WO2021065771A1 - 細胞スクリーニングデバイスおよび細胞スクリーニングキット - Google Patents

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WO2021065771A1
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fluid injection
lid
screening device
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享史 大坂
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東京応化工業株式会社
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    • B01L2300/0877—Flow chambers

Definitions

  • the present invention relates to a cell screening device and a cell screening kit for screening cells.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-178989 filed in Japan on September 30, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • the target of cell analysis has been subdivided from the cell group level to the single cell level, and cells are captured one by one in fine wells using a cell screening device.
  • a method is used in which a large number of cells are screened all at once to select cells having the desired characteristics.
  • a method for screening cells for example, cells trapped in a large number of wells are brought into contact with a solution in which a reagent such as a catcher that binds to a specific antibody is dispersed to secrete a secretion bound to the catcher.
  • a method of searching for cells and collecting them from a well is adopted.
  • Patent Document 1 shows a cell screening device previously proposed by the applicants and the like.
  • This cell screening device has a first substrate and a second substrate arranged horizontally stacked, and a large number of wells capable of accommodating one cell are formed on the surface of the first substrate, and from the bottom surface of each well. Communication holes that reach the back surface of the first substrate are formed respectively. These communication holes are so thin that cells cannot pass through.
  • On the second substrate a storage portion that receives the secretion flowing out of the well through the communication hole is formed, and the secretion and the reagent are reacted at the storage portion to identify the target cell.
  • a cell screening device such as Patent Document 1
  • a reagent introduction unit in order to supply the reagent to the storage unit.
  • a reagent introduction part that communicates with the storage part is provided at the end of the device
  • cells are captured in the well, and the cell screening device is carried with the storage part filled with a dispersion liquid or a reagent, or from a horizontal state.
  • the dispersion liquid or reagent flows in the longitudinal direction of the accumulation part (called a sloshing phenomenon), and a part of the dispersion liquid or reagent flows into the well through the through hole, lifting the cells trapped in the well and lifting the cells.
  • a sloshing phenomenon a part of the dispersion liquid or reagent flows into the well through the through hole
  • the cell screening device includes a bottom plate portion, a cell mounting portion provided on the bottom plate portion and constituting a cell mounting surface, and the cell mounting portion on the bottom plate portion.
  • a fluid injection portion provided in a partitioned manner, a plurality of wells formed on the cell mounting surface of the cell mounting portion and having a size capable of individually accommodating cells to be screened, and the bottom plate portion.
  • the end of the flow path of the flow path is closed with a lid, and the lid is provided with a fluid injection port having an opening communicating with the flow path, so that the flow is caused by the lid.
  • the movement of the fluid in the path is suppressed, and the fluid can be taken in and out of the flow path through the fluid injection port. Therefore, even when cells are trapped in the wells of the cell screening device and the cell screening device is carried or tilted with a fluid such as a dispersion in the flow path, the fluid moves excessively along the flow path. It becomes difficult to do so, and the sloshing phenomenon can be suppressed. Therefore, it is possible to suppress the problem that a part of the dispersion liquid flows into the well through the through hole and the cells trapped in the well are detached.
  • the fluid storage portion capable of storing the fluid overflowing from the opening of the fluid injection port is provided in the lid portion around the fluid injection port.
  • a partition portion is formed between the cell mounting surface and the lid portion to prevent the fluid from flowing to the cell mounting portion when the fluid is accumulated in the fluid storage portion. ..
  • the partition portion is formed between the cell mounting surface and the lid portion, it is possible to prevent the fluid from flowing to the cell mounting portion even when the fluid is accumulated in the fluid storage portion. it can.
  • the bottom plate portion has a rectangular shape having a long side and a short side, and the bottom plate portion is described on both sides in the longitudinal direction.
  • the fluid injection portion, the lid portion, and the fluid injection port are formed, and the cell mounting portion is arranged between the two lid portions.
  • a wide range of usage methods such as flowing a fluid from one of the two fluid injection ports into the flow path and discharging a surplus fluid from the other fluid injection port becomes possible.
  • the present invention is not limited to the configuration in which two fluid injection ports are provided, and if necessary, only one side may be provided, or three or more fluid injection ports may be provided.
  • the cell mounting portion is a membrane body, and the wells are arranged in a grid pattern on the upper surface of the membrane body.
  • the lower surface of the membrane body is formed with the through holes leading to the inner and lower surfaces of the wells, and a frame body that supports the periphery of the membrane body and surrounds the cell mounting surface is provided.
  • the bottom plate portion is provided with an engaging portion for fixing the frame body detachably. In this case, when the frame body is engaged with the engaging portion of the bottom plate portion, the film body having the wells at the correct position on the bottom plate portion is positioned, and the frame body can be removed from the bottom plate portion after screening.
  • the cell screening device of the aspect [5] has a peripheral wall portion that stands up from the peripheral edge of the lid portion, and the lid portion and the peripheral wall portion are formed of the peripheral wall portion. It is formed as an outer frame that can be attached and detached from the bottom plate.
  • the lid portion and the peripheral wall portion can be accurately positioned and assembled easily by simply molding the bottom plate portion and the outer frame body as separate bodies and attaching the outer frame body to the bottom plate portion.
  • the outer frame can be removed from the bottom plate after use, facilitating maintenance.
  • an upright peripheral wall portion is formed on the peripheral edge of the lid portion, and the lid portion and the peripheral wall portion can be attached to and detached from the bottom plate portion.
  • It is formed as an outer frame body, and the frame body that supports the film body is detachably fixed to the outer frame body.
  • the bottom plate portion, the outer frame body, and the frame body are molded as separate bodies, and the film body, the lid portion, and the peripheral wall portion can be accurately positioned simply by attaching the frame body and the outer frame body to the bottom plate portion. It becomes possible and the ease of assembly can be improved. Further, the frame body and the outer frame body can be removed from the bottom plate portion after use, which facilitates maintenance.
  • the cell screening device of the aspect [7] has a rectangular shape having a long side and a short side, and both sides of the bottom plate portion in the longitudinal direction.
  • the fluid injection portion, the lid portion, and the fluid injection port are formed in the two lid portions, respectively, and the cell mounting portion is arranged between the two lid portions, and stands up from the lid portion and the peripheral edge of the lid portion.
  • the peripheral wall portion and the peripheral wall portion surrounding the periphery of the cell mounting portion are formed as an outer frame body that can be attached to and detached from the bottom plate portion.
  • the bottom plate portion and the outer frame portion are molded as separate bodies, and the outer frame portion is simply attached to the bottom plate portion, so that the cell mounting portion, the lid portion, the peripheral wall portion, and the two fluid injection ports are formed. Accurate positioning is possible and ease of assembly can be improved.
  • the outer frame can be removed from the bottom plate after use and disassembled, facilitating maintenance.
  • the fluid injection port has a cylindrical shape rising from the upper surface of the lid portion.
  • the conical pointed tip of the pipette or dispenser can be applied almost airtightly to facilitate the inflow and outflow of the fluid.
  • the cell screening device of the aspect [9] approaches the fluid injection port at least a part of the ceiling surface at the end of the flow path in the lid portion.
  • a foam discharge surface that rises in an inclined surface shape or a stepped shape is formed.
  • an inclined surface or a stepped bubble discharge surface that rises toward the fluid injection port is formed on the ceiling surface on the back side of the lid, air bubbles that have entered the flow path are discharged from the fluid injection port. It is easy and troubles caused by air bubbles can be suppressed.
  • the cell screening kit of the aspect [10] is a carrier particle in which the cell screening device according to any one of the above aspects [1] to [9] and a substance having binding property to the secretion of the cell to be screened are immobilized. It is provided with a detection particle which is.
  • the detected particles react with the secretions of the cells in the wells, and screening can be performed by luminescence from the detected particles, and the cells are dispersed in the flow path. Even when the cell screening device is carried or tilted with a fluid such as a liquid in it, the fluid becomes difficult to move along the flow path, and the slosing phenomenon can be suppressed. Therefore, it is possible to suppress the problem that a part of the dispersion liquid flows into the well through the through hole and the cells and the detected particles trapped in the well are separated from the well.
  • cells are captured in the wells of the cell screening device, and the cell screening device is carried in a state where a fluid such as a dispersion liquid is put in the flow path. Even when tilted, it becomes difficult for the fluid to move along the flow path, suppressing the throttling phenomenon, and a part of the dispersion liquid flows into the well through the through hole, and the cells and detected particles trapped in the well are removed. It has an excellent effect of suppressing problems such as detachment.
  • FIG. 1 to 6 show the completed state of the cell screening device 1 according to the embodiment of the present invention
  • FIG. 7 shows the method of assembling the cell screening device 1.
  • the cell screening device 1 of this embodiment is provided on the bottom plate portion 2, the cell mounting membrane (cell mounting portion) 6 provided on the bottom plate portion 2 and constituting the cell mounting surface 4, and cells on the bottom plate portion 2.
  • the mounting membrane 6 is provided between a pair of fluid injection portions 8 provided separately from the mounting membrane 6 and the bottom plate portion 2 and the cell mounting membrane 6, and the flow path end portion 12 extends to the fluid injection portion 8. It has a flow path 10.
  • a plurality of wells 50 having a size capable of individually accommodating cells C to be screened, and a flow path from the inner bottom surface of the wells 50.
  • a through hole 52 leading to 10 is formed.
  • the through hole 52 has an inner diameter that cells C to be screened cannot pass through.
  • the bottom plate portion 2 of this example has an elongated rectangular plate shape having a constant wall thickness, and the four corners are chamfered round. A slight ridge 2B is formed on the bottom plate portion 2 along the outer peripheral edge of the bottom surface over the entire circumference.
  • the shape of the bottom plate portion 2 is not limited to the one shown in the drawing, and may be any shape such as a disk shape, an elliptical shape, or a square shape. If a horizontal flow path 10 can be formed, the wall thickness of the bottom plate portion 2 is constant. It does not have to be.
  • the bottom plate portion 2 is made of various plastics that are harmless to the target cells in terms of molding accuracy and cost, but if necessary, the bottom plate portion 2 is made of any material such as ceramic, glass, or metal. It may have been done. The surface of the bottom plate portion 2 may be coated with some kind of coating to mitigate the influence on the cells.
  • a rectangular engaging wall 18 having semicircular ends in a plan view so as to surround the central portion stands up vertically from the bottom plate portion 2. It is integrally formed in the state.
  • the engaging wall 18 is not limited to the shape shown in the figure, and may be a simple rectangular shape, a circular shape, an elliptical shape, or the like.
  • the height of the engaging wall 18 in this example is equalized over the entire circumference.
  • An outer frame body 20 is detachably attached to the engaging wall 18 so as to cover the engaging wall 18 from above over the entire circumference.
  • the outer frame body 20 has a rectangular peripheral wall portion 22 having semicircular ends at both ends in a plan view, and a pair of partition portions 28 provided parallel to each other on the inner peripheral side of the peripheral wall portion 22, and the whole is integrated. Is formed
  • the material of the outer frame 20 is not limited, and it is generally desirable that the outer frame 20 is made of various plastics that are harmless to cells in terms of molding accuracy and cost, but if necessary, ceramic, glass, metal, etc. It may be made of any material.
  • a rectangular parallelepiped space is opened between the partition 28 and the partition 28, and the cell mounting membrane 6 is arranged in the space.
  • the upper end of the peripheral wall portion 22 of the outer frame body 20 has a cross-sectional shape that is folded outward over the entire circumference, and inside the folded portion, a narrow engaging groove 24 that opens downward extends over the entire circumference. It is formed at a certain depth.
  • the outer frame body 20 can be attached to and detached from the engaging wall 18 by inserting the upper end portion of the engaging wall 18 into the engaging groove 24 over the entire circumference and elastically tightening the folded portion of the peripheral wall portion 22. It is fixed to.
  • Horizontally projecting protrusions 26 are formed at both tips in the longitudinal direction of the outer frame body 20, and by lifting these protrusions 26 with a fingertip, the engaging wall 18 is pulled out from the engaging groove 24, and the bottom plate portion 2 and the bottom plate portion 2.
  • the outer frame body 20 can be separated.
  • the semicircular region surrounded by the peripheral wall portion 22 of the outer frame body 20 and each partition portion 28 is a fluid injection portion 8, respectively.
  • a semicircular lid portion 14 is formed parallel to the bottom plate portion 2 so as to connect the lower end of the peripheral wall portion 22 and the lower end of each partition portion 28.
  • a flow path end portion 12 at both ends of the flow path 10 is formed between the lid portion 14 and the bottom plate portion 2, and the lid portion 14 airtightly closes the flow path end portion 12.
  • the lid portion 14 By forming the lid portion 14 in this way, the flow path end portions 12 at both ends of the flow path 10 are sealed, and even when the cell screening device 1 is tilted or shaken, the flow path 10 and It is prevented that the fluid flows excessively to the left and right through the flow path end portion 12.
  • the thickness of the flow path end portion 12 in the vertical direction is constant, but it may be partially changed if necessary, as in the embodiment of FIG. 10 described later.
  • a circular opening 16A is formed at substantially the center of each lid 14, and a cylindrical fluid injection port 16 corresponds to each of the openings 16A from the lid 14. It is formed upright.
  • the surface of the lid portion 14 around the fluid injection port 16 is used as a fluid storage portion, and as shown in FIG. 5, the fluid L overflowing from the fluid injection port 16 is collected.
  • a recess may be positively formed around the fluid injection port 16 on the upper surface of the lid portion 14.
  • the fluid injection port 16 is erected from the lid 14 in this embodiment, but instead the fluid injection port is a flat, non-upward opening formed in the lid 14, while the lid 14 It is also possible to form a recess such as an annular shape surrounding the opening on the surface of the surface, and use this recess as a fluid storage portion.
  • the opening 16A of the fluid injection port 16 has a diameter that is familiar to the tips of instruments such as pipettes, micropipettes, and dispensers for injecting fluid (reagents and dispersions) from the fluid injection port 16 and has a sharp instrument.
  • the tip can be airtightly brought into contact with the opening 16A of the fluid injection port 16.
  • the shape of the fluid injection port 16 is not limited to a cylindrical shape, and may be a square cylinder or a polygonal cylinder, if necessary, an annular shape in which the circumference of the opening 16A is slightly raised, or the above-mentioned one. It may be just an opening.
  • the fluid injection port 16 may be an inverted conical opening formed by being recessed in the surface of the lid portion 14.
  • a step 34 having a constant height from the lower surface is formed over the entire length of the partition 28, and above the step 34, the upper end of the partition 28 is formed.
  • Each of the two ribs 30 reaching the above is formed so as to extend in the vertical direction.
  • the rib 30 enhances the bending strength of the partition portion 28.
  • the partition portion 28 is formed with an engaging groove 32 having a constant depth that opens on the lower surface of the step portion 34 and an engaging ridge 42 adjacent to the cell mounting membrane 6 side of the engaging groove 32. ing.
  • the engaging grooves 32 having a constant depth that open on the lower surface of the peripheral wall portion 22 and the cells of the engaging grooves 32 are also provided at two locations extending linearly on the peripheral wall portion 22 of the outer frame body 20.
  • Engaging ridges 42 adjacent to the mounting film 6 side are formed respectively. These two linearly extending engaging grooves 32 and engaging ridges 42 are connected to the engaging grooves 32 and the engaging ridges 42 of the partition portion 28, respectively, and form a rectangular shape when viewed in a plan view.
  • a square tubular frame 36 having a rectangular shape in a plan view is detachably housed in a square space surrounded by two linearly extending peripheral wall portions 22 and two partition portions 28.
  • a cell mounting membrane 6 is stretched over the entire surface of the lower end of the frame 36 with the wells 50 facing upward, and the lower end of the frame 36 and the cell mounting membrane 6 are all around. It is joined without any gaps.
  • the frame body 36 is made of a flexible plastic or the like, and when a force to spread it outward is applied, the walls on all four sides expand outward slightly, tension is applied to the cell mounting membrane 6, and the cell mounting film 6 is placed. The slackening of the film 6 can be prevented.
  • the thickness of the cell mounting membrane 6 is not limited, but is a viewpoint of forming a well 50 into which target cells enter one by one and forming a fine through hole 52 through which a fluid flows from the bottom of the well 50 to the back surface side. Therefore, it is preferably about 5 to 100 ⁇ m, more preferably about 10 to 50 ⁇ m.
  • the cell mounting membrane 6 may be a multilayer membrane having two or more layers. In that case, a through hole to be a well 50 is formed in the upper layer, a through hole to be a through hole 52 is formed in the lower layer, and these two layers are bonded together to form a well 50 and a through hole 52. You may.
  • the material of the cell mounting membrane 6 is not limited, and it is generally desirable to be formed of various plastics that are harmless to cells in terms of molding accuracy and cost, but if necessary, ceramic, polycrystalline or It may be made of any material such as single crystal silicon, an inorganic compound such as glass, and a metal.
  • the well 50 and the through hole 52 can also be formed by etching or photolithography.
  • the planar shape of the well 50 is preferably hexagonal or circular as shown in FIG. 8 from the viewpoint of increasing the arrangement density according to the average shape of cells C to be captured. It may be a quadrangle such as a square, another polygon, an ellipse, or the like.
  • the size of the well 50 should be selected according to the size of the cell C to be captured and is not limited, but one cell C can be contained in one well 50, but it is difficult for two or more cells C to enter. Generally, the maximum diameter of the circle entering the well opening is about 1 to 100 ⁇ m, and the depth is about 1 to 100 ⁇ m.
  • a plurality of types of frame bodies 36 having cell mounting membranes 6 having different sizes of wells 50 may be prepared and combined with a common bottom plate portion 2 and outer frame body 20 to form a cell screening kit.
  • the maximum diameter of the circle that enters the well 50 in a plan view is often about 0.5 to 2 times the maximum diameter of the cell C to be collected. , More preferably 0.8 to 1.9 times.
  • the depth of the well 50 is preferably about 0.5 to 4 times the maximum diameter of the cells C to be collected, and more preferably 0.8 to 1.9 times. It is convenient that the shortest distance between the adjacent wells 50 and the wells 50 is about 1 to 10 ⁇ m because the density of the wells 50 can be increased, but the range is not limited.
  • Two through holes 52 in this example are formed in the center of the bottom surface of each well 50. It is convenient that a plurality of the wells are formed in this way because clogging is unlikely to occur, but the present invention is not limited to this, and one or three or more may be formed in the center, or the well 50 may be formed. A plurality of through holes 52 may be formed at random or at lattice point positions on the bottom surface.
  • the inner diameter of the through hole 52 is not limited, but the minimum inner diameter is preferably in the range of about 10 nm to 20 ⁇ m so that the cells C do not pass through, and is 0.5 times the average diameter of the cells C to be captured in the well 50. The following is preferable.
  • an engaging groove 44 that opens upward and an engaging ridge 40 that protrudes downward are formed on the outer peripheral surface of the lower end portion of the frame body 36 by forming the shape so as to be folded upward. It is formed over the entire circumference.
  • the depth of the engaging groove 44 and the vertical width of the engaging ridge 40 are substantially constant over the entire circumference of the frame body 36.
  • the engaging ridge 40 is inserted into the engaging groove 32 formed on the lower surface of the outer frame body 20, and the engaging ridge 42 of the outer frame body 20 is inserted into the engaging groove 44 of the frame body 36.
  • the lower end surface of the frame body 36 abuts on the upper surface of the spacer 46 formed on the bottom plate portion 2, and the thickness of the spacer 46 causes the separation amount of the cell mounting membrane 6 from the bottom plate portion 2, that is, the flow.
  • the thickness of the road 10 is accurately defined.
  • a pair of plan-viewing U-shaped spacers 46 are formed inside the engaging wall 18 along the lower end shape of the frame body 36, and the spacers 46 are connected to each other. A notch 47 is formed between them. In a state where the frame body 36 is fixed on the bottom plate portion 2, fluid flows from the flow path 10 to each flow path end portion 12 through these notches 47.
  • the spacer 46 does not have to have a shape as shown in the drawing, and may come into contact with the lower surface of the frame body 36 at several points. In some cases, the height of the frame body 36 from the bottom plate portion 2 may be accurately defined by engaging with the outer frame body 20 without forming the spacer 46.
  • An inclined surface 38 having a constant width is formed on the inner peripheral surface of the lower end portion of the frame body 36, and the inclined surface 38 protrudes toward the cell mounting membrane 6 as it goes downward. Due to the formation of such an inclined surface 38, as shown in FIG. 4, when the target cells are sucked up from the wells 50 of the cell mounting membrane 6 by an instrument P such as a pipette, a micropipette, or a dispenser, the target cells are sucked up. Even if the well 50 in which the cells are collected is located just before the inner peripheral edge of the frame body 36, the cells can be easily sucked out by the instrument P. Further, the inclined surface 38 also has an effect of increasing the adhesion area of the cell mounting membrane 6 to the frame body 36 and increasing the bonding strength of the cell mounting membrane 6, and is also useful for increasing the strength of the frame body 36. There is.
  • the bottom plate portion 2, the frame body 36, and the outer frame body 20 are separately formed as shown in FIG. 7, and the frame body 36 is first formed into the outer frame body 20. Then, by fitting the outer frame body 20 into the engaging wall 18 of the bottom plate portion 2, the completed state as shown in FIGS. 1 to 6 is obtained.
  • the engaging ridges 42 of the outer frame body 20 are fitted into the engaging grooves 44 of the frame body 36, and By fitting the engaging ridge 40 of the frame body 36 into the engaging groove 32 of the outer frame body 20, both are firmly fixed by the elasticity of each engaging portion.
  • the inner peripheral surface of the engaging ridge 40 and the outer peripheral surface of the engaging ridge 42 are shaped to be slightly inclined outward as at least one of them goes upward.
  • the cell screening kit using the present embodiment includes a cell screening device 1 and beads (detection particles) B which are carrier particles in which a substance having binding property to the secretion of cells to be screened is immobilized.
  • beads (detection particles) B which are carrier particles in which a substance having binding property to the secretion of cells to be screened is immobilized.
  • one or more cell screening devices 1 and a large number of fine beads B, which are detection particles are encapsulated in an outer container such as a box in a powder state or suspended in a dispersion. It is a product that houses an inner container.
  • the type of bound particles is not limited, but for example, carrier particles composed of beads (magnetic beads, resin beads, etc.), hydrogel particles (sodium alginate gel, agarose gel, etc.), metal particles (gold nanoparticles, etc.), and carrier particles. It may be a catcher that can bind to an antibody that is attached to and secreted from a target antibody-producing cell.
  • the particle size of the bound particles is not limited, but in general, the maximum diameter of the particles is preferably 100 nm to 50 ⁇ m, and more preferably about 500 nm to 30 ⁇ m.
  • the cells and the beads B which are the detection particles, are dispersed in a dispersion liquid to fill the cell mounting membrane 6, and the cell screening device 1 is shaken or the through hole 52 is sent to the flow path 10.
  • Cell C is put into the well 50 one by one by draining or the like, a large number of beads B are put into the well 50 together with each cell C, and excess dispersion liquid is drained to the flow path 10 through the through hole 52. If the antibody in the secretion of cell C is reacted with the catcher of beads B in this state, only the reacted beads B can be visualized with a fluorescently labeled antibody to find the target cell.
  • the flow path ends 12 located at both ends of the flow path 10 are closed by the lid portions 14, and the lid portions 14 have openings 16A communicating with the flow path 10.
  • the lid portion 14 suppresses the movement of the fluid in the flow path end portion 12 and the flow path 10, and the fluid can be taken in and out of the flow path 10 through the fluid injection port 16. is there. Therefore, even when the cell C is captured in the well 50 of the cell screening device 1 and the cell screening device 1 is carried or tilted with a fluid such as a dispersion liquid in the flow path 10, the flow path 10 and the flow flow are also performed. It becomes difficult for the fluid to move along the roadside portion 12, and the sloshing phenomenon can be suppressed. Therefore, it is possible to suppress the problem that a part of the dispersion liquid flows into the well 50 through the through hole 52 and the cells C and the beads B captured in the well 50 are separated.
  • the fluid storage portion (upper surface of the lid portion 14) receives the fluid, and the flow path 10 is again transmitted from the fluid injection port 16. It is possible to suppress the entry into the inside, and for example, the risk of contamination from the outside can be reduced. Further, since the partition portion 28 is formed between the cell mounting surface 4 and the lid portion 14, it is possible to prevent the fluid from flowing to the cell mounting portion 6 even when the fluid is accumulated in the fluid storage portion 14. it can.
  • the fluid flows into the flow path 10 from one fluid injection port 16 and the surplus portion from the other fluid injection port 16. It can be used in a wide range of ways, such as discharging the fluid from.
  • the cell mounting membrane 6 is positioned at the correct position on the bottom plate portion 2 by bringing the lower end of the frame body 36 into contact with the spacer 46 of the bottom plate portion 2, so that the well 50 and the flow path are formed.
  • the flow of the fluid to and from 10 becomes as desired, and highly accurate screening becomes possible.
  • the bottom plate portion 2 and the outer frame body 20 are molded as separate bodies, and the lid portion 14 and the peripheral wall portion 22 are accurately attached to the bottom plate portion 2 simply by attaching the outer frame body 20 to the bottom plate portion 2. Since it can be arranged at any position, the cell screening device 1 can be easily assembled. The outer frame body 20 can be removed from the bottom plate portion 2 after use, and maintenance is easy.
  • the cell mounting membrane 6 is simply formed by molding the bottom plate portion 2, the outer frame body 20 and the frame body 36 as separate bodies, and attaching the frame body 36 and the outer frame body 20 to the bottom plate portion 2. ,
  • the lid portion 14 and the peripheral wall portion 22 can be accurately positioned, and the ease of assembly can be improved.
  • the frame body 36 and the outer frame body 20 can be removed from the bottom plate portion 2 after use, and maintenance is easy.
  • the bottom plate portion 2 and the outer frame body 20 are molded as separate bodies, and the outer frame body 20 is attached to the bottom plate portion 2, and the cell mounting portion 6, the lid portion 14, and the peripheral wall portion are simply attached. It is easy to assemble because it allows accurate positioning of 22 and the two fluid injection ports 16.
  • the fluid injection port 16 since the fluid injection port 16 has a cylindrical shape, it is easy to put in and take out the fluid by airtightly applying a conical pointed tip such as a pipette or a dispenser to the opening 16A.
  • the cell screening kit of this embodiment in a state where cells C are taken into individual wells 50, detection particles B and cell secretions are reacted in the wells 50, and screening can be performed by light emission from the detection particles B or the like. Further, even when the cell screening device 1 is carried or tilted with a fluid such as a dispersion liquid contained in the flow path 10, the fluid becomes difficult to move along the flow path 10, and a part of the dispersion liquid becomes difficult to move. It is possible to suppress the problem that the cells C and the detection particles B that have flowed into the well 50 through the through hole 52 and have been captured in the well 50 are separated from the well 50.
  • the fluid injection ports 16 are provided at both ends of the cell screening device 1, but as shown in FIG. 9, the fluid injection ports 16 are provided only on the lid 14 on one side of the cell screening device 1.
  • the configuration to be formed is also possible. In this case, fluid can be taken in and out from only one fluid injection port 16.
  • the lid portion 14 was flat, but as shown in FIG. 10, in the lid portion 14, at least a part of the ceiling surface of the flow path end portion 12 is connected to the fluid injection port 16. It is also possible to form a foam discharge surface 54 that rises in an inclined or stepped manner as it approaches. In this case, since the ceiling surface on the back side of the lid portion 14 rises toward the fluid injection port, the air bubbles G that have entered the flow path end portion 12 rise along the inclined surface 54 and are discharged from the fluid injection port 16. It becomes easy, and troubles such as the through hole 52 being blocked by the bubble G can be suppressed.
  • the present invention when cells are trapped in the wells of the cell screening device and the cell screening device is carried or tilted with a fluid such as a dispersion liquid in the flow path.
  • a fluid such as a dispersion liquid in the flow path.

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Abstract

この細胞スクリーニングデバイス（１）は、底板部（２）と、底板部（２）上に設けられ、細胞載置面（４）を構成する細胞載置膜（６）と、底板部（２）上に細胞載置膜（６）とは区画して設けられた一対の流体注入部（８）と、底板部（２）と細胞載置膜（６）との間に設けられ、流体注入部（８）まで流路端部（１２）が延びている流路（１０）とを有する。細胞載置膜（６）の細胞載置面（４）には、スクリーニングすべき細胞（Ｃ）を個別に収容可能なサイズを有する複数のウェルと、ウェルの内底面から流路（１０）に通じる貫通孔が形成されている。

Description

細胞スクリーニングデバイスおよび細胞スクリーニングキット
　本発明は、細胞をスクリーニングするための細胞スクリーニングデバイスおよび細胞スクリーニングキットに関する。本願は、２０１９年９月３０日に日本に出願された特願２０１９－１７８９８９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、特に創薬分野において、細胞解析のターゲッ卜が細胞群レベルから単一細胞レベルへと細分化され、細胞スクリーニングデバイスを用いて、微細なウェル内に細胞を1つ1つ捕捉したうえ、多数の細胞に一斉にスクリーニングテストを行い、目的の特性を有する細胞を選別する手法が使用されている。細胞をスクリーニングする方法としては、例えば、多数のウェル内に捕捉されている細胞を、特定の抗体と結合するキャッチャーなどの試薬を分散させた液と接触させ、キャッチャーと結合した分泌物を分泌した細胞を探し出し、ウェルから回収する方法などが採用されている。
　特許文献１は、本出願人等が先に提案した細胞スクリーニングデバイスを示す。この細胞スクリーニングデバイスは、水平に積層して配置された第１基板および第２基板を有し、第１基板の表面には細胞一つずつを収容できるウェルが多数形成され、各ウェルの底面から第１基板の裏面に達する連通孔がそれぞれ形成されている。これらの連通孔は、細胞が通り抜けられないほどに細い。第２基板には、前記連通孔を通じてウェルから流れ出した分泌物を受け止める蓄積部が形成され、蓄積部で分泌物と試薬とを反応させ、ターゲット細胞を特定する。
国際公開第ＷＯ２０１７／０５７２３４Ａ１号パンフレット
　特許文献１のような細胞スクリーニングデバイスにおいては、蓄積部へ試薬を供給するために試薬導入部を設ける必要がある。例えばデバイスの端部に蓄積部へ連通する試薬導入部を設けた場合には、ウェルに細胞を捕捉し、蓄積部に分散液や試薬を満たした状態で細胞スクリーニングデバイスを持ち運んだり、水平状態から傾けたりすると、蓄積部の長手方向に分散液や試薬が流れ（スロッシング現象と称する）、分散液や試薬の一部が貫通孔を通じてウェルに流れ込み、ウェルに捕捉されていた細胞を持ち上げて、細胞がウェルから脱離してしまうおそれがあった。
　本発明の態様［１］に係る細胞スクリーニングデバイスは、底板部と、前記底板部上に設けられ、細胞載置面を構成する細胞載置部と、前記底板部上に、前記細胞載置部とは区画して設けられた流体注入部と、前記細胞載置部の前記細胞載置面に形成され、スクリーニングすべき細胞を個別に収容可能なサイズを有する複数のウェルと、前記底板部と前記細胞載置部との間に設けられ、前記流体注入部まで流路端部が延びている流路と、前記ウェルの内底面から前記流路に通じ、前記スクリーニングすべき細胞が通過できない内径を有する貫通孔と、前記流体注入部に設けられ、前記流路端部を塞ぐ蓋部と、前記蓋部に設けられ前記流路に連通する開口部を有する流体注入ポートとを有する。
　このような細胞スクリーニングデバイスによれば、流路の流路端部を蓋部で塞ぎ、この蓋部に流路に連通した開口部を有する流体注入ポートを設けたことにより、前記蓋部により流路内の流体の移動が抑制されるとともに、前記流体注入ポートを通じて流体を流路へ出し入れすることが可能である。したがって、細胞スクリーニングデバイスのウェルに細胞を捕捉し、流路に分散液などの流体を入れた状態で細胞スクリーニングデバイスを持ち運んだり、傾けたりした場合にも、流路に沿って流体が過剰に移動しにくくなり、スロッシング現象を抑えることができる。よって、分散液の一部が貫通孔を通じてウェルに流れ込み、ウェルに捕捉されていた細胞を離脱させるといった問題を抑制できる。
　態様［２］の細胞スクリーニングデバイスは、前記態様［１］において、前記流体注入ポートの周囲の前記蓋部に、前記流体注入ポートの前記開口部から溢れ出た流体を貯留しえる流体貯留部が形成され、前記細胞載置面と、前記蓋部との間には、前記流体貯留部に流体が溜まった場合に前記流体が前記細胞載置部へ流れることを防ぐ仕切り部が設けられている。この場合、前記流体注入ポートの前記開口部から流体が溢れ出た場合にも、流体貯留部が流体を受け止め、再度、流体注入ポートから流路内へ入ることが抑制でき、例えばコンタミネーションなどのおそれを低減できる。また、前記細胞載置面と、前記蓋部との間に仕切り部が形成されているから、前記流体貯留部に流体が溜まった場合にも前記流体が前記細胞載置部へ流れることを抑制できる。
　態様［３］の細胞スクリーニングデバイスは、前記態様［１］または［２］において、前記底板部は、長辺と短辺とを有する矩形状をなし、前記底板部の長手方向の両側にそれぞれ前記流体注入部、前記蓋部、および前記流体注入ポートが形成され、前記二つの蓋部の間に、前記細胞載置部が配置されている。この場合、２つの流体注入ポートの一方から流体を流路へ流し込みながら、他方の流体注入ポートから余剰分の流体を排出させるなど幅広い利用方法が可能となる。ただし、本発明は２つの流体注入ポートを設ける構成に限定されず、必要であれば片側だけでもよいし、３つ以上の流体注入ポートを設けることも可能である。
　態様［４］の細胞スクリーニングデバイスは、前記態様［１］～［３］のいずれかにおいて、前記細胞載置部は膜体であり、前記膜体の上面には前記ウェルが複数格子状に並んで形成され、前記膜体の下面には前記ウェルのそれぞれの内底面に通じる前記貫通孔が形成され、前記膜体の周囲を支持するとともに前記細胞載置面を囲む枠体が設けられ、前記底板部には、前記枠体を着脱可能に固定するための係合部が設けられている。この場合、底板部の係合部に枠体を係合させると、底板部上の正しい位置にウェルを有する膜体が位置決めされ、スクリーニング後に枠体を底板部から取り外すことも可能となる。
　態様［５］の細胞スクリーニングデバイスは、前記態様［１］～［４］のいずれかにおいて、前記蓋部の周縁から起立した周壁部が形成されており、前記蓋部と前記周壁部は、前記底板部から着脱可能な外枠体として形成されている。この場合、底板部と外枠体を別体として成形しておき、底板部に外枠体を取り付けるだけで、蓋部と周壁部の正確な位置決めが可能となり、組み立てが容易である。また、使用後に底板部から外枠体を取り外すこともでき、メンテナンスが容易になる。
　態様［６］の細胞スクリーニングデバイスは、前記態様［４］において、前記蓋部の周縁には起立した周壁部が形成されており、前記蓋部と前記周壁部は、前記底板部から着脱可能な外枠体として形成され、前記外枠体に、前記膜体を支持する前記枠体が着脱可能に固定されている。この場合、底板部と外枠体と枠体をそれぞれ別体として成形しておき、底板部に枠体と外枠体とを取り付けるだけで、膜体、蓋部、周壁部の正確な位置決めが可能となり、組み立てしやすさが向上できる。また、使用後に底板部から枠体と外枠体とを取り外すこともでき、メンテナンスが容易になる。
　態様［７］の細胞スクリーニングデバイスは、前記態様［１］～［５］のいずれかにおいて、前記底板部は、長辺と短辺とを有する矩形状をなし、前記底板部の長手方向の両側にそれぞれ、前記流体注入部、前記蓋部、および前記流体注入ポートが形成され、前記二つの蓋部の間に、前記細胞載置部が配置され、前記蓋部、前記蓋部の周縁から起立した周壁部、および前記細胞載置部の周囲を囲む周壁部が、前記底板部から着脱可能な外枠体として形成されている。この場合、底板部と外枠体とをそれぞれ別体として成形しておき、底板部に外枠体とを取り付けるだけで、細胞載置部、蓋部、周壁部、および二つの流体注入ポートの正確な位置決めが可能となり、組み立てやすさが向上できる。また、使用後に底板部から外枠体を取り外して分解することもでき、メンテナンスが容易になる。
　態様［８］の細胞スクリーニングデバイスは、前記態様［１］～［７］のいずれかにおいて、前記流体注入ポートが、前記蓋部の上面から起立した円筒状をなしている。この場合、流体注入ポートが円筒状をなしているので、ピペットやディスペンサーの円錐状に尖った先端をほぼ気密的に当てて流体の出し入れが容易である。
　態様［９］の細胞スクリーニングデバイスは、前記態様［１］～［８］のいずれかにおいて、前記蓋部において、前記流路端部の天井面の少なくとも一部には、前記流体注入ポートへ近づくにつれ傾斜面状または階段状に上昇する泡排出面が形成されている。この場合、蓋部の裏側の天井面に、流体注入ポートに向けて上昇する傾斜面または階段状の泡排出面が形成されているから、流路内に入り込んだ気泡を流体注入ポートから排出させやすく、気泡によるトラブルを抑制できる。
　態様［１０］の細胞スクリーニングキットは、前記態様［１］～［９］のいずれかに記載の細胞スクリーニングデバイスと、スクリーニングすべき細胞の分泌物に結合性を有する物質が固定化された担体粒子である検出粒子とを備える。この細胞スクリーニングキットによれば、個々のウェルに細胞を取り込んだ状態で、ウェル内で検出粒子と細胞の分泌物とを反応させ、検出粒子からの発光等によってスクリーニングが行えるうえ、流路に分散液などの流体を入れた状態で細胞スクリーニングデバイスを持ち運んだり、傾けたりした場合にも、流路に沿って流体が移動しにくくなり、スロッシング現象を抑えることができる。よって、分散液の一部が貫通孔を通じてウェルに流れ込み、ウェルに捕捉されていた細胞や検出粒子をウェルから離脱させるといった問題を抑制できる。
　以上説明したように、本発明の細胞スクリーニングデバイスまたは細胞スクリーニングキットによれば、細胞スクリーニングデバイスのウェルに細胞を捕捉し、流路に分散液などの流体を入れた状態で細胞スクリーニングデバイスを持ち運んだり、傾けたりした場合にも、流路に沿って流体が移動しにくくなり、スロッシング現象を抑えて、分散液の一部が貫通孔を通じてウェルに流れ込み、ウェルに捕捉されていた細胞や検出粒子を離脱させるなどの問題を抑制できるという優れた効果を奏する。
本発明の一実施形態の細胞スクリーニングデバイスを示す平面図である。 同実施形態の正面図である。 同実施形態の正断面を示す斜視図である。 同実施形態の中央部の正断面図である。 同実施形態の端部の正断面図である。 同実施形態の側断面図である。 同実施形態の組立方法を示す斜視図である。 同実施形態の細胞載置膜（細胞載置部）とウェルを示す拡大斜視図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞スクリーニングデバイスの正断面を示す斜視図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞スクリーニングデバイスの端部の正断面図である。
　図１～図６は、いずれも本発明の一実施形態に係る細胞スクリーニングデバイス１の完成状態を示し、図７はその細胞スクリーニングデバイス１の組み立て方法を示す。この実施形態の細胞スクリーニングデバイス１は、底板部２と、底板部２上に設けられ、細胞載置面４を構成する細胞載置膜（細胞載置部）６と、底板部２上に細胞載置膜６とは区画して設けられた一対の流体注入部８と、底板部２と細胞載置膜６との間に設けられ、流体注入部８まで流路端部１２が延びている流路１０とを有している。細胞載置膜６の細胞載置面４には、例えば図８に示すように、スクリーニングすべき細胞Ｃを個別に収容可能なサイズを有する複数のウェル５０と、ウェル５０の内底面から流路１０に通じる貫通孔５２が形成されている。貫通孔５２は、スクリーニングすべき細胞Ｃが通過できない内径を有する。
　以下、細胞スクリーニングデバイス１の構造について詳細に説明する。この例の底板部２は、肉厚が一定の細長い矩形板状をなし、四隅は丸く面取りされている。底板部２には底面の外周縁に沿って僅かな突条２Ｂが全周に亘って形成されている。底板部２の形状は図示のものに限定されず、円板状や楕円形状、正方形状などいかなる形状であってもよいし、水平な流路１０を形成できれば、底板部２の肉厚は一定でなくてもよい。底板部２は、一般的には、ターゲット細胞に無害な各種のプラスチックで形成されることが成型精度やコストの上で望ましいが、必要に応じては、セラミック、ガラス、金属などいかなる材質で形成されていてもよい。底板部２の表面に細胞に対する影響を和らげるための何らかのコーティングが施されていてもよい。
　図３に示すように、底板部２の上面には、中央部を囲むように、平面視して両端が半円形とされた長方形をなす係合壁１８が、底板部２から垂直に起立した状態で一体的に形成されている。係合壁１８は図示の形状に限定されず、単純な長方形状や円形、楕円形などであってもよい。この例の係合壁１８の高さは全周に亘って等しくされている。係合壁１８には、係合壁１８を全周に亘って上から覆うように、外枠体２０が着脱可能に取り付けられている。
　外枠体２０は、平面視して両端が半円形をなす長方形の周壁部２２と、周壁部２２の内周側に一対、互いに平行に設けられた仕切り部２８とを有し、全体が一体的に形成されている。外枠体２０の材質は限定されず、一般的には細胞に無害な各種のプラスチックで形成されることが成型精度やコストの上で望ましいが、必要に応じては、セラミック、ガラス、金属などいかなる材質で形成されていてもよい。仕切り部２８と仕切り部２８の間には、直方体状の空間が開けられており、この中に細胞載置膜６が配置されている。
　外枠体２０の周壁部２２の上端は、全周に亘って外側へ折り返した断面形状をなし、この折り返し部分の内側に、下に向けて開く幅の細い係合溝２４が全周に亘って一定の深さで形成されている。この係合溝２４に、係合壁１８の上端部が全周に亘って挿入され、周壁部２２の折り返し部分で弾性的に締め付けられることにより、外枠体２０が係合壁１８に着脱可能に固定されている。外枠体２０の長手方向の両先端には、水平に突き出す突起２６がそれぞれ形成され、これら突起２６を指先で持ち上げることにより、係合溝２４から係合壁１８が抜けて、底板部２と外枠体２０が分離できるようになっている。
　外枠体２０の周壁部２２と、各仕切り部２８とで囲まれる半円形の領域は、それぞれ流体注入部８とされている。これら流体注入部８において、周壁部２２の下端と各仕切り部２８の下端をつなぐように、半円形状をなす蓋部１４が底板部２と平行に形成されている。蓋部１４と底板部２との間には、流路１０の両端となる流路端部１２が形成され、蓋部１４が流路端部１２を気密的に塞ぐ構造となっている。このように蓋部１４が形成されていることにより、流路１０の両端である流路端部１２が封止され、細胞スクリーニングデバイス１が傾いたり揺すられたりした場合にも、流路１０および流路端部１２を通じて流体が左右に過剰に流動することが防止されている。この例では、流路端部１２の上下方向の厚さが一定であるが、後述する図１０の実施形態のように、必要に応じては部分的に変更してもよい。
　この実施形態では、各蓋部１４のほぼ中央に、それぞれ一ケ所ずつ円形の開口部１６Ａが形成され、これら開口部１６Ａに対応して、円筒形状をなす流体注入ポート１６がそれぞれ蓋部１４から直立して形成されている。流体注入ポート１６の回りの蓋部１４の表面が流体貯留部とされ、図５に示すように、流体注入ポート１６から溢れた流体Ｌが溜まるようになっている。流体貯留部として、蓋部１４の上面の流体注入ポート１６の周囲に、積極的に凹部を形成してもよい。
　流体注入ポート１６は、この実施形態では蓋部１４から起立させているが、その代わりに、流体注入ポートを蓋部１４に形成された平坦で上方へ突出しない開口部とする一方、蓋部１４の表面に、この開口部を囲む円環状などの凹部を形成して、この凹部を流体貯留部とすることも可能である。
　流体注入ポート１６の開口部１６Ａは流体注入ポート１６から流体（試薬や分散液）を注入するためのピペット、マイクロピペット、ディスペンサーなどの器具の先端と馴染みがよい口径に形成され、器具の尖った先端を流体注入ポート１６の開口部１６Ａに気密的に当接させることができる。流体注入ポート１６の形状は円筒形に限らず、必要に応じては角筒状や多角形筒状であってもよいし、開口部１６Ａの周囲を僅かに盛り上げただけの環状、あるいは前述のように単なる開口部であってもよい。流体注入ポート１６を蓋部１４の表面に凹んで形成された逆円錐状の開口部としてもよい。
　仕切り部２８の流体注入部８側の下端には、下面から一定高さを有する段部３４が仕切り部２８の全長に亘って形成され、この段部３４の上方には、仕切り部２８の上端に達する二本のリブ３０がそれぞれ上下方向に延びて形成されている。リブ３０により仕切り部２８の撓み強度が高められている。また、仕切り部２８には、段部３４の下面に開口する一定深さの係合溝３２と、この係合溝３２の細胞載置膜６側に隣接する係合突条４２がそれぞれ形成されている。
　外枠体２０の周壁部２２の直線状に延びる２箇所にも、図６に示すように、周壁部２２の下面に開口する一定深さの係合溝３２と、この係合溝３２の細胞載置膜６側に隣接する係合突条４２がそれぞれ形成されている。これら直線状に延びる２箇所の係合溝３２と係合突条４２は、仕切り部２８の係合溝３２と係合突条４２とにそれぞれ連なって、平面視すると矩形状をなしている。
　周壁部２２の直線状に延びる２箇所と、二つの仕切り部２８とで囲まれる四角い空間には、平面視して矩形状をなす角筒状の枠体３６が着脱可能に収容されている。枠体３６の下端には、細胞載置膜６が図８に示すようにウェル５０を上向きにして全面に亘って張られており、枠体３６の下端と細胞載置膜６は全周に亘って隙間無く接合されている。枠体３６は可撓性のあるプラスチック等で形成されており、外方へ広げる力がかかると僅かに四方の壁が外方へ広がり、細胞載置膜６に張力が印加され、細胞載置膜６の弛みを防止できるようになっている。
　細胞載置膜６の厚さは限定されないが、ターゲットとなる細胞が一つずつ入るウェル５０を形成し、かつ、ウェル５０の底から裏面側へ流体を流す微細な貫通孔５２を形成する観点から、５～１００μｍ程度であることが好ましく、より好ましくは、１０～５０μｍ程度とされる。細胞載置膜６は２層以上の多層膜であってもよい。その場合、上側の層にウェル５０になる貫通孔を形成し、下側の層には貫通孔５２となる貫通孔を開け、これら二つの層を貼り合わせて、ウェル５０と貫通孔５２を形成してもよい。
　細胞載置膜６の材質は限定されず、一般的には細胞に無害な各種のプラスチックで形成されることが成型精度やコストの上で望ましいが、必要に応じては、セラミック、多結晶または単結晶シリコン、ガラスなど無機化合物、金属などいかなる材質で形成されていてもよい。ウェル５０および貫通孔５２は、エッチング加工や、フォトリソグラフィーなどで形成することも可能である。
　ウェル５０の平面形状は、捕獲すべき細胞Ｃの平均的形状に合わせて、配置密度を高める観点から図８に示すように六角形、あるいは円形であることが好ましいが、必要に応じては、正方形などの四角形や、他の多角形、楕円形などであってもよい。ウェル５０の大きさは捕捉すべき細胞Ｃの大きさによって選択すべきであり限定はされないが、一つのウェル５０内に一つずつ細胞Ｃが入るが、２つ以上の細胞Ｃは入りにくいように、一般的にはウェル開口部に入る円の最大径が１～１００μｍ程度、深さが１～１００μｍ程度とされるとよい。ウェル５０の大きさが異なる細胞載置膜６を有する枠体３６を複数種用意しておき、共通の底板部２および外枠体２０に組み合わせて、細胞スクリーニングキットを構成してもよい。
　細胞Ｃの大きさの関係では、ウェル５０を平面視してその中に入る円の最大径は、補集すべき細胞Ｃの最大径の０．５～２倍程度の大きさであるとよく、より好ましくは０．８～１．９倍である。ウェル５０の深さは、補集すべき細胞Ｃの最大径の０．５～４倍程度の大きさであるとよく、より好ましくは０．８～１．９倍である。隣接するウェル５０とウェル５０の間の最短距離は、１～１０μｍ程度であるとウェル５０の密度を高められるので都合が良いが、この範囲に限定はされない。
　この例の貫通孔５２は各ウェル５０の底面の中央に二つずつ形成されている。このように複数形成されていると目詰まりしにくいので好都合であるが、本発明はこれには限定されず、中央に１個ずつまたは３個以上ずつ形成されていてもよいし、ウェル５０の底面にランダムまたは格子点位置に複数の貫通孔５２が形成されていてもよい。貫通孔５２の内径は限定されないが、細胞Ｃが通過しないように、最小内径が１０ｎｍ～２０μｍ程度の範囲であることが好ましく、ウェル５０内に捕獲すべき細胞Ｃの平均径の０．５倍以下が好ましい。
　枠体３６の下端部の外周面には、図４および図６に示すように、上向きに折り返した形状とすることにより、上へ開く係合溝４４と、下へ突き出す係合突条４０が全周に亘って形成されている。係合溝４４の深さおよび係合突条４０の上下幅は、枠体３６の全周に亘ってほぼ一定である。係合突条４０は、外枠体２０の下面に形成された係合溝３２に挿入され、外枠体２０の係合突条４２は、枠体３６の係合溝４４に挿入される。これらの嵌合により、外枠体２０の中央空間内に枠体３６が収容された状態で、枠体３６が外枠体２０に固定される。
　この時、枠体３６の下端面は、底板部２に形成されたスペーサ４６の上面に当接して、スペーサ４６の厚みにより、底板部２からの細胞載置膜６の離間量、すなわち、流路１０の厚さが正確に規定される。この実施形態では、図７に示すように、係合壁１８の内側に一対の平面視してコ字状をなすスペーサ４６が、枠体３６の下端形状に沿って形成され、スペーサ４６同士の間には、切欠４７が形成されている。枠体３６を底板部２上に固定した状態では、これら切欠４７を通じて流路１０から各流路端部１２へ流体が流れるようになっている。スペーサ４６は図示したような形状でなくてもよく、枠体３６の下面に数カ所で当接するようになっていればよい。場合によっては、スペーサ４６を形成せずに、外枠体２０との係合によって、底板部２からの枠体３６の高さが正確に規定されるようにしてもよい。
　枠体３６の下端部の内周面には、全周に亘って一定幅を有する傾斜面３８が形成され、傾斜面３８は下方へ行くほど細胞載置膜６の側へせり出している。このような傾斜面３８が形成されていることにより、図４に示すように、細胞載置膜６のウェル５０からターゲット細胞をピペット、マイクロピペット、ディスペンサー等の器具Ｐで吸い上げる際に、ターゲット細胞が補集されたウェル５０がもしも枠体３６の内周縁の間際の位置であっても、器具Ｐで細胞の吸い出しが容易に行えるようになっている。また、傾斜面３８は枠体３６への細胞載置膜６の接着面積を増やし、細胞載置膜６の接合強度を高める効果も果たしているし、枠体３６の強度を高めるためにも役立っている。
　上記構成からなる細胞スクリーニングデバイスを製造する場合は、図７に示すように底板部２、枠体３６、および外枠体２０をそれぞれ別個に形成したうえ、まず、枠体３６を外枠体２０の下面にはめ込み、次に、外枠体２０を底板部２の係合壁１８にはめ込むことにより、図１～図６に示すような完成状態となる。
　枠体３６を外枠体２０の下面にはめ込む過程では、図４および図６に示すように、外枠体２０の係合突条４２が、枠体３６の係合溝４４にはまり込み、かつ、枠体３６の係合突条４０が、外枠体２０の係合溝３２にはまり込むことにより、各係合部の弾力性によって両者が強固に固定される。同時に、係合突条４０の内周面と、係合突条４２の外周面は、少なくとも一方が上方へ行くほど僅かに外側へ傾く形状とされている。これにより、係合が進行すると、枠体３６の四辺の係合突条４０が、外枠体２０の係合突条４２によって外側へ引かれ、枠体３６の下端部が四方へ僅かに広げられ、細胞載置膜６の四辺を引っ張る張力を生じ、細胞載置膜６に均一な張力が印加される。
　したがって、枠体３６が自由状態にある時には細胞載置膜６にわずかな弛みがあったとしても、外枠体２０へ枠体３６を固定した時には、細胞載置膜６の弛みが解消され、細胞載置膜６の多数のウェル５０が形成された細胞載置面４の平面度を高め、細胞を分散した分散液を細胞載置面４上に満たして、細胞スクリーニングデバイスを揺り動かすなどにより、細胞を偏り無く流動させて、ウェル５０内に細胞を一つずつ捕獲することが容易になるという利点を有する。
　本実施形態を用いた細胞スクリーニングキットは、細胞スクリーニングデバイス１と、スクリーニングすべき細胞の分泌物に結合性を有する物質が固定化された担体粒子であるビーズ（検出粒子）Ｂとを備える。細胞スクリーニングキットは、例えば箱型などの外側容器の中に、一又は複数の細胞スクリーニングデバイス１と、検出粒子である多数の微細なビーズＢを粉末状態でもしくは分散液に懸濁させて封入した内側容器とを収容した製品とされる。
　結合粒子の種類は限定されないが、例えば、ビーズ（磁気ビーズ、樹脂ビーズ等）、ハイドロゲル粒子（アルギン酸ナトリウムゲル、アガロースゲルなど）、金属粒子（金ナノ粒子）などからなる担体粒子と、担体粒子に付着されターゲットとなる抗体産生細胞から分泌される抗体に結合可能なキャッチャーであってもよい。結合粒子の粒径は限定されないが、一般的には粒子の最大径が１００ｎｍ～５０μｍであることが好ましく、５００ｎｍ～３０μｍ程度であることがより好ましい。
　実際のスクリーニングを行う場合には、細胞と検出粒子であるビーズＢとを分散液に分散させて細胞載置膜６上に満たし、細胞スクリーニングデバイス１を揺するか、貫通孔５２を通して流路１０へ排出するなどしてウェル５０に細胞Ｃを一つずつ入れるとともに、各細胞Ｃとともに多数のビーズＢをウェル５０へ入れ、余分な分散液を貫通孔５２を通して流路１０へ排出する。この状態で細胞Ｃの分泌物中の抗体とビーズＢのキャッチャーとを反応させれば、反応したビーズＢのみを蛍光標識抗体で可視化して、ターゲット細胞を見つけることができる。
　上記構成から成る細胞スクリーニングデバイス１によれば、流路１０の両端に位置する流路端部１２を蓋部１４でそれぞれ塞ぎ、これら蓋部１４に流路１０に連通した開口部１６Ａを有する流体注入ポート１６を設けたことにより、蓋部１４により流路端部１２および流路１０内の流体の移動が抑制されるとともに、流体注入ポート１６を通じて流体を流路１０へ出し入れすることが可能である。したがって、細胞スクリーニングデバイス１のウェル５０に細胞Ｃを捕捉し、流路１０に分散液などの流体を入れた状態で細胞スクリーニングデバイス１を持ち運んだり、傾けたりした場合にも、流路１０および流路端部１２に沿って流体が移動しにくくなり、スロッシング現象を抑えることができる。よって、分散液の一部が貫通孔５２を通じてウェル５０に流れ込み、ウェル５０に捕捉されていた細胞ＣやビーズＢを離脱させるといった問題を抑制できる。
　また、この実施形態では、流体注入ポート１６の開口部１６Ａから流体が溢れ出た場合にも、流体貯留部（蓋部１４の上面）が流体を受け止め、再度、流体注入ポート１６から流路１０内へ入ることが抑制でき、例えば外部からのコンタミネーションなどのおそれを低減できる。また、細胞載置面４と、蓋部１４との間に仕切り部２８が形成されているから、流体貯留部１４に流体が溜まった場合にも流体が細胞載置部６へ流れることを抑制できる。
　また、この実施形態では、２つの流体注入ポート１６が流路１０の両端に形成されているから、一方の流体注入ポート１６から流体を流路１０へ流し込み、他方の流体注入ポート１６から余剰分の流体を排出させるなど幅広い利用方法が可能となる。
　また、この実施形態では、底板部２のスペーサ４６に枠体３６の下端を当接させることにより、底板部２上の正しい位置に細胞載置膜６が位置決めされるため、ウェル５０と流路１０との間での流体の流れが所望どおりとなり、精度の高いスクリーニングが可能となる。
　また、この実施形態では、底板部２と外枠体２０が別体として成形され、底板部２に外枠体２０を取り付けるだけで、蓋部１４と周壁部２２を底板部２に対して正確な位置に配置できるから、細胞スクリーニングデバイス１の組み立てが容易である。使用後に底板部２から外枠体２０を取り外すこともでき、メンテナンスが容易である。
　また、この実施形態では、底板部２と外枠体２０と枠体３６をそれぞれ別体として成形し、底板部２に枠体３６と外枠体２０とを取り付けるだけで、細胞載置膜６、蓋部１４、周壁部２２の正確な位置決めが可能となり、組み立てしやすさが向上できる。使用後に底板部２から枠体３６と外枠体２０とを取り外すこともでき、メンテナンスが容易である。
　また、この実施形態では、底板部２と外枠体２０とをそれぞれ別体として成形し、底板部２に外枠体２０とを取り付けるだけで、細胞載置部６、蓋部１４、周壁部２２、および二つの流体注入ポート１６の正確な位置決めが可能となるから、組み立てやすい。
　また、この実施形態では、流体注入ポート１６が円筒状をなしているので、ピペットやディスペンサーなどの円錐状に尖った先端をほぼ開口部１６Ａに気密的に当てて流体の出し入れが容易である。
　この実施形態の細胞スクリーニングキットは、個々のウェル５０に細胞Ｃを取り込んだ状態で、ウェル５０内で検出粒子Ｂと細胞の分泌物とを反応させ、検出粒子Ｂからの発光等によってスクリーニングが行えるうえ、流路１０に分散液などの流体を入れた状態で細胞スクリーニングデバイス１を持ち運んだり、傾けたりした場合にも、流路１０に沿って流体が移動しにくくなり、分散液の一部が貫通孔５２を通じてウェル５０に流れ込み、ウェル５０に捕捉されていた細胞Ｃや検出粒子Ｂをウェル５０から離脱させるといった問題を抑制できる。
　先の実施形態では、細胞スクリーニングデバイス１の両端に流体注入ポート１６を設けた構成であったが、図９に示すように、細胞スクリーニングデバイス１の片側の蓋部１４のみに流体注入ポート１６を形成する構成も可能である。この場合、ひとつの流体注入ポート１６のみから流体の出し入れが可能となる。
　また、先の実施形態では、蓋部１４が平面状であったが、図１０に示すように、蓋部１４において、流路端部１２の天井面の少なくとも一部に、流体注入ポート１６へ近づくにつれ傾斜面状または階段状に上昇する泡排出面５４を形成することも可能である。この場合、蓋部１４の裏側の天井面が流体注入ポートに向けて上昇するから、流路端部１２内に入り込んだ気泡Ｇが傾斜面５４に沿って上昇し、流体注入ポート１６から排出されやすくなり、気泡Ｇによって、貫通孔５２が閉塞するなどのトラブルを抑制できる。
　本発明の細胞スクリーニングデバイスまたは細胞スクリーニングキットによれば、細胞スクリーニングデバイスのウェルに細胞を捕捉し、流路に分散液などの流体を入れた状態で細胞スクリーニングデバイスを持ち運んだり、傾けたりした場合にも、流路に沿って流体が移動しにくくなり、スロッシング現象を抑えて、分散液の一部が貫通孔を通じてウェルに流れ込み、ウェルに捕捉されていた細胞や検出粒子を離脱させるなどの問題を抑制できる。よって、本発明は産業上の利用が可能である。
１：細胞スクリーニングデバイス、２：底板部、４：細胞載置面、
６：細胞載置膜（細胞載置部）、８：流体注入部、１０：流路、１２：流路端部、
１４：蓋部（流体貯留部）、１６：流体注入ポート、１６Ａ：開口部、
１８：係合壁、２０：外枠体、２２：周壁部、２４：係合溝、２６：突起、
２８：仕切り部、３０：リブ、３２：係合溝、３４：段部、３６：枠体、
３６Ａ：壁部、３８：傾斜面、４０：係合突条、４２：係合突条、４４：係合溝、
４６：スペーサ、４７：切欠、５０：ウェル、５２：貫通孔、
５４：傾斜面（泡排出面）、Ｃ：細胞、Ｂ：ビーズ、Ｌ：分散液、Ｇ：気泡。

Claims (10)

  1. 　底板部と、
    　前記底板部上に設けられ、細胞載置面を構成する細胞載置部と、
    　前記底板部上に、前記細胞載置部とは区画して設けられた流体注入部と、
    　前記細胞載置部の前記細胞載置面に形成され、スクリーニングすべき細胞を個別に収容可能なサイズを有する複数のウェルと、
    　前記底板部と前記細胞載置部との間に設けられ、前記流体注入部まで流路端部が延びている流路と、
    　前記ウェルの内底面から前記流路に通じ、前記スクリーニングすべき細胞が通過できない内径を有する貫通孔と、
    　前記流体注入部に設けられ、前記流路端部を塞ぐ蓋部と、
    　前記蓋部に設けられ前記流路に連通する開口部を有する流体注入ポートと、を有することを特徴とする細胞スクリーニングデバイス。
  2. 　前記流体注入ポートの周囲の前記蓋部には、前記流体注入ポートの前記開口部から溢れ出た流体を貯留しえる流体貯留部が形成され、
    　前記細胞載置面と、前記蓋部との間には、前記流体貯留部に流体が溜まった場合に前記流体が前記細胞載置部へ流れることを防ぐ仕切り部が設けられている、請求項１に記載の細胞スクリーニングデバイス。
  3. 　前記底板部は、長辺と短辺とを有する矩形状をなし、前記底板部の長手方向の両側にそれぞれ前記流体注入部、前記蓋部、および前記流体注入ポートが形成され、前記二つの蓋部の間に、前記細胞載置部が配置されている、請求項１または２に記載の細胞スクリーニングデバイス。
  4. 　前記細胞載置部は膜体であり、
    　前記膜体の上面には前記ウェルが複数格子状に並んで形成され、前記膜体の下面には前記ウェルのそれぞれの内底面に通じる前記貫通孔が形成され、
    　前記膜体の周囲を支持するとともに前記細胞載置面を囲む枠体が設けられ、
    　前記底板部には、前記枠体を着脱可能に固定するための係合部が設けられている、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞スクリーニングデバイス。
  5. 　前記蓋部の周縁から起立した周壁部が形成されており、前記蓋部と前記周壁部は、前記底板部から着脱可能な外枠体として形成されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞スクリーニングデバイス。
  6. 　前記蓋部の周縁には起立した周壁部が形成されており、前記蓋部と前記周壁部は、前記底板部から着脱可能な外枠体として形成され、
    　前記外枠体に、前記膜体を支持する前記枠体が着脱可能に固定されている、請求項４に記載の細胞スクリーニングデバイス。
  7. 　前記底板部は、長辺と短辺とを有する矩形状をなし、前記底板部の長手方向の両側にそれぞれ、前記流体注入部、前記蓋部、および前記流体注入ポートが形成され、前記二つの蓋部の間に、前記細胞載置部が配置され、
    　前記蓋部、前記蓋部の周縁から起立した周壁部、および前記細胞載置部の周囲を囲む周壁部が、前記底板部から着脱可能な外枠体として形成されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞スクリーニングデバイス。
  8. 　前記流体注入ポートは、前記蓋部の上面から起立した円筒状をなす、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞スクリーニングデバイス。
  9. 　前記蓋部において、前記流路端部の天井面の少なくとも一部には、前記流体注入ポートへ近づくにつれ傾斜面状または階段状に上昇する泡排出面が形成されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞スクリーニングデバイス。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞スクリーニングデバイスと、
    　スクリーニングすべき細胞の分泌物に結合性を有する物質が固定化された担体粒子である検出粒子とを備えた細胞スクリーニングキット。
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