CN110292959B - 一种微流控芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微流控芯片及其制备方法与应用。本发明的芯片，包括沿样品流动方向设置的样品垫、结合物垫、具有产生毛细驱动力的基片、吸水材料依次固定于底板上；结合物垫上固化有荧光标记探针；荧光标记探针以荧光染料作为标记材料，标记蓖麻毒素多克隆抗体作为检测荧光复合物；在具有产生毛细驱动力的基片上设置有纳米森林的微流道；纳米森林设置为具有向上突起的纤维状纳米结构阵列，经过表面修饰后产生毛细驱动力并固化捕获探针；纳米森林包括检测区和质控区；检测区包被蓖麻毒素单克隆抗体；质控区包被与蓖麻毒素多克隆抗体结合的抗体的质控探针。本发明能对样品和试剂的数量和流速的控制，使得分析物的分离和检测具有高精度和高灵敏度。

Description

一种微流控芯片及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片及其制备方法与应用，属于生物毒素微流控检测领域。
背景技术
微流控(Microfluidic)是一种在微米尺度空间对以层流或低雷诺系数为主要特征的微流体进行操控的科学技术，以此技术为基础，以微机电加工技术(Micro ElectromMchanical Systems，MEMS)为依托，将常规实验室的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成在一块只有几平方厘米，甚至尺寸更小的芯片上的分析系统称为微流控芯片(Microfluidic chip)，又称芯片实验室(Lab-on-a-chip，LOC)。现阶段，主流形式的微流控芯片多由微米级的微通道网络构成，以可控流体贯穿整个系统，用以实现常规化学或生物实验室的各种功能，以达到微型化、便携化、自动化、集成化、低成本、高通量和简单、快速、高效的分析目的。微流控芯片的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小可控平台上的灵活组合和规模集成。微流控芯片的上述优势为其在生物医学、疾病诊断、环境监测、食品安全、卫生检疫、司法鉴定、生物战剂的侦检等众多领域的应用提供了极为广阔的前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种微流控芯片及其制备方法与应用，本发明对样品和试剂的数量和流速的控制，使得分析物的分离和检测具有高精度和高灵敏度。
本发明提供的一种微流控芯片，该微流控芯片包括样品垫、结合物垫、具有产生毛细驱动力的基片、吸水材料和底板；
沿样品流动方向，所述样品垫、所述结合物垫、所述具有产生毛细驱动力的基片、所述吸水材料依次固定于所述底板上；
所述结合物垫上固化有荧光标记探针；所述荧光标记探针以荧光染料作为标记材料，标记蓖麻毒素多克隆抗体作为检测荧光复合物；
在所述具有产生毛细驱动力的基片上设置有纳米森林的微流道；所述纳米森林设置为具有向上突起的纤维状纳米结构阵列，经过表面修饰后产生毛细驱动力并固化捕获探针；所述纳米森林包括检测区和质控区；所述检测区包被蓖麻毒素单克隆抗体；所述质控区包被与蓖麻毒素多克隆抗体结合的抗体的质控探针。
上述的微流控芯片中，所述样品垫和所述结合物垫均为玻璃纤维膜；
所述底板为采用3D打印制作的树脂材料制成；
所述与蓖麻毒素多克隆抗体结合的抗体为羊抗兔IgG。
上述的微流控芯片中，所述纳米森林的表面修饰为氨基化、醛基化处理；
所述氨基化、醛基化处理的步骤如下：a)将清洗好的芯片浸入氨基化试剂进行活化处理，在所述纳米森林的表面修饰活性的氨基基团，得到表面修饰氨基的基片；所述氨基化试剂具体为3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷；
b)将所述表面修饰氨基的基片放入醛溶液中，使醛基与氨基结合，得到醛基化修饰的基片。
上述的微流控芯片中所述醛基化处理的步骤中，所述醛溶液具体为pH 7.4、含体积分数为1～5％戊二醛的PBS缓冲溶液；所述醛基化处理的步骤具体可为：将所述表面修饰氨基的基片放入所述醛溶液中，室温浸泡0.5～3h，使醛基与氨基结合，再分别用pH 7.4的PBS溶液、水清洗后氮气吹干，得到醛基化修饰的基片。具体的，所述醛溶液具体为pH 7.4、含体积分数为5％戊二醛的PBS缓冲溶液；浸泡时间可为2h。
上述的微流控芯片中，所述吸水材料为滤纸、玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜；
所述荧光染料包括AbFluorTM 680 Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 546和AlexaFluor 568中的至少一种，所述荧光染料为发红光的化学荧光染料均可。
本发明还提供了上述的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：(1)流道的制备：依次经衬底的清洗和干燥、六甲基二硅胺气相成底膜、旋涂聚酰亚胺涂层、旋涂酚醛树脂光刻胶、光刻图形化、等离子体轰击PI层、反应离子刻蚀、去除残胶，得到具有纳米森林的微流道的基片；
(2)基片的表面修饰与捕获配体的固化
1)将步骤(1)制备的具有纳米森林的微流道的基片清洗；
2)将清洗好的基片浸入所述氨基化试剂进行活化处理，在所述基片表面修饰活性的氨基基团，得到氨基化的基片；
3)将所述氨基化的基片放入醛溶液中，使醛基与氨基结合，得到醛基化修饰的基片；
4)将抗体以2～4mg/mL的浓度，分别点样于步骤3)表面修饰后的基片的检测区与质控区，每个区域内点样量100～150nL，并置于湿盒中4℃孵育过夜，得到固化有抗体的基片；
5)取出所述固化有抗体的基片用含有体积分数为0.05％的Tween-20的PBS溶液彻底清洗后氮气吹干，再置于含有质量分数为1.5～3％的牛血清白蛋白的PBS溶液中37℃孵育30～60min1h封闭基片，最后将芯片用含有体积分数为0.05％的Tween-20 的PBS溶液彻底清洗后氮气吹干，得到偶联有捕获抗体的纳米森林基底，即为所述具有产生毛细驱动力的基片；
(3)芯片的组装
将所述样品垫、所述结合物垫、所述具有产生毛细驱动力的基片和所述吸水材料依次搭接粘贴于所述底板，即得到所述的微流控芯片；
其中，所述具有产生毛细驱动力的基片的微流道上，所述抗蓖麻毒素单克隆抗体偶联在近固化有荧光标记探针的所述结合物垫端，所述羊抗兔多克隆抗体偶联在近所述吸水材料端。
上述的制备方法，步骤(1)中所述流道的制备步骤如下：
1)衬底的清洗
采用丙酮、异丙醇、水各超声清洗15～30min，对衬底用H2O2:H2SO4＝1:2的溶液 60℃浸泡30～60min，去水清洗后氮气吹干；
2)脱水烘焙和增黏处理
步骤1)处理后的衬底进行脱水烘焙；然后采用气相涂底法沉积六甲基二硅胺烷，进行增黏处理；
3)旋涂聚酰亚胺光刻胶
步骤2)处理后的衬底置于匀胶机上，旋涂聚酰亚胺光刻胶；
4)旋涂酚醛树脂光刻胶
步骤3)涂覆好聚酰亚胺光刻胶的衬底上再旋涂一层酚醛树脂光刻胶；
5)光刻
采用微电子光刻方法对所述聚酰亚胺光刻胶层和所述酚醛树脂光刻胶层进行光刻，图形化后形成微流道；
6)等离子轰击制备纳米森林
采用氧等离子体和氩等离子体分别对聚酰亚胺光刻胶进行轰击形成聚酰亚胺光刻胶纳米纤维森林结构；
7)反应离子刻蚀
以所述聚酰亚胺光刻胶纳米纤维森林结构为掩模，采用反应离子刻蚀的方法将图形转移至衬底上；
8)去除残胶
依次采用缓冲氧化物刻蚀液、丙酮漂洗去除残胶，得到侧壁为聚酰亚胺光刻胶、中间为纳米森林的流道；
9)聚酰亚胺光刻胶侧墙固化
聚酰亚胺光刻胶侧墙固化的参数为：120℃保温1小时、120℃升温20分钟至 160℃、160℃保温1小时，160℃升温20分钟至200℃、200℃保温4小时，得到侧墙为疏水、中间为亲水性的纳米森林的微流道。
上述的制备方法，步骤(1)流道的制备中，
所述衬底包括硅片、石英片；
所述脱水烘焙的条件为在真空环境下，180℃烘烤20min；
旋涂所述聚酰亚胺光刻胶的厚度为6μm；所述旋涂聚酰亚胺光刻胶的步骤如下：所述匀胶机的参数为前转600rpm/min，6s，使胶铺平；后转4000rpm/min，30s，后，将涂覆好所述聚酰亚胺光刻胶的衬底放于热板上，120℃烘焙20min，以蒸发光刻胶中的有机溶剂，缓和旋涂过程中光刻胶内部的应力并使胶固化；
旋涂所述酚醛树脂光刻胶厚度5μm，旋涂所述酚醛树脂光刻胶的条件为：匀胶机参数为前转600rpm/min，6s，后转800rpm/min，30s；
所述光刻的步骤如下：将步骤4)处理的衬底放于100℃热板上前烘2min；冷却后采用EVG光刻机对聚合物层进行曝光，曝光时采用的紫外光波长为365nm，曝光剂量为11mJ/s，时间为5s；曝光后将衬底放于120℃热板上后烘90s；冷却后将衬底置于JZX3038显影液中进行显影，时间约60s，去离子水漂洗后氮气吹干；
步骤6)中步骤如下：March去胶机的参数为：氧等离子体和氩等离子体的流量分别为200sccm和150sccm，作用时间分别为20min和40min，整个作用过程中保持腔体压强和功率不变，均为400W和80mTorr；
步骤7)中刻蚀采用的条件与参数如下：SF6/CHF3/HE:5.5/32/150sccm，200W，1850mTorr，刻蚀时间15min；
步骤8)中首先采用缓冲氧化物刻蚀液(简称BOE)为7:1溶液漂洗5～10s去除流道内的PI残胶，其次用丙酮溶液漂洗去除KXN5735残胶。
上述的制备方法，步骤(2)-1)中，所述清洗放入H2O2:H2SO4＝1:2的溶液中清洗1h，进行羟基化处理，然后置于去离子水中超声3min彻底清洗芯片，氮气吹干；
步骤(2)-2)中，所述氨基化试剂具体为3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷；
所述氨基化试剂为质量百分浓度为5％的丙酮溶液，活化的时间为20min；丙酮、水超声清洗3遍，氮气吹干；
步骤(2)-3)中，所述醛溶液为pH 7.4、含体积分数为1～5％戊二醛的PBS缓冲溶液；所述醛基化处理的步骤为：将所述表面修饰氨基的基片放入所述醛溶液中，室温浸泡0.5～3h，使醛基与氨基结合，再分别用pH 7.4的PBS溶液、水清洗后氮气吹干，得到醛基化修饰的基片。具体的，所述醛溶液具体为pH 7.4、含体积分数为5％戊二醛的PBS缓冲溶液；浸泡时间可为2h。
本发明中，室温为本领域公知的常识，可为20～30℃。
本发明进一步提供了利用上述的微流控芯片检测蓖麻毒素的方法，包括如下步骤：将待测样品置于所述的微流控芯片的所述样品垫上；流经所述结合物垫、所述检测区，在激发光照射下进行荧光检测，检测结果如下：
1)当所述检测区显色，且所述质控区也显色，则所述待测样品检测结果为阳性，即所述待测样品中含蓖麻毒素；
2)当所述检测区不显色，且所述质控区显色，则所述待测样品检测结果为阴性，即所述待测样品中不含蓖麻毒素；
3)当所述质控区不显色，则所述微流控芯片无效，需要用新的所述微流控芯片重新测定。
本发明所述的微流控芯片应用于检测蓖麻毒素中。
本发明具有以下优点：
与传统的检测方法相比，微流控芯片的优点在于对样品和试剂的数量和流速的控制，使得分析物的分离和检测具有高精度和高灵敏度。微流控芯片还可缩短反应时间，提高分析效率，节约试剂和样本，以及易于集成化、便携化，操作简便，更易实现自动化。常规微流控芯片检测系统虽然芯片本身体积小携带方便，但往往需要复杂的辅助系统，使得整个检测过程步骤繁琐、应用成本昂贵，极大的限制了其在现场快速检测领域的应用。
附图说明
图1为纳米森林基片制备工艺流程示意图。
图2为微流控芯片实物图。
图3为蓖麻毒素灵敏度检测结果。
图4为蓖麻毒素特异性检测结果。
图5为蓖麻毒素模拟样本检测结果，其中图5(a)为牛奶的检测结果，图5(b) 为橙汁的检测结果。
图6为石英片上图形化刻蚀的流道。
图7为本发明实施例1中石英基片上纳米森林结构的电镜图，其中图7C1为其正面图，图7C2为其侧面图。
图8为本发明实施例2中硅基片上纳米森林结构的电镜图，其中图8C1为其正面图，图8C2为其侧面图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、
1、毒素的制备
(1)制备粗毒
称取蓖麻籽100g，浸泡于500mL的PBS(0.01M，pH 7.2)中，4℃，24h。去壳，去离子水清洗，将洗净的种子置于500mL PBS(0.01M，pH 7.2)缓冲液中，于匀浆机中匀浆，并于4℃条件下浸提过夜(放置24h)，得到浸提液；将浸提液用纱布滤去残渣，12000rpm，4℃离心25min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤至烧杯中，调pH为7.2。向烧杯中缓慢(约1h)加入研磨好的硫酸铵((NH4)2SO4)固体，至饱和度为90％，室温磁力搅拌1h使硫酸铵溶解彻底，转移至4℃继续搅拌1h，静置过夜(12h)；次日将混合液在4℃条件下以12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用50 mL的PBS(0.01M，pH 7.2)溶解，将溶液转移至透析袋中，在4℃条件下用PBS缓冲液透析72h(每8h换一次液)，使硫酸铵尽可能多的透析出。透析后，溶液经1200 g、4℃离心30min，上清即为蓖麻毒素粗提液，4℃保存备用。
(2)亲和层析纯化
亲和层析介质为p-苯胺基-1-巯基-β-D-吡喃半乳糖苷琼脂糖凝胶。取5mL亲和介质缓慢装入层析柱柱管，静置10min，以10倍柱体积的PBS缓冲液清洗平衡，流速 1mL/min。加入蓖麻毒素粗提取液，轻摇1h，使其与介质充分结合。用20个柱体积的PBS缓冲液清洗，流速控制在1mL/min左右，以洗脱去杂蛋白，然后改用含有0.1 M半乳糖的PBS缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。
(3)分子筛层析纯化
亲和层析纯化后的洗脱液中含蓖麻毒素和蓖麻凝集素，分子筛层析的目的就是去除蓖麻凝集素，获得较纯的蓖麻毒素，凝胶过滤柱为SephacrylTMS-100G75凝胶预装柱。首先将亲和层析收集的洗脱液在4℃条件下用PBS缓冲液透析48h(每8h换一次液)，以去除半乳糖，再用PEG 20000浓缩至5mL左右。其次，用PBS缓冲液平衡凝胶柱2个柱体积，流速1mL/min。将浓缩好的样品经0.22μm的滤膜过滤后上样。以PBS为洗脱液进行洗脱，流速为1mL/min，分别收集蓖麻毒素和蓖麻凝集素，保存备用。
2、抗体的制备
(1)多克隆抗体的制备
脱毒：用PBS(0.1M，pH 7.4)稀释纯化的蓖麻毒素至0.2～0.3mg/mL，放置PBS 缓冲液(0.1M，pH 8.1)中，35℃透析7天，然后再放入PBS(0.01M，pH 7.4)中透析48h，12000rpm离心10min，取上清液，即为脱毒的蓖麻毒素溶液，分装，-20℃保存。
动物免疫：以脱毒的蓖麻毒素蛋白作为免疫原，取200μg与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀，免疫新西兰纯种大耳白兔。两周后用0.5mg脱毒的蓖麻毒素蛋白和等体积弗氏不完全佐剂加强免疫1次；隔三周后再用1mg脱毒的蓖麻毒素蛋白和等体积弗氏不完全佐剂加强免疫1次；此后每周耳缘静脉采血，间接ELISA测定效价。加强免疫后，取血清进行多抗纯化。
(2)单克隆抗体的制备
将本室保存的单克隆抗体复苏培养，用间接ELISA法筛选稳定性和效价较高的细胞株，扩大培养收集细胞培养上清。
(3)多抗与单抗的纯化
取样品5mL，用PB(20mM，pH 7.8)稀释至50mL，0.22μm的滤膜过滤。用 PB缓冲液以5个柱体积平衡Protein A柱，流速5mL/min。上样，流速1mL/min。用洗脱液(0.1M柠檬酸盐酸盐，pH 4.0)以2mL/min流速洗脱，收集蛋白峰。用1M Tris-HCl，pH 9.0调节pH为7.2～7.4，保存备用。
(4)荧光探针的制备
将纯化的蓖麻毒素抗体用PBS稀释/浓缩至4mg/mL，取抗体溶液25μL。
1)将5μL AbFluor 680标记溶液加入待标记的抗体溶液中。用移液枪轻轻混合。
2)加入2.5μL的活化AbFluor 680溶液，再加去离子水至50μL的体积，轻轻混合，在37℃黑暗中静置反应1h。
3)反应完成后，向混合物中加入适量的PBS溶液(约450μL)，轻轻混合并将溶液移至纯化柱中。在4℃下以12,000×g离心10min。重复操作1次。
4)取出纯化柱中的溶液置于干净的离心管中，在4000g，4℃下离心2min，所得溶液即为标记好的探针。
将纯化的荧光标记抗体以1mg/mL左右浓度溶于含有1％BSA，0.2％PEG20000，0.02％Na3N，10％蔗糖，2.5％海藻糖，0.1％Tween-20，pH 7.4的PBS缓冲液中。最后将玻纤膜浸入荧光标记探针溶液中，36℃干燥过夜后切割成如图2所示形状，长度可为1～3mm，宽度为3～10mm，干燥条件下常温保存备用。
3、微流控芯片的制备
(1)流道的制备
石英纳米森林结构流道的制备工艺流程如图所示。主要有衬底的清洗和干燥、六甲基二硅胺(HMDS)气相成底膜、旋涂聚酰亚胺(PI)涂层、旋涂酚醛树脂光刻胶、光刻图形化、等离子体轰击PI层、反应离子刻蚀(RIE)、去除残胶。具体步骤如下：
1)衬底的清洗
光刻胶与衬底之间的黏附性对光刻的质量有很大影响，如果黏附性差，则在后续处理工艺中容易出现浮胶或脱胶，造成图形移位或缺陷。清洗衬底的目的是去除污染物去除颗粒、减少针孔和其它缺陷，提高光刻胶黏附性。实验中首先采用丙酮、异丙醇、去离子水各超声清洗15min，对石英片用H2O2:H2SO4＝1:2的溶液60℃浸泡30min，去离子水清洗后氮气吹干。
2)脱水烘焙和增黏处理
清洗后的的石英片，其表面会由于物理或化学作用吸附水分，会降低光刻胶胶与衬底的黏附性。对于物理吸附的水分，通过高温烘焙可去除。实验中将硅片脱水烘焙系统中，在真空环境下，180℃烘烤20min。
对于化学吸附的水分，由于表面硅原子与吸附的单层水分子形成亲水的羟基结构，必须使用化学方法增黏处理。常用的增黏剂为六甲基二硅胺烷(HMDS)，其可与羟基结合，使之转变为疏水的硅氧烷结构，增强光刻胶的附着力。实验中采用气相涂底法沉积HMDS。使用HMDS预处理系统可在同一仪器里完成脱水烘焙和HMDS的气相成底膜。
3)旋涂聚酰亚胺(PI)光刻胶
将处理好的石英片置于匀胶机上，旋涂6μm厚的PI光刻胶。匀胶机参数为前转600rpm/min，6s，使胶铺平；后转4000rpm/min，30s，达到相应的厚度。其后，将涂覆好PI的石英片放于热板上，120℃烘焙20min，以蒸发光刻胶中的有机溶剂，缓和旋涂过程中光刻胶内部的应力并使胶固化。
4)旋涂KXN5735光刻胶
在已涂覆好PI的石英衬底上再旋涂一层KXN5735光刻胶，厚度5μm，匀胶机参数为前转600rpm/min，6s，后转800rpm/min，30s。
5)光刻
采用常规的微电子光刻工艺对聚合物层进行光刻，图形化后形成微流道。具体步骤如下：将衬底放于100℃热板上前烘2min；冷却后采用EVG光刻机对聚合物层进行曝光，曝光时采用的紫外光波长为365nm，曝光剂量为11mJ/s，时间为5s；曝光后将衬底放于120℃热板上后烘90s；冷却后将衬底置于JZX3038显影液中进行显影，时间约60s，去离子水漂洗后氮气吹干。
6)等离子轰击制备纳米森林
采用氧等离子体和氩等离子体分别对PI层进行轰击形成PI纳米纤维森林结构。March去胶机的参数为：氧等离子体和氩等离子体的流量分别为200sccm和150sccm，作用时间分别为20min和40min，整个作用过程中保持腔体压强和功率不变，均为400W和80mTorr。
7)反应离子刻蚀(RIE)
以PI纳米纤维森林结构为掩模，采用反应离子刻蚀(Reactive Ion Etching，RIE)的方法将图形转移至衬底上。RIE是同时用物理和化学两种作用来刻蚀薄膜，大量带点粒子受电场加速以较大能量垂直撞击薄膜表面，进行物理刻蚀；同时还与薄膜发生强烈的化学反应，进行化学刻蚀，因此兼具各向异性的刻蚀优点，又有较高的选择比。刻蚀工艺采用的条件与参数为SF6/CHF3/HE:5.5/32/150sccm，200W，1850mTorr，刻蚀时间15min。
8)去除残胶
首先采用BOE(7:1)溶液漂洗5～10s去除流道内的PI残胶，其次用丙酮溶液漂洗去除KXN5735残胶，得到侧壁为PI中间为石英纳米森林的流道。
9)PI侧墙固化
PI侧墙固化的参数为：120℃(保温1小时)-160℃(升温20分钟，保温1小时) -200℃(升温20分钟，保温4小时)。得到侧墙为疏水、中间为亲水性石英纳米森林的微流道。如图1所示。
(2)芯片的表面修饰与捕获配体的固化
1)将制备好的纳米森林结构芯片放入H2O2:H2SO4＝1:2的溶液中清洗1h，进行羟基化处理，然后置于去离子水中超声3min彻底清洗芯片，氮气吹干。
2)将清洗好的芯片浸入3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷(APTES)活化试剂(5％，使用95％丙酮稀释)中20min进行活化处理，在芯片表面修饰活性的氨基基团用以蛋白质的固定。丙酮、去离子水超声清洗3遍，氮气吹干。氨基化化后的芯片可直接用于蛋白质的固定。
3)将氨基化的芯片放入含5％戊二醛的PBS缓冲溶液(pH 7.4)中，室温浸泡2 h，使醛基与氨基结合，再分别用PBS溶液(pH 7.4)、去离子水清洗后氮气吹干，得到醛基化修饰的芯片，用于蛋白质的固定。
4)将抗体以4mg/mL的浓度，通过非接触式点样仪分别点样于表面修饰后的芯片的检测区与质控区，每个区域内点样量150nL，并置于湿盒中4℃孵育过夜，得到固化有抗体的芯片。
5)取出固化有抗体的芯片用含有体积分数为0.05％的Tween-20的PBS溶液彻底清洗后氮气吹干，再置于含有质量分数为3％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中37℃孵育1h封闭芯片，最后将芯片用含有体积分数为0.05％的Tween-20的PBS 溶液彻底清洗后氮气吹干，得到偶联有捕获抗体的纳米森林基底。
其中，石英片上图形化刻蚀的流道如图6所示。图7为石英片上纳米森林结构的电镜图。
(3)芯片的组装
将样品垫(玻纤膜)、结合物垫、可产生毛细驱动力的微流道(偶联有抗蓖麻毒素单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体的纳米森林基底)和吸水材料(吸水纸)按照玻纤膜、固化有荧光标记探针的玻纤膜、可产生毛细驱动力的微流道和吸水材料的顺序依次搭接粘贴于塑料壳体上形成微流控检测芯片。其中，微流道上的抗蓖麻毒素单克隆抗体偶联在固化有荧光标记探针的玻纤膜方向，基底的上羊抗兔多克隆抗体偶联在吸水材料方向。如图2所示。
结合物垫和吸水材料之间形成的微通道长度为10mm，宽度为2mm；微通道内检测区和质控区均为方形，长度均为2mm，宽度均为2mm。样品垫(玻纤膜)剪切成如附图所示类梯形形状，上底为4mm，下底为15mm，结合物垫大小为4×2mm，一端压在样品垫下，另一端正好插入到微通道中。NC膜的大小为6×6mm，一端与微通道连接，另一端与吸水纸连接。吸水材料的大小为16×20mm。
4、蓖麻毒素的检测
分别滴加100μL不同浓度的蓖麻毒素溶液，室温反应15min，Odyssey红外荧光成像系统读取结果。
(1)灵敏度实验
取天然蓖麻毒素样品，以PBS为稀释液，分别将毒素样品稀释至质量浓度为10 pg/mL、50pg/mL、250pg/mL、1250pg/mL、6250pg/mL，以3％的BSA作为阴性对照，在制备好的芯片样品区滴加100μL样品，15min后观察结果，测试芯片对不同浓度毒素的反应，以荧光强度作为评价指标，以阴性结果的均值加两倍标准差
Figure RE-GDA0002169070000000101
作为截止值(Cut-off值)。结果如图3所示。
结果表明，荧光强度随蓖麻毒素的浓度增加而增强，其在10pg/mL～6.25ng/mL 范围内具有较好线性关系，检测限低于10pg/mL。
Figure RE-GDA0002169070000000102
(2)特异性实验
分别取AT、BontA、ETX 3种毒素，稀释至其质量浓度为10ng/mL，蓖麻毒素的质量浓度为1.0ng/mL，以3％的BSA作为阴性对照，测试芯片对不同毒素的反应，观察有无交叉反应，评价芯片的特异性。结果如图4所示。
AT、BontA、ETX三种毒素的检测结果无差别，均低于阴性值，RT高于阴性值，差异具有统计学意义，表明芯片无交叉反应，特异性较好。
Figure RE-GDA0002169070000000111
(3)模拟样品检测
用牛奶作为模拟样品检测，将其用PBS 10倍稀释，用这些稀释液梯度稀释蓖麻毒素，浓度分别为10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、4ng/mL、20ng/mL，以牛奶为阴性对照，测试芯片对模拟样品的检测灵敏度。结果如图5所示。
以牛奶稀释蓖麻毒素做模拟样品，毒素浓度为10pg/mL的检测结果与阴性检测结果无差异(P>0.05)，毒素浓度为100pg/mL的检测结果大于阴性值(P<0.05)，差异有统计学意义。芯片的灵敏度有所下降，在100pg/mL至20ng/mL范围内有较好线性关系，理论最低检测限为40pg/mL。
Figure RE-GDA0002169070000000112
实施例2、
与本发明实施例1中，不同之处为采用硅片制备微流控芯片(硅基纳米森林结构)，具体如下：
1、硅基纳米森林结构的制备
纳米纤维结构的周期、直径和形貌可以通过控制光刻胶涂层的厚度、等离子体源的种类、等离子体轰击时间、气体流量、压强以及功率等参数进行调控。
(1)衬底的清洗
实验中首先采用丙酮、异丙醇、去离子水各超声清洗15min，去离子水清洗后氮气吹干，再用BOE(HF：NH4F＝1：6)溶液浸泡清洗5min，去离子水清洗后氮气吹干。
(2)脱水烘焙和增黏处理
同本发明实施例1。
(3)旋涂聚酰亚胺(PI)光刻胶
同本发明实施例1。
(4)等离子轰击制备纳米森林
同本发明实施例1。
5)去除残胶
同本发明实施例1。
6)PI侧墙固化
同本发明实施例1。
(7)PECVD镀膜
PECVD(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition)是指等离子体增强化学的气相沉积法，其反应温度低，成膜均匀一致。由于等离子轰击制备的纳米纤维森林结构，其主要化学成分依然是光刻胶等形成的有机成分，结构的机械强度不高，耐受性、亲水性和生物相容性不好，因此，在其基础上利用PECVD镀一层SiO2薄膜，增加其耐受性、亲水性和生物相容性，并且有助于后续的表面修饰和处理。
使用Plasmalab System 100型仪器镀膜，厚度100nm，参数为：SiH4流量0-40sccm，N2O流量0-1600sccm，NH3流量0-80sccm，温度范围200-350度，RF功率范围0-300W。
图8所示为硅基片上纳米森林结构的电镜图。
除衬底清洗条件和多一步镀膜步骤外其他方法均相同，其他制备方法也与本发明实施例1全相同，即得到微流控芯片。

Claims (4)

1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片包括样品垫、结合物垫、具有产生毛细驱动力的基片、吸水材料和底板；
沿样品流动方向，所述样品垫、所述结合物垫、所述具有产生毛细驱动力的基片、所述吸水材料依次固定于所述底板上；
所述结合物垫上固化有荧光标记探针；所述荧光标记探针以荧光染料作为标记材料，标记蓖麻毒素多克隆抗体作为检测荧光复合物；
在所述具有产生毛细驱动力的基片上设置有纳米森林的微流道；所述纳米森林设置为具有向上突起的纤维状纳米结构阵列，经过表面修饰后产生毛细驱动力并固化捕获探针；所述纳米森林包括检测区和质控区；所述检测区包被蓖麻毒素单克隆抗体；所述质控区包被与蓖麻毒素多克隆抗体结合的抗体的质控探针；
所述样品垫和所述结合物垫均为玻璃纤维膜；
所述底板为采用3D打印制作的树脂材料制成；
所述吸水材料为滤纸、玻璃纤维膜或硝酸纤维素膜；
所述荧光染料包括AbFluorTM 680Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 546和AlexaFluor568中的至少一种；
所述与蓖麻毒素多克隆抗体结合的抗体为羊抗兔IgG；
所述纳米森林的表面修饰为氨基化、醛基化处理；
所述氨基化、醛基化处理的步骤如下：a)将清洗好的芯片浸入氨基化试剂进行活化处理，在所述纳米森林的表面修饰活性的氨基基团，得到表面修饰氨基的基片；所述氨基化试剂具体为3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷；
b)将所述表面修饰氨基的基片放入醛溶液中，使醛基与氨基结合，得到醛基化修饰的基片；
所述微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：(1)流道的制备：依次经衬底的清洗和干燥、六甲基二硅胺气相成底膜、旋涂聚酰亚胺涂层、旋涂酚醛树脂光刻胶、光刻图形化、等离子体轰击PI层、反应离子刻蚀、去除残胶，得到具有纳米森林的微流道的基片；
所述衬底包括硅片、石英片；
(2)基片的表面修饰与捕获配体的固化
1)将步骤(1)制备的具有纳米森林的微流道的基片清洗；
2)将清洗好的基片浸入所述氨基化试剂进行活化处理，在所述基片表面修饰活性的氨基基团，得到氨基化的基片；
3)将所述氨基化的基片放入醛溶液中，使醛基与氨基结合，得到醛基化修饰的基片；
4)将抗体以2～4mg/mL的浓度，分别点样于步骤3)表面修饰后的基片的检测区与质控区，每个区域内点样量100～150nL，并置于湿盒中4℃孵育过夜，得到固化有抗体的基片；
5)取出所述固化有抗体的基片用含有体积分数为0.05％的Tween-20的PBS溶液彻底清洗后氮气吹干，再置于含有质量分数为1.5～3％的牛血清白蛋白的PBS溶液中37℃孵育30～60min封闭基片，最后将基片用含有体积分数为0.05％的Tween-20的PBS溶液彻底清洗后氮气吹干，得到偶联有捕获抗体的纳米森林基底，即为所述具有产生毛细驱动力的基片；
(3)芯片的组装
将所述样品垫、所述结合物垫、所述具有产生毛细驱动力的基片和所述吸水材料依次搭接粘贴于所述底板，即得到所述的微流控芯片；
其中，所述具有产生毛细驱动力的基片的微流道上，所述蓖麻毒素单克隆抗体偶联在近固化有荧光标记探针的所述结合物垫端，所述羊抗兔多克隆抗体偶联在近所述吸水材料端；
步骤(1)中所述流道的制备步骤如下：
1)衬底的清洗
采用丙酮、异丙醇、水各超声清洗15～30min，对衬底用H2O2:H2SO4＝1:2的溶液60℃浸泡30～60min，去水清洗后氮气吹干；
2)脱水烘焙和增黏处理
步骤1)处理后的衬底进行脱水烘焙；然后采用气相涂底法沉积六甲基二硅胺烷，进行增黏处理；
3)旋涂聚酰亚胺光刻胶
步骤2)处理后的衬底置于匀胶机上，旋涂聚酰亚胺光刻胶；
4)旋涂酚醛树脂光刻胶
步骤3)涂覆好聚酰亚胺光刻胶的衬底上再旋涂一层酚醛树脂光刻胶；
5)光刻
采用微电子光刻方法对所述聚酰亚胺光刻胶层和所述酚醛树脂光刻胶层进行光刻，图形化后形成微流道；
6)等离子轰击制备纳米森林
采用氧等离子体和氩等离子体分别对聚酰亚胺光刻胶进行轰击形成聚酰亚胺光刻胶纳米纤维森林结构；
7)反应离子刻蚀
以所述聚酰亚胺光刻胶纳米纤维森林结构为掩模，采用反应离子刻蚀的方法将图形转移至衬底上；
8)去除残胶
依次采用缓冲氧化物刻蚀液、丙酮漂洗去除残胶，得到侧壁为聚酰亚胺光刻胶、中间为纳米森林的流道；
9)聚酰亚胺光刻胶侧墙固化
聚酰亚胺光刻胶侧墙固化的参数为：120℃保温1小时、120℃升温20分钟至160℃、160℃保温1小时，160℃升温20分钟至200℃、200℃保温4小时，得到侧墙为疏水、中间为亲水性的纳米森林的微流道；
步骤(1)流道的制备中，
所述脱水烘焙的条件为在真空环境下，180℃烘烤20min；
旋涂所述聚酰亚胺光刻胶的厚度为6μm；所述旋涂聚酰亚胺光刻胶的步骤如下：所述匀胶机的参数为前转600rpm/min，6s，使胶铺平；后转4000rpm/min，30s，后，将涂覆好所述聚酰亚胺光刻胶的衬底放于热板上，120℃烘焙20min，以蒸发光刻胶中的有机溶剂，缓和旋涂过程中光刻胶内部的应力并使胶固化；
旋涂所述酚醛树脂光刻胶厚度5μm，旋涂所述酚醛树脂光刻胶的条件为：匀胶机参数为前转600rpm/min，6s，后转800rpm/min，30s；
所述光刻的步骤如下：将步骤4)处理的衬底放于100℃热板上前烘2min；冷却后采用EVG光刻机对聚合物层进行曝光，曝光时采用的紫外光波长为365nm，曝光剂量为11mJ/s，时间为5s；曝光后将衬底放于120℃热板上后烘90s；冷却后将衬底置于JZX3038显影液中进行显影，时间60s，去离子水漂洗后氮气吹干；
步骤6)中步骤如下：March去胶机的参数为：氧等离子体和氩等离子体的流量分别为200sccm和150sccm，作用时间分别为20min和40min，整个作用过程中保持腔体压强和功率不变，均为400W和80mTorr；
步骤7)中刻蚀采用的条件与参数如下：SF6/CHF3/HE:5.5/3 2/150sccm，200W，1850mTorr，刻蚀时间15min；
步骤8)中首先采用BOE为7:1溶液漂洗5～10s去除流道内的PI残胶，其次用丙酮溶液漂洗去除KXN5735残胶。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：步骤(2)-1)中，所述清洗放入H2O2:H2SO4＝1:2的溶液中清洗1h，进行羟基化处理，然后置于去离子水中超声3min彻底清洗芯片，氮气吹干；
步骤(2)-2)中，所述氨基化试剂具体为3-氨基丙基-三甲氧基硅氧烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷；
所述氨基化试剂为质量百分浓度为5％的丙酮溶液，活化的时间为20min；丙酮、水超声清洗3遍，氮气吹干；
步骤(2)-3)中，所述醛溶液为pH7.4、含体积分数为1～5％戊二醛的PBS缓冲溶液；所述醛基化处理的步骤为：将所述表面修饰氨基的基片放入所述醛溶液中，室温浸泡0.5～3h，使醛基与氨基结合，再分别用pH7.4的PBS溶液、水清洗后氮气吹干，得到醛基化修饰的基片。
3.一种利用权利要求1所述的微流控芯片检测蓖麻毒素的方法，包括如下步骤：将待测样品置于所述的微流控芯片的所述样品垫上；流经所述结合物垫、所述检测区，在激发光照射下进行荧光检测，检测结果如下：
1)当所述检测区显色，且所述质控区也显色，则所述待测样品检测结果为阳性，即所述待测样品中含蓖麻毒素；
2)当所述检测区不显色，且所述质控区显色，则所述待测样品检测结果为阴性，即所述待测样品中不含蓖麻毒素；
3)当所述质控区不显色，则所述微流控芯片无效，需要用新的所述微流控芯片重新测定。
4.利用权利要求1所述的微流控芯片在检测蓖麻毒素中的应用。
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