JP4472823B2 - クロマトグラフィー試験片、及びその製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体試料を定性あるいは定量分析するためのクロマトグラフィー試験片、及びその製造方法に関し、特に液体試料が均一に展開するものに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、水質検査や尿検査などの液体試料の化学試験、あるいは臨床試験を実施する方法として、抗原抗体反応や酵素反応を利用した、クロマトグラフィーによる測定方法が汎用されている。一般にクロマトグラフィーとは、混合物をその構成成分に応じて分離する方法をいう。
【０００３】
図８は、クロマトグラフィーによる測定に使用される、従来のクロマトグラフィー試験片を示す図である。
図８において、クロマトグラフィー試験片１００は、クロマトグラフィー材料を支持する反応層担体支持体１０１と、液体試料が添加される試料添加部１０２と、液体試料の浸透により移動可能な標識試薬を保持する標識物保持部位１０３と、流れてきた液体試料に含まれる分析対象物と特異的に結合する物質を備えた標識試薬と分析対象物との結合反応が行われる反応層１０４と、反応層１０４の領域上に、反応形式にあわせて、抗体あるいは抗原のような分析対象物に対して特異的に結合反応する特異的タンパク質を固定化する特異的タンパク固定化部１０５と、流れてきた液体試料を吸収する吸水部１０６とを備える。
【０００４】
次に、従来のクロマトグラフィー試験片１００による測定方法について説明する。
液体試料が試料添加部１０２に添加されると、試料添加部１０２に浸透し、標識物保持部位１０３に達する。次に、標識物保持部位１０３の領域に保持された標識試薬が、液体試料の浸透により溶解され、液体試料と共に反応層１０４に浸透する。反応層１０４の領域上には、特異的タンパク質が固定化された特異的タンパク固定化部１０５がある。液体試料が分析対象物を含む場合は、特異的タンパク質が分析対象物と標識試薬との複合体に対して抗原抗体反応を起こし、特異的タンパク固定化部１０５の領域に何らかの呈色反応が見られる。液体試料が分析対象物を含まない場合は、抗原抗体反応は起こらず、呈色反応も見られない。最終的に、液体試料は吸水部１０６に吸収され、反応は終了する。この呈色反応を目視的、あるいは検出装置を用いて測定する。このように、クロマトグラフィーによる測定方法は、検査結果の判定が非常に容易であることから、用途範囲が広いのが特色である。
【０００５】
このクロマトグラフィーによる測定は、さまざまな分析対象物の検査に利用することが可能である。しかし、液体試料を添加するため、その試料のより均一な展開パターンが必要であり、また、その展開速度が反応層１０４での反応に影響を与えるため、反応層１０４上の浸透性の向上が必要とされてきた。
【０００６】
クロマトグラフィー試験片の反応層の浸透性を向上させたものとして、特開昭６２−７１８６１号公報には、免疫原理を用いた測定においてＨＬＢ値が２０より大きい界面活性剤を添加する方法が開示されている。また、特開平１１−１５３６０１号公報には、試料添加部から反応層までの間に界面活性剤などを担持した添加剤含浸部を設ける方法が開示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来のクロマトグラフィー試験片には、液体試料の浸透速度を機械的にコントロールする手段がなく、人為的に浸透速度を制御することができないために、液体試料の浸透速度は試験片の浸透性に左右される。そのため、浸透に大幅な時間を要したり、反応層上を進む試料の浸透が不均一であったり、特異的タンパク固定化部等の反応成分固定化部に試料が浸透しない部分が生じるなどにより、反応の正確性を欠くことになるという問題があった。
【０００８】
上記の問題点を解決するために、従来より、界面活性剤処理によるクロマトグラフィー試験片の浸透性能の向上が図られてきた。しかし、本来の性状が、液状またはペースト状である界面活性剤を用いた場合には、界面活性剤を絶乾状態まで乾燥させることが不可能であるため、クロマトグラフィー試験片の保存期間中に徐々に固定化抗体の失活が進み、試験片の性能が悪化してしまう。そのため、試験片の品質保持期限が短期間化する、あるいは試験片の保管条件が限定される等の問題があった。
【０００９】
また、クロマトグラフィーによる測定においては、試験片に液体試料を添加して一定時間の経過後に測定を行うが、界面活性剤処理を行った場合に、標識試薬の反応層への非特異吸着が起ることにより、標識試薬が反応層上にバックグラウンドとして残留することがある。このバックグラウンドの値が呈色度合に上乗せされると、検出計器を用いて測定を行う場合では、その誤差を含めて測定することになり、定量性能が低下するという問題があった。また、目視における判断でも、バックグラウンドの呈色が本来の呈色状況の判断を誤認させることになるという問題があった。
【００１０】
また、特開昭６２−７１８６１号公報に開示されている測定方法では、浸透性を高めるために、２０より大きいＨＬＢ値の界面活性剤が添加されているため、確かに浸透性と浸透速度とは向上するものの、その速度があまりに速いために測定に必要とされる反応が十分に行われず、測定の正確性を欠くことになる。
【００１１】
また、特開平１１−１５３６０１号公報に開示されているクロマトグラフィー試験片では、バックグラウンドの影響を軽減するために界面活性剤を試験片上の反応層より前の部位に含浸している。このクロマトグラフィー試験片を用いた場合には、特異的タンパク固定化部等の反応成分固定化部には界面活性剤が存在しないため、反応成分の失活や変性は生じない。しかし、浸透が進行する段階で固定化領域中の反応成分に十分試料が浸透しないため、均一に反応が行われず、測定の正確性を欠くことになる。
【００１２】
本発明は、かかる問題点に鑑みてなされたものであり、バックグラウンドにおける標識試薬の残留量を最低限に抑え、液体試料の浸透性の向上と、より均一な液体試料の展開とにより反応性を向上させ、また、クロマトグラフィー試験片の保存安定性を向上させたクロマトグラフィー試験片、及びその製造方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明のクロマトグラフィー試験片は、複数の多孔質性材料を積層してなる、あるいは単層の多孔質性材料よりなるクロマトグラフィー試験片において、クロマトグラフ分析で用いられる反応成分の少なくとも一つが固定化された反応層が、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を含むことを特徴とするものである。
【００１４】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片は、上記クロマトグラフィー試験片において、上記界面活性剤が、２０以下のＨＬＢ値の界面活性剤を含むことを特徴とするものである。
【００１５】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片は、上記クロマトグラフィー試験片において、上記界面活性剤が、非イオン性の界面活性剤を含むことを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片は、上記クロマトグラフィー試験片において、上記界面活性剤が、コール酸系の界面活性剤を含むことを特徴とするものである。
【００１７】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片は、上記クロマトグラフィー試験片において、上記界面活性剤が、親水部に糖をもつ界面活性剤を含むことを特徴とするものである。
【００１８】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片は、上記クロマトグラフィー試験片において、上記反応層は、上記界面活性剤を上記反応層の全体に含むことを特徴とするものである。
【００１９】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片は、上記クロマトグラフィー試験片において、上記反応層は、上記界面活性剤を上記反応層の一部に含むことを特徴とするものである。
【００２０】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法は、クロマトグラフ分析で用いられる反応成分の少なくとも一つが固定化された反応層を有するクロマトグラフィー試験片の製造方法において、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を溶解した界面活性剤溶解液を、上記クロマトグラフィー試験片の反応層に含浸、あるいはコーティングするステップと、上記反応層に、含浸、あるいはコーティングした界面活性剤溶解液を乾燥させるステップと、を備えたことを特徴とするものである。
【００２１】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法は、上記クロマトグラフィー試験片の製造方法において、上記界面活性剤が、２０以下のＨＬＢ値の界面活性剤を含むことを特徴とするものである。
【００２２】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法は、上記クロマトグラフィー試験片の製造方法において、上記界面活性剤が、非イオン性の界面活性剤を含むことを特徴とするものである。
【００２３】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法は、上記クロマトグラフィー試験片の製造方法において、上記界面活性剤が、コール酸系の界面活性剤を含むことを特徴とするものである。
【００２４】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法は、上記クロマトグラフィー試験片の製造方法において、上記界面活性剤が、親水部に糖をもつ界面活性剤を含むことを特徴とするものである。
【００２５】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法は、上記クロマトグラフィー試験片の製造方法において、上記反応層の乾燥が自然乾燥により行われることを特徴とするものである。
【００２６】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法は、上記クロマトグラフィー試験片の製造方法において、上記反応層の乾燥が風乾により行われることを特徴とするものである。
【００２７】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法は、上記クロマトグラフィー試験片の製造方法において、上記反応層の乾燥が凍結乾燥により行われることを特徴とするものである。
【００２８】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法は、上記クロマトグラフィー試験片の製造方法において、上記界面活性剤溶解液が、上記反応層の全体に含浸、あるいはコーティングされたことを特徴とするものである。
【００２９】
また、本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法は、上記クロマトグラフィー試験片の製造方法において、上記界面活性剤溶解液が、上記反応層の一部に含浸、あるいはコーティングされたことを特徴とするものである。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。
【００３１】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１による単層の多孔質性材料よりなる横型クロマトグラフィー試験片を示す図である。
図１において、横型クロマトグラフィー試験片１０は、反応層担体支持体１と、試料添加部２と、標識物保持部位３と、反応層４と、特異的タンパク固定化部５と、吸水部６とを備える。
【００３２】
反応層担体支持体１は、液体不透過性のプラスチックなどからなり、クロマトグラフィー材料を支持する。試料添加部２は、吸収性の大きい不織布などからなり、液体試料が添加あるいは塗布される。標識物保持部位３は、不織布などに溶解可能なように標識試薬を保持する。反応層４は、ニトロセルロースなどからなり、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を溶解した界面活性剤溶解液が含浸処理され、その後、乾燥処理されている。ここで示す乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤とは、高濃度状態の界面活性剤を真空あるいは凍結乾燥、または熱をかけての常圧下もしくは常温常圧下においての乾燥作業を行った際に、塊化または顆粒、粉末といった固体の形状となり得るもののことを表す。なお、反応層４に対する含浸処理とは、反応層４を界面活性剤溶解液に浸漬する処理のことである。特異的タンパク固定化部５は、反応層４の領域上に、反応形式にあわせて、抗体あるいは抗原のような分析対象物に対して特異的に結合反応する特異的タンパク質を固定化する。吸水部６は、液体試料を最終的に吸収する。以上、試料添加部２、標識物保持部位３、反応層４、特異的タンパク固定化部５、及び吸水部６は、反応層担体支持体１の上部に形成されている。標識試薬、及び特異的タンパク質は、分析する試料、及び分析対象物に合わせて適切なものを選択する必要がある。
【００３３】
なお、界面活性剤溶解液に用いる界面活性剤としては、例えば、ＨＬＢ値が２０以下の界面活性剤、非イオン性の界面活性剤、コール酸系の界面活性剤、あるいは親水部に糖を持つ界面活性剤等を含むものを使用する。
【００３４】
また、反応層４に含浸した界面活性剤溶解液の乾燥処理としては、例えば、常温常圧下に放置して乾燥する方法である自然乾燥、任意の温度下において一定の風力をかけることで乾燥する方法である風乾、あるいは凍結乾燥等がある。
【００３５】
また、横型クロマトグラフィー試験片１０としては、ニトロセルロースやガラス繊維濾紙のような、任意の多孔質性担体で構成されたクロマトグラフィー材料からなる試験片が用いられる。
【００３６】
次に、本実施の形態１による横型クロマトグラフィー試験片１０を用いたクロマトグラフ分析方法について説明する。
【００３７】
図１において、液体試料が試料添加部２に添加されると、試料添加部２に浸透し、標識物保持部位３に達する。次に、標識物保持部位３の領域に保持された標識試薬が、液体試料の浸透により溶解され、液体試料と共に反応層４に浸透する。そして、液体試料の浸透と共に反応層４に含まれた界面活性剤が溶解する。溶解した界面活性剤の作用により、反応層４の浸潤が速やかに行われ、液体試料の浸透は、浸透する液体の先端がそろった状態で、かつ滞ること無く進行する。反応層４の領域上には、特異的タンパク質が固定化された特異的タンパク固定化部５がある。液体試料が分析対象物を含む場合は、特異的タンパク質が分析対象物と標識試薬との複合体に対して抗原抗体反応を起こし、特異的タンパク固定化部５の領域に何らかの呈色反応が見られる。液体試料が分析対象物を含まない場合は、抗原抗体反応は起こらず、呈色反応も見られない。最終的に、液体試料は吸水部６に吸収され、反応は終了する。
【００３８】
以上のように、本実施の形態１による横型クロマトグラフィー試験片１０によれば、クロマトグラフィー試験片１０上の界面活性剤溶解液の含浸処理と乾燥処理により、反応層４の浸透性を向上させ、より均一な浸透が行われる。この浸透性の向上と、均一な浸透により、クロマトグラフィー試験片の反応性が向上し、より高感度で、より高性能なクロマトグラフィー測定を実現することのできる効果が得られる。また、界面活性剤として、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を含んだものを用いることにより、液体試料が添加され反応層４に浸透するまで、反応層４は完全な乾燥状態にあるため、固定化された特異的タンパク質の失活を最低限に抑えることができ、クロマトグラフィー試験片の保存安定性の向上と、品質保持期間の長期化と、保管条件の緩和とを実現することができる。
【００３９】
また、界面活性剤としてＨＬＢ値が２０以下の界面活性剤を含むものを用いることで、反応層４における液体試料の浸透速度が速すぎることにより反応が不十分となることを回避することができる。さらに、ＨＬＢ値を選択することにより適度な反応速度に調節することができ、より高感度かつ高性能なクロマトグラフィー測定を実現できる。
【００４０】
また、界面活性剤として非イオン性の界面活性剤を含むものを用いることで、反応層４上への標識試薬の非特異吸着を回避でき、標識試薬が反応層４上にバックグラウンドとして残留することを防止できることにより、より高感度で、より高性能なクロマトグラフィー試験片による測定が可能となる。
【００４１】
また、界面活性剤としてコール酸系の界面活性剤を含むものを用いることで、タンパク質に対しての影響を低減でき、固定化された特異的タンパク質の変性あるいは失活を最低限に抑えることが可能となり、反応層４の長期間の性能保持を実現できる。
【００４２】
また、界面活性剤として親水部に糖を持つ界面活性剤を含むものを用いることで、糖の作用により溶解性が高く、浸透性が増す一方で、タンパク質に対しての影響が低いため、固定化された特異的タンパク質の変性あるいは失活を最低限に抑えることが可能となり、反応層４の長期間の性能保持を実現できる。
【００４３】
また、反応層の乾燥を自然乾燥により行うことで、反応層に固定化された特異的タンパク質に対する負荷を低く抑えることが可能となり、試験片の長期間の性能保持を実現できる。
また、反応層の乾燥を風乾により行うことで、乾燥時間を短時間化することができ、乾燥中における特異的タンパク質の失活あるいは変性を最低限に抑えることが可能となり、試験片の長期間の性能保持を実現できる。
また、反応層の乾燥を凍結乾燥により行うことで、特異的タンパク質の性質をほぼ保持することが可能となり、試験片の長期間の性能保持を実現できる。
【００４４】
（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態２による縦型クロマトグラフィー試験片について、図２、図３、及び図４を参照しながら説明する。
【００４５】
図２は、本実施の形態２による複数の多孔質性材料を積層してなる縦型クロマトグラフィー試験片の構成を示す斜視図である。図３は、試料添加部側から見た縦型クロマトグラフィー試験片を示す斜視図である。図４は、最終的に試料を吸収する吸水部側から見た縦型クロマトグラフィー試験片を示す斜視図である。
【００４６】
図２において、縦型クロマトグラフィー試験片２０は、試料添加部１１と、標識物保持部位１２と、特異的タンパク固定化部１３と、反応層１４と、吸水部１５とを備える。
試料添加部１１は、吸収性の大きい不織布などからなり、液体試料が添加あるいは塗布される。標識物保持部位１２は、不識布などに溶解可能なように標識試薬を保持する。特異的タンパク固定化部１３は、反応層１４の領域上に、反応形式にあわせて、抗体あるいは抗原のような分析対象物に対して特異的に結合反応する特異的タンパク質を固定化する。反応層１４は、ニトロセルロースなどからなり、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を溶解した界面活性剤溶解液が含浸処理され、その後、乾燥処理されている。なお、反応層１４に対する含浸処理とは、反応層１４を界面活性剤溶解液に浸漬する処理のことである。吸水部１５は、反応層１４上の反応結果を見るための結果確認窓１６を有しており、液体試料を最終的に吸収する。以上、試料添加部１１、標識物保持部位１２、特異的タンパク固定化部１３、反応層１４、及び吸水部１５は、積層されることにより、縦型クロマトグラフィー試験片２０が形成される。標識試薬、及び特異的タンパク質は、分析する試料、及び分析対象物に合わせて適切なものを選択する必要がある。
【００４７】
なお、界面活性剤溶解液に用いる界面活性剤としては、例えば、ＨＬＢ値が２０以下の界面活性剤、非イオン性の界面活性剤、コール酸系の界面活性剤、あるいは親水部に糖を持つ界面活性剤等を含むものを使用する。
また、反応層４に含浸した界面活性剤溶解液の乾燥処理としては、例えば、常温常圧下に放置して乾燥する方法である自然乾燥、任意の温度下において一定の風力をかけることで乾燥する方法である風乾、あるいは凍結乾燥等がある。
また、縦型クロマトグラフィー試験片２０としては、ニトロセルロースやガラス繊維濾紙のような、任意の多孔質性担体で構成されたクロマトグラフィー材料からなる試験片が用いられる。
【００４８】
次に、本実施の形態２による縦型クロマトグラフィー試験片２０を用いたクロマトグラフ分析方法について説明する。
図２、図３、及び図４に示された縦型クロマトグラフィー試験片２０上において、液体試料が試料添加部１１に添加されると、試料添加部１１に浸透し、標識物保持部位１２に達する。次に、標識物保持部位１２の領域に保持された標識試薬が、液体試料の浸透により溶解され、液体試料と共に反応層１４に浸透する。そして、液体試料の浸透と共に反応層１４に含まれた界面活性剤が溶解する。溶解した界面活性剤の作用により、反応層１４の浸潤が速やかに行われ、液体試料の浸透は、浸透する液体の先端が比較的均一な状態で、かつ滞ること無く進行する。反応層１４の領域上には、特異的タンパク質が固定化された特異的タンパク固定化部１３がある。液体試料が分析対象物を含む場合は、特異的タンパク質が分析対象物と標識試薬との複合体に対して抗原抗体反応を起こし、特異的タンパク固定化部１３の領域に何らかの呈色反応が見られる。この呈色反応は、吸水部１５に設けられた結果確認窓１６を通して見ることができる。液体試料が分析対象物を含まない場合は、抗原抗体反応は起こらず、呈色反応も見られない。最終的に、液体試料は吸水部１５に吸収され、反応は終了する。
【００４９】
以上のように、本実施の形態２による縦型クロマトグラフィー試験片２０によれば、縦型クロマトグラフィー試験片２０上の界面活性剤溶解液の含浸処理と乾燥処理により、反応層１４の浸透性を向上させ、より均一な浸透が行われる。この浸透性の向上と、均一な浸透により、クロマトグラフィー試験片の反応性が向上し、より高感度で、より高性能なクロマトグラフィー測定を実現することのできる効果が得られる。また、界面活性剤として、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を含んだものを用いることにより、液体試料が添加され反応層１４に浸透するまで、反応層１４は完全な乾燥状態にあるため、固定化された特異的タンパク質の失活を最低限に抑えることができ、クロマトグラフィー試験片の保存安定性の向上と、品質保持期間の長期化と、保管条件の緩和とを実現することができる。
【００５０】
また、界面活性剤としてＨＬＢ値が２０以下の界面活性剤を含むものを用いることで、反応層１４における液体試料の浸透速度が速すぎることにより反応が不十分となることを回避することができる。さらに、ＨＬＢ値を選択することにより適度な反応速度に調節することができ、より高感度かつ高性能なクロマトグラフィー測定を実現できる。
【００５１】
また、界面活性剤として非イオン性の界面活性剤を含むものを用いることで、反応層１４上への標識試薬の非特異吸着を回避でき、標識試薬が反応層１４上にバックグラウンドとして残留することを防止できることにより、より高感度で、より高性能なクロマトグラフィー試験片による測定が可能となる。
【００５２】
また、界面活性剤としてコール酸系の界面活性剤を含むものを用いることで、タンパク質に対しての影響を低減でき、固定化された特異的タンパク質の変性あるいは失活を最低限に抑えることが可能となり、反応層１４の長期間の性能保持を実現できる。
【００５３】
また、界面活性剤として親水部に糖を持つ界面活性剤を含むものを用いることで、糖の作用により溶解性が高く、浸透性が増す一方で、タンパク質に対しての影響が低いため、固定化された特異的タンパク質の変性あるいは失活を最低限に抑えることが可能となり、反応層１４の長期間の性能保持を実現できる。
【００５４】
また、反応層の乾燥を自然乾燥により行うことで、反応層に固定化された特異的タンパク質に対する負荷を低く抑えることが可能となり、試験片の長期間の性能保持を実現できる。
また、反応層の乾燥を風乾により行うことで、乾燥時間を短時間化することができ、乾燥中における特異的タンパク質の失活あるいは変性を最低限に抑えることが可能となり、試験片の長期間の性能保持を実現できる。
また、反応層の乾燥を凍結乾燥により行うことで、特異的タンパク質の性質をほぼ保持することが可能となり、試験片の長期間の性能保持を実現できる。
【００５５】
なお、実施の形態１及び２における界面活性剤とは、分子内に水分子との親和性が強い親水性原子団と、水分子との親和性の弱い疎水性原子団を持つ界面、または表面の諸性質を変化させる性質を有する物質のことを総称している。
【００５６】
また、実施の形態１及び２では、クロマトグラフ分析で用いられる反応成分として、特異的タンパク質が反応層上に固定化された試験片について説明したが、これは一例であって、例えば、酵素のように反応の前後において何らかの変化を生じるものを、反応層に固定化された反応成分として用いてもよい。
【００５７】
図５、及び図６は、酵素を用いたクロマトグラフィー試験片の構成を示す図である。
クロマトグラフィー試験片３０は、試料添加部１１と、反応試薬含浸部位１７と、反応層１４と、酵素固定化部７と、吸水部１５とを備える。なお、反応層１４の領域上に、酵素を固定化した酵素固定化部７以外の構成は、実施の形態２と同様であり、説明を省略する。
【００５８】
酵素を用いたクロマトグラフィー試験片３０による測定において、液体試料が分析対象物を含む場合には、反応試薬含浸部位１７に含浸された反応試薬と、酵素固定化部７に固定化された酵素の作用により、酵素固定化部７の領域に何らかの呈色が見られる。
【００５９】
このクロマトグラフィー試験片３０においても、界面活性剤溶解液を、反応層１４に含浸し、その後に乾燥させたことにより、実施の形態２と同様の効果を得ることができる。
【００６０】
また、実施の形態１及び２では、界面活性剤として、ＨＬＢ値が２０以下の界面活性剤を含むものを用いるとしたが、好ましくは、ＨＬＢ値が２０に近い値であり、かつ、親水性原子団を多く持つ構造である界面活性剤を含むものを用いる。
【００６１】
また、実施の形態１及び２では、界面活性剤として、コール酸系の界面活性剤を含むものを用いるとしたが、好ましくは、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅや、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅなどのコール酸を母核とする界面活性剤を含むものを用いる。
【００６２】
また、実施の形態１及び２では、親水部に糖を持つ界面活性剤を含むものを用いるとしたが、好ましくは、Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅや、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−Ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅなどの糖鎖を持つ構造を有した界面活性剤を含むものを用いる。
【００６３】
また、実施の形態１及び２では、反応層４、１４に対する界面活性剤処理は、反応層４、１４の一部に対してなされても、全体に対してなされてもよい。
【００６４】
また、実施の形態１及び２では、反応層４、１４に対する界面活性剤処理は、反応層４、１４に界面活性剤溶解液を含浸する含浸処理により行うとしたが、反応層４、１４に界面活性剤溶解液をコーティングするコーティング処理により行ってもよい。
【００６５】
また、実施の形態１及び２で示した界面活性剤の物質名は一部であり、上記以外の界面活性剤を用いてもよい。
【００６６】
【実施例】
以下の実施例により、本発明を実施する方法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例になんら制約されるものではない。
【００６７】
（血漿中ｈＣＧの定量）
ニトロセルロース膜中に抗ｈＣＧ−β抗体固定化ライン、及び抗ｈＣＧ−α抗体と金コロイドとの複合体の広いバンドを含む免疫クロマトグラフィー試験片を製造した。この試験片を図１に示す。図中、試験片は、特異的タンパク固定化部５と、それよりも前にある抗ｈＣＧ−α抗体と金コロイドとの複合体が含有された領域である標識物保持部位３と、試料添加部２とを含む。これらの試験片は、次のようにして製造した。
【００６８】
実施例１．
クロマトグラフィー試験片の調製
リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ｈＣＧ−β抗体溶液を準備した。この抗体溶液を溶液吐出装置を用いて、ニトロセルロース膜上に塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に検出用の抗体固定化ラインが得られた。このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽に膜を移動し、１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にて更に１０分間緩やかに振り、膜の洗浄を行なった。２度洗浄を行った後に、０．０５％Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ（同仁化学製）を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して１０分間緩やかに振った膜を液槽から取り出して、室温で乾燥させた。
【００６９】
金コロイドは、０．０１％塩化金酸の還流中の１００℃溶液に１％クエン酸溶液を加えることによって調製した。還流を３０分間続けた後に、冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ９に調製した前記金コロイド溶液に、抗ｈＣＧ−α抗体を加えて数分間攪拌した後に、１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液ｐＨ９を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、当初の金コロイド溶液量の１０分の１に調製して、４℃で貯蔵した。
【００７０】
前記標識抗体溶液を溶液吐出装置にセットして、抗ｈＣＧ−β抗体固定化乾燥膜上の抗体固定化位置から離れた位置に塗布した後に、膜を乾燥させた。これによって、固定化膜上に標識抗体保持部位が得られた。
【００７１】
こうして調製された標識抗体保持部位を含む抗体固定化膜を、反応層担体支持体上に貼付け、不織布を試料添加部として、ガラス繊維ろ紙を吸水部として、付け加えてから０．５ｃｍ幅の細片に切断して、試験片を作製した。
【００７２】
実施例２．
試料の調製
抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液を４０００ｒｐｍにて、５分間遠心分離を行って血球を分離した血漿を調製した。この血漿に既知濃度のｈＣＧ溶液を加えることにより、さまざまな既知濃度のｈＣＧ溶液を調製した。
【００７３】
実施例３．
試験片上の呈色度合の測定
試験片上の試料添加部にｈＣＧを含む血漿を２００μｌ以上添加して、吸水部方向へと展開処理して、抗原抗体反応をさせて抗体固定化部における呈色反応を行った。この試験片への試料添加から５分後の呈色状況を反射型分光光度計（ＣＳ９３００；島津製作所製）を用いて計測して、呈色度を演算処理した。
【００７４】
０、１００、１０００、１００００Ｕ／ｌのｈＣＧを含有する血漿を試験片に添加して展開処理した。各ｈＣＧ濃度の血漿に対する試験片上の抗体固定化部の呈色状況を反射型分光光度計で測定した。５２０ｎｍの波長における吸光度を計測して、予め作成しておいたｈＣＧ濃度と吸光度との関係を示す検量線に代入した。その結果を図７に示す。本来、例えば１０００Ｕ／ｌのｈＣＧを含有する血液の吸光度を計測し、その吸光度を検量線に代入すると、ｈＣＧ濃度は１０００Ｕ／ｌとなるはずであるが、実際には、少しずれる。そのずれの大きさにより、その測定の正確さを知ることができる。
【００７５】
図７は、クロマトグラフィー試験片において、反応層を界面活性剤で処理していない場合（ａ）と、界面活性剤で処理した場合（ｂ）との定量性能を示す図である。横軸は、試験片に添加した試料のｈＣＧ濃度を表す。縦軸は、試験片上の呈色領域における標識物からの信号を検量線に代入して求めた抗原濃度の換算値を表す。
【００７６】
以下、クロマトグラフィー試験片において、反応層を界面活性剤で処理していない場合と、界面活性剤で処理した場合について、その効果を説明する。
図７において、クロマトグラフィー試験片に液体試料を添加し、５分後の呈色度合の測定値をもとに、分析対象物の濃度を換算した結果を表している。この際に使用した標識試薬は、（ａ）、（ｂ）共に同じ抗体−金コロイド複合体を使用している。まず、界面活性剤で反応層を処理した場合（図７（ｂ））は、ＣＶ値（変動係数）が０〜７％であるのに対して、界面活性剤で処理していない場合（図７（ａ））は、ＣＶ値が１５〜３５％と、大きなばらつきを示し、定量性能が悪いことがわかる。以上の結果から、クロマトグラフィー試験片において、界面活性剤を含浸処理した反応層を用いることは、定量性能の向上に大きく関与していることが理解できる。今回は定量性能について比較説明を行ったが、定性試験においても界面活性剤を含浸処理した反応層を有したクロマトグラフィー試験片を用いた方が、より正確な測定結果が得られている。
【００７７】
なお、本実施例においては、金コロイドを標識物として用いているため、５２０ｎｍの波長における呈色度合を測定したが、標識物が持つ吸収波長であれば、どの波長における吸光度を測定しても良い。
【００７８】
【発明の効果】
本発明のクロマトグラフィー試験片によれば、複数の多孔質性材料を積層してなる、あるいは単層の多孔質性材料よりなるクロマトグラフィー試験片において、クロマトグラフ分析で用いられる反応成分の少なくとも一つが固定化された反応層が、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を含むものとしたことで、反応層の浸透性の向上と、均一な試料の浸透によりクロマトグラフィー試験片の反応性を向上させることができ、より高感度で、高性能なクロマトグラフィー測定を実現することのできる効果が得られる。また、界面活性剤として、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を用いることにより、反応層に固定化された反応成分の失活を最低限に抑えることができ、クロマトグラフィー試験片の保存安定性の向上と、品質保持期限の長期化と、保管条件の緩和とを実現することができる。
【００７９】
本発明のクロマトグラフィー試験片によれば、界面活性剤としてＨＬＢ値が２０以下の界面活性剤を含むものを用いることで、上記の効果に加え、反応層における液体試料の浸透速度が速すぎることにより反応が不十分となることを回避することができ、さらに、ＨＬＢ値を選択することにより適度な反応速度に調節することができ、より高感度かつ高性能なクロマトグラフィー測定を実現できる効果も得られる。
【００８０】
本発明のクロマトグラフィー試験片によれば、界面活性剤として非イオン性の界面活性剤を含むものを用いることで、上記の効果に加え、反応層上への標識試薬の非特異吸着を回避でき、標識試薬が反応層上にバックグラウンドとして残留することを防止できることにより、より高感度で、より高性能なクロマトグラフィー試験片による測定が可能となる効果も得られる。
【００８１】
本発明のクロマトグラフィー試験片によれば、界面活性剤としてコール酸系の界面活性剤を含むものを用いることで、上記の効果に加え、タンパク質に対しての影響を低減でき、固定化された特異的タンパク質の変性あるいは失活を最低限に抑えることが可能となり、反応層の長期間の性能保持を実現できる効果も得られる。
【００８２】
本発明のクロマトグラフィー試験片によれば、界面活性剤として親水部に糖を持つ界面活性剤を含むものを用いることで、上記の効果に加え、糖の作用により溶解性が高く、浸透性が増す一方で、タンパク質に対しての影響が低いため固定化された特異的タンパク質の変性あるいは失活を最低限に抑えることが可能となり、反応層の長期間の性能保持を実現できる効果も得られる。
【００８３】
本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法によれば、クロマトグラフ分析で用いられる反応成分の少なくとも一つが固定化された反応層を有するクロマトグラフィー試験片の製造方法において、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を溶解した界面活性剤溶解液を、上記クロマトグラフィー試験片の反応層に含浸、あるいはコーティングするステップと、上記反応層に、含浸、あるいはコーティングした界面活性剤溶解液を乾燥させるステップとを備えたことで、反応層の浸透性の向上と、均一な試料の浸透によりクロマトグラフィー試験片の反応性を向上させることができ、より高感度で、高性能なクロマトグラフィー試験片を製造できる効果が得られる。また、界面活性剤として、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を用いることにより、反応層に固定化された反応成分の失活を最低限に抑えることができ、保存安定性の向上と、品質保持期限の長期化と、保管条件の緩和とを実現したクロマトグラフィー試験片を製造することができる。
【００８４】
本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法によれば、界面活性剤としてＨＬＢ値が２０以下の界面活性剤を含むものを用いることで、上記の効果に加え、反応層における液体試料の浸透速度が速すぎることにより反応が不十分となることを回避することができ、さらに、ＨＬＢ値を選択することにより適度な反応速度に調節することができ、より高感度かつ高性能なクロマトグラフィー試験片を製造できる効果も得られる。
【００８５】
本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法によれば、界面活性剤として非イオン性の界面活性剤を含むものを用いることで、上記の効果に加え、反応層上への標識試薬の非特異吸着を回避でき、標識試薬が反応層上にバックグラウンドとして残留することを防止できることにより、より高感度で、より高性能なクロマトグラフィー試験片の製造が可能となる効果も得られる。
【００８６】
本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法によれば、界面活性剤としてコール酸系の界面活性剤を含むものを用いることで、上記の効果に加え、タンパク質に対しての影響を低減でき、固定化された特異的タンパク質の変性あるいは失活を最低限に抑えることが可能となり、長期間の性能保持が可能なクロマトグラフィー試験片を製造できる効果も得られる。
【００８７】
本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法によれば、界面活性剤として親水部に糖を持つ界面活性剤を含むものを用いることで、上記の効果に加え、糖の作用により溶解性が高く、浸透性が増す一方で、タンパク質に対しての影響が低いため固定化された特異的タンパク質の変性あるいは失活を最低限に抑えることが可能となり、長期間の性能保持が可能なクロマトグラフィー試験片を製造できる効果も得られる。
【００８８】
本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法によれば、反応層の乾燥を自然乾燥により行うことで、上記の効果に加え、反応層上に固定化された反応成分に対する負荷を低く抑えることが可能となるため、処理された反応層の性能を長期間保持することのできるクロマトグラフィー試験片を製造できる効果も得られる。
【００８９】
本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法によれば、反応層の乾燥を風乾により行うことで、上記の効果に加え、乾燥時間を短時間化することができ、乾燥中における固定化反応成分の失活あるいは変性を最低限にすることが可能となり、処理された反応層の性能を長期間保持することのできるクロマトグラフィー試験片を製造できる効果も得られる。
【００９０】
本発明のクロマトグラフィー試験片の製造方法によれば、反応層の乾燥を凍結乾燥により行うことで、上記の効果に加え、固定化反応成分の性質をほぼ保持することが可能となり、処理された反応層の性能を長期間保持することのできるクロマトグラフィー試験片を製造できる効果も得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１による横型クロマトグラフィー試験片の構成を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態２による縦型クロマトグラフィー試験片の構成を示す斜視図である。
【図３】本発明の実施の形態２による縦型クロマトグラフィー試験片を示す斜視図である。
【図４】本発明の実施の形態２による縦型クロマトグラフィー試験片を示す斜視図である。
【図５】酵素を用いたクロマトグラフィー試験片の構成を示す図である。
【図６】酵素を用いたクロマトグラフィー試験片の構成を示す図である。
【図７】本発明の実施例による反応層の処理として界面活性剤を用いない場合（ａ）と、界面活性剤を用いた場合（ｂ）との定量性能を示す図である。
【図８】従来のクロマトグラフィー試験片を示す図である。
【符号の説明】
１ 反応層担体支持体
２、１１ 試料添加部
３、１２ 標識物保持部位
４、１４ 反応層
５、１３ 特異的タンパク固定化部
６、１５ 吸水部
７ 酵素固定化部
１６ 結果確認窓
１７ 反応試薬含浸部位
１０ 横型クロマトグラフィー試験片
２０ 縦型クロマトグラフィー試験片
３０ クロマトグラフィー試験片

Claims (10)

1. 複数の多孔質性材料を積層してなる、あるいは単層の多孔質性材料よりなるクロマトグラフィー試験片において、
   クロマトグラフ分析で用いられる反応成分の少なくとも一つが固定化された反応層が、乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を含み、上記界面活性剤が、親水部に糖をもつ界面活性剤であるＳｕｃｒｏｓｅ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ、もしくはｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−Ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅであることを特徴とするクロマトグラフィー試験片。
2. 請求項１に記載のクロマトグラフィー試験片において、
   上記界面活性剤が、０＜ＨＬＢ値≦２０の界面活性剤を含むことを特徴とするクロマトグラフィー試験片。
3. 請求項１または２に記載のクロマトグラフィー試験片において、
   上記反応層は、上記界面活性剤を上記反応層の全体に含むことを特徴とするクロマトグラフィー試験片。
4. クロマトグラフ分析で用いられる反応成分の少なくとも一つが固定化された反応層を有するクロマトグラフィー試験片の製造方法において、
   乾燥した際に固体となり得る性状の界面活性剤を溶解した界面活性剤溶解液を、上記クロマトグラフィー試験片の反応層に含浸、あるいはコーティングするステップと、
   上記反応層に、含浸、あるいはコーティングした界面活性剤溶解液を乾燥させるステップと、
   を備え、
   上記界面活性剤が、親水部に糖をもつ界面活性剤であるＳｕｃｒｏｓｅ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ、もしくはｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−Ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅであることを特徴とするクロマトグラフィー試験片の製造方法。
5. 請求項４に記載のクロマトグラフィー試験片の製造方法において、
   上記界面活性剤が、０＜ＨＬＢ値≦２０の界面活性剤を含むことを特徴とするクロマトグラフィー試験片の製造方法。
6. 請求項４または５に記載のクロマトグラフィー試験片の製造方法において、
   上記反応層の乾燥が自然乾燥により行われることを特徴とするクロマトグラフィー試験片の製造方法。
7. 請求項４または５に記載のクロマトグラフィー試験片の製造方法において、
   上記反応層の乾燥が風乾により行われることを特徴とするクロマトグラフィー試験片の製造方法。
8. 請求項４または５に記載のクロマトグラフィー試験片の製造方法において、
   上記反応層の乾燥が凍結乾燥により行われることを特徴とするクロマトグラフィー試験片の製造方法。
9. 請求項４ないし８のいずれか一つに記載のクロマトグラフィー試験片の製造方法において、
   上記界面活性剤溶解液が、上記反応層の全体に含浸、あるいはコーティングされたことを特徴とするクロマトグラフィー試験片の製造方法。
10. 請求項４ないし８のいずれか一つに記載のクロマトグラフィー試験片の製造方法において、
    上記界面活性剤溶解液が、上記反応層の一部に含浸、あるいはコーティングされたことを特徴とするクロマトグラフィー試験片の製造方法。

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