CN109536590A - 一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法，包括以下步骤：1)提供一种包含若干微孔单元的微孔阵列芯片；2)将细胞悬液滴加于微孔阵列芯片上，通过离心实现单细胞在单个微孔单元中的定位；3)在微孔阵列芯片上粘贴PCR封装膜，进行第一次封装，离心，高温加热，揭掉PCR封装膜；4)在微孔阵列芯片上滴加PCR预混液，采用聚丙烯双面胶膜粘贴微孔阵列芯片，离心，将玻璃盖板与聚丙烯双面胶膜上层贴合，实现第二次封装；以及5)将第二次封装完成的微孔阵列芯片放置于PCR原位仪上进行PCR，反应结束后，显微镜下观察荧光信号，分析单细胞基因表达水平。根据本发明提供的方法实现了单细胞水平的高通量、一体化和快速检测。

Description

一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法

技术领域

本发明涉及单细胞基因检测技术领域，更具体地涉及一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法。

背景技术

细胞是生物体的基本组成单元，随着显微镜成像技术的发展，细胞间的相似及差异都逐渐显现。细胞的分类一般根据其来源组织或者细胞本身和其分泌物的特征而定。根据细胞群体的行为分类细胞有助于定位疾病相关细胞类型以及描述细胞间相互作用。利用分子生物学高通量分析技术，获得了大量生物体以及生物群体的基因图谱，而且推动了人类蛋白组学以及癌症的研究进程。

随着单细胞研究技术的发展，同一组织来源的细胞在尺寸、基因表达和生长特征方面存在的异质性逐渐显露。很多研究显示细胞群体的这些特征的分布并非正态分布，而属于更复杂的分布模式。尽管如此，许多细胞研究还是基于基础正态分布的假设而取大量细胞检测结果的平均值，而这些传统检测方法明显平均掉个别细胞的微小差异，使其无法检测到。但是恰恰是少数细胞中的突变基因或者蛋白异常分泌对重大疾病特别是癌症的发生发展起着关键作用。所以准确的检测单细胞水平的生物学特征是生物学及医学研究中亟待发展的技术。

为了准确描述及阐明细胞异质性的根本原因，则需要分析足够数量的单细胞才能反映整体情况。而目前传统的高通量单细胞分析技术一般是基于激光的流式细胞术。该技术是将成千上万的细胞以一定速率经过探测器，再通过激光来分析荧光信号以及单细胞的光散射性质。流式细胞术只适用于单一时间点的细胞的蛋白表达分析，特别是标记有荧光的或者本身有荧光的蛋白，无法应用于一些重要的单细胞分析，如长时间的特定细胞的追踪和细胞分泌产物分析等。而在很大程度上是因为该技术无法对单细胞进行精准区分。

近年来，发展起来一种研究微尺度下流体行为和操控的微流控技术。在该领域，越来越多的微流控技术开发出来，被应用于医疗、生物技术、材料科学和化学领域。而在过去的几年中，基于微流控技术的单细胞分析研究也呈显著增加趋势，主要包括阀驱动的微流体系统，乳液滴系统和微孔阵列检测系统等。2013年，White AK等开发了一种阀门控制的单细胞RNA检测装置，集成了单细胞捕获、裂解、反转录和数字PCR扩增功能，实现了高通量单细胞检测[White AK,Heyries KA,Doolin C,et al.High-throughput microfluidicsingle-cell digital polymerase chain reaction.Anal Chem,2013,85(15):7182-7190]。但是该装置采用多个阀门控制各个腔室的开合，结构较为复杂，操作繁琐，不适合更大通量的细胞检测。专利文献CN 104877898 A公开了一种基于液滴微流控芯片技术的单细胞分离获取方法，对获得的液滴进行破乳化、提取细胞以进行单细胞下游分子的检测。而该方法仅仅实现了单细胞的有效捕获，并未将细胞捕获和基因检测一体化。专利文献CN103894248 B公开了一种基于微孔阵列的单细胞检测方法，将单细胞捕获、鉴定及裂解过程集成在单块微流控芯片上。该方法实现了单细胞鉴定和裂解功能，但是仍旧无法在一个芯片上实现单细胞基因检测。

目前公开的单细胞检测技术主要存在以下几点问题：1)结构复杂，成本高；2)大多技术只能实现单细胞的免疫表型检测；3)无法实现单细胞捕获、裂解和核酸扩增功能一体化。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法，从而解决现有技术无法单细胞水平的高通量、一体化和快速检测的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明，提供一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法，包括以下步骤：1)提供一种微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片由玻璃基底和聚甲基硅氧烷芯片键合而成，所述聚甲基硅氧烷芯片包括微孔阵列和包围在所述微孔阵列外侧的外围沟道，所述微孔阵列包含若干微孔单元；2)将细胞悬液滴加于所述微孔阵列芯片上，通过离心操作使细胞沉降于所述微孔阵列芯片的各个微孔中，实现单细胞在单个微孔单元中的定位；3)在所述微孔阵列芯片上粘贴PCR封装膜，进行第一次封装，通过离心操作甩掉多余的溶液，然后高温加热使细胞膜蛋白变性失活，揭掉PCR封装膜；4)在所述微孔阵列芯片上滴加PCR预混液，然后采用聚丙烯双面胶膜粘贴所述微孔阵列芯片，通过离心操作甩掉多余的溶液，然后再利用紫外光固化胶将玻璃盖板与所述微孔阵列芯片上的聚丙烯双面胶膜上层贴合，实现第二次封装；以及5)将第二次封装完成的微孔阵列芯片放置在PCR原位仪上进行PCR，反应结束后，显微镜下观察荧光信号，分析单细胞基因表达水平。

优选地，所述步骤2)中细胞悬液中的细胞总个数少于所述微孔阵列芯片上微孔单元数量的十分之一，以保证经过离心操作之后单个微孔单元中最多落入一个细胞。

此处仅作为举例而非限制，本发明提供一种微孔阵列芯片，该聚甲基硅氧烷芯片上设计13×14个阵列，每个阵列包含144个微孔，所述聚甲基硅氧烷芯片上具有26208个微孔单元。

对于检测细胞在微孔中沉降的分布情况，符合泊松分布原理，假设将n个细胞加入到含有m个微孔的芯片中，每个孔中至多有一个细胞(1个细胞或者0个细胞)的概率可以表示如下：

根据公式计算，当我们设计26208个微孔时，加入2000个细胞则可以保证每个孔中至多有一个细胞的概率在99.7％，该芯片可同时对2000个细胞进行单细胞基因检测。因此优选地，当步骤2)中细胞悬液中的细胞总个数少于所述微孔阵列芯片上微孔单元数量的十分之一时，即可充分保证经过离心操作之后单个微孔单元中最多落入一个细胞。

应当理解的是，该微孔阵列芯片上的微孔单元数量和待检测细胞应当并不仅限于上述数值，研究者可以根据待检测细胞数量相应增加微孔数量，提高检测通量。

所述聚甲基硅氧烷芯片由经过PEG-(6-9)-硅氧烷处理过的聚甲基硅氧烷材料制成，表面表现为强亲水性，表面接触角≤20°。目的是为了减少PDMS表面对PCR预混液中蛋白和核酸大分子类物质的吸附，使目标核酸高效扩增，提高检测灵敏度。

所述步骤2)、3)、4)中的离心操作均通过匀胶机进行。

优选地，所述步骤3)中的高温加热是将微孔阵列芯片放置于恒温箱内75～85℃加热5～10min进行，使细胞膜蛋白变性失活。

所述步骤3)还包括在进行高温加热操作之后对微孔阵列芯片进行低温冷却。可选地，该低温冷却是将微孔阵列芯片移入4℃冰箱冷却10min。最后将PCR封装膜揭掉，细胞均被固定在微孔底部，即可进入后续的操作。

所述步骤4)中的PCR预混液可选地包含Taqman DNA聚合酶、dNTP、Taqman水解探针、Mg²⁺、0.2％Tween以及上、下游引物。

其中，所述Taqman水解探针是针对待测细胞中的特定基因序列设计的修饰有荧光基团和猝灭基团的特定序列。本领域技术人员可以根据待测细胞待检测基因种类设计不同水解探针，以实现多重基因检测。

所述步骤4)中利用紫外光固化胶将玻璃盖板与所述微孔阵列芯片上的聚丙烯双面胶膜上层进行贴合时，涂覆紫外光固化胶之后，在所述微孔阵列芯片的微孔阵列部分上方覆盖一张铝箔纸，进行紫外灯照射使紫外光固化胶完全固化。

可选地，所述步骤5)中在PCR反应程序前将第二次封装完成的微孔阵列芯片于50℃孵育30min，目的是使细胞膜破裂，释放待测核酸。

优选地，所述聚甲基硅氧烷芯片的厚度为0.2mm～1mm，所述外围沟道宽度为150μm～250μm，高度为50μm～60μm。其目的均是为了降低微孔中溶液的扩散，保证PCR的顺利完成。

还优选地，所述微孔直径为20μm～50μm，高度为50μm～60μm，同一行每相邻两个微孔之间的间距为30μm～60μm，相邻行中的一个微孔位于上一行与该微孔距离最近的两微孔中心的中轴线上。

优选地，所述细胞悬液是用10％FBS-PBS溶液重悬的体外培养细胞或者血液细胞。

可选地，所使用的PCR封装膜为96孔板专用粘附性膜，单面有胶，粘性为20oz/in。

进一步的，所使用的聚丙烯双面胶膜两面有胶，粘性≥50oz/in。

根据本发明的一个优选实施方案，提供了一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法，包括以下步骤：

1)提供一种微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片上具有26208个微孔单元；

2)将细胞悬液滴加于该微孔阵列芯片上，通过低速离心操作(28g，5min)使细胞沉降于微孔中，而且每个微孔中至多有一个细胞。其中，所述细胞悬液是用10％FBS-PBS溶液重悬的体外培养细胞或者血液细胞。

3)在芯片上粘贴PCR膜，对微孔阵列进行第一次封装，再通过离心操作(336g，5min)甩掉多余的溶液，然后将芯片放置在恒温箱内75～85℃高温加热7min，使细胞膜蛋白变性失活。反应结束后，立即将微孔阵列芯片移入4℃冰箱冷却10min，最后将PCR封装膜揭掉，细胞均被固定在微孔底部，即可进入后续的操作。

4)在芯片上滴加10μL PCR预混液(包含Taqman DNA聚合酶、dNTP、Taqman水解探针、Mg²⁺、0.2％Tween和引物)，待溶液充满所有微孔后，将聚丙烯双面胶膜一面聚酯膜揭掉，用聚丙烯双面胶膜贴合芯片，然后336g离心5min甩掉多余的溶液，使各个微孔形成封闭和分立的反应环境，然后再利用紫外光固化胶将玻璃与芯片上的聚丙烯双面胶膜上层贴合，使芯片上层与空气隔绝，减少溶液在芯片内的扩散挥发，实现微孔阵列芯片的第二次封装。

5)将封装好的微孔阵列芯片放置在PCR原位仪上进行PCR，反应结束后，显微镜下观察荧光信号，分析单细胞基因表达水平。PCR反应程序前加一步50℃孵育30min，目的是使细胞膜破裂，释放待测核酸。

根据本发明提供的上述单细胞基因检测方法，其工作原理是利用一种微孔阵列芯片来分离单个细胞，然后再在该微孔阵列芯片上实现细胞的裂解、核酸高效扩增以及信号读取，以实现单细胞水平的基因检测。

其优点体现在以下几个方面：1)本发明发展了一种结构简单的开放式微孔阵列芯片，利用芯片的表面张力和离心力驱动细胞沉降于微孔的进样方法省去了对外部机械泵和内部复杂微阀结构的需求，提出的“玻璃-聚丙烯双面胶膜-玻璃”的夹心结构实现了芯片方便有效的封装，也为开放式微流控芯片的封装提供了一种解决方案；2)本发明在芯片上实现了单细胞捕获、裂解、核酸扩增和信号读取功能一体化，可以对上千个细胞进行多重基因突变平行检测，研究者可以根据待检测细胞数量增加微孔数量，提高检测通量；3)本发明的微孔阵列芯片适用范围广，可以对细胞内的核酸和mRNA进行检测，还可以直接检测核酸提取物并进行绝对定量分析。

总之，根据本发明提供的一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法，利用具有开放式芯片结构的、构造简单的、制作成本低的微孔阵列芯片，进行单细胞捕获、裂解和目标核酸扩增等操作，无需复杂进样装置，可同时对上千个细胞进行多重基因单细胞水平平行检测，从而实现了单细胞水平的高通量、一体化和快速检测，为单细胞基因检测领域开辟了新的道路。

附图说明

图1为根据本发明的一个优选实施例制作的微孔阵列芯片的整体结构示意图；

图2为如图1所示微孔阵列芯片上的微孔阵列局部结构示意图；

图3为微孔阵列芯片在二次封装完成后的结构分解示意图；

图4为根据本发明的实施例三检测3×10²拷贝/μL核酸提取物的荧光结果图；

图5为根据本发明的实施例四H1975细胞、A549细胞和白细胞的EGFR T790M和L858R突变基因检测结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例一

检测单细胞基因的微孔阵列芯片的制备：

1)采用四寸单晶硅作为模具基底，旋涂2.4μm光刻胶，进行一次光刻，深反应离子刻蚀50μm-60μm，得到具有微结构的硅片模具。

2)对制作好的硅片模具表面做氟硅烷处理，便于PDMS从硅片上剥离。

3)称量PDMS预聚物和固化剂(重量比10：1)，将二者混匀，置于真空干燥箱中抽真空静置30min除气泡。

4)将硅片放置在甩胶仪上，浇注PDMS，旋涂200μm-1000μm厚。

5)然后在水平台上静置30min，使微结构中充满PDMS，然后放入80℃烘箱中加热1h。

6)待PDMS完全固化后，小心的将PDMS从硅片上剥离下来，用白膜粘贴PDMS防止沾染灰尘。

7)最后将PDMS芯片2无结构面的白膜撕掉，朝上和玻璃基底1一起放入等离子清洗机中清洗45s，取出后迅速贴合在一起，即完成了微孔阵列芯片的制作。如图1所示，所述芯片由玻璃基底1和聚甲基硅氧烷(PDMS)芯片2键合而成，该微孔阵列芯片结构包括微孔阵列22和外围沟道21。如图2所示，微孔阵列区域中每个阵列内下排微孔24位置位于上排两微孔23中心的中轴线上。

实施例二

单细胞基因检测过程：

1)细胞沉降：利用芯片制作过程中无结构的空白PDMS切割一个面积大于微孔阵列区域的PDMS垫圈，然后将PEG(6-9)-硅氧烷处理过的微孔阵列芯片和PDMS垫圈放入等离子体清洗机中处理1min，再将PDMS垫圈键合到微孔阵列区域22外围，形成一个样品槽。将50μL细胞悬液滴加在制作好的芯片的样品槽中，然后将芯片用胶带固定在一个四寸硅片中心位置，再把固定好的硅片放置在甩胶机上，真空吸附后，28g离心5min，使细胞沉降在微孔中。

2)细胞裂解：吸取样品槽中40μL溶液，移去PDMS垫圈，用PCR封装膜贴合芯片，对该微孔阵列芯片进行第一次封装，然后在甩胶仪上336g离心5min。接着将芯片放入PCR原位仪中，芯片上再放置一块载玻片，防止PCR封装膜受蒸汽作用与芯片分离。PCR仪设置程序为75℃8min。反应结束后，立即将芯片移入4℃冰箱冷却10min。最后将PCR封装膜揭掉，细胞均被固定在微孔底部，即可进入后续的操作。

3)核酸扩增：在完成细胞裂解步骤的芯片上滴加10μL PCR预混液或者RT-PCR预混液，待溶液充满所有微孔后，结合图3所示，将聚丙烯双面胶膜3一面聚酯膜揭掉，用聚丙烯双面胶膜贴合芯片，然后在甩胶仪上336g离心5min。用枪头将紫外光固化胶水4涂布在芯片的封装膜表面和PDMS芯片四周，然后将切割好的37mm*25mm载玻片5覆盖在芯片上，在芯片微阵列部分覆盖一小块铝箔纸。用紫外灯照射20s，使胶水完全固化。

4)结果观察：将芯片转移到PCR原位仪中进行PCR反应。在倒置荧光显微镜下观察荧光信号种类和强度。

实施例三

利用该微孔阵列芯片检测从肺癌细胞株H1975细胞中提取的基因组核酸中的EGFR21号外显子基因，具体步骤如下：配置10μL PCR预混液(包含5μL Premix Ex Taq mix，400nM的上下游引物，300nM MGB探针(追踪所有EGFR 21外显子基因产物，在HEX通道中有荧光信号)，0.2％Tween和1μL细胞核酸提取物)，吸取8μL PCR预混液滴加在PEG(6-9)-硅氧烷处理过的微孔阵列芯片上。待溶液充满整个待溶液充满所有微孔后，将与芯片大小一样的聚丙烯双面胶膜的一面聚酯膜揭掉，从一端轻轻地贴合在芯片上，保证没有气泡。然后将芯片用胶带固定在一个四寸硅片中心位置，再将固定好的硅片放置在甩胶仪上，真空吸附后，336g离心5min，将膜与芯片之间多余的溶液甩出，使膜与芯片贴合紧密。用枪头将紫外光固化胶水涂布在芯片的封装膜表面和PDMS芯片四周，然后将切割好的37mm*25mm载玻片覆盖在芯片上，在芯片微孔阵列部分覆盖一小块铝箔纸。用紫外灯照射20s，使胶水完全固化。将芯片转移到PCR原位仪中进行PCR反应。在倒置荧光显微镜下观察荧光信号种类和强度。检测3×10²拷贝/μL核酸提取物结果如图4所示，阳性信号为含有待测模板的微孔PCR扩增出来的信号。

实施例四

采用实施例二的检测方法，对已知有EGFR L858R和T790M突变的肺癌H1975细胞、无突变的正常人白细胞和无突变的肺癌A549细胞进行单细胞EGFR突变基因检测。PCR预混液中的MGB探针包含HEX、FAM和ROX探针，分别追踪所有EGFR20号和21号外显子产物、EGFR-L858R突变产物和EGFR-T790M突变产物。部分检测结果如图5所示，正常人白细胞和A549细胞仅在HEX通道下有荧光信号，说明两种细胞仅表达野生型EGFR基因。而并非所有的H1975细胞均发生双点突变，部分细胞只有EGFR-L858R突变或者EGFR-T790M突变。这些结果都说明该检测装置可以实现芯片上细胞捕获、裂解、PCR扩增和信号读取功能于一体，对单细胞进行多种基因平行检测。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提供一种微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片由玻璃基底和聚甲基硅氧烷芯片键合而成，所述聚甲基硅氧烷芯片包括微孔阵列和包围在所述微孔阵列外侧的外围沟道，所述微孔阵列包含若干微孔单元；

2)将细胞悬液滴加于所述微孔阵列芯片上，通过离心操作使细胞沉降于所述微孔阵列芯片的各个微孔中，实现单细胞在单个微孔单元中的定位；

3)在所述微孔阵列芯片上粘贴PCR封装膜，进行第一次封装，通过离心操作甩掉多余的溶液，然后高温加热使细胞膜蛋白变性失活，揭掉PCR封装膜；

4)在所述微孔阵列芯片上滴加PCR预混液，然后采用聚丙烯双面胶膜粘贴所述微孔阵列芯片，通过离心操作甩掉多余的溶液，然后再利用紫外光固化胶将玻璃盖板与所述微孔阵列芯片上的聚丙烯双面胶膜上层贴合，实现第二次封装；

5)将第二次封装完成的微孔阵列芯片放置在PCR原位仪上进行PCR，反应结束后，显微镜下观察荧光信号，分析单细胞基因表达水平。

2.根据权利要求1所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述步骤2)中细胞悬液中的细胞总个数少于所述微孔阵列芯片上微孔单元数量的十分之一，保证经过离心操作之后单个微孔单元中最多落入一个细胞。

3.根据权利要求1所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述聚甲基硅氧烷芯片由经过PEG-(6-9)-硅氧烷处理过的聚甲基硅氧烷材料制成，表面表现为强亲水性，表面接触角≤20°。

4.根据权利要求1所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述步骤2)、3)、4)中的离心操作均通过匀胶机进行。

5.根据权利要求1所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述步骤3)中的高温加热是将微孔阵列芯片放置于恒温箱内75～85℃加热5～10min进行。

6.根据权利要求5所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述步骤3)还包括在进行高温加热操作之后对微孔阵列芯片进行低温冷却。

7.根据权利要求1所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述PCR预混液包含Taqman DNA聚合酶、dNTP、Taqman水解探针、Mg²⁺、0.2％Tween以及上、下游引物。

8.根据权利要求7所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述Taqman水解探针是针对待测细胞中的特定基因序列设计的修饰有荧光基团和猝灭基团的特定序列。

9.根据权利要求1所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述步骤4)中利用紫外光固化胶将玻璃盖板与所述微孔阵列芯片上的聚丙烯双面胶膜上层进行贴合时，涂覆紫外光固化胶之后，在所述微孔阵列芯片的微孔阵列部分上方覆盖一张铝箔纸，进行紫外灯照射使紫外光固化胶完全固化。

10.根据权利要求1所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述聚甲基硅氧烷芯片的厚度为0.2mm～1mm，所述外围沟道的宽度为150μm～250μm，高度为50μm～60μm。