JP7388131B2 - 微小粒子回収方法、微小粒子分取用マイクロチップ、微小粒子回収装置、エマルションの製造方法、及びエマルション - Google Patents
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Description
すなわち、本技術は、微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有
する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
微小粒子回収方法を提供する。
前記微小粒子回収方法を実施することによって、前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成されうる。
また、本技術は、微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収され、且つ、
前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される、
微小粒子回収方法も提供する。
前記微小粒子回収方法を実施することによってエマルションが形成され、且つ、当該エマルションを構成する液滴の少なくとも一部が、前記回収対象粒子を1つ含みうる。
前記エマルションを構成する全液滴のうち、70%以上の数の液滴が1つの回収対象粒子を含みうる。
前記第一液体が親水性であり且つ前記第二液体が疎水性であってよい。
前記第二液体の動粘度が、前記第一液体の動粘度の1/100倍~100倍でありうる。
前記通流工程、前記判定工程、及び前記回収工程は、前記第二液体を前記液体供給流路から前記接続流路へと供給しながら行われうる。
前記主流路が、前記接続流路及び回収対象粒子以外の微小粒子が流れる少なくとも一つの廃棄流路へと分岐してよく、
前記液体供給流路が、前記接続流路へ液体を供給しうる。
前記接続流路に、前記第一液体が前記回収流路へと進行することを防ぐバルブが設けられていてよい。
前記通流工程において、前記微小粒子が前記主流路内を略一列に並んで前記接続流路に向かって流れうる。
前記微小粒子分取機構は、微小粒子を含有する液体が流れるサンプル流路及び微小粒子を含有しない液体が流れるシース流路が合流部で主流路へ連結し、合流部後の主流路に微小粒子が主流路内を略一列に並び流れるようにする流路構造を有してよく、
当該流路構造によって、略一列に並んで流れる微小粒子を含む層流が形成されうる。
前記判定工程において、前記主流路中を流れる微小粒子に光が照射され、当該照射により生じた光に基づき当該微小粒子が回収対象粒子であるかが判定されうる。
前記回収工程において、前記回収流路内の圧力変動により、前記回収対象粒子が前記接続流路を通って前記回収流路内へと回収されうる。
前記主流路、前記接続流路、及び前記回収流路は直線状に並んでいてよい。
前記微小粒子が細胞又は細胞塊であり、且つ、前記第一液体が当該微小粒子の培養液であってよい。
前記微小粒子が細胞、細胞塊、又は合成粒子であり、且つ、前記回収工程後に当該微小粒子が破壊されてよい。
前記回収流路内の回収された微小粒子が、さらなる微小粒子分取処理に付されてもよい。
前記微小粒子分取用マイクロチップは、前記流路構造を一つ又は二つ以上含みうる。
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有し、
前記主流路は、第一液体に含まれた状態で流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定するために用いられる判定領域を有し、
回収対象粒子であると判定された微小粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
微小粒子分取用マイクロチップも提供する。
また、本技術は、微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有し、
前記主流路は、第一液体に含まれた状態で流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定するために用いられる判定領域を有し、
回収対象粒子であると判定された微小粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収され、且つ、前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される微小粒子回収方法を実行するために用いられる、
微小粒子分取用マイクロチップも提供する。
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、
を含む流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップと、
前記主流路に、微小粒子を含む第一液体を供給する第一液体供給部と、
前記液体供給流路に、前記第一液体と非混和性である第二液体を供給する第二液体供給部と、
前記主流路内を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定部と、
を備えている微小粒子回収装置も提供する。
また、本技術は、微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、
を含む流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップと、
前記主流路に、微小粒子を含む第一液体を供給する第一液体供給部と、
前記液体供給流路に、前記第一液体と非混和性である第二液体を供給する第二液体供給部と、
前記主流路内を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定部と、
を備えており、且つ、
前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される微小粒子回収方法を実行するように構成されている、
微小粒子回収装置も提供する。
前記微小粒子分取用マイクロチップは、前記微小粒子回収装置から取り外し可能であってよい。
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションの製造方法も提供する。
また、本技術は、微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収され、且つ、
前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される、
微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションの製造方法も提供する。
1.第1の実施形態(微小粒子回収方法)
(1)第1の実施形態の説明
(2)第1の実施形態の第1の例
(2-1)通流工程
(2-2)判定工程
(2-3)回収工程
(2-4)他の工程
(2-4-1)培養工程
(2-4-2)破壊工程
(2-4-3)検出工程
(2-4-4)合成工程
(2-5)微小粒子分取機構及び微小粒子
(3)流路構造の他の例
(3-1)主流路と廃棄流路とが直線状に並んでいる流路構造
(3-2)複数の回収流路を有する流路構造
2.第2の実施形態(微小粒子分取用マイクロチップ)
3.第3の実施形態(微小粒子回収装置)
4.第4の実施形態(エマルションの製造方法)
5.第5の実施形態(エマルション)
また、本技術において、回収流路内へと回収される微小粒子は、前記判定工程において回収対象粒子であると判定されたものであり、且つ、適切なタイミングで回収動作が実施される。さらに、微小粒子が流れて来ない時又は前記判定工程で回収対象粒子でないと判断された微小粒子が来た時には回収動作が行われないため、回収流路内に微小粒子を含まないエマルション粒子又は回収対象粒子以外の粒子を含むエマルション粒子が形成されない。そのため、エマルション粒子中に1つの回収対象粒子が含まれる確率は極めて高い。例えば、本技術に従う方法によって、1つの微小粒子(特には回収対象粒子)を含むエマルション粒子を例えば70%以上、特には80%以上、より特には90%以上、さらには95%以上の成功率で生成することができる。本技術において、回収対象粒子は、前記判定工程において回収すると判定された微小粒子をいう。
しかしながら、例えば、上記非特許文献2に記載されるとおり、1つのエマルション粒子中に或る数の細胞が入る確率はポアソン分布に従うと考えられる。従来のエマルション形成技術では、1つのエマルション粒子中に1つの細胞が含まれる確率は、最大でも約65%程度であると言われている。
また、当該割合を高めるためには、サンプル中の細胞の数を増やすことが考えられる。しかしながら、例えばクリニカルサンプルに含まれる解析対象細胞の数はしばしば少なく、例えば1サンプル中の解析対象細胞数は例えば104~105でありうる。また、例えばCTC(血中循環腫瘍細胞)などの希少細胞を解析対象とする場合において、入手可能な細胞の数は限られる。
本技術により、上記のとおり、1つの微小粒子(例えば細胞)を含むエマルション粒子の割合を高めることができる。そのため、本技術は、エマルションを用いて単一細胞解析を行うために極めて有効である。
セルソータを用いて、検出シグナルに基づきウェルプレートにシングルセルソートする技術もあるが、当該ウェルプレートのウェルの数は384が上限であり、解析スケール及びスループットが低い。また、ソートノズルがウェル間を移動する間はソートできないので、この間に流れてきたターゲット細胞はロスすることになる。
本技術の方法において、前記判定工程において回収対象粒子であると判定された微小粒子をエマルションの状態で回収することができる。そのため、本技術によって、セルソート工程を別途行うことなく、エマルションを形成することができる。また、本技術の方法によって、回収対象粒子の回収率を高められる。
以上のとおりであるので、本技術は、1つの微小粒子を含むエマルション粒子を含むエマルションの製造方法も提供する。当該製造方法に含まれる工程は、前記微小粒子回収方法の工程と同じであってよい。
また、本技術は、1つの細胞を含むエマルション粒子の数の割合がエマルション粒子全数に対して70%以上であるエマルションも提供する。前記割合は、好ましくは75%以上、さらにより好ましくは80%以上、85%以上、又は90%以上であってもよい。このように、本技術によって、1つのエマルション粒子を極めて高い含有割合で含むエマルションが提供される。
前記回収対象粒子が前記接続流路付近に到達した場合にだけ前記第一液体を回収流路内へ導くことで、前記回収対象粒子を、前記第一液体に含まれた状態で前記回収流路内に導くことができる。
前記第一液体及び前記第二液体の25℃における密度はいずれも、例えば0.5g/cm3~5g/cm3、好ましくは0.6g/cm3~4g/cm3、より好ましくは0.7g/cm3~3g/cm3でありうる。
また、前記第二液体の密度は、好ましくは前記第一液体の密度の1/100倍~100倍であり、より好ましくは1/10倍~10倍であり、さらにより好ましくは1/5倍~5倍であり、特に好ましくは1/2倍~2倍である。本技術において、前記第一液体及び前記第二液体の密度は同程度であることが好ましい。これによりエマルションが形成されやすくなる。
前記第一液体及び前記第二液体の25℃における動粘度は、例えば0.3cSt~5cSt、好ましくは0.4cSt~4cSt、より好ましくは0.5cSt~3cStでありうる。
前記第一液体及び前記第二液体が以上の物性を有することによって、前記回収流路内にエマルションが形成されやすくなる。また、このような物性によって、マイクロ流路内をこれら液体が流れやすくなる。
前記親水性の液体は、例えば生体分子を含む液体であってよい。当該生体分子は、例えば、アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質から選ばれる1種又は2種以上の組合せであってよい。
また、前記親水性の液体は、例えば界面活性剤、特には非イオン性界面活性剤を含んでもよい。非イオン界面活性剤の例として、例えばポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとのトリブロック共重合体を挙げることができ、当該トリブロック共重合体は、ポロキサマー又はプルロニック系界面活性剤とも呼ばれる。プルロニック系界面活性剤のより具体的な例は、Pluronic(商標)F68である。
当該親水性の液体として培養液を用いることで、回収対象粒子として回収された細胞を、エマルション粒子中に保持されたまま培養することができる。
また、当該親水性の液体(特には当該シース液)が細胞刺激性成分を含むことによって、回収対象粒子として回収された細胞を、エマルション粒子中に保持されたまま刺激することができる。さらに、刺激された細胞の特徴(例えば形態など)を顕微鏡などによって観察することもできる。
また、当該親水性の液体(例えば当該シース液又は当該サンプル液)が、細胞刺激の応答を観察することを可能とするアッセイ系を含んでもよい。当該アッセイ系によって、回収対象粒子として回収された細胞からの当該応答を、エマルション粒子中に保持されたまま、例えば光学的に検出することができる。当該アッセイ系は、好ましくはwash freeのアッセイ系であり、例えば蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)又は生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)などを利用した系が好ましい。
以上のとおり、本技術において微小粒子が生体粒子(特には細胞)である場合、種々の単一の生体粒子の解析(特には単一細胞解析、例えば単一細胞イメージングなど)を行うことができる。
前記親水性の液体の25℃における動粘度は、例えば0.3cSt~5cSt、好ましくは0.4cSt~4cSt、より好ましくは0.5cSt~3cStでありうる。
前記親水性の液体が以上の物性を有することによって、マイクロ流路内を流れやすくなり、また、前記回収流路内にエマルションが形成されやすくなる。
前記脂肪族炭化水素は、好ましくは炭素原子数が7以上30以下の脂肪族炭化水素である。炭素原子数が7以上30以下であることで、疎水性液体の動粘度がマイクロ流路内を流れるために適している。脂肪族炭化水素の例として、ミネラルオイル;例えばスクワランオイル及びオリーブオイルなどの動植物由来のオイル;例えばデカン及びヘキサデカンなどの炭素原子数10~20のパラフィン系炭化水素;及び、炭素原子数10~20のオレフィン系炭化水素を挙げることができる。
本技術において、前記親水性の液体との良好な非混和性の観点から、前記疎水性の液体は好ましくはフッ素系油である。前記フッ素系油として、例えばパーフルオロカーボン(PFC)、パーフルオロポリエーテル(PFPE)、及びハイドロフルオロエーテル(HFE)を挙げることができる。パーフルオロカーボンとして例えばフロリナート(商標)FC40及びフロリナートFC-770(3M社製)などが挙げられる。パーフルオロポリエーテルとして例えばKrytox(DuPont社製)を挙げることができる。ハイドロフルオロエーテルとして例えばHFE7500(3M社製)を挙げることができる。
前記疎水性の液体の25℃における動粘度は、例えば0.3cSt~5cSt、好ましくは0.4cSt~4cSt、より好ましくは0.5cSt~3cStでありうる。
前記疎水性の液体が以上の物性を有することによって、前記回収流路内にエマルションが形成されやすくなる。例えば密度又は動粘度が高すぎる場合は、前記接続流路内をスムーズに流れなくなる可能性が高まる。
この実施態様において、前記回収流路内に、親水性の液体を分散媒とし且つ疎水性の液体を分散質とするエマルションが形成されうる。本技術は、当該エマルション中に微小粒子を回収するために用いられてもよい。当該疎水性の液体及び当該親水性の液体の例は、上記で述べたとおりである。
また、この実施態様は、例えば分散媒及び分散質がそれぞれ疎水性液体及び親水性液体であり且つエマルション粒子が微小粒子を含むエマルションから、さらに目的とする微小粒子だけを回収する場合に適用されうる。
また、本技術において用いられうるアッセイ系として、微小粒子が蛍光を発する系だけでなく、エマルション粒子が蛍光を発する系も用いられうる。そのため、微小粒子を含むエマルション粒子を回収するために、前記判定工程において、微小粒子に対する判定が行われてよく、エマルション粒子に対する判定が行われてよく、又は、微小粒子及びエマルション粒子の両方に対する判定が行われてもよい。このように、本技術において、微小粒子且つ/又はエマルション粒子から得られる情報に基づき、微小粒子又はエマルション粒子が回収対象であるかが判定されてよい。
以下で各工程について説明する。
前記散乱光及び/又は蛍光が検出される実施態様において、検出部102により得られたデジタル電気信号の波形が制御部103によって処理され、そして、当該処理によって生成された光の特徴に関する情報に基づき、判定部105が、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する。例えば、散乱光に基づく判定において、微小粒子の外形及び/又は内部構造の特徴が特定され、当該特徴に基づき微小粒子が回収対象粒子であるかが判定されてよい。さらに、例えば細胞などの微小粒子に対して予め前処理を施しておくことで、フローサイトメトリーにおいて用いられる特徴と同様の特徴に基づき、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定することもできる。また、例えば細胞などの微小粒子を抗体又は色素(特には蛍光色素)で標識を行っておくことで、当該微小粒子の表面抗原の特徴に基づき、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定することもできる。
以下で回収工程についてより詳細に説明する。
上流側接続流路170aへ流れた当該第二液体は、接続流路170の主流路155との接続面から出たのち、2つの廃棄流路158へと別れて流れる。このように当該第二液体が当該接続面から出ていることによって、回収流路159内へ回収される必要のない第一液体及び微小粒子が接続流路170を通って回収流路159へ入ることを防ぐことができる。
下流側接続流路170bへ流れた当該第二液体は、回収流路159内へと流れる。これによって、回収流路159内が当該第二液体によって満たされ、当該第二液体は例えばエマルション形成のための分散媒となる。
例えば、上流側接続流路180aの横断面及び下流側接続流路180bの横断面がいずれも矩形である場合は、後者の横断面の面積を前者の横断面の面積よりも大きくすることによって、上記で述べたように、既に回収された微小粒子が接続流路180を通って主流路155へと放出されることをより効果的に防ぐことができる。
接続流路170に導入された第二液体の一部によって接続流路170から主流路155に向かう流れが形成されることで、回収対象粒子以外の微小粒子が回収流路159へ入ることが防がれる。接続流路170から主流路155に向かう流れが形成する第二液体は、主流路155を流れる第一液体が廃棄流路158へと流れる流れによって、主流路155内を流れることなく、第一液体と同様に廃棄流路158を流れる。
なお、接続流路170に導入された第二液体の残りは、回収流路159へと流れる。これにより、回収流路159内は第二液体によって満たされうる。
また、回収流路末端163を閉じて回収動作を行うと、回収流路159内に複数のエマルション粒子を保持することができる。当該回収動作の終了後に回収流路159内で、継続して、例えば単一細胞解析などのアッセイを行うこともできる。
また、図1及び2に示されるように、本技術の方法において用いられる微小粒子分取用マイクロチップにおいて、微小粒子は、主流路内を略一列に並び、接続流路へ向かって流れる。そのため、回収工程における吸引量を少なくすることもできる。
逆に、1回の回収動作で同時に接続流路へ引き込まれ得るほど近接した二つ以上の微小粒子の各々の特徴も判断することができる。例えば同一の特徴を持つ二つの微小粒子を一つのエマルション粒子内に閉じ込めることができ、又は、指定した異なる特徴を持つ微小粒子の組合せを一つのエマルジョン粒子内に閉じ込めることもできる。
図1に示される微小粒子分取用マイクロチップ150と同じ流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップを用いて、以下のとおりに、1つの微小粒子を含むエマルション粒子の形成を行った。以下当該エマルション粒子の形成のための操作について、図1を参照しながら説明する。
直径10μmのビーズを含む親水性サンプル液を、サンプル液インレット151からサンプル液流路152へと導入し、且つ、親水性シース液を、シース液インレット153からシース液流路154へと導入した。導入された当該親水性サンプル液及び当該親水性シース液は合流部162で合流し、そして、当該親水性サンプル液が当該親水性シース液によって囲まれた層流が形成された。当該層流は、略一列に並んでいるビーズを含み、当該層流は主流路155内を接続流路170へと向かって流れた。
また、当該親水性サンプル液及び当該親水性シース液の導入と並行して、液体供給流路161から接続流路170へと疎水性の液体が供給された。前記疎水性の液体が液体供給流路161から接続流路170へと供給されることによって、前記層流が接続流路170を通って回収流路159へと侵入することが防がれ、且つ、回収流路159は前記疎水性の液体によって満たされていた。
主流路155のうちの検出領域156へと照射されているレーザ光の照射位置をビーズが通過することで、当該ビーズへレーザ光が照射されて光が生じる。当該生じた光が検出され、検出された光の特徴に基づき、各ビーズを回収するかが判定された。
図8Aの(a)は、ビーズ(白の矢印により示されている)が接続流路170に向かって流れている状態を示す写真である。図8Aの時点において、主流路155を親水性の液体が粒子分取部157へ向かって流れ、そして、接続流路170へ流れることなく、主流路155から分岐する2つの廃棄流路158へと流れている。疎水性の液体が液体供給流路161から接続流路170へと供給され、主流路155及び回収流路159の両方へと流れる。主流路155へ流れた当該疎水性の液体は、接続流路170から出た直後に、前記親水性の液体の流れによって、2つの廃棄流路158へと別れて流れている(図8A中のaにより示される付近を、廃棄流路158の壁に沿って流れている)。
図8Aの(b)は、ビーズがさらに接続流路に近づいた時点での写真である。この時点において、ビーズ回収のための操作が開始される。すなわち、前記ピエゾ素子を駆動することによって、回収流路159内腔の変形が開始される。
図8Aの(c)は、親水性の液体が回収流路159内へと進行している状態を示す写真である。当該写真から、図8Cの時点において、ビーズは親水性の液体によって包まれており、さらに当該親水性の液体が疎水性の液体によって囲まれていることが分かる。すなわち、ビーズを1つ含むエマルション粒子Pが形成されている。
図8Aの(d)は、当該エマルション粒子Pが、接続流路170から回収流路159へと入る直前の写真である。
図8Aの(e)は、当該エマルション粒子Pが、回収流路159へ入った直後の写真である。当該エマルション粒子P内にビーズが1つ含まれていることが確認できる。
図8Aの(f)は、当該エマルション粒子Pが、海流流路159内をさらに下流へと流れたことを示す写真である。
以上のとおり、本技術に従う方法によって、1つのビーズを含むエマルション粒子が形成された。
例えば、ピエゾ素子による回収流路内腔の変形量を大きくすることによって、回収流路159内に吸い込まれる親水性の液体の量が多くなり、これによりエマルション粒子のサイズを大きくすることができる。反対に、当該変形量を小さくすることによって、回収流路159内に吸い込まれる親水性の液体の量が少なくなり、これによりエマルション粒子のサイズを小さくすることができる。
また、上記(ii)の保持時間をより長くする又はより短くすることによって、エマルション粒子のサイズをより大きくする又はより小さくすることもできる。このことを図8Bに示す。図8Bは、上記(ii)の保持時間が10μ秒間、15μ秒間、25μ秒間、及び35μ秒間である場合のエマルション粒子のサイズを示す写真である。この写真から、上記(ii)の保持時間の変更により、エマルション粒子のサイズを調整することができることが分かる。
また、接続流路170の容積(特には上流側接続流路170a、接続部170c、及び下流側接続流路170bのそれぞれ)を調整することによって、エマルション粒子の製図を調整することもできる。
本技術の他の好ましい実施態様に従い、細胞、細胞塊、及び合成粒子以外の粒子が破壊されてもよい。すなわち、本技術の微小粒子回収方法は、前記回収工程後に、回収された回収対象粒子を破壊する破壊工程を含みうる。
前記検出又は前記反応を行うために、例えば本技術に従い形成されたエマルション粒子が、他のエマルション粒子とマージされうる。そして、当該マージ後に、当該回収対象粒子が有する成分の検出若しくは分析、又は、当該成分と他の成分との反応が、マージ後のエマルション粒子内において行われうる。
当該マージにより、例えばCellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing(CITE-seqともいう)が可能となる。例えば、回収対象粒子が、poly-A配列を有するオリゴバーコードが結合した抗体を結合した細胞である場合を想定する。前記回収工程において、当該細胞を含むエマルション粒子が形成される。そしてその後、当該エマルション粒子が、バーコード配列を有するビーズ又はゲルを含むエマルション粒子とマージされる。当該マージによって、当該細胞の細胞表面タンパク質又は細胞内mRNAを検出することができる。
また、エマルション化した細胞又は細胞塊(例えばスフェロイド又はオルガノイドなど)と薬剤とが反応されてもよい。これにより、当該薬剤に対する当該細胞又は細胞塊の応答を検出又は分析することができる。
また、当該検出において、生体分子が検出されてよい。生体分子の検出は、例えばwash free assayにより行われうる。wash free assayでは、例えばLOCI、FRET、BRET、又はFlimPIA法が用いられうる。
本技術において、「マイクロ」とは、微小粒子分取用マイクロチップに含まれる流路の少なくとも一部が、μmオーダの寸法を有すること、特にはμmオーダの横断面寸法を有することを意味する。すなわち、本技術において、「マイクロチップ」とは、μmオーダの流路を含むチップ、特にはμmオーダの横断面寸法を有する流路を含むチップをいう。例えば、μmオーダの横断面寸法を有する流路から構成されている粒子分取部を含むチップが、本技術に従うマイクロチップと呼ばれうる。例えば、粒子分取部157のうち、主流路155の横断面は例えば矩形であり、主流路155の幅は、粒子分取部157内において例えば100μm~500μmであり、特には100μm~300μmでありうる。主流路155から分岐する分岐流路の幅は、主流路155の幅よりも小さくてよい。接続流路170の横断面は例えば円形であり、接続流路170と主流路155との接続部における接続流路170の直径は例えば10μm~60μm、特には20μm~50μmでありうる。流路に関するこれらの寸法は、微小粒子のサイズ、特には回収対象粒子のサイズに応じて適宜変更されてよい。
生物学的微小粒子(生体粒子ともいう)には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれうる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれうる。細胞は、特には血液系細胞又は組織系細胞でありうる。前記血液系細胞は、例えばT細胞及びB細胞などの浮遊系細胞であってよい。前記組織系細胞は、例えば接着系の培養細胞又は組織からばらされた接着系細胞などであってよい。細胞塊には、例えばスフェロイド及びオルガノイドなどが含まれうる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれうる。さらに、生物学的微小粒子には、核酸、タンパク質、これらの複合体などの生物学的高分子も包含されうる。これら生物学的高分子は、例えば細胞から抽出されたものであってよく又は血液サンプル若しくは他の液状サンプルに含まれるものであってもよい。
合成微小粒子は、例えば有機若しくは無機高分子材料又は金属などからなる微小粒子でありうる。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、及びポリメチルメタクリレートなどが含まれうる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、及び磁性体材料などが含まれうる。金属には、金コロイド及びアルミなどが含まれうる。前記合成微小粒子は、例えばゲル粒子又はビーズなどであってよく、より特にはオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、及び酵素から選ばれる1つ又は2つ以上の組合せが結合されたゲル粒子又はビーズであってよい。
微小粒子の形状は、球形若しくは略球形であってよく、又は非球形であってもよい。微小粒子の大きさ及び質量は、マイクロチップの流路のサイズによって当業者により適宜選択されうる。他方で、マイクロチップの流路のサイズも、微小粒子の大きさ及び質量によって適宜選択されうる。本技術において、微小粒子には、必要に応じて化学的又は生物学的な標識、例えば蛍光色素又は蛍光タンパクなど、が取り付けられうる。当該標識によって、当該微小粒子の検出がより容易になりうる。取り付けられるべき標識は、当業者により適宜選択されうる。当該標識には、微小粒子に特異的に反応する分子(例えば抗体、アプタマー、DNA、又はRNAなど)が結合しうる。
本技術の一つの実施態様に従い、前記微小粒子は生体粒子であり、特には細胞でありうる。
例えば、当該さらなる微小粒子分取処理において、上記(2-1)~(2-4)において述べた工程のいずれか1つ又は2つ以上の組合せが行われてもよい。例えば、前記さらなる微小粒子分取処理において上記(2-2)で述べた判定工程が行われる場合において、微小粒子を含むエマルション粒子を回収するために、前記判定工程において、微小粒子に対する判定が行われてよく、エマルション粒子に対する判定が行われてよく、又は、微小粒子及びエマルション粒子の両方に対する判定が行われてもよい。このように、当該さらなる微小粒子分取処理においても、微小粒子且つ/又はエマルション粒子から得られる情報に基づき、微小粒子又はエマルション粒子が回収対象であるかが判定されてよい。
また、前記さらなる微小粒子分取処理において、微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションが、当該分取処理に付されてよい。
このように、本技術の微小粒子回収方法において用いられる微小粒子分取用マイクロチップは、前記接続流路及び前記回収流路が、前記主流路と直線状に並んでいなくてもよい。例えば、前記主流路と前記廃棄流路とが直線状に並んでおり、且つ、前記接続流路及び前記回収流路が前記主流路から分岐する流路構造を有していてよい。
この場合、前記判定工程において、微小粒子が、例えば2種の回収対象粒子A及びBのいずれかであるか又は当該2種の回収対象粒子のいずれでもないかが判定される。回収対象粒子A又はBに属するかに関する基準は、ユーザによって適宜選択されてよい。
前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子Aである場合は、当該微小粒子は、接続流路470-1を通って、回収流路459-1へと回収される。回収対象粒子Aである当該微小粒子は、第一液体に含まれた状態、回収流路459-1内の第二液体中に回収される。
前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子Bである場合は、当該微小粒子は、接続流路470-2を通って、回収流路459-2へと回収される。回収対象粒子Bである当該微小粒子は、第一液体に含まれた状態、回収流路459-2内の第二液体中に回収される。
前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子A及びBのいずれでもない場合は、当該微小粒子は、廃棄流路458へと流れる。
以上のとおりにして、回収対象粒子Aを含むエマルション及び回収対象粒子Bを含むエマルションが形成される。
この場合においても、前記判定工程において、微小粒子が、例えば2種の回収対象粒子A及びBのいずれかであるか又は当該2種の回収対象粒子のいずれでもないかが判定される。回収対象粒子A又はBに属するかに関する基準は、ユーザによって適宜選択されてよい。
前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子Aである場合は、当該微小粒子は、接続流路570-1を通って、回収流路559-1へと回収される。回収対象粒子Aである当該微小粒子は、第一液体に含まれた状態、回収流路559-1内の第二液体中に回収される。
前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子Bである場合は、当該微小粒子は、接続流路570-2を通って、回収流路559-2へと回収される。回収対象粒子Bである当該微小粒子は、第一液体に含まれた状態、回収流路559-2内の第二液体中に回収される。
前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子A及びBのいずれでもない場合は、当該微小粒子は、廃棄流路558へと流れる。
以上のとおりにして、回収対象粒子Aを含むエマルション及び回収対象粒子Bを含むエマルションが形成される。
前記第一液体供給部は、例えば、上記1.の(2)で述べた層流を形成するための少なくとも一つの構成要素であってよく、例えばサンプル液流路152及びシース液流路154を含みうる。また、前記第一液体供給部は、サンプル液インレット151及びシース液インレット153へそれぞれサンプル液及びシース液を導入するためにこれらインレットにそれぞれ接続される流路(例えばチューブなど)及び当該流路に接続されているサンプル液含有容器及びシース液含有容器も含みうる。
前記第二液体供給部は、例えば、上記1.の(2)において述べた液体供給流路161へ第二液体を供給するための少なくとも一つの構成要素であってよく、例えば液体供給流路161へ供給される第二液体を収容する容器、及び、当該容器と液体供給流路とを接続する流路(例えばチップと当該容器とを接続するチューブなど)を含みうる。
前記判定部は、上記1.において述べた判定部と同じであり、その説明が本実施形態においても当てはまる。
当該1つの微小粒子を含むエマルション粒子は、上記「1.第1の実施形態(微小粒子回収方法)」において述べたとおりにして形成されうる。また、当該エマルションは、例えば上記「1.第1の実施形態(微小粒子回収方法)」又は「4.第4の実施形態(エマルションの製造方法)」において述べたとおりに製造されうる。
〔1〕微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
微小粒子回収方法。
〔2〕前記微小粒子回収方法を実施することによって、前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される、〔1〕に記載の微小粒子回収方法。
〔3〕前記微小粒子回収方法を実施することによってエマルションが形成され、且つ、当該エマルションを構成する液滴の少なくとも一部が、前記回収対象粒子を1つ含む、〔1〕又は〔2〕に記載の微小粒子回収方法。
〔4〕前記第一液体が親水性であり、且つ、前記第二液体が疎水性である、〔1〕~〔3〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔5〕前記第二液体の動粘度が、前記第一液体の動粘度の1/100倍~100倍である、〔1〕~〔4〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔6〕前記通流工程、前記判定工程、及び前記回収工程は、前記第二液体を前記液体供給流路から前記接続流路へと供給しながら行われる、〔1〕~〔5〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔7〕前記主流路が、前記接続流路及び回収対象粒子以外の微小粒子が流れる少なくとも一つの廃棄流路へと分岐し、
前記液体供給流路が、前記接続流路へ液体を供給する、
〔1〕~〔6〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔8〕前記接続流路に、前記第一液体が前記回収流路へと進行することを防ぐバルブが設けられている、〔1〕~〔7〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔9〕前記通流工程において、前記微小粒子が前記主流路内を略一列に並んで前記接続流路に向かって流れる、〔1〕~〔8〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔10〕前記微小粒子分取機構は、微小粒子を含有する液体が流れるサンプル流路及び微小粒子を含有しない液体が流れるシース流路が合流部主流路へ連結し、合流部後の主流路に微小粒子が主流路内を略一列に並び流れるようにする流路構造を有し、
当該流路構造によって、一列に並んで流れる微小粒子を含む層流が形成される、
〔1〕~〔9〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔11〕前記判定工程において、前記主流路中を流れる微小粒子に光が照射され、当該照射により生じた光に基づき当該微小粒子が回収対象粒子であるかが判定される、〔1〕~〔10〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔12〕前記回収工程において、前記回収流路内の圧力変動により、前記回収対象粒子が前記接続流路を通って前記回収流路内へと回収される、〔1〕~〔11〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔13〕前記主流路、前記接続流路、及び前記回収流路が直線状に並んでいる、〔1〕~〔12〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔14〕前記微小粒子が細胞又は細胞塊であり、且つ、前記第一液体が当該微小粒子の培養液である、〔1〕~〔13〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔15〕前記微小粒子が細胞、細胞塊、又は合成粒子であり、且つ、前記回収工程後に当該微小粒子が破壊される、〔1〕~〔14〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔16〕前記回収流路内の回収された微小粒子が、さらなる微小粒子分取処理に付される、〔1〕~〔13〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔17〕前記微小粒子分取用マイクロチップが、前記流路構造を一つ又は二つ以上含む、〔1〕~〔6〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔18〕微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有し、
前記主流路は、第一液体に含まれた状態で流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定するために用いられる判定領域を有し、
回収対象粒子であると判定された微小粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
微小粒子分取用マイクロチップ。
〔19〕微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、
を含む流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップと、
前記主流路に、微小粒子を含む第一液体を供給する第一液体供給部と、
前記液体供給流路に、前記第一液体と非混和性である第二液体を供給する第二液体供給部と、
前記主流路内を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定部と、
を備えている微小粒子回収装置。
〔20〕前記微小粒子分取用マイクロチップが、前記微小粒子回収装置から取り外し可能である、〔19〕に記載の微小粒子回収装置。
〔21〕微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションの製造方法。
〔22〕1つの微小粒子を含むエマルション粒子の数の割合が、エマルション粒子全数に対して70%以上である、微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルション。
150 微小粒子分取用マイクロチップ
155 主流路
159 回収流路
161 液体供給流路
170 接続流路
Claims (21)
- 微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収され、且つ、
前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される、
微小粒子回収方法。 - 前記微小粒子回収方法を実施することによってエマルションが形成され、且つ、当該エマルションを構成する液滴の少なくとも一部が、前記回収対象粒子を1つ含む、請求項1に記載の微小粒子回収方法。
- 前記エマルションを構成する全液滴のうち、70%以上の数の液滴が1つの回収対象粒子を含む、請求項1又は2に記載の微小粒子回収方法。
- 前記第一液体が親水性であり、且つ、前記第二液体が疎水性である、請求項1~3のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記第二液体の動粘度が、前記第一液体の動粘度の1/100倍~100倍である、請求項1~4のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記通流工程、前記判定工程、及び前記回収工程は、前記第二液体を前記液体供給流路から前記接続流路へと供給しながら行われる、請求項1~5のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記主流路が、前記接続流路及び回収対象粒子以外の微小粒子が流れる少なくとも一つの廃棄流路へと分岐し、
前記液体供給流路が、前記接続流路へ液体を供給する、
請求項1~6のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。 - 前記接続流路に、前記第一液体が前記回収流路へと進行することを防ぐバルブが設けられている、請求項1~7のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記通流工程において、前記微小粒子が前記主流路内を略一列に並んで前記接続流路に向かって流れる、請求項1~8のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記微小粒子分取機構は、微小粒子を含有する液体が流れるサンプル流路及び微小粒子を含有しない液体が流れるシース流路が合流部で主流路へ連結し、合流部後の主流路に微小粒子が主流路内を略一列に並び流れるようにする流路構造を有し、
当該流路構造によって、略一列に並んで流れる微小粒子を含む層流が形成される、
請求項1~9のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。 - 前記判定工程において、前記主流路中を流れる微小粒子に光が照射され、当該照射により生じた光に基づき当該微小粒子が回収対象粒子であるかが判定される、請求項1~10のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記回収工程において、前記回収流路内の圧力変動により、前記回収対象粒子が前記接続流路を通って前記回収流路内へと回収される、請求項1~11のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記主流路、前記接続流路、及び前記回収流路が直線状に並んでいる、請求項1~12のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記微小粒子が細胞又は細胞塊であり、且つ、前記第一液体が当該微小粒子の培養液である、請求項1~13のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記微小粒子が細胞、細胞塊、又は合成粒子であり、且つ、前記回収工程後に当該微小粒子が破壊される、請求項1~14のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記回収流路内の回収された微小粒子が、さらなる微小粒子分取処理に付される、請求項1~15のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 前記微小粒子分取機構が、前記流路構造を一つ又は二つ以上含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の微小粒子回収方法。
- 微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有し、
前記主流路は、第一液体に含まれた状態で流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定するために用いられる判定領域を有し、
回収対象粒子であると判定された微小粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収され、且つ、前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される微小粒子回収方法を実行するために用いられる、
微小粒子分取用マイクロチップ。 - 微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、
を含む流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップと、
前記主流路に、微小粒子を含む第一液体を供給する第一液体供給部と、
前記液体供給流路に、前記第一液体と非混和性である第二液体を供給する第二液体供給部と、
前記主流路内を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定部と、
を備えており、且つ、
前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される微小粒子回収方法を実行するように構成されている、
微小粒子回収装置。 - 前記微小粒子分取用マイクロチップが、前記微小粒子回収装置から取り外し可能である、請求項19に記載の微小粒子回収装置。
- 微小粒子が通流される主流路と、
前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収され、且つ、
前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される、
微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションの製造方法。
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