análisis de imágenes de fluorescencia opcionales de manera que las células se pueden caracterizar con respecto a viabilidad u otras propiedades (usando, por ejemplo, las sondas ópticas descritos anteriormente) al mismo tiempo que se realiza el recuento.
Análisis de datos y software de visualización: En algunas realizaciones del sistema de instrumentos, el sistema comprenderá medios legibles por ordenador que incluyen código para proporcionar análisis de datos para el conjunto de datos de secuencia generado realizando los ensayos de marcado estocástico de células individuales o de creación de códigos de barras moleculares. Los ejemplos de funcionalidad de análisis de datos que se pueden proporcionar por el software de análisis de datos incluyen, pero no se limitan a, (i) algoritmos para decodificación/demultiplexado del código de barras de muestras, código de barras de células, código de barras molecular, y datos de secuencia diana proporcionados por la secuenciación de la biblioteca de oligonucleótidos creada en la realización del ensayo, (ii) algoritmos para determinar el número de lecturas por gen por célula, y el número de moléculas de transcrito único por gen por célula, basándose en los datos, y creación tablas resumen, (iii) análisis estadístico de los datos de secuencia, por ejemplo, para agrupamiento de células por datos de expresión génica, o para predecir intervalos de confianza para determinaciones del número de moléculas de transcrito por gen por célula, etc., (iv) algoritmos para identificar sub­ poblaciones de células raras, por ejemplo, usando análisis de componentes principales, agrupamiento jerárquico, agrupamiento de k-medias, mapas auto-organizados, redes neurales, etc., (v) capacidades de alineamiento de secuencias para alineamiento de datos de secuencias de genes con secuencias de referencia conocidas y detección de mutación, marcadores polimórficos y variantes de corte y empalme, y (vi) agrupamiento automatizado de marcadores moleculares para compensar los errores de amplificación o secuenciación. En algunas realizaciones, se puede usar software comercialmente disponible para realizar todo o una porción del análisis de datos, por ejemplo, se puede usar el software Seven Bridges para compilar tablas del número de copias de uno o más genes que ocurren en cada célula para todo el conjunto de células. En algunas realizaciones, el software de análisis de datos puede incluir opciones para generar los resultados de secuenciación en formatos gráficos útiles, por ejemplo, mapas de calor que indican el número de copias de uno o más genes que ocurren en cada célula de un conjunto de células. En algunas realizaciones, el software de análisis de datos puede comprender además algoritmos para extraer significado biológico de los resultados de secuenciación, por ejemplo, correlacionando el número de copias de uno o más genes que ocurren en cada célula de un conjunto de células con un tipo de célula, un tipo de célula rara, o una célula derivada de un sujeto que tiene una enfermedad o afección específica. En alguna realización, el software de análisis de datos puede comprender además algoritmos para comparar poblaciones de células a través de diferentes muestras biológicas.
En algunas realizaciones, toda la funcionalidad de análisis de datos se puede presentar dentro de un único paquete de software. En algunas realizaciones, el conjunto completo de capacidades de análisis de datos puede comprender un paquete de aplicaciones de software. En algunas realizaciones, el software de análisis de datos puede ser un paquete individual se pone a disposición de los usuarios independientemente del sistema de instrumentos del ensayo. En algunas realizaciones, el software puede estar basado en banda, y puede permitir a los usuarios compartir datos.
Procesadores y redes del sistema: En general, el ordenador o procesador incluido en los sistemas de instrumentos actualmente desvelados, como se ilustra en la FIG. 35, se puede entender además como un aparato lógico que puede leer instrucciones de medios 511 o un puerto de red 505, que se puede conectar opcionalmente a un servidor 509 que tiene medios fijos 512. El sistema 500, tal como se muestra en la FIG. 35, puede incluir una CPU 501, unidades de disco 503, dispositivos de entrada opcionales tales como teclado 515 o ratón 516 y monitor opcional 507. La comunicación de datos se puede lograr a través del medio de comunicación indicado a un servidor en una localización local o remota. El medio de comunicación puede incluir cualquier medio de transmisión o recepción de datos. Por ejemplo, el medio de comunicación puede ser una conexión de red, una conexión inalámbrica o una conexión de internet. Dicha conexión puede proporcionar comunicación mediante la red de extensión mundial. Se prevé que los datos referentes a la presente divulgación se puedan transmitir mediante dichas redes o conexiones para recepción o revisión por una parte 522 como se ilustra en la FIG. 35.
La FIG. 36 es un diagrama de bloques que ilustra una primera arquitectura de ejemplo de un sistema informático 100 que se puede usar a propósito de las realizaciones de ejemplo de la presente divulgación. Como se representa en la FIG. 36, el sistema informático de ejemplo puede incluir un procesador 102 para procesar instrucciones. Los ejemplos no limitantes de procesadores incluyen: procesador Intel Xeon™, procesador AMD Opteron™, procesador Samsung 32-bit RISC Ar M 1176JZ(F)-S v1.0™, procesador ARM Cortex-A8 Samsung S5PC100™, procesador ARM Cortex-A8 Apple A4™, procesador Marvell PXA 930™, o un procesador funcionalmente equivalente. Se pueden usar múltiples hilos de ejecución para procesamiento paralelo. En algunas realizaciones, también se pueden usar múltiples procesadores o procesadores con múltiples núcleos, tanto en un único sistema informático, en a grupo, o distribuidos a través de sistemas por una red que comprende una pluralidad de ordenadores, teléfonos móviles, o dispositivos de asistentes de datos personales.
Como se ilustra en la FIG. 36, se puede conectar un caché de alta velocidad 104 a, o incorporar en, el procesador 102 para proporcionan una memoria de alta velocidad para instrucciones o datos que han sido recientemente, o son frecuentemente, usados por el procesador 102. El procesador 102 se conecta a un puente norte 106 por un bus de procesador 108. El puente norte 106 se conecta a una memoria de acceso aleatorio (RAM) 110 por un bus de memoria 112 y gestiona el acceso a la RAM 110 por el procesador 102. El puente norte 106 también se conecta a un puente sur 114 por un bus de conjunto de chips 116. El puente sur 114 se conecta, a su vez, a un bus periférico 118. El bus periférico puede ser, por ejemplo, PCI, PCI-X, PCI Express, u otro bus periférico. El puente norte y el puente sur se denominan frecuentemente un conjunto de chips de procesador y gestionan la transferencia de datos en el procesador, RAM y los componentes periféricos en el bus periférico 118. En algunas arquitecturas alternativas, la funcionalidad del puente norte se puede incorporar en el procesador en lugar de usar un chip de puente norte separado.
En algunas realizaciones, el sistema 100 puede incluir una tarjeta de aceleración 122 fijada al bus periférico 118. El acelerador puede incluir matrices de puerta programable por campo (FPGAs) u otro hardware para acelerar ciertos procesamientos. Por ejemplo, se puede usar un acelerador para la reestructuración adaptativa de datos o para evaluar expresiones algebraicas usadas en el procesamiento de conjuntos extendidos.
El software y los datos se almacenan en almacenamiento externo 124 y se pueden cargar en RAM 110 o caché 104 para su uso por el procesador. El sistema 100 incluye un sistema operativo para gestionar los recursos del sistema; ejemplos no limitantes de sistemas operativos incluyen: Linux, Windows™, MacOS™, BlackBerry OS™, iOS™ y otros sistemas operativos funcionalmente equivalentes, así como la ejecución de software de aplicación, además del sistema operativo para gestionar el almacenamiento de datos y la optimización según realizaciones de ejemplo de la presente invención.
En este ejemplo, el sistema 100 también incluye tarjetas de interfaz de red (NICs) 120 y 121 conectadas al bus periférico para proporcionar interfaces de red al almacenamiento externo, tal como almacenamiento conectado en red (NAS) y otros sistemas informáticos que se pueden usar para procesamiento distribuido en paralelo.
La FIG. 37 es un diagrama que muestran una red 200 con una pluralidad de sistemas informáticos 202a, y 202b, una pluralidad de teléfonos móviles y asistentes de datos personales 202c, y almacenamiento conectado en red (NAS) 204a, y 204b. En las realizaciones de ejemplo, los sistemas 212a, 212b, y 212c pueden gestionar el almacenamiento de datos y optimizar el acceso a datos para datos almacenados en el almacenamiento conectado en red (NAS) 214a y 214b. Se puede usar un modelo matemático para los datos y evaluar usando procesamiento distribuido en paralelo a través de sistemas informáticos 212a, y 212b, y teléfono móvil y sistemas de asistente de datos personales 212c.
Los sistemas informáticos 212a, y 212b, y el teléfono móvil y sistemas de asistente de datos personales 212c también pueden proporcionar procesamiento en paralelo para la reestructuración adaptativa de datos de los datos almacenados en el almacenamiento conectado en red (NAS) 214a y 214b. La FIG. 37 ilustra un ejemplo solo, y se puede usar una amplia variedad de otras arquitecturas y sistemas informáticos junto con las diversas realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, se puede usar un servidor blade para proporcionar procesamiento en paralelo. Se pueden conectar blades de procesador a través de una placa de bus común para proporcionar procesamiento en paralelo. El almacenamiento también se puede conectar a la placa de bus común o como almacenamiento conectado en red (NAS) a través de una interfaz de red separada.
En algunas realizaciones de ejemplo, los procesadores pueden mantener espacios de memoria separados y transmitir datos a través de interfaces de red, placa de bus común u otros conectores para procesamiento en paralelo por otros procesadores. En otras realizaciones, algunos o todos los procesadores pueden usar un espacio de memoria de dirección virtual compartida.
La FIG. 38 es un diagrama de bloques de un sistema informático de multiprocesador 300 que un espacio de memoria de dirección virtual compartida según una realización de ejemplo. El sistema incluye una pluralidad de procesadores 302a-f que pueden acceder a un subsistema de memoria compartida 304. El sistema incorpora una pluralidad de procesadores de algoritmo de memoria (MAPs) de hardware programable 306a-f en el subsistema de memoria 304.
Cada MAP 306a-f puede comprender una memoria 308a-f y una o más matrices de puerta programable por campo (FPGAs) 310a-f. El MAP proporciona una unidad funcional configurable y se pueden proporcionar algoritmos particulares o porciones de algoritmos a las FPGAs 310a-f para procesar en estrecha coordinación con un procesador respectivo. Por ejemplo, los MAPs se pueden usar para evaluar expresiones algebraicas referentes al modelo de datos y para realizar la reestructuración adaptativa de datos en las realizaciones de ejemplo. En este ejemplo, cada MAP está globalmente accesible por todos los procesadores para estos fines. En una configuración, cada MAP puede usar acceso directo a memoria (DMA) para acceder a una memoria asociada 308a-f, que permite que ejecute tareas independientemente de, y asíncronamente de, el microprocesador respectivo 302a-f. En esta configuración, una MAP puede alimentar resultados directamente a otro MAP para segmentación y ejecución paralela de algoritmos.
Las arquitecturas y sistemas informáticos anteriores son ejemplos solo, y se puede usar una amplia variedad de otras arquitecturas y sistemas informáticos, de teléfonos móviles y de asistentes de datos personales a propósito de las realizaciones de ejemplo, que incluyen sistemas que usan cualquier combinación de procesadores generales, coprocesadores, FPGAs y otros dispositivos lógicos programables, sistema en chips (SOCs), circuitos integrados para aplicaciones específicas (ASICs), y otros elementos de procesamiento y lógicos. En algunas realizaciones, todo o parte del sistema informático se puede implementar en software o hardware. Se puede usar cualquier variedad de medios de almacenamiento de datos a propósito de las realizaciones de ejemplo, que incluyen memoria de acceso aleatorio, discos duros, memoria flash, dispositivos de cinta, matrices de discos, almacenamiento conectado en red (NAS) y otros dispositivos y sistemas locales o almacenamiento distribuido de datos.
En las realizaciones de ejemplo, el subsistema informático de la presente divulgación se puede implementar usando módulos de software que se ejecutan en cualquiera de las arquitecturas y sistemas informáticos anteriores u otros. En otras realizaciones, las funciones del sistema se pueden implementar parcialmente o completamente en firmware, dispositivos lógicos programables tales como matrices de puerta programable por campo (FPGAs) como se referencia en la FIG. 38, sistema en chips (SOCs), circuitos integrados para aplicaciones específicas (ASICs), u otros elementos de procesamiento y lógicos. Por ejemplo, se puede implementar el conjunto procesador y optimizador con aceleración de hardware a través del uso de una tarjeta de acelerador de hardware, tal como la tarjeta de aceleración 122 ilustrada en la FIG 36.
Kits:
También se desvelan en el presente documento kits para realizar los ensayos de marcado estocástico de células individuales o de creación de códigos de barras moleculares. En algunas realizaciones, el kit puede comprender uno o más sustratos de micropocillos (bien como un sustrato independiente (o chip) que comprende uno o más patrones de micropocillos, o empaquetado dentro de una o más celdas de flujo o cartuchos) y una o más suspensiones de perlas, en donde las perlas individuales dentro de una suspensión comprenden una pluralidad de marcadores estocásticos fijados. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además un elemento fijo mecánico para montar un sustrato de micropocillos independiente para crear pocillos de reacción que facilitan el pipeteado de muestras y reactivos en los micropocillos. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además reactivos, por ejemplo, tampones de lisis, tampones de aclarado, o tampones de hibridación, para realizar el ensayo de marcado estocástico. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además reactivos (por ejemplo, enzimas, cebadores, o tampones) para realizar reacciones de extensión de ácidos nucleicos, por ejemplo, reacciones de transcripción inversa. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además reactivos (por ejemplo, enzimas, cebadores universales, cebadores de secuenciación, cebadores específicos de diana, o tampones) para realizar reacciones de amplificación para preparar bibliotecas de secuenciación. En algunas realizaciones, el kit puede comprender uno o más moldes, por ejemplo, moldes que comprenden un patrón de micropilares, para colar patrones de micropocillos, y una o más suspensiones de perlas, en donde las perlas individuales dentro de una suspensión comprenden una pluralidad de marcadores estocásticos fijados. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además un material para uso en la colada de micropocillos, por ejemplo, agarosa, un hidrogel, PDMS, y similares.
En algunas realizaciones de los kits desvelados, el kit puede comprender uno o más sustratos de micropocillos que se cargan previamente con perlas que comprenden una pluralidad de marcadores estocásticos fijados, en donde existe como máximo una perla por micropocillo. En algunas realizaciones, la pluralidad de marcadores estocásticos se puede unir directamente a una superficie del micropocillo, en vez de a una perla. En cualquiera de estas realizaciones, el uno o más sustratos de micropocillos se pueden proporcionar en forma de sustratos independiente (o chips), o se pueden empaquetar en celdas de flujo o cartuchos.
En algunas realizaciones de los kits desvelados, el kit puede comprender uno o más cartuchos que incorporan uno o más sustratos de micropocillos. En algunas realizaciones, el uno o más cartuchos pueden comprender además una o más suspensiones de perlas cargadas previamente, en donde las perlas individuales dentro de una suspensión comprenden una pluralidad de marcadores estocásticos fijados. En algunas realizaciones, las perlas puede estar previamente distribuidas en el uno o más sustratos de micropocillos del cartucho. En algunas realizaciones, las perlas, en forma de suspensiones, se pueden cargar previamente y almacenar dentro de pocillos de reactivo del cartucho. En algunas realizaciones, el uno o más cartuchos pueden comprender además otros reactivos de ensayo que se cargan previamente y se almacenan dentro de los recipientes de reactivo de los cartuchos.
Aplicaciones:
Los métodos, dispositivos y sistemas desvelados en el presente documento se pueden usar para una variedad de aplicaciones en investigación básica, investigación biomédica, ensayos medioambientales y diagnósticos clínicos. Los ejemplos de posibles aplicaciones para las tecnologías desveladas incluyen, pero no se limitan a, genotipificación, pauta de expresión génica, detección e identificación de células raras, diagnóstico de una enfermedad o afección, determinación del pronóstico para una enfermedad o afección, determinación de un ciclo de tratamiento para una enfermedad (por ejemplo, determinar si un paciente puede responder a una terapia) o afección, y monitorización de la respuesta al tratamiento para una enfermedad o afección, y entendimiento de procesos de desarrollo biológico.
Células tumorales circulantes (CTCs): En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas de la divulgación se pueden usar para caracterizar células tumorales circulantes (CTCs). Los métodos, dispositivos y sistemas de la divulgación se pueden usar para detectar el perfil de expresión en células tumorales circulantes de una muestra de sangre enriquecida. El método puede comprender obtener una muestra biológica que contiene una población mixta de células de un individuo que se sospecha que tiene células raras diana, poner en contacto dicha muestra (que se pueden enriquecer) con los dispositivos y sistemas de la divulgación de forma que una célula individual esté en un pocillo individual. La muestra se puede someter a métodos de retirada de glóbulos rojos y/o células muertas de la sangre. La muestra se puede poner en contacto con perlas de la divulgación de forma que una perla individual esté en un pocillo individual con una célula individual. La célula se puede lisar. La perla puede comprender un marcador estocástico que puede unirse a de genes localización específica en la célula y/o ARNms de la célula. Las moléculas de las CTC asociadas a soporte sólido se pueden someter a los métodos de biología molecular de la divulgación, que incluyen transcripción inversa, amplificación y secuenciación. Las células se pueden agrupar basándose en el perfil de expresión génica de las células, identificando así células raras (por ejemplo, CTCs) y subpoblaciones de células raras (por ejemplo, CTCs) basándose en sus genotipos.
Los métodos se pueden usar para identificar y caracterizar subpoblaciones (subgrupos) de células tumorales circulantes (CTCs) en una población de CTCs o una muestra, cuantificar subgrupos de CTCs en la población de CTCs 0 la muestra, diagnosticar y monitorizar cáncer, tratamiento y pronóstico, en particular para tumores sólidos, y usar los subgrupos de CTC identificadas como biomarcadores para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento terapéutico.
Emparejamiento de cadenas de receptores de linfocitos T: Los receptores de linfocitos T (TCRs) son moléculas de reconocimiento presentes sobre la superficie de linfocitos T. Los receptores de linfocitos T encontrados sobre la superficie de linfocitos T pueden estar comprendidos de dos subunidades de glucoproteína que se denominan las cadenas a y p. Ambas cadenas pueden comprender un peso molecular de aproximadamente 40 kDa y poseer un dominio variable y constante. Los genes que codifican las cadenas a y p se pueden organizar en bibliotecas de regiones V, D y J de las que los genes se forman por transposición genética. Los TCRs pueden reconocer antígeno que se presenta por una célula presentadora de antígenos como una parte de un complejo con una auto-molécula específica codificada por un gen de histocompatibilidad. Los genes de histocompatibilidad más potentes se conocen como el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). El complejo que es reconocido por receptores de linfocitos T, por tanto, consiste en y MHC/ligando de péptido.
En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas de la divulgación se pueden usar para la secuenciación y emparejamiento de receptores de linfocitos T. Los métodos, dispositivos y sistemas de la divulgación se pueden usar para la secuenciación de receptor de linfocitos T alfa y cadenas beta, emparejamiento de cadenas alfa y beta, y/o determinación de la copia funcional de las cadenas alfa de receptores de linfocitos T. Una célula individual puede estar contenida en un pocillo individual con una perla individual. La célula se puede lisar. La perla puede comprender un marcador estocástico que puede unirse a una localización específica dentro de una cadena alfa y/o beta de un TCR. Las moléculas alfa y beta de TCR asociadas al soporte sólido se pueden someter a los métodos de biología molecular de la divulgación, que incluyen transcripción inversa, amplificación y secuenciación. Se puede considerar que las cadenas alfa y beta de t Cr que comprenden el mismo marcador celular son de la misma célula individual, emparejándose así las cadenas alfa y beta del TCR.
Emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras en repertorios de anticuerpos: Los métodos, dispositivos y sistemas de la divulgación se pueden usar para el emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras en anticuerpos. Los métodos de la presente divulgación permiten el repertorio de inmunorreceptores y anticuerpos en un organismo o individual o población de células a determinar Los métodos de la presente divulgación pueden ayudar en la determinación de pares de cadenas de polipéptidos que constituyen inmunorreceptores. Los linfocitos B y linfocitos T expresan cada uno inmunorreceptores; los linfocitos B expresan inmunoglobulinas, y los linfocitos T expresan receptores de linfocitos T (TCRs). Ambos tipos de inmunorreceptores pueden comprender dos cadenas de polipéptidos. Las inmunoglobulinas pueden comprender cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL). Pueden tener dos tipos de TCRs: uno que consiste en una cadena a y una p, y uno que consiste en una cadena y y una 8. Los polipéptidos en un inmunorreceptor pueden comprender una región constante y una región variable. Las regiones variables pueden resultar de la recombinación y la reordenación conjunta de extremos de fragmentos de genes en el cromosoma de un linfocito B o T. En los linfocitos B, la diversificación adicional de regiones variables puede ocurrir por hipermutación somática. El sistema inmunitario tiene un gran repertorio de receptores, y cualquier par de receptores dado expresado por un linfocito se puede codificar por un par de transcritos únicos separados. Se puede usar el conocimiento de las secuencias de pares de cadenas de inmunorreceptores expresados en una célula individual para determinar el repertorio inmunitario de una célula individual dada o una población de células.
En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas de la divulgación se pueden usar para la secuenciación y emparejamiento de anticuerpos. Los métodos, dispositivos y sistemas de la divulgación se pueden usar para la secuenciación de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos (por ejemplo, en linfocitos B), y/o el emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras. Una célula individual estar contenida en un pocillo individual con una perla individual. La célula se puede lisar. La perla puede comprender un marcador estocástico que puede unirse a una localización específica dentro de una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo (por ejemplo, en un linfocito B). Las moléculas de cadena pesada y ligera asociadas a soporte sólido se pueden someter a los métodos de biología molecular de la divulgación, que incluyen transcripción inversa, amplificación y secuenciación. Se puede considerar que las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que comprenden el mismo marcador celular son de la misma célula individual, emparejándose así las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo.
Inmuno-oncología: Se pueden usar tratamientos inmunomediados basados en antígenos, anticuerpos, péptidos, ADN y similares para tratar cáncer. Los tratamientos pueden estimular el sistema inmunitario propio de un paciente en la lucha contra el cáncer (por ejemplo, aumentando la respuesta inmunitaria, y/o retirando los frenos de la respuesta inmunitaria). Las inmunoterapias a modo de ejemplo pueden incluir un anticuerpo (Ab), ipilimumab (YERVOY®), que se une a e inhibe el antígeno-4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) para el tratamiento de pacientes con melanoma avanzado y el desarrollo de Abs que bloquean la vía inhibidora de PD-1. Muerte programada-1 (PD-1) es un receptor del punto de regulación inmunitario clave expresado por linfocitos T y B activados y media en la inmunosupresión. PD-1 es un miembro de la familia de receptores de CD28, que incluye CD28, Ct La -4, ICOS, PD-1 y bTlA. Se han identificado dos ligandos de glucoproteína de la superficie celular para PD-1, el ligando-1 de muerte programada (PD-L1) y el ligando-2 de muerte programada (PD-L2), que se expresan en células presentadoras de antígeno, así como muchos cánceres humanos, y se ha mostrado que regulan por disminución la activación de linfocitos T y la secreción de citocinas tras la unión a PD-1. A diferencia de CTLA-4, PD-1 funciona principalmente en tejidos periféricos donde los linfocitos T activados pueden encontrar los ligandos de PD-L1 (B7-H1) y PD- L2 (B7-DC) inmunosupresores expresados por tumor y/o células del estroma. La inhibición de la interacción PD-1/PD-L1 puede mediar en la potente actividad antitumoral en muestras clínicas.
No todos los pacientes con cáncer responden a las inmunoterapias. No ha habido métodos fiables para establecer si los pacientes responderán al tratamiento. Los dispositivos, métodos y sistemas de la divulgación se pueden usar para predecir una respuesta y/o beneficio de la inmunoterapia en un paciente que padece cáncer que implica, por ejemplo, determinar en una muestra tumoral la expresión de al menos un gen marcador indicativo de una respuesta a inmunoterapia para el tumor, y dependiendo de la expresión génica, predecir la respuesta y/o el beneficio. En algunos casos, los dispositivos, métodos y sistemas de la divulgación se pueden usar para predecir un efecto de una inmunoterapia en un paciente con cáncer, que comprende, por ejemplo, determinar el nivel de al menos un marcador de cáncer en una muestra de un paciente con cáncer, en donde un nivel más alto (o elevado) del marcador en comparación con la mediana de una población dada de pacientes con cáncer es indicativo de un efecto beneficioso de una inmunoterapia para el paciente.
En algunas realizaciones de los métodos, dispositivos y sistemas desvelados, se obtiene una primera muestra de células de una persona que no tiene una enfermedad o afección, y se obtiene una segunda muestra de células de una persona que tiene la enfermedad o afección. En algunas realizaciones, las personas son diferentes. En algunas realizaciones, las personas son las mismas, pero las muestras de células se toman en momentos de tiempo diferentes. En algunas realizaciones, las personas son pacientes, y las muestras de células son muestras de pacientes. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un cáncer, una infección bacteriana, una infección viral, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad neurodegenerativa, una enfermedad fúngica, una enfermedad parasítica, un trastorno genético, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, las células son células cancerosas escindidas de un tejido canceroso, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer cerebral, melanoma y cánceres de piel distintos de melanoma, y similares. En algunos casos, las células derivan de un cáncer, pero se recogen de un líquido corporal (por ejemplo, células tumorales circulantes). Los ejemplos no limitantes de cánceres pueden incluir, adenoma, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, carcinoma de células pequeñas, carcinoma indiferenciado de células grandes, condrosarcoma, y fibrosarcoma.
En algunas realizaciones, las células son células que han sido infectadas con virus y contienen oligonucleótidos virales. En algunas realizaciones, la infección viral se puede provocar por un virus seleccionado del grupo que consiste en virus de ADN bicatenario (por ejemplo, adenovirus, virus del herpes, poxvirus), virus de ADN monocatenario (cadena o "sentido") (por ejemplo, parvovirus), virus de ARN bicatenario (por ejemplo, reovirus), virus de ARN monocatenario (cadena o sentido) (por ejemplo, picornavirus, togavirus), virus de ARN monocatenario (cadena - o antisentido) (por ejemplo, orthomyxovirus, rabdovirus), virus de ARN monocatenario-RT (virus de ARN (cadena o sentido) con un producto intermedio de ADN en su ciclo vital) (por ejemplo, retrovirus), y virus de ADN bicatenario-RT (por ejemplo, hepadnavirus).
En algunas realizaciones, las células son bacterias. Éstas pueden incluir o bacterias Gram-positivas o Gram-negativas. Los ejemplos de bacterias que se puede analizar usando los métodos, dispositivos y sistemas desvelados incluyen, pero no se limitan a, Actinomedurae, Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Nocardia, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epiderm, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae y similares. Las bacterias Gram-negativas incluyen, pero no se limitan a, Afipia felis, Bacteriodes, Bartonella bacilliformis, Bortadella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter, Escherichia coli, Francisella tularensis, Gardnerella vaginalis, Haemophilius aegyptius, Haemophilius ducreyi, Haemophilius influenziae, Heliobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Neisseria meningitidia, Porphyromonas gingivalis, Providencia sturti, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteridis, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella boydii, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis y similares. Otras bacterias pueden incluir Myobacterium avium, Myobacterium leprae, Myobacterium tuberculosis, Bartonella henseiae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, Rickettsia akari, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia tsutsugamushi, Rickettsia typhi, Ureaplasma urealyticum, Diplococcus pneumoniae, Ehrlichia chafensis, Enterococcus faecium, Meningococci y similares.
En algunas realizaciones, las células son hongos. Los ejemplos no limitantes de hongos que se puede analizar usando los métodos, dispositivos y sistemas desvelados incluyen, pero no se limitan a, Aspergilli, Candidae, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococci, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, las células son protozoos y otros parásitos. Los ejemplos de parásitos a analizar usando los métodos, dispositivos y sistemas de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, Balantidium coli, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayatanensis, Encephalitozoa, Entamoeba histolytica, Enterocytozoon bieneusi, Giardia lamblia, Leishmaniae, Plasmodii, Toxoplasma gondii, Trypanosomae, amebas trapezoidales, gusanos (por ejemplo, helmintos), particularmente gusanos parasíticos que incluyen, pero no se limitan a, namatodos (ascaris, por ejemplo, tricocéfalos, anquilostomas, lombrices intestinales, ascárides, filáridos y similares), céstodos (por ejemplo, tenias).
Ejem plo 1 - Captura de células, m arcado y secuenciación
Fabricación de matrices de micropocillos: Se fabricaron matrices de micropocillos usando fotolitografía convencional. Se estampó una matriz (~35 mm x 15 mm) que contenía -150.000 micropilares con SU-8 sobre una oblea de silicio. Se vertió PDMS sobre la oblea para crear matrices de micropocillos. Se hicieron réplicas de la oblea con adhesivo óptico NOA63 usando la matriz de micropocillos de PDMS como molde. Se colaron matrices de micropocillos de agarosa (5 %, tipo IX-A, Sigma) de la réplica de NOA63 antes de cada experimento. Para experimentos descritos aquí, se cortó una subsección de la matriz completa y se usó, variando desde -25.000 hasta 100.000 pocillos (Tabla 1). El tamaño de la matriz de micropocillos se puede aumentar simplemente aumentando el área total del patrón de la matriz de micropocillos sobre la máscara de litografía y se fabrica con las mismas etapas anteriores. Por ejemplo, un portaobjetos de microscopio de 3" x 2" puede contener -1,4 millones de pocillos, para capturar -140.000 células individuales.
Tabla 1. Tamaño de la matriz de micropocillos, número de células cargadas y eficiencia de captura de las células sobre la matriz. La eficiencia de captura se define como el número de código de barras de células único retenido después del filtrado de datos en comparación con la cantidad de células cargadas sobre la matriz de micropocillos basándose en el recuento de hemocitómetro. Obsérvese que en el actual diseño de matriz de micropocillos, el área de pocillos total constituyó -23 % del área superficial total. Las células que no sedimentaron en los pocillos se lavaron. Además, criterios de filtrado rigurosos (véase Métodos) tienden a subestimar el número total de células ensayadas, especialmente para muestras con secuenciación relativamente superficial.
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Síntesis de biblioteca de perlas: Se fabricaron perlas usando un enfoque combinatorio de conjuntos fraccionados. Brevemente, se distribuyeron en 96 tubos perlas magnéticas de veinte micrómetros de diámetro funcionalizadas con grupos carboxilo (Spherotech). Usando química de carbodiimida, se acopló a las perlas en cada tubo un oligonucleótido modificado con amina en 5' que lleva una secuencia de cebador de PCR universal, un marcador celular de 8 nucleótidos único y un conector común. Entonces se reunieron las perlas conjugadas de todos los tubos y se fraccionaron en un segundo conjunto de 96 tubos para hibridar con oligonucleótidos de molde que llevan el complemento al conector común, otro marcador celular de 8 nucleótidos y un nuevo conector común. Tras la polimerización enzimática, las perlas se reunieron nuevamente y se fraccionaron en un tercer conjunto de 96 tubos para hibridación con oligonucleótidos que llevan oligo(dA)17 en el extremo 5', seguido por una secuencia de 8 nucleótidos sintetizada al azar que sirve de índice molecular, un tercer marcador celular de 8 nucleótidos, y una secuencia complementaria al segundo conector. Después de la polimerización enzimática, las perlas se reunieron para derivar la biblioteca final. Cada perla resultante se recubre con decenas a centenas de millones de oligonucleótidos oligo-dT del mismo marcador celular clonalmente representado (884,736 o 96 x 96 x 96 posibles códigos de barras), y una diversidad de indexado molecular de 65,536 (48). El tamaño de la biblioteca aumenta exponencialmente aumentando linealmente la diversidad en cada etapa de síntesis.
Preparación de muestras: Se cultivaron células K562 y Ramos en RPMI-1640 con 10% de FBS y 1x antibiótico antimicótico. Se compraron linfocitos B primarios de un donante sano de Sanguine Biosciences. Se aislaron CMSPs de un donante sano de sangre completa fresca en un tubo con heparina sódica adquirido del Stanford Blood Center usando disolución Lymphoprep (StemCell).
Captura de células individuales: Se midió la densidad celular por recuento de hemocitómetro (SI tabla 3) y se ajustó para lograr ~1 célula capturada por 10 o más micropocillos. Se pipeteó la suspensión de células sobre la matriz de micropocillos y se dejó que sedimentara por gravedad. Se confirmó el llenado de células de micropocillos por microscopía. Se retiraron las células que sedimentaron sobre la superficie entre los pocillos (~77 % del área superficial total en el diseño actual) y podrían ser guardadas para un uso futuro. Entonces se cargó la biblioteca de perlas a una densidad de ~5 perlas por pocillo para saturar todos los pocillos. Se lavó el exceso de perlas y se pipeteó tampón de lisis frío (Tris-HCl 0,1 M a pH 7,5, LiCl 0,5 M, 1 % de LísDs , EDTA 10 mM, DTT 5 mM) sobre la superficie de la matriz de micropocillos. Después de 10 minutos de incubación sobre un imán de deslizamiento, se retiró el tampón de lisis que cubría la matriz y se sustituyó por tampón de lisis fresco. Se recuperaron las perlas con ARNms capturado colocando el imán encima de la matriz de micropocillos. Se recogieron las perlas en disolución en un tubo de microcentrifugadora pipeteando, y se lavaron dos veces en el tubo con tampón de lavado A (Tris-HCl 0,1 M, LiCl 0,5 M, EDTA 1 mM) y una vez con tampón de lavado B (Tris-HCl 20 mM a pH 7,5, KCl 50 mM, MgCh3 mM). En la actual implementación sin el uso de automatización, este proceso dura hasta 1,5 horas con dos muestras procesadas en paralelo.
Síntesis de ADNc: Se resuspendieron perlas lavadas en 40 pL de mezcla RT (Life Technologies, 1x tampón de primera cadena, 20 unidades de inhibidor de RNasa superase^n, 200 unidades de SuperScript II o SuperScript III, MgCh adicional 3 mM, dNTP 1 mM, 0,2 pg/mL de BSA) en un tubo de microcentrifugadora girado a 16 rpm en una estufa a 50 °C durante 50 minutos (cuando se usa SuperScript III para el experimento temprano con K562 y células Ramos) o 42 °C durante 90 minutos (cuando se usa Superscript II para todos los otros experimentos). Después de la síntesis de ADNc, se retiró el exceso de oligonucleótidos sobre las perlas mediante tratamiento con 20 unidades de ExoI (NEB) en 40 pL de 1x tampón de ExoI a 37 °C durante 30 minutos, y luego se inactivaron a 80 °C durante 15 minutos.
PCR multiplexy secuenciación: Se recuperaron secuencias de genes de RefSeq. Cada panel de marcadores consiste en dos conjuntos de cebadores específicos de gen diseñados usando Primer3. Se usó MATLAB para seleccionar los cebadores de PCR con complementariedad mínima del extremo 3' dentro de cada conjunto (Tabla 2). El esquema de amplificación se muestra en la FIG. 5. Se realizó PCR sobre las perlas con el kit KAPA Fast Multiplex, usando 50 nM de cada cebador específico de gen en el primer conjunto de cebadores y cebador universal 400 nM en 50 pL (para la mezcla de células K562 y Ramos), 100 pL (para experimentos de CMSP y linfocitos B) o 200 pL (para experimentos de linfocitos T), con el siguiente protocolo de ciclos: 3 min a 95 °C; 15 ciclos de 15 s a 95 °C, 60 s a 60 °C, 90 s a 72 °C; 5 min a 72 °C. El aumento en volumen de PCR fue para mitigar el efecto inhibidor del hierro sobre las perlas magnéticas. Las perlas se recuperaron usando un imán, y los productos de PCR se purificaron con 0,7x Ampure XP (Beckman Coulter). La mitad de los productos purificados se usaron para la siguiente ronda de PCR anidada con el segundo conjunto de cebadores usando el mismo kit de KAPA y el protocolo de ciclado. Después de limpiar con 0,7x Ampure XP, 1/10 del producto fue la entrada en una reacción de PCR final por la cual se añadieron adaptadores Illumina de longitud completa (1x KAPA HiFi Ready Mix, 200 nM de cebador p 5, 200 nM de cebador P7. 95 °C 5 min; 8 ciclos de 98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s; 72 °C 5 min). La secuenciación se realizó en el instrumento Illumina MiSeq con química de 150 x 2 pb a una mediana de la profundidad de 1,6 millones de lecturas por muestra (Tabla 3).
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Tabla 3. Estadística de secuenciación y alineamientos.
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Análisis de datos: Se detectaron el marcador celular, el índice molecular y la identidad de genes en cada lectura secuenciada (FIG. 5). La asignación de genes para la segunda lectura emparejada (lectura 2) se realizó usando el software de alineamiento 'bowtie2' (44) con parámetros por defecto. Los marcadores celulares e índices moleculares en la primera lectura emparejada (lectura 1) se analizaron usando textos de MATLAB a medida. Solo se retuvieron las lecturas que correspondieron perfectamente a los códigos de barras de células combinatorios, pero este requisito se puede relajar más puesto que los códigos de barras de células se diseñaron para permitir la corrección de errores (M. Hamady, et al. (2008), Nat. Methods 5, 235-237). Las lecturas se agruparon primero por marcador celular, luego por identidad de genes e índice molecular. Para calcular el número de moléculas únicas por gen por célula, se agruparon los índices moleculares de lecturas del mismo transcrito de genes de la misma célula. Se consideró distancia de edición superior a 1 nucleótido como agrupación única, y así una molécula de transcrito única. Se construyó una tabla que contiene el perfil de expresión génica digital de cada célula para cada muestra - cada fila en la tabla representa una célula única, cada columna representa un gen, y cada entrada en la tabla representa la cifra de moléculas de transcrito único para ese gen en cualquier célula dada. La tabla se filtró para retirar moléculas únicas que se secuenciaron solo una vez (es decir, redundancia = 1). Para el experimento con mezcla de células K562 y Ramos, se retuvieron células con 30 o más moléculas únicas totales para la agrupación. Para el resto de los experimentos, se retuvieron células con una suma de 10 o más moléculas únicas o con co-expresión de 4 o más genes en el panel para agrupación. Entonces se usó la tabla filtrada para el análisis de agrupamiento. Se realizó el análisis de componentes principales y agrupamiento jerárquico en el recuento de transcritos transformados por logaritmo natural (con pseudorecuento de 1 añadido) con funciones incorporadas en MATLAB.
Medición del número de copias de GAPDH en células individuales Ramos usando métodos alternativos: En el primer método, se extrajo ARN total de células Ramos por el kit RNeasy Mini (Qiagen) y se cuantificó por Nanodrop. Se prepararon diluciones sucesivas hasta 7 pg y se cargaron en 12.765 Digital Array (Fluidigm) con 1x mezcla de qPCR EXPRESS SuperScript (Life Technologies), 1x mezcla de enzimas EXPRESS SuperScript (Life Technologies), 1x ensayo de FAM de GAPDH FAM (ABI), 1x reactivo de carga (Fluidigm) y 1x colorante ROX. La matriz se analizó en BioMark (Fluidigm) con el siguiente protocolo: 50 °C durante 15 min, 95 °C durante 2 min, y 35 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 60 min. Se midió que GAPDH era 34 copias por pg de ARN total. En el segundo método, se diluyó una suspensión de células Ramos en PBS a aproximadamente 1 célula por 10 microlitros. Se pipeteó un microlitro de suspensión en múltiples tubos de 0,2 mL. La presencia de una célula individual en un tubo se confirmó por microscopía. Se determinaron los recuentos de GAPDH en las células individuales usando el método brevemente expuesto en Fu, et al. (2014), Analytical Chemistry 86, 2867-2870. Se obtuvieron mediciones de 8 células. Se obtuvo un promedio de 214 /- 36 (E.E.) copias (intervalo 113 a 433 copias) por célula. Se compararon los recuentos de GAPDH por enriquecimiento en células Ramos (18 células individuales) con estos dos métodos para evaluar la eficiencia de detección de ARN.
Resultados: Se expone brevemente en las FIGS. 1 y 2 el procedimiento de marcado estocástico de células individuales y de creación de códigos de barras moleculares. Primero, se carga una suspensión de células sobre una superficie microfabricada con hasta 100.000 micropocillos. Cada micropocillo de 30 micrómetros de diámetro contiene un volumen de ~20 picolitros. El número de células en la suspensión se ajusta de manera que solo aproximadamente uno de los diez pocillos reciba una célula. Las células sedimentan simplemente en los pocillos por gravedad.
A continuación, la biblioteca de perlas se carga sobre la matriz de micropocillos hasta saturación, de manera que se llenan la mayoría de los pocillos. Se han optimizado las dimensiones de las perlas y pocillos para prevenir la doble ocupación de perlas. Cada perla de 20 micrómetros ha sido funcionalizada con decenas a centenas de millones de cebadores de oligonucleótidos de la estructura brevemente expuesta en la FIG. 1. Los oligonucleótidos consisten en un sitio de cebado por PCR universal, seguido por un marcador celular combinatorio, un índice molecular y una secuencia de captura de ARNm de oligo(dT). Todos los cebadores en cada perla comparten el mismo marcador celular, pero incorporan una diversidad de índices moleculares. Se ideó un método de síntesis combinatorio de conjuntos fraccionados para generar la biblioteca de perlas que contiene una diversidad de marcado de células próxima a un millón. Puesto que solo se usa ~1 % de la diversidad disponible total de marcadores celulares, es baja la probabilidad de tener dos células individuales marcadas con la misma marca (del orden de 10-4). Similarmente, la diversidad de marcadores moleculares sobre una perla individual es del orden de 105, de manera que es baja la probabilidad de dos moléculas de transcrito del mismo gen de la misma célula marcada con el mismo índice molecular. Una vez se co-localizan células individuales y perlas en los micropocillos, se aplica un tampón de lisis sobre la superficie y se deja que difunda dentro. La alta concentración local de ARNms liberados (decenas de nanomolar) conduce eficazmente su hibridación sobre las perlas.
Tras la captura de ARNm, todas las perlas se recuperan magnéticamente de la matriz de micropocillos. A partir de entonces, todas las reacciones se llevan a cabo en un único tubo. Después de la transcripción inversa, las moléculas de ADNc sintetizadas en cada perla se codifican con códigos de barras celulares y moleculares y sirven de moldes de amplificación (FIGS. 1 y 5A-D).
La secuenciación de productos de amplificación revela el marcador celular, el índice molecular y la identidad de genes (FIGS. 1 y 5A-D). El análisis computacionales agrupa las lecturas basadas en el marcador celular, y colapsa las lecturas con el mismo índice molecular y secuencia de genes en una única entrada para corregir para sesgo de amplificación, permitiendo la determinación de números absolutos de transcrito para cada gen en cada célula.
La FIG. 3A representa células individuales atrapadas en micropocillos junto con perlas que comprenden bibliotecas de marcadores estocásticos anclados (una célula y una perla por pocillo). La FIG. 3B representa un ejemplo de análisis de componentes principales de datos de códigos de barras estocásticos para células mononucleares de sangre periférica humana. La FIG. 3C representa un ejemplo de análisis de componentes principales de datos de códigos de barras estocásticos para una población de células raras.
E jem plo 2 - Identificación de tipos de células en m ezclas de células
Métodos: Los métodos usados para este ejemplo fueron los mismos que se describen para el Ejemplo 1.
Resultados: Para demostrar la capacidad de marcado estocástico de células individuales o la creación de códigos de barras moleculares para identificar células individuales entre una población de dos tipos de células, se cargó una mezcla ~1:1 de células K562 (leucemia mielógena) y Ramos (linfoma de Burkitt) sobre una matriz parcial de -25.000 micropocillos. Se seleccionó un panel de 12 genes y se amplificó de las perlas de ADNc y se secuenció. El panel consistió en 5 genes específicos para células K562, 6 genes específicos para células Ramos, y el gen de mantenimiento común GAPDH (Tabla 2A). La mayoría de las lecturas de secuenciación (-78 %) se asociaron a 765 marcadores celulares únicos.
Se agrupó el perfil de expresión génica de cada célula usando análisis de componentes principales (PCA) (FIG. 4A). El primer componente principal (PC) separó las células en dos agrupaciones principales basándose en el tipo de célula. Los genes que contribuyen al lado positivo del primer PC fueron específicos de Ramos, mientras que los genes que contribuyeron al lado negativo del mismo PC fueron específicos de K562. El segundo PC resaltó el alto grado de variabilidad en la expresión de la hemoglobina fetal (HBG1) dentro de las células K562, que se ha observado previamente (G. Fu, et al. (2014), Analytical Chemistry 86, 2867-2870, R. D. Smith, et al. (2000), Nucleic Acids Res.
28, 4998-5004).
A continuación, los presentes inventores enriquecieron un pequeño número de células Ramos en linfocitos B primarios de un individuo sano. Se analizó un panel de 111 genes (Tabla 2B) que se sabía que estaba implicado en la función de linfocitos B (D. A. Kaminski, et al. (2012), Frontiers in Immunology 3:302; Y. Shen et al. (2004), BMC Immunol. 5:20; J. A. Weinstein et al. (2013), PloS One 8:e67624) a través de 1.198 células. Se encontró que dieciocho células (~1,5 % de la población) tenían un patrón de expresión génica distinto (FIG. 4B). Se sabe que los genes expresados preferencialmente por este grupo se asociaron a linfoma de Burkitt, e incluyen MYC e IgM, y marcadores (CD10, CD20, CD22, BCL6) asociados a linfocitos B foliculares de los que se origina el linfoma de Burkitt (22) (FIG. 4C). Además, este grupo de células contuvo mayores niveles de CCND3 y GAPDH, así como un contenido de ARNm mayor global (FIG. 4B). Este hallazgo está de acuerdo con el hecho de que las células de linfoma son físicamente más grandes que los linfocitos B primarios en individuos normales, y que están proliferando rápidamente y son transcripcionalmente más activas.
Se usaron copias detectadas de GAPDH para estimar la eficiencia de captura de ARN del ensayo de marcado estocástico de células individuales o de creación de códigos de barras moleculares. Se midió que GAPDH en 10 pg de ARN total de Ramos era ~343 copias usando RT-PCR digital. Además, los presentes inventores probaron células Ramos individuales usando un técnica sensible de indexado molecular (G. Fu, et al. (2014) y se determinó un promedio de 214 /- 36 (E.E.) de transcritos de GAPDH por célula, comparable a las 152 /- 10 (E.E.) copias obtenidas por marcado estocástico de células individuales o creación de códigos de barras moleculares.
Ejem plo 3 - Fabricación de m atrices de m icropocillos que tienen crestas abovedadas
En algunas realizaciones de los métodos y sistemas desvelados, se puede desear fabricar matrices de micropocillos que tienen crestas abovedadas (u otras características) entre los pocillos para minimizar el número de células o perlas que sedimentan entre los pocillos. La FIG. 7A muestra una micrografía de una matriz de micropocillos que tiene superficies abovedadas o crestas entre los pocillos. La FIG. 7B muestra una vista lateral de la matriz de micropilares usada para moldear los micropocillos, en la que la superficie superior de cada pilar se redondeó usando un proceso de reflujo (la flecha indica el borde curvo de un micropilar). Las matrices de micropilares se fabricaron usando técnicas de litografía óptica y un fotoprotector positivo (MicroChemicals AZ® 40 XT). Tras el desarrollo del protector, la matriz de micropilares se sometió a calor (110 °C a 130 °C) durante intervalos de tiempo que variaban desde 30 segundos hasta 4 minutos. En general, mayor calor y/o tiempos de exposición más largos produjeron más curvatura. Se calentó la matriz de micropilares mostrada en la FIG. 7b a 130 °C durante 30 segundos. Las matrices de micropilares resultantes se usaron para colar estructuras intermedias de polidimetilsiloxano (PDMS), que entonces se usaron para micromoldear las matrices de micropocillos en agarosa, adhesivo óptico Norland, u otros polímeros. La matriz de micropocillos mostrada en la FIG. 7a tiene pocillos de aproximadamente 30 pm de diámetro y 30 a 40 pm de profundidad. Los micropilares usados para colar los micropocillos tuvieron aproximadamente 45 pm de diámetro antes de someterse al proceso de reflujo. Como se puede apreciar en la micrografía de la FIG. 7A, hubo relativamente pocas células o perlas que sedimentaron sobre la superficie del sustrato entre los pocillos. Las matrices de micropocillos que tienen una cresta abovedada entre los pocillos presentaron, en general, significativamente menos células o perlas que sedimentaron entre los pocillos que las matrices de micropocillos que tenían superficies planas entre los pocillos.
Las FIGS. 8A-B muestran micrografías de matrices de micropocillos moldeadas con un patrón de micropilares antes y después de someter la matriz de micropilares a un proceso de reflujo. La FIG. 8A muestra una matriz de micropocillos que tiene superficies de sustrato planas entre los pocillos, como se fabrican usando un patrón de micropilares antes de someterlo a un proceso de reflujo. Se cargaron perlas (22 pm de diámetro) sobre la matriz y se permitió que sedimentaran sin más agitación del fluido. Como se puede apreciar en la micrografía, sedimentó un número significativo de perlas sobre las superficies de sustrato planas entre los pocillos. La FIG. 8B muestra una matriz de micropocillos que tiene crestas abovedadas entre los pocillos, como se fabricaron con un patrón de micropilares que se habían sometido a un proceso de reflujo que comprende calentar a 110 °C durante 1 minuto. Nuevamente, se cargaron perlas de 22 pm de diámetro sobre la matriz y se permitió que sedimentaran sin agitación adicional del fluido. Como se puede apreciar en la micrografía, esencialmente no sedimentaron perlas sobre las superficies de sustrato entre los pocillos.
Ejem plo 4 - D iseño de l s istem a de obtención de im ágenes
En algunas realizaciones, el instrumento es un microscopio de campo brillante que usa trans-iluminación. El sistema de iluminación y el sistema de obtención de imágenes son coaxiales entre sí y se localizaron en lados opuestos de la muestra. El instrumento se usa para contar células y perlas de manera que se pueda determinar el número de células (normalmente 0, 1, o 2) y perlas (normalmente 0 o 1) en cada pocillo. No se requieren imágenes de células individuales de alta resolución.
Una realización del sistema de iluminación se muestra en la FIG. 40. La fuente de luz (LED Engin LZ420MA00) es un fuente de 4 colores que consiste en una matriz 2 x 2 de LEDs de un solo color (azul, verde, amarillo, rojo) montados en estrecha proximidad entre sí sobre un pequeño circuito impreso. Los LEDs se pueden controlar individualmente. En muchas realizaciones del instrumento, solo se usa un LED cada vez. En algunas realizaciones, se pueden usar simultáneamente más de un LED. La lente 1 (Thorlabs ACL2520-A) es una lente asférica con una longitud focal de 20 mm. La lente 2 (Edmund Optics 66017) es una lente asférica con una longitud focal de 40 mm. Las lentes 3 y 4 (Edmund Optics 66018) son lentes asféricas con longitudes focales de 50 mm. La lente 5 (Edmund Optics 47350) es una lente esférica con una longitud focal de 100 mm. El limitador de apertura y el limitador de campo (Thorlabs SM1D12C) son diafragmas de iris con diámetros máximos de iris de 12 mm. El difusor (Thorlabs ED1-C20) produce dispersión uniforme radialmente simétrica a ángulos desde 0 hasta 10 grados y muy poca dispersión a ángulos mayores.
La luz emitida por la fuente de luz es colimada por la lente 1 y se enfoca sobre el limitador de apertura por la lente 2.
Debido a que ninguno de los LEDs está centrado sobre el eje óptico, se necesita un difusor para garantizar que la luz emitida llene uniformemente el limitador de apertura. En algunas realizaciones, en las que un LED de 1 color adecuadamente grande está centrado sobre el eje óptico, el difusor puede no ser necesario. El limitador de campo se localiza entre la lente 2 y el limitador de apertura. Las lentes 3 y 4 captan la imagen del limitador de campo sobre el plano de la muestra. Cada punto en el plano de la muestra se ilumina por un haz de rayos que tienen una apertura numérica fijada por el limitador de apertura. En ausencia de la lente 5, el iluminador es telecéntrico, que significa que en cada punto en el campo el rayo principal es perpendicular al plano de la muestra. Para cada punto en el campo, el rayo principal es el rayo que pasa a través del centro del limitador de apertura. Es apropiado un iluminador telecéntrico si la lente de obtención de imágenes es telecéntrica. En algunas realizaciones del instrumento, la lente de obtención de imágenes no es telecéntrica. El fin de la lente 5 es flexionar los haces de rayos de manera que en cada punto en el campo el rayo principal se dirija al centro del limitador de apertura de la lente de obtención de imágenes. Excepto por la adición del difusor y la lente 5, el iluminador es similar a los iluminadores de Kohler que se han usado para microscopía desde 1893.
Son posibles muchas variaciones del diseño de iluminador. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las lentes 1 y 2 se pueden sustituir por una única lenta. En algunas realizaciones, las lentes 3, 4 , y 5 se pueden sustituir por una única lenta. Se pueden usar lentes acromáticas que contienen dos o más elementos en lugar de lentes de un elemento que no son acromáticas. En algunas realizaciones, los diafragmas de iris se pueden sustituir por aberturas de diámetro fijo. En algunas realizaciones, el limitador de campo circular se puede sustituir por un limitador de campo cuadrado o rectangular (por ejemplo, para corresponder la forma del sensor usado en el sistema de obtención de imágenes) o puede ser completamente omitido. En algunas realizaciones, se pueden usar iluminación de Abbe en lugar de iluminación de Kohler.
Una realización del sistema de obtención de imágenes incluye una lente de obtención de imágenes (Edmund Optics 45760) que es una lente de relé de 10 elementos simétrica específicamente diseñada para su uso en un aumento de 1, y produce una imagen invertida. Simétrica en este caso significa que la lente contiene un plano de simetría perpendicular al eje óptico. Se conoce bien (véase, por ejemplo, Warren Smith, Modern Optical Engineering, 3a edición, p. 401) que cuando se usa una lente simétrica a un aumento de 1, el coma, la distorsión y el color lateral son cero. La apertura numérica de la lente de obtención de imágenes es 0,12 en el espacio del objeto y 0,12 en el espacio de la imagen. El sensor, en esta realización del diseño del sistema de obtención de imágenes, es un sensor CMOS monocromo de 10 megapíxeles (Aptina MT9J003) que tiene 3856 x 2764 píxeles. El tamaño de píxel es 1,67 micrómetros. Debido a la lente de obtención de imágenes se usa a un aumento de 1, el tamaño de píxel eficaz en el plano de la muestra es 1,67 micrómetros. El sensor está contenido en una cámara (IDS Imaging UI-1490LE-M-GL o Basler acA3800-14um) que tiene salida digital de 8 o 12 bits y una interfaz USB 2.0 o USB 3.0.
Son posibles muchas variaciones del sistema de obtención de imágenes. Por ejemplo, en algunas realizaciones el aumento puede ser superior a 1 o inferior a 1. En alguna realización, se pueden usar dos lentes separadas (por ejemplo, un objetivo de microscopio y una lente del tubo del microscopio) en lugar de una única lente de relé multielemento. En algunas realizaciones, el sensor puede tener más o menos de 10 millones de píxeles. En algunas realizaciones, el tamaño de los píxeles del sensor puede ser más o menos 1,67 micrómetros. El sensor usado puede ser una matriz lineal en lugar de una matriz bidimensional (si se usa una matriz lineal, se usará una platina de traslación tiene un eje de movimiento paralelo a la muestra, pero perpendicular al eje largo del sensor, en el modo de barrido en lugar del modo escalonado). En algunas realizaciones, el sensor puede ser una CCD en lugar de un dispositivo CMOS.
En la microscopía de campo brillante, la calidad de la imagen es frecuentemente mejor si la apertura numérica del sistema de iluminación se elige para ser igual a la apertura numérica del sistema de obtención de imágenes. Sin embargo, en estas condiciones, las imágenes de células no teñidas inmersas en disolución de tampón tienen mal contraste. Los presentes inventores han encontrado que una combinación de iluminación parcialmente coherente y desenfoque mejora el contraste. La iluminación parcialmente coherente ocurre cuando la apertura numérica de iluminación es inferior a la apertura numérica de obtención de imágenes. Los presentes inventores han encontrado que el contraste es mejor cuando el factor de coherencia parcial (factor de llenado, sigma, S) es aproximadamente 0,5. El factor de coherencia parcial es la apertura numérica de iluminación dividida entre la apertura numérica de obtención de imágenes. En nuestro caso, un factor de coherencia parcial de 0,5 significa una apertura numérica de iluminación de 0,06. En estas condiciones, con un desenfoque de algunas décimas de micrómetros, una imagen de una célula sumergida en disolución de tampón parece un punto brillante rodeado por un anillo oscuro. Esto es evidentemente debido al hecho de que el índice de refracción de la célula es superior al índice de refracción de la disolución de tampón y, por tanto, cada célula está en efecto actuando como una lente esférica en miniatura. Por ejemplo, si el diámetro de la célula es 5 micrómetros, el índice de refracción de la célula es 1,376, y el índice de refracción de la disolución de tampón es 1,336, entonces la luz de iluminación transmitida a través de la célula se enfoca aproximadamente 35 micrómetros más allá del centro de la célula. Puesto que las células no son esferas perfectas, y no son internamente homogéneas, este modelo es, por supuesto, una aproximación general. Con un desenfoque de algunas décimas de micrómetros en la dirección opuesta, las células sumergidas en disolución de tampón parecen puntos oscuros. Para mejorar la exactitud del recuento de células, en algunas realizaciones del sistema de obtención de imágenes puede ser ventajoso capturar y comparar dos imágenes de cada área - una imagen en la que las células parecen puntos brillantes rodeados por anillos oscuros, y una imagen en la que las células parecen puntos oscuros. Se podría usar software de procesamiento de imágenes para restar una imagen de la otra y entonces contar los puntos brillantes en la imagen de diferencia. Alternativamente, puede ser ventajoso usar software de procesamiento de imágenes para analizar las dos imágenes por separado, y entonces comparar los resultados. Debido a que las perlas magnéticas usadas son opacas y relativamente grandes, las imágenes de perlas sumergidas en disolución de tampón tienen buen contraste bajo un amplio intervalo de condiciones de iluminación. Una imagen de una perla parece un punto oscuro grande, que contiene normalmente un punto brillante central pequeño. El punto brillante es probablemente un punto de Arago provocado por difracción de Fresnel. Las perlas aparecen claramente en imágenes si el punto de Arago está presente o ausente.
Ejem plo 5 - D etección de células y perlas usando análisis autom atizado de im ágenes
Métodos experimentales: Se coló una matriz de micropocillos de agarosa que comprende aproximadamente 150.000 pocillos (30 |jm de diámetro) y se dispuso en un celda de flujo encerrada que tenía un volumen de aproximadamente 1,5 mL (FIG. 12). La altura de la celda de flujo era 2 mm. El diámetro de las células Ramos varió desde 5-10 micrómetros con un promedio de 8 micrómetros. Las células Ramos se suspendieron en PBS a una concentración de aproximadamente 53.000 células/mL (como se determinó por un analizador de células Muse), se inyectaron a través de la entrada sobre la matriz de micropocillos de agarosa para llenar la celda de flujo, y se dejó que sedimentaran en los pocillos bajo la influencia de la gravedad. Las células que no se capturaron en los pocillos fueron posteriormente desplazadas y lavadas inyectando PBS en la cámara. A continuación, se inyectó una suspensión de perlas magnéticas (perlas de 20 jm de diámetro; aproximadamente 33.000 perlas/mL como se ha determinado por un analizador de células Muse) a través de la entrada y las perlas se dejaron sedimentar en pocillos bajo la influencia de la gravedad. Para examinar la sedimentación y distribución de células y perlas en la matriz en función del tiempo, se recogieron una serie de imágenes de campo brillante de la matriz de micropocillos. Se escribió en Matlab un programa de análisis de imágenes a medida para detectar la presencia de células y perlas en la matriz de micropocillos. El programa identificó la localización de cada pocillo en la matriz y determinó la presencia de perlas y células en cada pocillo. Además, también se calcularon y registraron el número de células presentes en cada pocillo y el radio de las células.
Algoritmo de análisis: Para detectar los pocillos, el programa detecta primero bordes en la imagen usando el método de Canny, que determina los máximos locales de gradientes de intensidad en la imagen. Tras la detección de bordes, el programa detecta entonces pocillos identificando círculos que tienen un radio dentro de un intervalo especificado usando una transformada de Hough circular. Para hacer la detección de pocillos más robusta, algunas realizaciones del algoritmo de análisis también pueden utilizar la detección de patrones en la imagen, por ejemplo, patrones correspondientes a la rejilla regular conocida de pocillos en la matriz. Este enfoque se puede usar para ayudar a eliminar resultados positivos falsos, y también puede mejorar la velocidad del análisis. Los ejemplos de algoritmos adecuados para implementar dichos enfoques incluyen, pero no se limitan a, transformada de Fourier, análisis de ondículas y funciones de autocorrelación.
Una vez se han detectado los pocillos, el programa examina el interior de los pocillos para contar las perlas y/o células. Para detectar las perlas, la imagen se divide en sub-imágenes más pequeñas que contienen pocillos individuales, se convierten en datos binarios aplicando un umbral de intensidad calculado usando el método de Otsu, y se determina la presencia de perlas en cada pocillo basándose en los tamaños conocidos de las perlas y pocillos, y la fracción de píxeles localizada dentro del pocillo que tiene un valor de cero. Si la presencia de perlas se detecta dentro del pocillo, el programa usa entonces una transformada de Hough circular para determinar la localización y el tamaño de las perlas. Para detectar células, el programa detecta primero bordes dentro de cada pocillo usando el método de Canny, y entonces se identifican las células detectando círculos que tienen un radio dentro de un intervalo especificado usando una transformada de Hough circular.
Resultados: Se procesaron imágenes de la matriz de micropocillos (correspondiente a una porción de la matriz total que comprendía aproximadamente 1.500 pocillos) usando el (los) algoritmo(s) descritos anteriormente. Tras la inyección en la celda de flujo, el número de pocillos que contenían células aumentó gradualmente con el tiempo y con el tiempo alcanzó una meseta (FIG. 41). El número de pocillos que contenía células alcanzó más de 90 % del valor saturado 30 minutos después de la inyección de células. Como aumentó el número de células que sedimentan en pocillos, también aumentó el número de pocillos que contenían dos o más células (FIG. 42). La distribución de células en los micropocillos siguió las predicciones de la distribución de Poisson, como se demuestra comparando con datos experimentales recogidos a los 60 minutos (FIG. 43). Las perlas sedimentaron en los micropocillos más rápidamente que las células. Se alcanzó un valor de saturación 2 minutos tras la inyección de perlas en la celda de flujo (FIG. 44).
Ejem plo 6 - Recuento autom atizado de células con un hem ocitóm etro
Un ejemplo de recuento automatizado de células usando el software de procesamiento y análisis de imágenes descrito anteriormente y un hemocitómetro se ilustra en las FIGS. 45-46. El recuento de células es útil en términos de determinar cuánto cargar de una suspensión de células en la celda de flujo que contiene la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, el recuento de células se puede acoplar con una determinación simultánea de la viabilidad celular, por ejemplo, usando un ensayo Live cell / Dead cell basado en fluorescencia. La FIG. 45A (arriba) representa una imagen de campo brillante de células distribuidas en un hemocitómetro. La FIG. 45A (abajo) representa una imagen de fluorescencia correspondiente del mismo campo de vista donde las células se han precargado con calceína, un indicador fluorescente (longitudes de onda de excitación y emisión de 495 nm y 515 nm, respectivamente) de concentración de calcio y viabilidad celular. El flujo de trabajo para el procesamiento de imágenes y el recuento automatizado de células comprende varias etapas (FIGS. 45A-C), que incluyen (i) selección de la imagen de campo brillante a analizar, (ii) selección de una imagen teñida con calceína correspondiente (o una imagen adquirida usando otros indicadores fluorescentes) si se desea, (iii) entrada de un nombre para el archivo de texto de salida (que contendrá estadística básica sobre el número total de células, % de células vivas, radios de las células, etc.), (iv) entrada del factor de dilución y volumen total de suspensión de células usada, (v) identificación basada en algoritmos de cuatro rejillas de 1 mm x 1 mm en las esquinas del hemocitómetro, y (vi) procesamiento de imágenes para identificar y contar células en cada rejilla basándose en la detección de bordes y la transformada de Hough circular. El proceso de procesamiento y análisis de imágenes tarda aproximadamente 30 segundos en realizarse. Un ejemplo de los resultados de salida se muestra en la FIG. 46. Se enumera el número de células identificadas en cada uno de los cuatro cuadrantes y su radio promedio, junto con estadísticas sobre la concentración de células, radio promedio de las células, porcentaje de células vivas, etc.
Ejem plo 7 - D etección de m icropocillos, células y perlas usando análisis autom atizado de im ágenes
Los ejemplos adicionales de detección automatizada de micropocillo, detección de células y detección de perlas usando el software de procesamiento y análisis de imágenes como se ha descrito anteriormente se muestran en las FIGS. 47-51. El flujo de trabajo para el procesamiento y análisis de imágenes comprende varios etapas, que incluyen (i) selección de la(s) imagen (imágenes) de campo brillante a analizar, (ii) selección de una imagen (imágenes) teñidas con calceína correspondientes (o imagen (imágenes) adquiridas usando otros indicadores fluorescentes) si se desea, (iii) entrada de un nombre para el archivo de texto de salida (que contendrá estadística básica sobre el número total de células, % de células vivas, radios de las células, etc.), (iv) selección de si detectar perlas, células, o ambas (con la opción adicional de seleccionar células pequeñas, medianas o grandes), (v) entrada de la región de interés (ROI) dentro de la(s) imagen (imágenes) a analizar, y (vi) procesamiento y análisis de imágenes para identificar los micropocillos en la imagen y las células y/o perlas contenidas dentro de los micropocillos. Las FIGS. 47A-C ilustran una imagen de campo brillante de una matriz de micropocillos que contiene células (FIG. 47A), la imagen de fluorescencia correspondiente donde las células han sido previamente cargadas con calceína (FIG. 47B), y una superposición de las dos imágenes (FIG. 47C). El procesamiento y análisis de imágenes procede en cuatro etapas (FIG. 48): (1) identificación y numeración de micropocillos a través del uso de detección de borde, (2) identificación de perlas, (3) detección de bordes dentro de los micropocillos, y (4) identificación de células. Los bordes de los micropocillos se identifican aumentando la imagen (a aumento 4X, los pocillos engloban un área de aproximadamente 20 x 20 píxeles), realizando la detección de bordes, y aplicando la transformada de Hough circular (FIGS. 49A-B). Se pueden usar resultados de la etapa de detección de micropocillos para crear una máscara para excluir características de la imagen que se encuentran fuera de los micropocillos del posterior análisis (FIG. 49C; FIGS. 50A-C). Las perlas se identifican dentro de pocillos individuales aplicando un umbral binario de intensidad a la imagen, y determinando si una perla está presente o no basándose en el porcentaje de píxeles oscuros dentro de cada pocillo. Si está presente, se puede determinar la localización de la pela dentro del pocillo usando la transformada de Hough circular (HCT) (FIG. 48). Una vez se han detectado las perlas, se realiza detección adicional de bordes dentro del área de cada pocillo (es decir, fuera de la región del pocillo asociada a una perla detectada) para identificar la presencia de células y determinar la localización de células usando HCT (FIG. 48). Una imagen típica (~6 mm x 4 mm de área, -10.000 pocillos) tarda aproximadamente 2 minutos en procesarse y analizarse. Un ejemplo de los resultados de salida se muestra en las FIGS. 51A-C. El software proporciona una visualización gráfica de los resultados (FIGS. 51A-B), así como una tabla sumario (FIG. 51C). Los resultados detallados se almacenan en un archivo de texto (incluyendo el número de pocillos, datos sobre las distribuciones de células y perlas, etc.). En algunas realizaciones, la visualización gráfica de resultados comprende la imagen de campo brillante original superpuesta con gráficas, por ejemplo, círculos de diferentes colores, para indicar pocillos que no contienen células o perlas, pocillos que contienen una perla individual, pocillos que contienen una célula individual, pocillos que contienen tanto una perla individual como una célula individual, pocillos que contienen células que presentan propiedades seleccionadas, por ejemplo, como se indica por un indicador fluorescente, etc. Puede ser útil la detección automatizada de micropocillos, perlas y células usando procesamiento y análisis de imágenes para el análisis cuantitativo de las eficiencias de distribución de perlas y células, eficiencias de recuperación de perlas, etc., en función de los parámetros de diseño del dispositivo y sistema.
E jem plo 8 - D istribución y recuperación de células y perlas frente a l diseño de celda de flujo, m ateria l de sustrato y d iám etro de l pocillo
Fabricación de matrices de micropocillos: Se fabricaron matrices de micropocillos que tenían un intervalo de diámetros de varios materiales de sustrato diferentes. Las FIGS. 52A-C muestran micrografías de micropocillos fabricados de Norland Optical Adhesive 63 (NOA63) usando un proceso de moldeo activado por UV para repetir sustratos de micropocillos de cuños de polidimetilsiloxano (PDMS) (véase el Ejemplo 10). Los micropocillos variaron desde 27,5 pm hasta 80 pm de diámetro, con una profundidad de 40 pm y paso variable (separación mínimo centro a centro = 15 pm). Las FIGS. 53A-C muestran micrografías de micropocillos fabricados de copolímero de olefina cíclica (COC) usando un proceso de estampado en relieve y una estructura de adhesivo óptico como se ilustra en las FIGS. 52A-C como patrón. Los micropocillos de COC mostrados en las FIGS. 53A-C tuvieron un diámetro de 50 pm, con una profundidad de 50 pm y 60 pm de paso. Las matrices de micropocillos que tienen otros diámetros, profundidades y pasos también se fabricaron de COC y se probaron, ya que fueron matrices de micropocillos fabricadas de polímero de cicloolefina (COP). Una realización preferida comprendió micropocillos de 55 pm de diámetro, 40 pm de profundidad y 70 pm de paso.
Tratamiento del sustrato de la matriz de micropocillos: Las matrices de micropocillos fabricadas de NOA63, COC, o COP se pretrataron normalmente con Pluronic F108 (0,02 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) durante al menos media hora antes de cargar las células. Las células se suspendieron en Pluronic F68 (1 % en PBS) para su uso en la carga de las matrices de micropocillos.
En estudios de eficiencias de recuperación de perlas para matrices de micropocillos que tenían perlas cargadas previamente, algunos sustratos de matrices de micropocillos se pretrataron con poli-HEMA (10 - 20 mg/mL en etanol o tampón de lisis (Tris HCl 0,1 M (pH 7,5), LiCl 0,5 M, 1 % de dodecilsulfato de litio (LiDS), EDTA 10 mM, DTT 5 mM)) antes de cargar las perlas.
Eficiencia de captura y recuperación de perlas frente al diámetro de micropocillo: La FIG. 54 muestra ejemplos de datos para la eficiencia de captura y recuperación de perlas para micropocillos de diferente diámetro (50 pm de profundidad, 15 pm de separación mínima entre pocillos) fabricadas de NOA63. Se suspendieron perlas (33 pm de diámetro) en PBS para la carga sobre la matriz. Como cabría esperar, la eficiencia de captura de perlas se disparó espectacularmente para pocillos que tenían un diámetro mayor que el de la perla. A medida que aumentaron los diámetros de los pocillos, también aumento el porcentaje de dobletes (pocillos que contienen dos perlas). La eficiencia de de recuperación de perlas presentó un mínimo para pocillos de aproximadamente el mismo tamaño que las perlas, y entonces aumentó a medida que aumentaron los diámetros de los pocillos.
Las FIGS. 55A-D y 56 muestran ejemplos de datos para la captura y recuperación de perlas de micropocillos de diferente diámetro fabricados de NOA63 o COC (profundidad de pocillo = 40 pm para los pocillos de adhesivo óptico y COC). Las propiedades de carga de las perlas fueron similares para los dos materiales (FIG. 55A-D). La eficiencia de recuperación de perlas mejoró para micropocillos fabricados de COC (y para COP) con respecto a aquella para micropocillos fabricados del adhesivo óptico (FIG. 56).
Eficiencia de recuperación de perlas para perlas cargadas previamente: La FIG. 57 muestra micrografías de micropocillos de c Oc pretratados con poli-HEMA como se ha descrito anteriormente. Se precargaron micropocillos con perlas de 35 pm de diámetro suspensas en PBS. Después de la carga, el sustrato de los micropocillos se aclaró 3x en agua desionizada para retirar sales, y se secó a vacío durante la noche. Las perlas cargadas en matrices de micropocillos de COC no tratadas no se pudieron recuperar magnéticamente de los pocillos. Las perlas cargadas en los micropocillos de COC que habían sido pretratadas con poli-HEMA se pudieron recuperar magnéticamente con esencialmente 100 % de eficiencia.
Eficiencia de carga y recuperación de perlas frente al diseño de celda de flujo y posición sobre el sustrato: Las FIGS.
58-60 muestran ejemplos de datos para estudios de carga y recuperación de perlas después de diferentes etapas de proceso y en función de la posición sobre el sustrato de matrices de micropocillos. La FIG. 58A ilustra una celda de flujo que encierra la matriz de micropocillos e incluye una entrada y salida decreciente. La FIG. 58B ilustra las etapas del proceso de carga y recuperación: (i) carga, (ii) atrapamiento potenciado por campo magnético, (iii) lavado, y (iv) recuperación basada en campo magnético. Las FIGS. 59A-D muestran micrografías de una matriz de micropocillos después de cada una de las etapas brevemente expuestas en la FIG. 58B. El porcentaje de pocillos que contienen una perla se indica debajo de cada imagen. La FIG. 60 muestra ejemplos de datos generados usando procesamiento y análisis automatizado de imágenes como se describe previamente para cuantificar el número de pocillos que contienen perlas después de cada etapa de proceso en función de la posición sobre el sustrato, por ejemplo, como se especifica por la distancia de la salida de la celda de flujo. Los datos indican que la eficiencia de carga y recuperación asistida por campo magnético es bastante alta. El diseño de celda de flujo usado en este ejemplo (FIG. 58A; entrada y salida decreciente) proporcionó una distribución uniforme de perlas a lo largo de la longitud del sustrato de matrices de micropocillos.
La FIG. 61 muestra otro ejemplo de datos para estudios de carga y recuperación de perlas después de diferentes etapas de proceso, que incluye la etapa de lisis, en función de la posición sobre el sustrato de micropocillos. Se cargó un sustrato de matrices de micropocillos de NOA63 (pocillos de 33 pm de diámetro) con células Ramos, seguido por carga con perlas en blanco de 22 |jm de diámetro. Procesamiento y análisis automatizado de imágenes como se describe previamente para cuantificar el número de pocillos que contienen perlas después de cada etapa de proceso en función de la posición sobre el sustrato. Nuevamente, la eficiencia de carga y recuperación asistidas por campo magnético es bastante alta, con una distribución de perlas bastante uniforme a lo largo de la longitud del sustrato de matrices de micropocillos.
Las FIGS. 62-66 ilustran los resultados de estudios para determinar la uniformidad de la distribución de perlas a través del sustrato de los micropocillos en función del diseño de la celda de flujo y el uso opcional de una etapa de inyección de aire entre las inyecciones de líquido para ayudar a minimizar la dispersión en las interfases líquido-líquido. Las FIGS. 62A-B representan los dos diseños diferentes de celda de flujo probados: diseño de entrada única - salida única (FIG. 62A) y un diseño de entrada ramificada (FIG. 62B). También se probaron dos enfoques diferentes para el intercambio de fluidos dentro de la celda de flujo. El enfoque N° 1 consistió en realizar las etapas de cebado de la celda de flujo, carga de las células y carga de las perlas, donde todas las etapas se realizaron usando PBS y cada disolución fue desplazada directamente por la siguiente. El enfoque N° 2 consistió en realizar las etapas de cebado de la celda de flujo, desplazamiento del tapón de cebado con una inyección de aire, carga de las células, desplazamiento de la suspensión de células con una inyección de aire, y carga de las perlas. Entonces se evaluó la uniformidad de carga de las perlas usando el software de procesamiento y análisis automatizado de imágenes descrito anteriormente. La FIG. 63 muestra una imagen superpuesta con los datos de eficiencia del llenado de perlas para la celda de flujo de entrada única - salida única usando el enfoque N° 1 (duración de dispensación de 12 segundos). Los números indican el porcentaje de llenado local (es decir, el número de pocillos con una perla presente / número total de pocillos de los que se captó imagen). El porcentaje de llenado global fue 83 ± 10 % (87 ± l0 % con respecto a la mitad delantera del sustrato). La FIG. 64 muestra una imagen superpuesta con los datos de eficiencia del llenado de perlas para la celda de flujo de entrada ramificada usando el enfoque N° 1 (de dispensación de 12 segundos). El porcentaje de llenado global fue 83 ± 12 % (94 ± 6 % con respecto a la mitad delantera del sustrato). La FIG. 65 muestra una imagen superpuesta con los datos de eficiencia del llenado de perlas para la celda de flujo de entrada única - salida única usando el enfoque N° 2 (es decir, usando inyecciones de aire entre las dispensaciones de líquido). El porcentaje de llenado global fue 95 ± 3 %. Los resultados del estudio se resumen en la FIG. 66. El uso de inyecciones de aire entre las etapas de dispensación de líquidos induce un perfil de velocidad del fluido de flujo pistón a través de la celda de flujo, y mejora la uniformidad de la distribución de perlas a través del sustrato de micropocillos. De un modo similar, el uso de inyecciones de aire entre las etapas de dispensación de líquido también mejora la uniformidad de la distribución de células dentro de la celda de flujo.
Se observó durante el transcurso de la realización de estos estudios que las perlas puede algunas veces quedar atrapadas en depósitos semisólidos, por ejemplo, ADN genómico y/o proteínas reticuladas, creados durante la lisis celular. Estos depósitos puede ser rotos o quitados usando métodos 'mecánicos', por ejemplo, burbujas de aire inyectadas, flujo vigoroso y/o sonicación. Alternativamente, se puede prevenir que los depósitos se formen, o se disuelven, a través del uso de tampones que tienen menor concentración de sales, por ejemplo, PBS (molalidad ~ 150 mM) en lugar de tampón de lisis (molalidad > 500 mM), diferentes concentraciones de tensioactivo, diferentes intervalos de pH, o tratamiento con DNasas y/o proteasas.
Experimento de prueba de concepto de celdas de flujo: La FIG. 67 proporciona una visión general de alto nivel del flujo de trabajo del ensayo para el marcado estocástico de células individuales. El ensayo comprende 13 etapas, que incluyen: (1) contar y diluir las células a cargar en los micropocillos, (2) cargar las células, y lavar cualquier célula que no haya sedimentando en los micropocillos, (3) cargar las perlas que comprenden la biblioteca de marcadores estocásticos usando un campo magnético externamente aplicado, (4) cargar tampón de lisis mientras que las perlas siguen retenidas por el campo magnético, e incubar, (5) lavar la superficie del sustrato con tampón de lisis, (6) recuperar las perlas con un campo de imán externamente aplicado, y transferir las perlas a tubos, (7) lavar las perlas para intercambiar tampones, (8) realizar transcriptasa inversa (RT) en los tubos, (9) tratar con exonucleasa 1, (10) realizar la tres rondas de PCR, (11) secuenciar el producto amplificado, (12) realizar el análisis de datos, y (13) proporcionar visualización de datos. El 'procesamiento y análisis de imágenes facilita las primeras seis de estas etapas de proceso.
Se realizó un estudio de prueba de concepto de la celda de flujo de principio a fin usando sustratos de micropocillos de COC que tenían pocillos de 50 jm de diámetro de 50 jm de profundidad y 60 jm de separación centro a centro. El estudio se realizó usando líneas celulares Ramos y K562, y perlas magnéticas de 33 jm de diámetro funcionalizadas con oligonucleótido. El sustrato de COC se empaquetó en una celda de flujo que tenía un área total de 225 mm2 que contenía aproximadamente 72.000 micropocillos expuestos. La celda de flujo se cebó con 99 % de etanol, y luego se lavó con PBS. Se cargaron las células en PBS (3.500 células K562 y 3.500 células Ramos) y se dejó que sedimentaran durante 20 minutos. Entonces se cargaron en PBS las perlas que llevaban oligonucleótido (100.000 perlas) y se dejó que sedimentaran durante 5 minutos, tras lo cual se introdujo tampón de lisis para lisar las células. Se colocó un imán debajo de la celda de flujo durante la lisis para evitar tener perlas empujadas de los micropocillos debido a la expansión de las células durante la lisis. Entonces se recuperaron las perlas de los micropocillos poniendo un imán por encima de la celda de flujo y lavando con tampón de lisis adicional. Se determinaron las eficiencias de carga y recuperación de célula y perlas tras las diferentes etapas de proceso usando el software de procesamiento y análisis automatizado de imágenes descrito anteriormente. Entonces se realizaron las restantes etapas del proceso de ensayo fuera de la celda de flujo.
Los resultados del estudio de prueba de concepto se muestran en las FIGS 68-69. La eficiencia de carga de células (es decir, el número de células capturadas dentro de pocillos / células totales de las que se capturó imagen) fue aproximadamente 80 % para ambos tipos de células, que fue algo superior a lo esperado considerando que 44 % del área superficial del sustrato de micropocillos usado en este estudio era espacio muerto. La mayor eficiencia de carga puede ser debida a la caída de células sobre la superficie del sustrato durante la carga de células. La eficiencia de carga de perlas (es decir, el número de pocillos que contienen una perla / pocillos totales de las que se capturó imagen) fue aproximadamente 84 % (aproximadamente 90 % excluyendo las zonas muertas fluídicas dentro de la celda de flujo). Después de la recuperación de las perlas, aproximadamente 6 % de los pocillos todavía contenían una perla, que implicó una eficiencia de recuperación de aproximadamente 93 %. El número de células identificadas por recuperación y procesamiento de perlas de los marcadores de oligonucleótidos correspondientes (es decir, realización de la transcripción inversa, amplificación por PCR y reacciones de secuenciación) se muestra en la FIG. 69. Actualmente, se pueden alcanzar eficiencias de recuento de aproximadamente 20-50 %. No quedó claro en este estudio por qué la población de células Ramos está infrarrepresentada por recuento molecular.
E jem plo 9 - D istribución y recuperación de células y perlas frente a l espesor de la celda de flujo, recuperación m agnética autom atizada y com posición de l tam pón de lisis
Se realizaron una serie de experimentos para examinar las eficiencias de distribución y recuperación de células y perlas en función del espesor de la celda de flujo (es decir, la profundidad de la cámara de la celda de flujo) y el caudal, composición del tampón de lisis y uso de recuperación automatizad de perlas magnéticas. El mecanismo automatizado de recuperación de perlas magnéticas comprendió un pequeño imán fijo mantenido en una posición estacionaria ya que la celda de flujo se trasladó pasando el imán usando una platina de traslación lineal (alternativamente, la celda de flujo se puede mantener en una posición estacionaria a medida que se traslada el imán).
Distribución y recuperación de células y perlas frente a la profundidad y caudal de la celda de flujo: Se realizaron experimentos usando sustratos de micropocillos de COP con pocillos de 50 pm de diámetro x 50 pm de profundidad separados un paso de 60 pm. Los sustratos de micropocillos se empaquetaron en una celda de flujo que tenía un diseño de canal diagonal de entrada única-salida única que tenía o: (a) un canal de 1 mm de espesor, 5 mm de ancho, o (b) un canal de 2 mm de espesor, 3 mm de ancho. Se usaron perlas funcionalizadas de 33 pm de diámetro para la carga de perlas. Se usaron células K562 para la carga de células. Se determinaron las eficiencia de carga de perlas y células en función de la posición a lo largo de la celda de flujo usando el software de procesamiento y análisis automatizado de imágenes descrito anteriormente.
Las FIGS. 70A-B muestran ejemplos de datos de carga de perlas en función de la posición a lo largo de la celda de flujo en diferentes etapas en el procedimiento de ensayo. La FIG. 70A muestra datos para una celda de flujo de 1 mm de espesor. El porcentaje de pocillos que contenían perlas fue bastante uniforme a lo largo de la longitud de la celda de flujo tras la carga inicial, después de aclarar la celda de flujo, y después de usar un imán para bajar las perlas en los pocillos. El porcentaje de pocillos que contenían perlas era más bajo en el extremo de entrada de la celda de flujo que en la salida tras las etapas de lisis celular y de recuperación de perlas. La FIG. 70B muestra datos para una celda de flujo de 2 mm de espesor. Nuevamente, el porcentaje de pocillos que contenían perlas era bastante uniforme a lo largo de la longitud de la celda de flujo tras la carga inicial y después de aclarar la celda de flujo. El porcentaje de pocillos que contenían perlas era algo más alto en el extremo de entrada de la celda de flujo y más bajo en el extremo de salida tras las etapas de lisis celular y de recuperación de perlas, que indica que el proceso de recuperación de perlas se pueden influir por la geometría de la celda de flujo, dimensiones de los canales de fluido, y los correspondientes cambios en las velocidades de flujo y los perfiles de flujo dentro de la cámara de matrices de micropocillos.
Las FIGS. 71A-B muestran ejemplos de datos para el porcentaje de perlas perdidas durante la etapa de lisis o recuperadas al final del proceso en función de la posición a lo largo de la celda de flujo. Los datos mostrados en la FIG. 71A indican que para la celda de flujo de 1 mm de espesor, existe un pérdida de perlas significativa dependiente de la posición observada durante la etapa de lisis en las condiciones usadas en este experimento. El porcentaje total de perlas recuperadas fue correspondientemente bastante bajo. La FIG. 71B muestra los datos correspondientes para la celda de flujo de 2 mm de espesor. El porcentaje de perlas perdidas durante la etapa de lisis era, en general, más bajo, y el porcentaje correspondiente de perlas recuperadas era, en general, más alto, que para la celda de flujo de 1 mm.
Las FIGS. 72A-F muestran ejemplos de datos para la carga de células en función de la posición a lo largo de la celda de flujo en diferentes etapas en el procedimiento de ensayo. Las FIGS. 72A-C muestran datos para la celda de flujo de 1 mm de espesor. Las FIGS. 72D-F muestran datos para la celda de flujo de 2 mm de espesor. El porcentaje de pocillos que contenían dos o tres células era, en general, más bajo para la celda de flujo de 2 mm de espesor, y bastante independiente de la posición a lo largo de la longitud de la celda de flujo.
Recuperación automatizada de perlas magnéticas: Las FIGS. 73-76 ilustran resultados de estudios de distribución y recuperación de células y perlas realizados usando un sistema automatizado de recuperación de perlas magnéticas. El uso de un mecanismo de control del movimiento, por ejemplo, una platina de traslación lineal, para mover el imán con respecto a la celda de flujo (o viceversa) ofrece la ventaja de ser capaces de ejecutar un movimiento relativo lento repetible que se puede optimizar para corresponder mejor la escala de tiempo de perlas en movimiento dentro y fuera de los pocilios. Los experimentos se realizaron usando sustratos de COC que tenían micropocillos de 50 |jm de diámetro. Se cargaron 3000 células Ramos en 1 % de F68. Las perlas tuvieron 33 micrómetros de diámetro y se cargaron 200.000 perlas sobre el sistema. Se determinaron las eficiencias de carga de perlas y células en función de la posición a lo largo de la celda de flujo usando el software de procesamiento y análisis automatizado de imágenes descrito anteriormente.
La FIG. 73 muestra datos para el porcentaje de pocillos que contienen perlas en función de la posición a lo largo de la longitud de la celda de flujo en diversas etapas del proceso de ensayo, es decir, después de la carga inicial y sedimentación de las perlas, después de lavar la celda de flujo con un tampón de aclarado, después de bajar las perlas con el imán externo, y después de introducir el tampón de lisis. El porcentaje de pocillos que contienen perlas (promediado en todo el conjunto de micropocillos) después de cada etapa de proceso se muestra en la FIG. 74. La eficiencia de recuperación global de perlas en estos estudios fue aproximadamente 48,8 %.
Las FIGS. 75A-C muestran datos para la carga de células después de la carga de células inicial y la etapa de sedimentación (FIG. 75A), después de la carga de perlas inicial y la etapa de sedimentación (FIG. 75B), y después de las perlas se bajen posteriormente con el imán (FIG. 75C). Se puede observar cierta pérdida de células en la FIG. 71C, quizás debido al desplazamiento de las células a medida que las perlas son bajadas más profundas en los micropocillos.
La FIG. 76 proporciona un resumen de la carga de células y los datos de carga de perlas en diferentes etapas en el proceso. El porcentaje de pocillos que contienen células individuales varió desde aproximadamente 8 % hasta aproximadamente 11 %. El porcentaje de pocillos que contienen dos células varío desde aproximadamente 0,2% hasta aproximadamente 0,8 %. El porcentaje de pocillos que contienen tanto una célula individual como una perla individual varió desde aproximadamente 4,1% hasta aproximadamente 4,6%. El porcentaje de pocillos que contuvieron perlas solo varió desde aproximadamente 55,5 % hasta aproximadamente 66,7 %. El uso del imán para distribuir las perlas tuvo poco efecto sobre el número de pocillos que contenían células individuales, dos células, o tanto una célula individual como una perla individual, aunque hubo un ligero aumento en el porcentaje de células que contenían perlas.
Recuperación de perlas frente a la composición del tampón de lisis: Se realizó un conjunto de experimentos para determinar si la modificación del tampón de lisis, por ejemplo, mediante adición de ditiotreitol (DTT) reducía los enlaces disulfuro en ADN genómico tiolado, en combinación con que la distribución de perlas asistida por campo magnético mejoraría las eficiencias de recuperación de perlas. Los estudios se realizaron usando sustratos de matrices de micropocillos de COC que tenían micropocillos de 50 jm de diámetro x 50 jm de profundidad en un paso de 60 jm . Se cebó la celda de flujo usando 100 % de etanol, y se aclaró 3x con PBS. Se cargaron células Ramos (total 30.000) usando 1 % de Pluronic F68 en PBS, seguido por la carga de perlas funcionalizadas de 33 jm de diámetro en PBS. Después de cargar las perlas, la celda de flujo se lavó con PBS, y se usó un imán situado debajo del sustrato para bajar las perlas restantes en los micropocillos. Se inyectó dos veces tampón de lisis (con DTT, dilución 1:20), seguido por un periodo de incubación de 20 minuto (con el imán situado debajo del sustrato), seguido por recuperación magnética de las perlas. Se determinaron las eficiencias de carga de perlas en función de la posición a lo largo de la celda de flujo usando el software de procesamiento y análisis automatizado de imágenes descrito anteriormente.
Las FIGS. 77A-B muestran ejemplos de datos que comparan la carga de perlas en diferentes etapas en el procedimiento de ensayo cuando se usa tampón de lisis con y sin DTT añadido. En ausencia de DTT, la tasa de recuperación de perlas (perlas recuperadas / perlas cargadas * 100%) fue aproximadamente 65,5% (FIG. 77A). Cuando se añadió DTT al tampón de lisis, la tasa de recuperación de perlas aumentó hasta aproximadamente 85,8 % (FIG. 77B).
Las FIGS. 78A-B muestran ejemplos de datos que comparan el impacto de la distribución de perlas asistida por campo magnético sobre la carga de perlas en diferentes etapas en el procedimiento de ensayo cuando el tampón de lisis incluye DTT. La tasa de recuperación de perlas fue aproximadamente 84,6 % sin el uso de distribución de perlas asistida por campo magnético (FIG. 78A). Cuando se empleó distribución de perlas asistida por campo magnético, la tasa de recuperación de perlas disminuyó a aproximadamente 43,6 % (FIG. 78B).
Estudios de celda de flujo de la carga y recuperación de perlas: Las FIGS. 79 y 80 muestran ejemplos de datos para estudios de carga y recuperación de perlas realizados usando sustratos de micromatrices de COC que tienen micropocillos de 50 jm de diámetro x 50 jm de profundidad (60 jm de paso) empaquetados en celdas de flujo. Se cargaron micropocillos con una mezcla de células (1:1:1:1 de células K562, THP1, Ramos, Jurkat; total 20.000 células) y perlas de 50 jm de diámetro funcionalizadas con bibliotecas de creación de códigos de barras de oligonucleótidos (total 100.000 perlas).
La FIG. 79A muestra el porcentaje de pocillos que contienen perlas después de la etapa de carga de perlas y después de la recuperación de perlas. La FIG. 79B proporciona una tabla de datos estadísticos para un experimento individual. Las FIGS. 80A y 80B muestran mapas de calor para la tasa de llenado de perlas (% de pocillos con perlas) en función de la posición dentro de la celda de flujo después de la carga de perlas y después de las etapas de recuperación de perlas. La FIG. 80C muestra un mapa de calor del porcentaje de recuperación de perlas (1 - perlas restantes / perlas cargadas)*100 %) en función de la posición con la celda de flujo después de la etapa de recuperación de perlas. La tasa de recuperación de perlas varió desde 77,2 % hasta 93,3 % durante tres experimentos independientes.
Ejem plo 10 - A dhesivo ópticos sobre la fabricación de sustratos de vidrio
Este ejemplo ilustra los procedimientos requeridos para fabricar un sustrato estampado con adhesivo óptico sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio. Usando cinta 3M, fijar los portaobjetos de microscopio al dentro de una placa de Petri. Dispensar aproximadamente 300- 350 pL de NOA63 sobre los portaobjetos de microscopio y usar una punta de pipeta P1000 para distribuir uniformemente NOA63 sobre el portaobjetos y eliminar las burbujas. Poner lentamente el molde de PDMs sobre el portaobjetos de microscopio de forma que el lado estampado e PDMS se ponga en contacto con NOA63, y tener cuidado para evitar atrapar burbujas entre el PDMS y NOA63. Poner el portaobjetos-NOA63-PDMS en la base de la plantilla de aluminio y poner un portaobjetos de microscopio limpio encima del molde de PDMS. Completar el ensamblaje de la plantilla poniendo la parte superior de la platilla sobre el portaobjetos de vidrio y avanzar ligeramente los tornillos hasta que exista resistencia. Entonces, apretar los tornillos en incrementos de no más de 1/8 de vuelta cada vez. Repetir hasta que no esté flojo antes de apretar cada tornillo. Esperar durante 5 minutos para permitir la distribución uniforme de NOA63 completamente y alrededor del perímetro de las porciones estampadas del molde de PDMS. Apretar ligeramente los tornillos una vez más, usando el mismo procedimiento de apretar que antes. Poner la plantilla de aluminio ensamblada sobre el trans-iluminador Maestro y curar durante un mínimo de 1 hora. Poner la fuente de UV en alto y 365 nm. Registrar el tiempo de inicio del "1° curado". Registrar el tiempo de finalización del "1° curado". Desensamblar la plantilla a medida. Desmoldear el molde de PDMS del NOA63/portaobjetos de microscopio moldeado. Usando escalpelo y cuchilla de afeitar, retirar NOA63 sobresaliente del perímetro del sustrato. Curar el sustrato durante al menos 6 horas adicionales con el lado de NOA63 del sustrato orientado a la fuente de UV, situar el sustrato sobre un portaobjetos de microscopio en cualquier extremo. Poner la fuente de UV en alto y 365 nm. Registrar el tiempo de inicio del "2° curado". Registrar el tiempo de finalización del "2° curado".
E jem plo 11 - Fabricación de m icropocillos usando un patrón foto litográficam ente estam pado y m oldeo p o r inyección
Se han evaluado varios enfoques para la fabricación de matrices de micropocillos. En este ejemplo, se fabricaron matrices de micropocillos usando un patrón fotolitográficamente estampado y moldeo por inyección. El método comprendió: (i) fabricar un patrón maestro usando litografía óptica UV y un sustrato adecuado (por ejemplo, vidrio o silicio); la dosis de UV se eligió de manera que solo se expusieran parcialmente las paredes del sustrato entre los pocillos, de forma que el ángulo de la pared fuera el ángulo de inclinación deseado y la superficie del sustrato entre los pocillos tuviera el perfil redondeado deseado; (ii) recubrir el patrón estampado con un material duradero tal como níquel; y (iii) moldear por inyección usando el patrón recubierto y COC u otros polímeros adecuados para fabricar las matrices de micropocillos. La FIG. 81 muestra una micrografía de una matriz de micropocillos fabricada usando este enfoque.
Ejem plo 12 - F lu jos de trabajo del ensayo alternativos
Se examinó un flujo de trabajo del ensayo alternativo para cargar perlas en micropocillos antes de cargar células. Las posibles ventajas para este flujo de trabajo alterno (es decir, las perlas se cargaron primero en vez de cargarse las células primero) son: (a) simplificación del flujo de trabajo (número de etapas reducido) y facilidad de operación del usuario, (b) reducida complejidad, coste y tiempo de desarrollo para la automatización del flujo de trabajo del ensayo, y (c) posible habilitación de pre-cargar perlas en el sustrato de los micropocillos antes de transportar un cartucho consumible a un consumidor.
En el flujo de trabajo convencional de carga de células y microperlas en la matriz de micropocillos, las células se cargan antes de cargar las perlas. Este estudio examinó un flujo de trabajo alternativo donde las perlas se cargan a la matriz de micropocillos antes de cargar las células. Se exploró este enfoque debido a los beneficios esperados, tales como simplificación del flujo de trabajo resultante de la reducción de etapas de proceso, posible facilidad de automatización, y las posibilidades de permitir la pre-carga de perlas al cartucho durante la fabricación del consumible. Además de estos posibles beneficios, los presentes inventores también encontraron algunos ventajas inesperadas al enfoque, por ejemplo, mejoró la eficiencia de la carga de perlas (es decir, se redujo la frecuencia de observar dobletes de perlas) y pareció que la eficiencia de captura de células, que se esperaba que disminuyera con este enfoque alternativo, era similar a la eficiencia de captura de células lograda con el flujo de trabajo convencional de cargar las células primero.
Las FIGS. 82A-B comparan los flujo de trabajos convencional ("células primero") y alternativo ("perlas primero"). El flujo de trabajo alternativo tuvo el beneficio de reducir el número de etapas de ensayo a realizar. Se examinaron varias variaciones en los flujos de trabajo "célula primero" y "perla primero" (FIGS. 83A-B) usando un sustrato de micropocillos fabricado de COC y diseño de celda de flujo (Rev. 14) que tenía una altura reducida (profundidad). Ambos procedimientos incluyeron una etapa de cebado con etanol y tratamiento de la celda de flujo con 0,02 % de Tween-20 durante 10 minutos antes de cargar las perlas o células. Los experimentos se repitieron dos veces.
Las FIGS. 84A-B muestran una comparación de la eficiencia de carga de perlas para cada en los flujos de trabajo del ensayo "perlas primero" y "células primero", respectivamente. La frecuencia de dobletes observada en el enfoque "células primero" varía, pero está normalmente en el intervalo de 5 % - 15 %. En la etapa antes de la lisis celular, la frecuencia observada de dobletes de perlas era aproximadamente 5 % en tanto los enfoques "perlas primero" como "células primero" usados para este experimento.
La FIG. 85 muestra una imagen compuesta de la celda de flujo que comprende la matriz de micropocillos usada en estos estudios. Las FIGS. 86A-C muestran mapas de calor de la eficiencia de carga de perlas individuales en función de la posición dentro de la celda de flujo para diferentes etapas del flujo de trabajo del ensayo "perlas primero". Se observaron "puntos calientes" de la frecuencia de dobletes de perlas debido a un aumento de la impedancia de flujo en una rama de salida de la celda de flujo (brevemente expuesto en la esquina inferior derecha de la imagen compuesta en la FIG. 85). Esta cuestión de fiabilidad es independiente del flujo de trabajo, y se espera que mejore la frecuencia de dobletes observada (es decir, se reduzca) ya que se resuelven dichas cuestiones de fiabilidad. Con todos los campos de vista (FOVs) en la imagen compuesta incluidos, la frecuencia de dobletes observada era ~ 5 %. La exclusión de los pocillos en la esquina inferior derecha de la imagen compuesta dio una frecuencia de dobletes de perlas para el flujo de trabajo del ensayo "perlas primero" de ~ 4 %.
Las FIGS. 87A-F muestran una comparación de la eficiencia de captura de células para los flujos de trabajo del ensayo "perlas primero" (FIGS. 87A-C) y "células primero" (FIGS. 87D-F). Una métrica de rendimiento clave es el número de células capturadas en la etapa antes de la lisis celular frente al número de células de las que se capturaron imágenes en la etapa de "carga de células". Para el enfoque "perlas primero", las células capturadas durante la etapa "lavado de células" (es decir, la etapa antes de la lisis celular) es casi equivalente al número de células de las que se capturaron imágenes durante la etapa "carga de células". En el enfoque "células primero", el número de células capturadas durante la etapa "lavado de perlas" (es decir, la etapa antes de la lisis celular) es inferior al número de células de las que se capturaron imágenes durante la etapa "carga de células". La pérdida de células neta (etapa "lavado de perlas" frente a la etapa "carga de células") en e l " enfoque células primero" no es siempre alta, pero es coherente, y esta pérdida no se observó en el enfoque "perlas primero".
Las FIGS. 88A-B muestran la frecuencia de otra métrica de rendimiento importante, es decir, el porcentaje de células asociadas a una perla individual. Ambos enfoques presentaron rendimiento similar con respecto a este parámetro.
Las FIGS. 89A-D muestran datos para otra métrica de rendimiento importante, es decir, el porcentaje de pocillos que contienen una perla individual antes de la etapa de lisis celular. Para este métrica, el enfoque "perlas primero" (FIGs .
89A-B) muestra una mejora con respecto al enfoque "células primero" (FIGS. 89C-D).
Las FIGS. 90A-B muestran gráficos de la eficiencia de carga de perlas frente al número de células en el micropocillo para los flujos de trabajo del ensayo "perla primero" (FIG. 90A) y "células primero" (FIG. 90B), respectivamente.
Ejem plo 13 - In terfaz de punta de p ipeta m odificada
El diseño de interfaz de punta de pipeta previa utilizó una válvula de pico de pato de una vía en la salida para eliminar el flujo de retorno en el cartucho desde un depósito del puerto de salida (FIGS. 91-92; que muestran la válvula de pico de pato en la salida del cartucho). Se encontró que la válvula de pico de pato era incompatible con el flujo de trabajo del ensayo debido a que el uso de perlas de 33 um restringe que la válvula se cierre completamente, dando así como resultado el flujo de retorno de tampón desde un recipiente de salida (por ejemplo, recipiente de residuos) al cartucho. El diseño modificado elimina la válvula de salida y usa en su lugar una válvula de dispensación x-fram (miniValve Inc.) en la entrada. Se abre una fisura en la válvula de entrada x-fragm y entonces se penetra por la punta de pipeta. El fluido (tal como un tampón de carga de perlas) circula a través de la punta de pipeta en vez de directamente a través de la válvula, por lo que se evita el problema del cierre incompleto de la válvula observado para el diseño previo.
El diseño de interfaz de punta de pipeta modificado también incluye cambios en el diseño del sellado formado alrededor de la punta de pipeta. El diseño previo utilizó una junta de ajuste por fricción entre la punta de pipeta y el cartucho (FIGS. 91-92; que muestra la interfaz de pipeta de ajuste por fricción en la entrada del cartucho). Las deficiencias observadas para la junta de ajuste por fricción incluyeron: (i) deformación / pellizcado de la punta de pipeta cuando la punta de pipeta se presionó en el cartucho con demasiada fuerza, dando así como resultado elevada impedancia fluídica y caudales reducidos al cartucho; esto fue especialmente problemático para la operación manual del cartucho; (ii) el ajuste por fricción no liberó suavemente la punta de pipeta del cartucho cuando la punta de pipeta se retrajo, dando así como resultado la elevación del cartucho o liberación de la punta de pipeta de la pipeta; esto fue especialmente problemático para la operación automatizada del cartucho con una pipeta robótica; y (iii) la posición completamente asentada para la punta de pipeta no está bien definida para el ajuste por fricción y varía con la fuerza aplicada a la punta de pipeta; si está presente un hueco de aire dentro de la interfaz de pipeta después de que se forme un sellado entre la punta de pipeta y el cartucho, entonces se puede inyectar una burbuja en el cartucho.
El diseño actualizado utiliza una junta moldeada a medida hecha de un material distensible, por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), poliisopreno, polibutadieno, o poliuretano. Reemplazando la interfaz de ajuste por fricción con una interfaz de junta, se reduce significativamente el tamaño del hueco de aire entre la punta de pipeta y el cartucho. Siempre que esté presente una pequeña gota de líquido sobre la punta de la pipeta antes de que se haga un sellado (dicha gota se puede introducir para pipeteado automatizado), se forma una interfase fluídica entre la junta y la punta de pipeta sin inyección de burbujas al cartucho. La FIG. 93 muestra la interfaz de cartucho actualizada con la junta distensible moldeada y la válvula de dispensación x-fram. La FIG. 94 muestra una comparación resumen de los dos diseños de interfaz de punta de pipeta.
Ejem plo 14 - F lu jo de trabajo de l ensayo "perlas p rim ero" m odificado con etapas de lavado de perlas basado en F ico ll y de lisis celu lar
Se evaluó un flujo de trabajo del ensayo modificado usando etapas de lavado de perlas basado en Ficoll y de lisis celular, en donde se cargaron microperlas magnéticas en un cartucho consumible que comprendía una matriz de micropocillos antes de cargar las células individuales (es decir, un flujo de trabajo del ensayo "perlas primero"). Las posibles ventajas para este flujo de trabajo del ensayo modificado son: (a) eliminación de las etapas de desplazamiento de aire realizadas en una placa inclinada que se usó para desplazar completamente los líquidos de la celda de flujo, (b) eliminación de las etapas de desplazamiento de fluidos realizadas en una placa inclinada que se usó para desplazar completamente las burbujas de aire de la celda de flujo (permitiendo así un flujo de trabajo completamente automatizado), y (c) difusión reducida de ARN y posible comunicación cruzada entre micropocillos.
En el flujo de trabajo del ensayo existente "perlas primero", las perlas se cargan antes que las células y se lavan con desplazamiento de aire para reducir el porcentaje de dobletes de perlas en los micropocillos. La etapa de desplazamiento de aire provoca una pérdida significativa de perlas con sustratos recubiertos de SiO2 y requiere que la operación se realice en una placa inclinada. Se evaluó un flujo de trabajo modificado donde las perlas se lavaron usando 75 % de Ficoll-Paque en PBS y 0,01 % de Pluronic F68-PBS sin desplazamiento de aire. Se esperó que el uso de 75 % de Ficoll-Paque redujera eficazmente la frecuencia de dobletes de perlas debido a su mayor viscosidad (—1,73 cP en comparación con 0,90 cP de PBS, véase la FIG. 98). El posterior lavado con 0,01 % de f68-PBS ayuda a eliminar las perlas flotantes generadas durante el lavado con Ficoll. Se examinó este enfoque de lavado de perlas basado en Ficoll debido a los beneficios esperados, tales como frecuencia reducida de dobletes de perlas, pérdida reducida de perlas, riesgo reducido de generación de burbujas, y la posible facilidad de automatización proporcionada por un flujo de trabajo del ensayo sin inclinación. Además de las modificaciones anteriores al tampón de lavado de perlas, también se añadió 5 % de Ficoll PM400 al tampón de lisis para aumentar la densidad y viscosidad del tampón (FIG. 98). Se esperaba que esto ralentizara la difusión de ARN después de la lisis celular y redujera la posible comunicación cruzada entre micropocillos.
Las FIGS. 95A-B muestran el flujo de trabajo del ensayo convencional "perlas primero" (FIG. 95A) y el flujo de trabajo del ensayo modificado basado en Ficoll (FIG. 95B). Las FIGS. 96A-B muestran ejemplos de datos que ilustran la eficiencia de carga de perlas mejorada lograda usando etapas de lavado de perlas basadas en Ficoll con sustratos de micropocillos recubiertos de SiO2. Cuando se usó desplazamiento de aire, los presentes inventores observaron un alto porcentaje de pocillos vacíos y un alto porcentaje de pocillos con 2 perlas. Cuando el desplazamiento de aire se sustituyó por 75 % de Ficoll-Paque en PBS y 0,01 % de F68-PBS durante las etapas de lavado de perlas, disminuyeron los porcentajes de tanto los pocillos vacíos como los pocillos con 2 perlas. Aumentando el volumen de 75 % de Ficoll-Paque en PBS durante las etapas de lavado de perlas se espera que mejore además la eficiencia de carga de perlas, que será una diana para optimización adicional.
Las FIGS. 97A-F muestran ejemplos de datos para la eficiencia de captura de células lograda usando el flujo de trabajo del ensayo basado en Ficoll. Se mantuvo bien la viabilidad celular con la introducción de Ficoll-Paque. Disminuyó la eficiencia de captura de células dentro de los micropocillos debido a la mayor densidad de 75 % de Ficoll-Paque en PBS que llena los micropocillos. Se necesita optimización adicional para aumentar la eficiencia de captura de células del flujo de trabajo del ensayo basado en Ficoll.
La FIG. 98 resume los valores estimados de densidad y viscosidad de perlas magnéticas, células y disoluciones usadas en el flujo de trabajo del ensayo basado en Ficoll.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo que comprende:
un sustrato que comprende al menos 100 micropociNos, en donde cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 1.000 jm 3 hasta aproximadamente 786.000 |jm3, y
una pluralidad de perlas, en donde una pluralidad de los al menos 100 micropocillos contienen cada uno una perla individual, y en donde la relación entre el diámetro promedio de los micropocillos y el diámetro de las perlas varía desde aproximadamente 1,2 hasta aproximadamente 1,8; y
una celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato; y
una interfaz de punta de pipeta para cargar o retirar muestras, reactivos de ensayo, suspensiones de perlas, o residuos del dispositivo;
y una válvula que previene el flujo de fluidos dentro del dispositivo a menos que una punta de pipeta se inserte en la característica cónica de la interfaz de punta de pipeta.
2. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde una superficie de los al menos 100 micropocillos está recubierta con un recubrimiento superficial para mejorar la humectabilidad.
3. El dispositivo de una cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde
(i) el coeficiente de variación para el volumen del micropocillo es inferior a 5 %; o
(ii) cada micropocillo tiene un volumen que varía desde aproximadamente 21.000 jm 3 hasta aproximadamente 170.000 jm 3; o
(iii) la relación de aspecto entre el diámetro promedio y la profundidad para los al menos 100 micropocillos varía desde aproximadamente 0,1 hasta 2; o
(iv) la relación entre el diámetro promedio de los micropocillos y el diámetro de las perlas es aproximadamente 1,5; o
(v) las paredes laterales de los micropocillos tienen un ángulo de inclinación positiva de aproximadamente 1 a 15 grados; o
(vi) cualquier combinación de (i) a (v).
4. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el sustrato se fabrica de un material seleccionado del grupo que consiste en silicio, sílice fundida, vidrio, un polímero, un metal, un elastómero, polidimetilsiloxano, agarosa y un hidrogel, o cualquier combinación de los mismos.
5. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la celda de flujo comprende el sustrato o en donde la celda de flujo se puede desprender del sustrato.
6. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la característica cónica se conecta a una punta de pipeta para formar una conexión fluida con el puerto de entrada o puerto de salida, y opcionalmente en donde la característica cónica comprende un material distensible que forma un sellado sustancialmente a prueba de fugas con la punta de pipeta.
7. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además una junta moldeada hecha de un material distensible, en donde la junta está configurada para formar un sellado liberable con una punta de pipeta insertada en la interfaz de punta de pipeta.
8. Un sistema que comprende:
el dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y
un controlador de flujo; en donde el controlador de flujo está configurado para controlar el suministro de fluidos, y opcionalmente en donde el controlador de flujo está configurado para intercalar inyecciones de fluido en la celda de flujo con inyecciones de aire.
9. El sistema de la reivindicación 8, que comprende además fluidos en donde los fluidos comprenden muestras de células, suspensiones de perlas, reactivos de ensayo, o cualquier combinación de los mismos.
10. El sistema de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, que comprende además
(i) un mecanismo de distribución para potenciar la distribución uniforme de células y perlas a través de los al menos 100 micropocillos, en donde el mecanismo de distribución realiza una acción seleccionada del grupo que consiste en balanceo, agitación, turbulencia, flujo recirculante, agitación de baja frecuencia, y agitación de alta frecuencia, o cualquier combinación de los mismos; o
(ii) un mecanismo de lisis celular que usa un transductor piezoeléctrico de alta frecuencia para sonicar las células; o
(iii) un controlador de temperatura para mantener una temperatura especificada por el usuario, o para incrementar la temperatura entre dos o más temperaturas especificadas durante dos o más intervalos de tiempo especificados; o
(iv) un controlador de campo magnético para crear gradientes de campo magnético usados en la elución de perlas de los al menos 100 micropocillos o para transportar perlas a través del dispositivo; o
(v) un sistema de obtención de imágenes configurado para capturar y procesar imágenes de todos o una porción de los al menos 100 micropocillos, en donde el sistema de obtención de imágenes comprende además un subsistema de iluminación, un subsistema de obtención de imágenes, y un procesador; o
(vi) un mecanismo de selección, en donde se usa información derivada de imágenes procesadas para identificar un subconjunto de células que presentan una o más características especificadas, y el mecanismo de selección está configurado para o incluir o excluir el subconjunto de células del posterior análisis de datos; o
(vii) cualquier combinación de (i) a (vi).
11. Un kit que comprende el dispositivo de una cualquiera de la reivindicación 1 a 7.
12. El kit de la reivindicación 11, que comprende además
(i) reactivos para realizar una reacción de transcripción inversa; o
(ii) reactivos para realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos; o
(iii) reactivos para realizar una o más reacciones de amplificación específicas de ácidos nucleicos diana; o (iv) un tampón de lisis celular o tampón de hibridación; o
(v) cualquier combinación de (i) a (iv).
13. Un método de carga de una o más muestras de células en los micropocillos del dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo el método:
a) inyectar aire en la celda de flujo en comunicación fluida con el sustrato que comprende al menos 100 micropocillos;
b) inyectar una muestra de células en la celda de flujo; y
c) inyectar aire en la celda de flujo,
y opcionalmente inyectar un tampón o suspensión de perlas en la celda de flujo después de que el aire se inyecte en la celda de flujo.
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