CN111763612B - 一种单细胞基因检测芯片及其制作方法与检测方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种单细胞基因检测芯片及其制作方法与检测方法，此芯片包括依次贴合的玻璃基片(3)、PDMS主芯层(2)、聚丙烯双面胶膜(1)，PDMS主芯层(2)开槽结构面上开设检测槽和负压槽，检测槽形成供待测细胞溶液流入的检测流道，负压槽形成负压空腔；检测流道依次包括进样口(21)、主流道(24)、微道腔阵列和废液腔(22)，沿主流道(24)两侧依次开设侧微道(28)，每个侧微道(28)终端开设微腔(26)，主流道(24)经过微道腔阵列分流后其终端通入废液腔(22)；本发明为自驱动式微腔阵列芯片，负压结构缩短了进样时间，省去了复杂微阀泵结构，芯片可实现单细胞捕获、裂解、核酸扩增功能。
Description
技术领域
本发明涉及细胞基因检测技术领域，具体涉及一种单细胞基因检测芯片及其制作方法，以及相应的单细胞基因检测方法。
背景技术
基因是生物体内携带遗传信息的物质的总称。通过检测基因，可以了解各个生物体的性状表达、探究疾病的成因，还可以达到预测和预防人类疾病的目的。传统的细胞基因检测方法有二代测序技术、基因芯片法、实时荧光定量PCR法等。这些方法都要经过核酸提取和纯化步骤得到纯度较高的核酸样本才能够实施。另外，随着细胞生物学和病理学的深入研究，人们发现无论是正常细胞还是肿瘤细胞均存在异质性。而传统的细胞基因检测方法都是需要获取大量细胞样本，无法分析特定单个细胞基因。
随着微流控和微机械加工技术的不断完善和发展，微全分析系统（Micro totalanalysis system，μ-TAS）在细胞水平上的生物学研究和临床实验诊断等领域里的优势日趋显著。微流控芯片因功能单元尺寸与细胞大小相当、精度高和检测快速方便等优点，在细胞分析方面表现出了明显的优势。该技术可以将现行所有的细胞分析步骤和过程（如细胞操纵、细胞捕捉/筛选、细胞培养以及在线实时动态监测分析等）整合于一块微芯片上，实现分析操作的一体化，可以减少操作过程中对细胞样本的损伤和污染，非常适合少量细胞特定基因的快速高灵敏检测。
目前，针对单细胞基因检测发展了一系列新型的微流控芯片及装置，主要可以分为以下几类：（1）利用乳液滴单元，包裹单个细胞，为细胞基因检测提供独立的空间。再利用微结构操纵液滴融合，实现单细胞的裂解和核酸扩增，如专利文献CN109988821A。（2）利用微腔结构单元，捕获单个细胞，再通过微阀结构控制特定通道开闭，通入裂解液裂解细胞并驱动裂解产物流入微反应腔内扩增，如专利文献CN106065391A。（3）利用介电电泳原理，在微芯片内集成电极，捕获单细胞，然后施加高电压裂解细胞，如专利文献CN107267382A。而微流控芯片内细胞基因检测方法主要有：（1）在核酸扩增试剂中加入特异性Taqman探针，根据荧光信号分析基因表达。（2）回收核酸扩增产物，采用二代测序技术检测目标核酸。（3）采用原位核酸杂交技术，无需裂解细胞即可分析基因。
以上这些应用于单细胞基因检测的微流控装置，仍旧存在以下几点问题：1）能够实现单细胞基因检测一体化的芯片，结构复杂，需要外接的进样或者操控设备。2）结构简单的芯片只是实现了单细胞捕获和裂解，没有将所有检测步骤集成化。
聚二甲基硅氧烷，英文名称Polydimethylsiloxane，简称PDMS。是一种高分子有机聚合物，具有光学透明与内部细微结构的多孔性，而且生物兼容性很好。PDMS的应用包括在生物微机电中的微流道系统、填缝剂、润滑剂、隐形眼镜。液态时的二甲基硅氧烷为一黏稠液体，称做硅油，是一种具有不同聚合度链状结构的有机硅氧烷混合物，其端基和侧基全为烃基（如甲基、乙基、苯基等）。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种单细胞基因检测芯片，摆脱对进样装置的依赖，将单细胞捕获、裂解、基因检测功能集成于一体，解决现有技术存在的芯片结构复杂和步骤繁琐等问题。本发明还提供此种单细胞基因检测芯片的制作方法，以及使用此种自驱动式微腔阵列芯片而实现的的单细胞基因检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明单细胞基因检测芯片所采用的技术方案为：
一种单细胞基因检测芯片，包括由下而上依次贴合的玻璃基片(3)、PDMS主芯层(2)、聚丙烯双面胶膜(1)，聚丙烯双面胶膜(1)上开设有进样孔(11)，所述PDMS主芯层(2)上面为开槽结构面，下面为光面，其特征在于，所述PDMS主芯层(2)开槽结构面上从同一水平面上向下开设检测槽和负压槽，检测槽在聚丙烯双面胶膜(1)下面形成供待测细胞溶液流入的检测流道，负压槽在聚丙烯双面胶膜(1)下面形成负压空腔，所述负压空腔相对检测流道形成负压；检测流道按试样流向依次包括进样口(21)、主流道(24)、微道腔阵列和废液腔(22)，沿所述主流道(24)两侧依次开设侧流道(28)，每个侧流道(28)终端开设微腔(26)，每个侧流道(28)的尺寸只允许一个单细胞流入，每个微腔(26)的尺寸允许容纳一个单细胞，沿所述主流道(24)两侧所开设的侧流道(28)与微腔(26)，形成微道腔阵列，所述主流道(24)经过微道腔阵列分流后其终端通入废液腔(22)。
以下为本发明单细胞基因检测芯片进一步的方案：
所述主流道(24)在PDMS主芯层(2)开槽结构面反复迂回前行布置，形成多条长直槽(4)，在每2条纵向长直槽(4)之间的迂回端形成短横槽(5)，沿所述长直槽(4)两侧依次开设侧流道(28)与微腔(26)，形成所述微道腔阵列，所述多条长直槽(4)、短横槽(5)与微道腔阵列共同在PDMS主芯层(2)开槽结构面上形成检测区域(6)，所述检测区域(6)右旁设置空余区域，所述废液腔(22)开设在空余区域。
所述主流道(24)宽度为80μm 至100μm，主流道(24)槽深度为20μm 至25μm，侧流道(28)宽度为20μm 至25 μm，侧流道(28)槽深度为20μm 至25 μm，微腔(26)直径为50μm 至80μm，微腔(26)槽深度为50 μm至60 μm，同一列中微腔(26)之间的间距为150μm 至200μm；微腔(26)个数为2000至2500个。
为防止腔体塌陷，所述废液腔(22)中设置有支撑柱(7) 阵列，每个支撑柱(7)直径为100μm；所述废液腔(22)呈正方形，边长为2mm，槽深度为50 μm至60 μm；或者，所述废液腔(22)呈圆形，直径为2mm。
所述负压空腔包括围绕在检测区域(6)外围的外腔道与伸入检测区域(6)每2条长直槽(4)之间的内腔道(8)，外腔道包括位于检测区域(6)上端的外腔道上段(12)，隔着废液腔(22)位于检测区域(6)右边的外腔道右段(13)，位于检测区域(6)下端的外腔道下段(14)；从外腔道上段(12)引入的各内腔道(8)在长直槽(4)下侧迂回端内形成盲端(9)，从外腔道下段(14)引入的各内腔道(8)在长直槽(4)上侧迂回端内形成盲端(9)。
所述负压空腔各内腔道(8)的槽宽度大于外腔道的槽宽度，在每个微腔(26)位置相对应处保留半圆柱凸出槽壁(10)，形成半圆柱凸出槽壁(10)阵列，半圆柱凸出槽壁(10)与对应的微腔(26)为同心圆；所述负压空腔包括开设在于检测区域(6)右边空余区域的圆孔腔(23)，从圆孔腔(23)开设至少1条通道与外腔道右段(13)相通。
所述外腔道宽度为80μm 至100μm，槽深度为50 μm至60 μm，侧流道宽度为80μm 至100μm，槽深度为50 μm至60 μm，各内腔道(8)的半圆柱凸出槽壁(10)的半径为60μm至75μm，各内腔道(8)的两侧半圆柱凸出槽壁(10)相对处为其槽宽度最小处，内腔道(8)槽宽度最小处的槽宽度为80μm 至100μm，各内腔道(8)槽深度为50 μm至60 μm；圆孔腔(23)是通过打孔器制作的通孔，直径为2mm至3mm；所述PDMS主芯层(2)厚度为2mm至3mm。
为了解决上述技术问题，本发明单细胞基因检测芯片的制作方法所采用的技术方案为：一种单细胞基因检测芯片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、PDMS主芯层(2)模具的制备：采用四寸单晶硅作为衬底，进行热氧化，生长一层2μm厚二氧化硅氧化层；旋涂2.4 μm光刻胶，进行一次光刻，湿法刻蚀去除二氧化硅层；对硅片进行浓硫酸和双氧水清洗，去除光刻胶；旋涂1.4μm光刻胶，进行一次光刻，深反应离子刻蚀，得到第一种高度的微结构；对硅片进行浓硫酸和双氧水清洗，去除光刻胶；以二氧化硅层图形为掩膜，深反应离子刻蚀，得到第二种高度的微结构；最后就得到具有不同高度微结构的硅片模具；
步骤2、PDMS主芯层(2)的制备及前处理：将制作好的硅片模具放入氟硅烷气氛中孵育4h，方便后续PDMS芯片的剥离；称量PDMS预聚物和固化剂，按重量比15：1将二者混匀，置于真空度设定为13psi的真空干燥器的中静置30 min除去大部分气泡；将硅片放置在水平台上，浇注PDMS混合物，静置30 min，使微结构中充满PDMS；放入80℃烘箱中加热1 h，待PDMS完全固化后，小心地将PDMS从硅片上剥离下来；采用针筒加特定孔径的针头，在PDMS芯片上面的设定位置打孔形成进样口(21)和圆孔腔(23)；用PCR粘附性膜粘贴PDMS芯片上层与下层，用针头按PDMS芯片上的进样口(21)对应位置在PCR膜上打孔，使进样口(21)与外界相通；将封装好的芯片置于等离子清洗机的真空状态下2h，照射辉光2min后拿出芯片，在进样孔(11)滴加v:v=1:1的PEG(6-9)-硅氧烷与丙酮混合溶液，利用PDMS芯片内负压作用使混合溶液充满整个芯片管道，室温孵育1h。将PDMS芯片上的PCR粘附性膜去除，用超纯水冲洗掉芯片内的混合溶液，此时PDMS芯片内样品检测区的微管道内表面均呈亲水性，可以减少管道对蛋白物质的吸附；
步骤3、PDMS主芯层(2)的封装与保存：将处理过的PDMS芯片2的结构面朝上和玻璃基底3一起放入等离子清洗机中清洗90s，取出后迅速贴合在一起，在90℃热板上加热30min，加强两者的结合程度；去除聚丙烯双面胶膜(1)1一面的透明膜，与PDMS芯片2上侧贴合，用针头按PDMS芯片上的进样口(21)对应位置在聚丙烯双面胶膜(1)上打孔形成进样孔(11)；将封装好的芯片置于真空干燥器中预脱气12h，然后拿出后放入真空袋内抽真空后备用。
为了解决上述技术问题，本发明单细胞基因检测方法所采用的技术方案为：
一种单细胞基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）、将封装好的单细胞基因检测芯片置于真空干燥器中预脱气12h，然后将芯片取出，使芯片内部相对外界形成负压；在进样口(21)处滴加细胞溶液，利用芯片内部相对外界的负压吸引细胞溶液快速进入整个样品检测区并充满所有腔体；
步骤（2）、将芯片放在PCR原位仪上，经过高温孵育，使芯片内水分蒸发，细胞膜蛋白变性失活；
步骤（3）、再将芯片放置在真空干燥器中预脱气2h，拿出芯片后，在进样口(21)处滴加核酸扩增试剂进行核酸扩增；
步骤（4）、当核酸扩增试剂进样完毕时，将油相加入进样口(21)，油相会推动主管道内反应液流向废液腔(22)，而不会进入微腔(26)阵列内，达到分隔所有微腔(26)室的目的；
步骤（5）、采用紫外光固化胶密封进样口(21)，再将芯片放置在PCR原位仪上进行恒温反应；反应结束后，在显微镜下观察荧光信号，根据荧光信号有无，分析微腔(26)内单细胞突变基因表达水平。
进一步的方案：
控制从进样口(21)处所滴加入的细胞溶液中的单细胞个数不多于微腔(26)个数，以免过多的单细胞堵塞通道；所述的侧流道(28)仅允许1个单细胞通过，然后一个细胞进入微腔（26）后会使微腔内部的流阻变大，致使下一个细胞无法进入该微腔，这样每个微腔(26)中就至多包含一个细胞。微腔26空间是比一个细胞大的，但是每个微腔的入口比较小，就是指侧流道的横截面尺寸比较小，只允许一个细胞通过。微腔26空间之所以设置的比一个细胞大，是因为太小的话，不利于后续核酸检测。
所述步骤（3）中核酸扩增的方式为环介导恒温扩增方式；检测特定突变基因时，核酸扩增试剂包含Bst DNA聚合酶、MgCl2、dNTP、三对引物、钙黄绿素-Mn2+和缓冲液；检测mRNA时，采用一步法RT-LAMP试剂盒，另外添加钙黄绿素作为荧光染料，表征扩增产物。
本发明提供了一种自驱动式微腔阵列结构的单细胞基因检测芯片的设计方案及其制作方法，以及相应的单细胞基因检测方法，其优点体现在以下几个方面：1、本发明发展了一种结构简单的自驱动式微腔阵列芯片，真空驱动区域的结构设计，增强了PDMS芯片储存负压的能力，缩短了进样时间。而利用这种自驱动的进样方法省去了对外部机械泵和内部复杂微阀结构的需求。2、本发明在芯片上实现了单细胞捕获、裂解、核酸扩增和信号读取功能一体化，可以同时对上千个细胞进行基因检测。研究者可以根据待检测细胞数量增加微腔数量和真空驱动的半圆柱结构数量，提高检测通量。3、本发明的自驱动式微腔阵列单细胞基因检测芯片适用范围广，可以对细胞内的突变基因或者mRNA进行检测。此外，本发明，并且可批量化制造，成本低，检测灵敏度高等特点，具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明单细胞基因检测芯片的三层结构分解示意图。
图2为本发明为PDMS主芯层上面开槽结构面俯视示意图。
图3为图2中局部A放大示意图。
图4为PDMS主芯层局部A立体示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明单细胞基因检测芯片，如图1所示，包括由下而上依次贴合的玻璃基片3、PDMS主芯层2、聚丙烯双面胶膜1，聚丙烯双面胶膜1上开设有进样孔11，PDMS主芯层2上面为开槽结构面，下面为光面。如图2所示，PDMS主芯层2开槽结构面上从同一水平面上向下开设检测槽和负压槽，检测槽在聚丙烯双面胶膜1下面形成供待测细胞溶液流入的检测流道，负压槽在聚丙烯双面胶膜1下面形成负压空腔，由于PDMS主芯层2材料内部细微结构的多孔性，负压空腔相对检测流道形成负压。检测流道按试样流向依次包括进样口21、主流道24、微道腔阵列和废液腔22，沿主流道24两侧依次开设侧流道28，每个侧流道28终端开设微腔26，微腔26呈圆孔状为宜；每个侧流道28的尺寸只允许一个单细胞流入，每个微腔26的尺寸只允许容纳一个单细胞，沿主流道24两侧所开设的侧流道28与微腔26，形成微道腔阵列，主流道24经过微道腔阵列分流后其终端通入废液腔22。
聚丙烯双面胶膜按照PDMS芯片大小裁剪而成，其进样孔11直径略小于PDMS主芯层2的进样口21为佳。其中的PDMS主芯层2 的开槽结构面的开槽结构，按其所要实现主要功能，可分为两大部分：一是为实现检测功能的开槽结构，二是为实现负压驱动功能的开槽结构。
如图2、图3、图4所示，主流道24在PDMS主芯层2开槽结构面反复迂回前行布置，形成多条长直槽4，在每2条纵向长直槽4之间的迂回端形成短横槽5，沿长直槽4两侧依次开设侧流道28与微腔26，形成微道腔阵列，多条长直槽4、短横槽5与微道腔阵列共同在PDMS主芯层2开槽结构面上形成检测区域6。检测区域6右旁设置空余区域，废液腔22开设在空余区域。主流道24宽度为80μm 至100μm，主流道24槽深度为20μm 至25μm，此槽深度刚好限制细胞呈单层流过。侧流道28宽度为20μm 至25 μm，侧流道28槽深度为20μm 至25 μm，此侧流道28从其宽度与槽深度2个维度均刚好够单个单细胞流过。微腔26直径为50μm 至80 μm，微腔26槽深度为50 μm至60 μm，同一列中微腔26之间的间距为150μm 至200μm；微腔26个数为2000至2500个。为防止腔体塌陷，废液腔22中设置有支撑柱7阵列，每个支撑柱7直径为100μm。废液腔22呈正方形，边长为2mm，槽深度为50 μm至60 μm；或者，废液腔22呈圆形，直径为2mm。样品检测区域中的主流道24一端与进样口21连接，两侧通过较窄的侧流道28与圆孔型微腔26相连，其尾端与废液腔22相通。
如图2、图3、图4所示，检测区域6中的主通道一端与进样口21连接，两侧通过较窄的侧流道28与圆孔型微腔相连，其尾端与废液腔22相通。主流道24宽度为80μm 至100μm，高度为10μm 至25μm，高度刚好限制细胞呈单层流过。主通道两侧排布着一系列的侧流道28，侧流道28将所有微腔26与主流道24连通，侧流道28呈鱼骨型排列，与主流道24呈45°夹角，其宽度为10μm 至25 μm，槽深度为10μm 至25 μm，能够使单个单细胞顺利流入，待单个单细胞流入微腔后，腔室内流阻变大，其他单细胞会自动向下一个侧流道28与微腔26流去，从而实现单细胞的捕获。微腔用来捕获单细胞，并为单细胞裂解和核酸扩增提供封闭空间。微腔26直径为30μm 至40 μm，槽深度度为20 μm至30 μm，同一列中微腔之间的间距为100μm 至200μm。微腔个数为2000至2500个。废液腔22用来存储多余的溶液，可以为边长为2mm的正四方体形状或者直径为2mm的圆柱体形状，槽深度为50 μm至60 μm，其中有直径为100μm支撑柱阵列，防止腔体塌陷。
如图2、图3、图4所示，负压空腔包括围绕在检测区域6外围的外腔道与伸入检测区域6每2条长直槽4之间的内腔道8，外腔道包括位于检测区域6上端的外腔道上段12，隔着废液腔22位于检测区域6右边的外腔道右段13，位于检测区域6下端的外腔道下段14；从外腔道上段12引入的各内腔道8在长直槽4下侧迂回端内形成盲端9，从外腔道下段14引入的各内腔道8在长直槽4上侧迂回端内形成盲端9。
如图2、图3、图4所示，负压空腔各内腔道8的槽宽度大于外腔道的槽宽度，在每个微腔26位置相对应处保留半圆柱凸出槽壁10，形成半圆柱凸出槽壁10阵列，半圆柱凸出槽壁10与对应的微腔26为同心圆；负压空腔包括开设在于检测区域6右边空余区域的圆孔腔23，从圆孔腔23开设至少1条通道与外腔道右段13相通。外腔道宽度为80μm 至100μm，槽深度为50 μm至60 μm，侧流道宽度为80μm 至100μm，槽深度为50 μm至60 μm，各内腔道8的半圆柱凸出槽壁10的半径为60μm至75μm，各内腔道8的两侧半圆柱凸出槽壁10相对处为其槽宽度最小处，内腔道8槽宽度最小处的槽宽度为80μm 至100μm，各内腔道8槽深度为50 μm至60 μm；圆孔腔23是通过打孔器制作的通孔，直径为2mm至3mm；PDMS主芯层2厚度为2mm至3mm。
在进样过程中，外界大气压会推动溶液逐渐充满样品检测区，而样品检测区内原有的少量气体则通过PDMS的孔隙扩散到真空驱动区域，所以真空驱动区域的所有腔体都起到了加速样品流动的作用。
封装膜为聚丙烯双面胶膜，两面有胶，粘性≥50 oz/in。
本发明单细胞基因检测芯片的制作方法，包括以下步骤：
步骤1、PDMS主芯层2模具的制备：采用四寸单晶硅作为衬底，进行热氧化，生长一层2μm厚二氧化硅氧化层；旋涂2.4 μm光刻胶，进行一次光刻，湿法刻蚀去除二氧化硅层；对硅片进行浓硫酸和双氧水清洗，去除光刻胶；旋涂1.4μm光刻胶，进行一次光刻，深反应离子刻蚀，得到第一种高度的微结构；对硅片进行浓硫酸和双氧水清洗，去除光刻胶；以二氧化硅层图形为掩膜，深反应离子刻蚀，得到第二种高度的微结构；最后就得到具有不同高度微结构的硅片模具。
步骤2、PDMS主芯层2的制备及前处理：将制作好的硅片模具放入氟硅烷气氛中孵育4h，方便后续PDMS芯片的剥离；称量PDMS预聚物和固化剂，按重量比15：1将二者混匀，置于真空度设定为13psi的真空干燥器的中静置30 min除去大部分气泡；将硅片放置在水平台上，浇注PDMS混合物，静置30 min，使微结构中充满PDMS；放入80℃烘箱中加热1 h，待PDMS完全固化后，小心地将PDMS从硅片上剥离下来；采用针筒加特定孔径的针头，在PDMS芯片上面的设定位置打孔形成进样口21和圆孔腔23；用PCR粘附性膜粘贴PDMS芯片上层与下层，用针头按PDMS芯片上的进样口21对应位置在PCR膜上打孔，使进样口21与外界相通；将封装好的芯片置于等离子清洗机的真空状态下2h，照射辉光2min后拿出芯片，在进样孔11滴加v:v=1:1的PEG6-9-硅氧烷与丙酮混合溶液，利用PDMS芯片内负压作用使混合溶液充满整个芯片管道，室温孵育1h。将PDMS芯片上的PCR粘附性膜去除，用超纯水冲洗掉芯片内的混合溶液，此时PDMS芯片内样品检测区的微管道内表面均呈亲水性，可以减少管道对蛋白物质的吸附。
步骤3、PDMS主芯层2的封装与保存：将处理过的PDMS芯片2的结构面朝上和玻璃基底3一起放入等离子清洗机中清洗90s，取出后迅速贴合在一起，在90℃热板上加热30min，加强两者的结合程度；去除聚丙烯双面胶膜11一面的透明膜，与PDMS芯片2上侧贴合，用针头按PDMS芯片上的进样口21对应位置在聚丙烯双面胶膜1上打孔形成进样孔11；将封装好的芯片置于真空干燥器中预脱气12h，然后拿出后放入真空袋内抽真空后备用。
本发明单细胞基因检测方法，包括以下步骤：
步骤（1）、单细胞捕获：将封装好的单细胞基因检测芯片置于真空干燥器中预脱气12h，然后将芯片取出，使芯片内部相对外界形成负压；在进样口21处滴加细胞溶液，利用芯片内部相对外界的负压吸引细胞溶液快速进入整个样品检测区并充满所有腔体。
步骤（2）、细胞裂解：将芯片放在PCR原位仪上，经过高温孵育，使芯片内水分蒸发，细胞膜蛋白变性失活。
步骤（3）、核酸扩增：再将芯片放置在真空干燥器中预脱气2h，拿出芯片后，在进样口21处滴加核酸扩增试剂进行核酸扩增。
步骤（4）、油相隔立微腔：核酸扩增试剂进样完毕时，将油相加入进样口21，利用油相会推动主管道内反应液流向废液腔22，而不会进入微腔26阵列内，达到分隔所有微腔26室的目的。
步骤（5）、单细胞基因表达分析：采用紫外光固化胶密封进样口21，再将芯片放置在PCR原位仪上进行恒温反应；反应结束后，在显微镜下观察荧光信号，根据荧光信号有无，分析微腔26内单细胞突变基因表达水平。
步骤（1）中，注意控制从进样口21处所滴加入的细胞溶液中的单细胞个数不多于微腔26个数，以免过多的单细胞堵塞通道；每个微腔26空间仅供容纳1个单细胞，使每个微腔26中只进入一个单细胞。本发明不需要保证所有微腔26中每个微腔26都进入一个单细胞，个别微腔26中没有单细胞进入对检测准确性是无关紧要的。步骤（3）中核酸扩增的方式为环介导恒温扩增方式；检测特定突变基因时，核酸扩增试剂包含Bst DNA聚合酶、MgCl2、dNTP、三对引物、钙黄绿素-Mn2+和缓冲液；检测mRNA时，采用一步法RT-LAMP试剂盒，另外添加钙黄绿素作为荧光染料，表征扩增产物。
利用本发明单细胞基因检测芯片与检测方法可检测肺癌细胞株H1975细胞的EGFRL858R突变基因表达情况。具体步骤如下：收集H1975细胞，配置呈浓度为105/mL的细胞悬液，吸取20μL细胞悬液滴加在进样口11。待溶液充满整个样本检测区域后，将芯片放在PCR原位仪上，经过75℃高温孵育8min，完成细胞裂解。再将芯片放置在真空干燥器中预脱气2h，拿出芯片后，在进样口11处滴加核酸扩增试剂20μL。核酸检测预混液（包含10 µL 2×LAMP Mix，三对引物混合物（F3和B3浓度为0.25μM、FIP和BIP浓度为2μM 、LF和LB浓度为0.25μM），钙黄绿素浓度为0.59mM，DEPC水补齐至20μL 。待试剂即将进样完毕前，迅速将抽气后的油相混合物加在进样口11。待油相充满主管道后，采用紫外光固化胶密封进样口11，再将芯片放置在PCR原位仪上进行63℃恒温PCR反应。反应40min后，取出芯片，放置在显微镜的紫外光通道下观察荧光信号。如果微腔中呈绿色荧光，则表明该微腔内H1975细胞发生EGFR L858R突变。
Claims (8)
1.一种单细胞基因检测芯片，包括由下而上依次贴合的玻璃基片(3)、PDMS主芯层(2)、聚丙烯双面胶膜(1)，聚丙烯双面胶膜(1)上开设有进样孔(11)，所述PDMS主芯层(2)上面为开槽结构面，其特征在于，所述PDMS主芯层(2)开槽结构面上从同一水平面上向下开设检测槽和负压槽，检测槽在聚丙烯双面胶膜(1)下面形成供待测细胞溶液流入的检测流道，负压槽在聚丙烯双面胶膜(1)下面形成负压空腔，所述负压空腔相对检测流道形成负压；检测流道按试样流向依次包括进样口(21)、主流道(24)、微道腔阵列和废液腔(22)，沿所述主流道(24)两侧依次开设侧流道(28)，每个侧流道(28)终端开设微腔(26)，沿所述主流道(24)两侧所开设的侧流道(28)与微腔(26)，形成微道腔阵列，所述主流道(24)经过微道腔阵列分流后其终端通入废液腔(22)；所述主流道(24)在PDMS主芯层(2)开槽结构面反复迂回前行布置，形成多条长直槽(4)，在每2条纵向长直槽(4)之间的迂回端形成短横槽(5)，沿所述长直槽(4)两侧依次开设侧流道(28)与微腔(26)，形成所述微道腔阵列，所述多条长直槽(4)、短横槽(5)与微道腔阵列共同在PDMS主芯层(2)开槽结构面上形成检测区域(6)，所述检测区域(6)右旁设置空余区域，所述废液腔(22)开设在空余区域；所述负压空腔包括围绕在检测区域(6)外围的外腔道与伸入检测区域(6)每2条长直槽(4)之间的内腔道(8)，外腔道包括位于检测区域(6)上端的外腔道上段(12)，隔着废液腔(22)位于检测区域(6)右边的外腔道右段(13)，位于检测区域(6)下端的外腔道下段(14)；从外腔道上段(12)引入的各内腔道(8)在长直槽(4)下侧迂回端内形成盲端(9)，从外腔道下段(14)引入的各内腔道(8)在长直槽(4)上侧迂回端内形成盲端(9)；所述负压空腔各内腔道(8)的槽宽度大于外腔道的槽宽度，在每个微腔(26)位置相对应处保留半圆柱凸出槽壁(10)，形成半圆柱凸出槽壁(10)阵列，半圆柱凸出槽壁(10)与对应的微腔(26)为同心圆；所述负压空腔包括开设在于检测区域(6)右边空余区域的圆孔腔(23)，从圆孔腔(23)开设至少1条通道与外腔道右段(13)相通。
2.如权利要求1所述的单细胞基因检测芯片，其特征在于，所述主流道(24)宽度为80μm至100μm，主流道(24)槽深度为20μm至25μm，侧流道(28)宽度为20μm至25μm，侧流道(28)槽深度为20μm至25μm，微腔(26)直径为50μm至80μm，微腔(26)槽深度为50μm至60μm，同一列中微腔(26)之间的间距为150μm至200μm；微腔(26)个数为2000至2500个。
3.如权利要求1所述的单细胞基因检测芯片，其特征在于，所述废液腔(22)中设置有支撑柱(7)阵列；所述废液腔(22)呈正方形，边长为2mm，槽深度为50μm至60μm；或者，所述废液腔(22)呈圆形，直径为2mm。
4.如权利要求1所述的单细胞基因检测芯片，其特征在于，所述外腔道宽度为80μm至100μm，槽深度为50μm至60μm，侧流道宽度为80μm至100μm，槽深度为50μm至60μm，各内腔道(8)的半圆柱凸出槽壁(10)的半径为60μm至75μm，各内腔道(8)的两侧半圆柱凸出槽壁(10)相对处为其槽宽度最小处，内腔道(8)槽宽度最小处的槽宽度为80μm至100μm，各内腔道(8)槽深度为50μm至60μm；圆孔腔(23)是通过打孔器制作的通孔，直径为2mm至3mm；所述PDMS主芯层(2)厚度为2mm至3mm。
5.如权利要求1至4任一项所述的单细胞基因检测芯片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、PDMS主芯层(2)模具的制备：采用四寸单晶硅作为衬底，进行热氧化，生长一层2μm厚二氧化硅氧化层；旋涂2.4μm光刻胶，进行一次光刻，湿法刻蚀去除二氧化硅层；对硅片进行浓硫酸和双氧水清洗，去除光刻胶；旋涂1.4μm光刻胶，进行一次光刻，深反应离子刻蚀，得到第一种高度的微结构；对硅片进行浓硫酸和双氧水清洗，去除光刻胶；以二氧化硅层图形为掩膜，深反应离子刻蚀，得到第二种高度的微结构；最后就得到具有不同高度微结构的硅片模具；
步骤2、PDMS主芯层(2)的制备及前处理：将制作好的硅片模具放入氟硅烷气氛中孵育4h，方便后续PDMS芯片的剥离；称量PDMS预聚物和固化剂，按重量比15：1将二者混匀，置于真空度设定为13psi的真空干燥器的中静置30min除去大部分气泡；将硅片放置在水平台上，浇注PDMS混合物，静置30min，使微结构中充满PDMS；放入80℃烘箱中加热1h，待PDMS完全固化后，小心地将PDMS从硅片上剥离下来；采用针筒加特定孔径的针头，在PDMS芯片上面的设定位置打孔形成进样口(21)和圆孔腔(23)；用PCR粘附性膜粘贴PDMS芯片上层与下层，用针头按PDMS芯片上的进样口(21)对应位置在PCR膜上打孔，使进样口(21)与外界相通；将封装好的芯片置于等离子清洗机的真空状态下2h，照射辉光2min后拿出芯片，在进样孔(11)滴加v:v＝1:1的PEG(6-9)-硅氧烷与丙酮混合溶液，利用PDMS芯片内负压作用使混合溶液充满整个芯片管道，室温孵育1h；将PDMS芯片上的PCR粘附性膜去除，用超纯水冲洗掉芯片内的混合溶液；
步骤3、PDMS主芯层(2)的封装与保存：将处理过的PDMS主芯层 2的结构面朝上和玻璃基片 3一起放入等离子清洗机中清洗90s，取出后迅速贴合在一起，在90℃热板上加热30min，加强两者的结合程度；去除聚丙烯双面胶膜(1)1一面的透明膜，与PDMS 主芯层 2上侧贴合，用针头按PDMS芯片上的进样口(21)对应位置在聚丙烯双面胶膜(1)上打孔形成进样孔(11)；将封装好的芯片置于真空干燥器中预脱气12h，然后拿出后放入真空袋内抽真空后备用。
6.一种单细胞基因检测方法，其特征在于，使用如权利要求1至4任一项所述的单细胞基因检测芯片，包括以下步骤：
步骤(1)、将封装好的单细胞基因检测芯片置于真空干燥器中预脱气12h，然后将芯片取出，使芯片内部相对外界形成负压；在进样口(21)处滴加细胞溶液，利用芯片内部相对外界的负压吸引细胞溶液快速进入整个样品检测区并充满所有腔体；
步骤(2)、将芯片放在PCR原位仪上，经过高温孵育，使芯片内水分蒸发，细胞膜蛋白变性失活；
步骤(3)、再将芯片放置在真空干燥器中预脱气2h，拿出芯片后，在进样口(21)处滴加核酸扩增试剂进行核酸扩增；
步骤(4)、当核酸扩增试剂进样完毕时，将油相加入进样口(21)，利用油相会推动主管道内反应液流向废液腔(22)，而不会进入微腔(26)阵列内，达到分隔所有微腔(26)室的目的；
步骤(5)、采用紫外光固化胶密封进样口(21)，再将芯片放置在PCR原位仪上进行恒温反应；反应结束后，在显微镜下观察荧光信号，根据荧光信号有无，分析微腔(26)内单细胞突变基因表达水平。
7.如权利要求6所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，控制从进样口(21)处所滴加入的细胞溶液中的单细胞个数不多于微腔(26)个数，以免过多的单细胞堵塞通道；所述每个微腔(26)仅容纳1个单细胞，每个微腔(26)中至多进入一个单细胞。
8.如权利要求6所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中核酸扩增的方式为环介导恒温扩增方式；检测特定突变基因时，核酸扩增试剂包含Bst DNA聚合酶、MgCl2、dNTP、三对引物、钙黄绿素-Mn2+和缓冲液；检测mRNA时，采用一步法RT-LAMP试剂盒，另外添加钙黄绿素作为荧光染料，表征扩增产物。
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