JP2705768B2 - 検定法 - Google Patents

検定法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は特異結合を伴う検定法、
特に免疫学的検定法に係る。
【０００２】詳細には、本発明は家庭、診療所、診察室
等での使用に適し、早急に分析結果を得ることができ、
しかも使用者の側の熟練も手間もほとんど要さない分析
装置に係る。
【０００３】
【従来技術および発明が解決しようとする課題】家庭で
試験装置を使って妊娠の判定や受胎（排卵）期の判定を
行うことは今や普通になっており、多種に及ぶ試験装置
やキットが市販されている。現在市販されている装置は
例外無く試験結果が観察されるようになるまでに使用者
が一連の作業を行わねばならない形式のものばかりであ
る。このような作業は当然ながら時間がかかる上に、失
敗の可能性も伴う。
【０００４】本発明の目的は、未熟練者でも容易に使用
でき、また好適には装置の一部分のみ試料（例えば妊娠
試験や排卵試験の場合では尿）と接触させれば良く、そ
の後使用者が何もしなくても分析結果を観察できる試験
装置を提供することである。理想的には試料を塗布して
から数分間、例えば１０分以下で分析結果を観察できる
ようにすべきであると言える。
【０００５】免疫学的検定法のような特異結合検定法に
おいて試薬含浸試験片を使用することがこれまでに提案
されている。この方法では、試料を試験片の一部分に塗
布し、通常は水のような溶離液を用いて試料を試験片の
材料に浸透させる。そうするうちに試料が、試験片の検
出区域に侵入し、あるいはここを通過し、そこで試料の
中に存在すると思われる検体に対する特異結合試薬が固
定される。従って試料中に存在する検体が検出区域の中
で結合される。検体が検出区域の中で結合される程度は
標識付き試薬を用いて判定することができるが、この標
識付き試薬もまた試験片の中に含ませておくか、あるい
は後に塗布することができる。上記の原理を用いた先行
技術例がタイロイド・ダイアグノスティックス・インコ
ーポレイテッド（Thyroid Diagnostics Inc ）GB 15892
34、ブーツ・セルテック・ダイアグノスティックス・リ
ミテッド（Boots-Celltech Diagnostics Limited）EP 0
225054、シンテックスUSA インコーポレイテッド（Synt
ex USA Inc. ）EP 0183442、ベーリンベルク（Behringw
erk) AG,EP0186799 に記載されている。
【０００６】本発明は上に挙げた刊行物に記載されてい
るような周知技術を改良して、特に家庭での使用に適
し、速効的で便利であり、しかも使用者の手間をできる
だけ少なくした診断試験装置を提供することを目的とす
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の典型的実施態様
である分析試験装置は、乾燥多孔質キャリヤを内蔵して
不透湿性固体材料で形成されている中空ケーシングを含
んで成る分析試験装置であって、前記多孔質キャリヤに
液状試験試料を付与できるように前記多孔質キャリヤが
ケーシングの外部と直接的または間接的に連通してお
り、前記装置が、湿潤状態において多孔質キャリヤ内部
で自由に移動し得る検体に対し特異結合性の標識付き試
薬と、キャリヤ材料上の検出区域に永久的に固定されて
おり従って湿潤状態でも移動しない同検体に対して特異
結合性の無標識試薬とを含んでおり、装置に付与した液
状試料が標識付き試薬を吸収した後に検出区域に浸透す
るように標識付き試薬と検出区域との位置関係が決定さ
れており、該装置がさらに、標識付き試薬が検出区域に
おいて結合された程度（結合された場合）を観察できる
ようにする手段を含んで成る装置である。
【０００８】本発明の別の実施態様は検体の検定に使用
する装置であり、該装置が第１区域に標識付き試薬を保
持する多孔質固相材料を含み、該標識付き試薬は多孔質
材料が乾燥状態にある間は第１区域に保持されるが、例
えば検体を含有すると思われる水性液状試料の塗布など
によって多孔質材料が湿潤されると多孔質材料を通って
自由に移動できるようになる試薬であり、多孔質材料が
さらに、第１区域から空間的に別の所にある第２区域に
検体に対して特異性を有する無標識特異結合試薬を保持
しており、前記無標識試薬は標識付き試薬と共に「サン
ドイッチ」反応または「競合」反応に参加できる試薬で
あり、多孔質材料が湿潤状態にある時にも自由に移動で
きないように多孔質材料上で固定化される。
【０００９】本発明はまた、分析方法も提供する。本発
明の分析方法では、上で述べた装置を検体を含有すると
思われる水性液状試料と接触させ、試料を毛細管現象に
より多孔質固相材料を通って第１区域から第２区域へと
浸透せしめ、試料と共に標識付き試薬も第１区域から第
２区域へと移動せしめ、標識付き試薬が第２区域で結合
された程度（結合された場合）を観察することによっ
て、試料の中に検体が存在するか否かを判定する。
【００１０】本発明の一実施態様では、標識付き試薬と
して検体に対して特異的に結合する相手の物質を使用す
る。標識付き試薬と検体（もしあれば）と固定化された
無標識特異結合試薬とが共同して「サンドイッチ」反応
を生じる。その結果、試料中に検体が存在する場合は第
２区域で標識付き試薬が結合される。これら２種類の結
合試薬は、検体の異なるエピトープに対して特異性をも
つものでなければならない。
【００１１】本発明の別の実施態様では、標識付き試薬
として標識と結合された検体そのもの、あるいは検体の
類似物、すなわち検体と同じ特異結合特性を有しかつ同
じように標識と結合された化学物質を使用する。後者の
場合、水性液状試料における溶解性や分散性および湿潤
多孔質固相材料を通って移動する能力に影響を及ぼす検
体類似物の特性は、検体そのものの特性と同じかあるい
は少なくともごく近いものにする必要がある。この第２
実施態様では、標識を付けた検体または検体類似物が多
孔質固相材料を通って第２区域に入り、固定化試薬と結
合する。試料の中に検体が存在すれば、それがこの結合
反応において標識付き試薬と競合する。このような競合
の結果、第２区域で結合される標識付き試薬の量が減少
し、その結果試料中に検体が存在しない場合に比較して
第２区域において観察される信号の程度が弱くなる。
【００１２】本発明の重要な好適実施態様ではキャリヤ
材料としてニトロセルロースを選択する。この材料は予
め増感しなくても固有に蛋白質と結合する能力を有する
ため、紙のような従来の試験片材料に比べて相当に優れ
ている。免疫グロブリンのような特異結合試薬を直接ニ
トロセルロースに塗布し、その上で固定化することがで
きる。試薬のもつ特異結合能力の妨げとなるような化学
処置を全く必要としない。その後ニトロセルロースの不
使用結合部位を、ポリビニルアルコールのような簡単な
材料を用いて遮断することができる。さらに、ニトロセ
ルロースはいろいろな大きさの気孔のものを入手するこ
とができるため、試料流量のような要件に特に合わせて
キャリヤ材料を選択することが容易になる。
【００１３】本発明の別の重要好適実施態様では、所謂
「直接標識」を一方の特異結合試薬に付けて使用する。
金ゾルや染料ゾルのような直接標識が既知となってお
り、それらを用いると、検出可能な信号を生成するため
に別の試薬を加えなくても分析結果を瞬時に得ることが
できる。直接標識は丈夫で安定性があるため、乾燥状態
で保存される分析装置に容易に使用することができる。
水性試料と接触した時の放出度を、例えば可溶性グレー
ズを用いて調整することができる。
【００１４】本発明の重要な特徴は、直接標識付きの特
異結合試薬をキャリヤをベースとした分析装置、例えば
ストリップ形式の装置に使用して短時間で明確な結果を
得られるようにする技術的特徴を選択したことにある。
理想を言えば、検定結果を眼で識別できるようにするべ
きであり、それを簡単にするためには、直接標識が検出
区域に集中することが必要である。これを達成するに
は、直接標識付きの試薬が展開液によって容易に移送さ
れるようにする必要がある。また、観察可能な結果が得
られる可能性を高めるために、展開試料液を比較的小さ
な検出区域に通すのが望ましい。
【００１５】この他に本発明の重要な面は、ニトロセル
ロースから成るキャリヤ材料に直接標識付き特異結合試
薬を使用することにある。ニトロセルロースの気孔の大
きさは少なくとも１ミクロンとするのが望ましい。また
その気孔の大きさを約20ミクロン以下とすることが望ま
しい。特に好適な実施態様では、直接標識として球形ま
たは略球形で最大直径約0.5 ミクロン以下の着色ラテッ
クス粒子を用いる。このような粒子の理想的な大きさは
約0.05〜0.5 ミクロンである。
【００１６】本発明のさらに別の実施態様では、多孔質
固相材料を多孔質受容部材に連結してこの受容部材に液
状試料を塗布し、そこから試料が多孔質固相材料の中に
透過できるようにする。好適には、多孔質固相材料を不
透湿性ケーシングまたはハウジングに内蔵し、この多孔
質固相材料と連結されている多孔質受容部材がハウジン
グの外に延びて、液状試料をハウジング内に導き入れ、
多孔質固相材料に透過させる手段として作用できるよう
にする。多孔質固相材料の第２区域（固定化された無標
識特異結合試薬を保持する）がハウジング外部から観察
できるようにして、検定結果の観察を可能にする手段、
例えば適宜に配置した開口部をハウジングに設けねばな
らない。また必要に応じて多孔質固相材料の別の区域、
すなわち検定を完了したかどうかに関する表示を行なえ
るようにする対象試薬を含む区域をハウジング外部から
観察できるようにする手段もハウジングに備えることも
できる。好適には、使用までの保管中に突出している多
孔質受容部材を保護する着脱自在のキャップまたは囲い
をハウジングに設ける。また必要であれば試料塗布後の
検定実施中にもキャップまたは囲いを突出多孔質受容部
材にかぶせても良い。標識付き試薬は装置内の任意の場
所、例えば吸湿性試料捕集部材の中に含ませることもで
きるが、好ましい方法ではない。
【００１７】本発明の重要な実施態様である妊娠判定装
置は乾燥多孔質ニトロセルロースキャリヤを内蔵した中
空伸長形ケーシングを含んで成り、前記ニトロセルロー
スキャリヤがケーシングから突出する吸湿性尿受容部材
を介してケーシング外部と間接的に連通しており、前記
受容部材は液溜めとして作用してそこから尿を多孔質キ
ャリヤ中へ放出するための部材であり、前記キャリヤ
が、多孔質キャリヤが湿潤状態にある時に多孔質キャリ
ヤ内で自由に移動する、着色「直接」標識付きの高度に
特異性の抗− hＣＧ抗体を第１区域に含み、また第１区
域と空間的に区別される第２区域にキャリヤ材料上に永
久的に固定化されており、従って湿潤状態でも移動しな
い高特異性の無標識抗− hＣＧ抗体を含んでおり、前記
標識付き抗体と無標識抗体がそれぞれ異なる hＣＧエピ
トープに対して特異性を有する抗体であり、前記第１区
域と第２区域は多孔質キャリヤに付与した尿試料が第１
区域を介して第２区域に浸透するように配設されてお
り、前記ケーシングが突出形吸湿性尿受容部材用の着脱
式カバーと共に、分析結果を観察できる開口部を少なく
とも１つ備える不透明または半透明材料で構成されて成
る。受胎期予知装置も検体がＬＨになる点を除いて本質
的には上記の装置と同じであり、重要な選択的実施態様
の１つである。
【００１８】これらの装置は家庭用として、複数（例え
ば２つ）の装置を個別に不透湿性の包装材で包んだもの
を一緒にパックして、使用者向けの使用説明書を付けた
キットの形で提供することができる。
【００１９】多孔質試料受容部材は、液体を急速に吸収
できるものであれば吸湿性材料、多孔質材料、繊維質材
料など任意の材料で形成することができる。材料の多孔
性は一方向性（すなわち気孔または繊維の全部が部材の
軸に平行に通っている）または多方向性（全方向性、そ
のため部材は非晶質のスポンジ状構造となる）の何れで
も良い。ポリプロピレン、ポリエチレン（好適には分子
量の非常に高いもの）、ポリフッ化ビニリデン、エチレ
ン酢酸ビニル、アクリロニトリル、ポリテトラフルオロ
エチレンのような多孔質プラスチック材料を使用するこ
とができる。多孔質試料受容部材を製造の段階で界面活
性剤で予め処理しておくと有利である。界面活性剤は部
材の固有の疎水性を低減できるため、湿潤試料を高速か
つ効率的に吸収、伝達することができるためである。多
孔質試料受容部材はその他にも紙やニトロセルロールの
ようなセルロース材料でも形成することができる。現在
所謂筆ペンのペン先に使用されている材料が特に好適で
あり、このような材料は本発明の目的に適するいろいろ
な長さおよび断面に成形または押出し成形することが可
能である。多孔質受容部材を構成する材料は、好適には
多孔質部材が数秒間で水性液で含浸されるように選択す
るべきである。またその材料は湿潤しても丈夫であるこ
とが望ましい。この理由から、多孔質受容部材がハウジ
ングから突出する実施態様では、紙のような材料は好適
でないとされる。その後試料液は多孔質試料受容部材か
ら多孔質固相材料の中に自由に浸透していく必要があ
る。
【００２０】「対照」区域が存在する場合、その区域は
装置の動作が完了したことを使用者に示す信号のみを伝
達するように構成することができる。例えば、第１区域
からの標識付抗体と結合する抗体を対照区域に含ませる
ことによって、試料が試験片に浸透したことを確認でき
る。この時の抗体は、例えば標識付抗体がネズミのハイ
ブリドーマを用いて誘導したものである場合には「抗−
ネズミ」抗体である。別の方法として、湿潤した時に変
色または発色する無水試薬、例えば水性試料で湿潤する
と青色に変わる無水硫酸銅を対照区域に含ませても良
い。さらに別の方法として、第１区域からの余分の標識
付き試薬と反応する固定化検体を対照区域に含ませる場
合もある。対照区域の目的が試験完了を使用者に知らせ
ることにあるため、対照区域の場所は所望の試験結果の
記録される第２区域より下流側にしなければならない。
こうすることで使用者に対して試料が所要距離に亘って
試験装置に浸透したことを確実に知らせるインジケータ
が得られる。
【００２１】標識はその存在を容易に検出できるもので
あれば任意の物質として良い。好適には直接標識、すな
わちその自然状態にある時に裸眼で見えるか、または光
学フィルタの使用および／または紫外光等の刺激を加え
て螢光を促進する方法の使用により容易に見える物質と
するのが良い。例えば、染料ゾル、金属ゾル（金な
ど）、着色ラテックス粒子のような微細な着色粒子は特
に好適である。これらの中でも着色ラテックス粒子が最
も好適である。標識を小さな区域または容積の中に集中
することによって濃く着色された領域のように容易に検
出可能な信号を生じることができるはずである。この信
号の評価は目測または必要に応じて器具を用いて行なう
ことができる。
【００２２】アルカリ性フォスファターゼ、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ等の酵素類のような間接標識
を用いることもできるが、可視信号を検出できるように
なるためには基質のような展開試薬を１種類またはそれ
以上添加することが必要になるのが普通であるため、余
り好適ではない。このような展開試薬を添加する場合
は、多孔質固相材料または試料受容部材に含ませて、水
性液状試料に溶解または分散させれば良い。別の方法と
して多孔質材質と接触させる前の試料に展開試薬を添加
したり、結合反応が生じた後に多孔質材料を展開試薬に
晒しても良い。
【００２３】標識と特異結合試薬との結合は、必要に応
じて共有結合または疎水結合によって行なうことができ
る。このような技術は当業界の常套手段であり、本発明
の一部を成すものではない。標識として着色ラテックス
粒子のような直接標識を使用する好適実施態様では、疎
水結合が好適である。
【００２４】本発明の全ての実施態様において重要なの
は、液状試料が検出区域へ向かうにつれて、それと共に
標識付き試薬も移動することである。検出区域を超えて
も試料が引続き流れるようにするのが好適であるが、そ
のためには十分な試料を多孔質材料に付与し、第１区域
からの標識付き試薬で第２区域において結合反応に参加
しない余分の試薬がこの検出区域を超えて続く試料の流
れによって検出区域から洗い流されるようにする。必要
であれば、キャリヤ材料の末端部に吸収「シンク」を設
けても良い。吸収「シンク」の材料としては、例えばＷ
hatman 3ＭＭクロマトグラフィー用紙を使用することが
できるが、未結合の配合体を検出区域から洗い流せるよ
うに十分な吸収能力をもつものとする必要がある。この
ようなシンクの代替物として、多孔質固相材料を検出区
域を超えて伸長させるだけでも良い。
【００２５】第２区域において結合される標識からの信
号の有無またはその強度によって、試料中に存在する検
体の質的または量的測定を行なうことができる。多孔質
固相材料に複数の検出区域を列状に配列し、水性液状試
料がそれらの区域を順次通過するようにしたものを用い
ても検体の量的測定を行なうことができる。また、これ
らの検出区域にそれぞれ異なる特異結合試薬を含ませ
て、多重検体試験を行なうこともできる。
【００２６】第２区域の固定化特異結合試薬として、高
度の特異性を有する抗体を用いるのが好適であり、より
好適にはモノクローン抗体を使用する。サンドイッチ反
応を伴う本発明実施態様の場合、標識付き試薬としても
高度の特異性を有する抗体、より好適にはモノクローン
抗体を使用するのが望ましい。
【００２７】キャリア材料は帯状またはシート状とし
て、それに試薬を空間的に別個の区域に塗布し、液状試
薬をシートまたは帯状片の片側または一端部から他方へ
浸透させるのが望ましい。
【００２８】本発明の装置は必要に応じて２つまたはそ
れ以上の多孔質固相材料、例えば個別の帯状片またはシ
ートを備えて、各々に可動性試薬と固定化試薬を保持さ
せておくこともできる。この時個別の帯状片を例えば平
行に配列すると、液状試料を装置に１回付与しただけで
それぞれの個別片で同時に試料の流動を開始することが
できる。こうして測定される別個の分析結果は対照結果
として用いることができる。また、それぞれのキャリヤ
に異なる試薬を用いた場合は、１回の試料塗布で複数の
分析を同時に行うことができる。別の方法として、複数
の試料をキャリヤ列に別々に塗布して同時に分析するこ
ともできる。
【００２９】多孔質固相材料としてはニトロセルロース
が望ましい。ニトロセルロースは第２区域の抗体を予め
化学的に処理しなくても確実に固定化できるという利点
がある。多孔質固相材料が例えば紙の場合は、第２区域
の抗体を固定化するのにＣＮＢｒ、カルボニルジイミダ
ゾール、塩化トレシル等を用いた化学結合を行なうこと
が必要になる。
【００３０】検出区域に抗体を塗布した後、多孔質固相
材料の残りの部分を処理して残留結合部位を他から遮断
しなければならない。遮断は蛋白質（例えば牛の血清ア
ルブミン、乳蛋白質等）、ポリビニルアルコールまたは
エタノールアミン、あるいはこれらの組合せ等を用いて
処理することで達成される。次に第１区域に含ませる標
識付き試薬を乾燥キャリヤ上に分与すると、キャリヤが
湿潤状態になった時にキャリヤ内で移動するようにな
る。このような各種段階（増感処理、無標識試薬の塗
布、遮断、標識付き試薬の塗布）の間に多孔質固相材料
を乾燥させねばならない。
【００３１】多孔質キャリヤが試料で湿潤された時の標
識付き試薬の移動性を助長するために、標識付き試薬は
キャリヤ内部に含浸させるよりもキャリヤの表面層とし
て塗布するのが好適である。こうすることでキャリヤ材
料と標識付き試薬と間の相互作用を最小化できるためで
ある。本発明の好適実施態様では、キャリヤの標識付き
試薬塗布領域をグレーズ材料で予備処理する。グレーズ
処理は例えば砂糖水または蔗糖、乳糖等のセルロース溶
液をキャリヤの関係部分に堆積して乾燥することによっ
て達成される。この後このグレーズ部分に標識付き試薬
を塗布すれば良い。キャリヤ材料の残りの部分をグレー
ズ処理してはならない。
【００３２】多孔質固相材料として好適なニトロセルロ
ースシートの気孔の大きさは少なくとも約１ミクロン、
より好適には約５ミクロン以上、さらに好適には約８〜
12ミクロンである。Schleicher and Schuell ＧmbＨか
ら呼称気孔径約12ミクロンまでの非常に好適なニトロセ
ルロースシートを入手することができる。
【００３３】ニトロセルロースシートはプラスチックシ
ート等で「裏打ち」して、取扱い上の強度を大きくする
のが望ましい。これは裏打ち材料シートの上にニトロセ
ルロースの薄膜を形成することによって容易に製造する
ことができる。こうして裏打ちした時のニトロセルロー
スの実際の気孔径は、裏打ちしない場合に比べて小さく
なる傾向がある。
【００３４】別の方法として、予め形成したニトロセル
ロースシートを例えばプラスチック等の固体材料から成
る２枚の支持シートの間に挾んで密着させても良い。
【００３５】多孔質固相材料を通る水性試料の流速は、
未処理材料において水性液が２分以内に１cm進む速度に
するのが望ましいが、必要に応じてそれより遅くしても
良い。
【００３６】区域内の空間的分離距離、および多孔質キ
ャリヤ材料の流速特性を適宜に選択することによって、
必要とされる特異結合が生じる反応時間を適当に調整で
きると共に、第１区域の標識付き試薬を液状試料中に溶
解または分散させてキャリヤを通って移動させることが
できる。試料の中に粘度調節剤（例えば砂糖や改質セル
ロース）を添加して試薬の移動を遅くすることにより、
上記パラメータをさらに制御することができる。
【００３７】第２区域の固定試薬は第２区域のキャリヤ
の厚さ全体（例えばキャリヤがシートまたは帯状片の形
をとる場合はそのシートまたは帯状片の厚さ全体）に含
浸させるのが望ましい。こうすることで固定化試薬が移
動試料内に存在する検体を捕獲できる程度を強化するこ
とができる。
【００３８】試薬はいろいろな方法でキャリヤ材料に塗
布することができる。液状試薬をキャリヤに塗布する方
法として、例えば超小形注射器、調整ポンプ付きペンの
他直接印刷、インキ噴射印刷等、いろいろな「印刷」技
術が提案されているが、本発明の目的上、これらの任意
の技術を使用することができる。製造を簡単にするため
に、キャリヤ（例えばシート）を試薬で処理した後、小
部分に分けて（例えばそれぞれが所要の試料含有区域を
含む小型の細い帯状片に分けて）同じキャリヤを複数個
作ることができる。
【００３９】
【実施例】次に本発明のいくつかの好適実施態様につい
て、添付図面を参照しながらより詳細に説明する。但
し、この説明は例示的な意味しか持たないものである。
【００４０】実施例１ 第１図と第２図は本発明による検定試験に使用する典型
的な多孔質固相材料製試験片を表したものであり、本発
明の動作原理を示している。
【００４１】第１図を参照すると、検定試験片10が（説
明の都合上）矩形帯状片としてその縦軸を垂直において
図示されている。試験片10の下端部11に隣接して幅の狭
い帯状区域12が試験片の幅全体に亘って延設されてい
る。区域12の下に試験片10の小領域13が垂直に配設され
る。区域12の上方、試験片10の離散距離を上がった所に
やはり試験片の幅全体に亘って延びる第２区域14が配設
されている。区域12と区域14の間の試験片10の領域15の
高さは、両区域を分離できる程度であれば任意の高さと
することができる。区域14の上にさらに試験片領域16が
延び、試験片10の頂部17に多孔質パッド18が固着されて
おり、このパッド18が液状試料の「シンク」として作用
し、毛細管現象により試験片10を登って来た液状試料を
吸収する。
【００４２】区域12には可視（「直接」）標識（例えば
着色ラテックス粒子、染料ゾル、金ゾル等）を保持する
第１抗体を含有させる。この試薬は液状試料の存在時に
試験片を通って自由に移動することができる。区域14で
は第１抗体と同じ検体に関して異なるエピトープに特異
性を有する第２抗体を試験片に含浸させる。第２抗体は
試験片上で固定化される。
【００４３】第２図は検定試験片を分析処理に使用した
場合に何が生じるかを示している。乾燥試験片の下端部
11を検体を含有するかもしれない液状試料（不図示）と
接触させる。毛細管現象によって流体が試験片を通って
上昇し、時にはパッド18まで到達する。その間に試料が
区域12を横断する時、標識付き抗体が試料の中に溶解ま
たは分散して、試料と共に試験片を通って移動する。試
料の中に検体が存在すれば、標識付き抗体は区域14に向
かって移動する間にその検体と結合することができる。
区域14に到達すると、検体の分子は第２抗体と結合し
て、そうすることで標識付き「サンドイッチ」が固定化
される。相当濃度の検体が液状試料中に存在する場合、
短時間で可視標識が区域14の中に累積されたことが識別
されるはずである。
【００４４】この実施態様を適用できる分析例として、
検体を hＣＧとし、区域12および14の試薬を hＣＧとの
「サンドイッチ」反応に参加し得る hＣＧに対するモノ
クローン抗体とし、標識として粒状染料、金ゾルまたは
着色ラテックス粒子を用いる例を挙げることができる。
【００４５】上では「サンドイッチ」反応に関連して説
明を行なったが、当業者には明らかなように、必要に応
じて「競合」反応に改変することも可能であり、その場
合は区域12の標識付き試薬として検体そのものまたはそ
の類似物を使用する。
【００４６】上記の原理に基く検定法を用いると、適当
な特異結合試薬を選択することによって広範囲の検体を
測定することができる。検体は例えば蛋白質、ハプテ
ン、免疫グロブリン、ホルモン、ポリヌクレオチド、ス
テロイド、薬品、Ｓtreptoccus，Ｎeisseria，Ｃhlamyd
iaのような病原体（細菌類、ウィルス類等）などであ
る。サンドイッチ検定法が例えば hＣＧ、ＬＨ、病原体
のような検体の検定に用いられるのに対し、競合検定法
は例えばＥ−３−Ｇ、Ｐ−３−Ｇのような検体の検定に
使用される。
【００４７】試料の中に１種類以上の検体が存在するこ
と（もし存在すれば）を判定できれば、臨床的に非常に
有用である。例えば、アポリポ蛋白質Ａ1 およびＢの濃
度比によって、冠動脈性心臓病の罹病性を表すことがで
きる。同様に、グリケート化ヘモグロビン（ＨｂＡ）対
非グリケート化ヘモグロビン（ＨｂＡｏ）または完全ヘ
モグロビン（Ｈｂ）の濃度比は糖尿病の管理に役立つ。
その他２種類のステロイド、例えばＥ−３−ＧとＰ−３
−Ｇとを同時に測定する試験を設計することも可能であ
る。検体が２種類ある場合の試験方法をアポリポ蛋白質
Ａ1 およびＢに関する試験方法を例にとって説明する
と、多孔質キャリヤ母体の２つの空間的に別個の区域の
１つである第１区域全体にアポリポ蛋白質Ａ1 に対して
特異性の抗体を堆積すると共に、第２区域全体にアポリ
ポ蛋白質Ｂに対して特異性の抗体を堆積する。適当な塗
布方法（例えばインク噴射印刷、計量ポンプとペン、エ
アブラシ等）を用いてそれぞれの区域に両抗体を塗布し
た後、多孔質材料の残りの部分を牛の血清アルブミン、
ポリビニルアルコール、エタノールアミド等の試薬で処
理して、残留結合部位を他から遮断しなければならな
い。次に標識を保持する第３、第４試薬を試験片の一端
部近くにある１つまたはそれ以上の区域の乾燥キャリヤ
上に分与する。この時、同じ区域に２種類の試薬を塗布
する場合は塗布工程の間で試験片を乾燥させる。試薬３
と試薬４は抗−アポリポ蛋白質Ａ1 抗体と抗−アポリポ
蛋白質Ｂ抗体の配合体をそれぞれ含むことができる。何
れの配合体もキャリヤが湿潤状態になると、キャリヤの
中およびその上で可動になる。試薬３および４は、水性
試料をキャリヤ片の第１端部に塗布すると、溶剤の流れ
と共に移動できるようになる。試験片に沿って前記２つ
の区域に向かって移動する間に、試薬３が試料中に存在
するアポリポ蛋白質Ａ1 と結合し、試薬４は試料中に存
在するアポリポ蛋白質Ｂと結合する。最初の第２抗体区
域（抗−アポリポ蛋白質Ａ1 抗体区域）に達すると、抗
−アポリポ蛋白質Ａ1 分子が第２抗体に結合されて、そ
うして生成される標識付き「サンドイッチ」を固定化す
る。標識付きアポリポ蛋白質Ｂ分子はこの第１区域に結
合されない。第２の第２抗体区域（抗−アポリポ蛋白質
Ｂ抗体区域）に達すると、アポリポ蛋白質Ｂ分子があれ
ばそれが第２抗体（固相抗体）に結合されて、そうして
生成される標識付き「サンドイッチ」を固定化する。第
２区域では標識付きアポリポ蛋白質Ａ1 分子が結合され
ることはない。直接標識が両区域または何れかの区域に
大なり小なり累積する結果、固相抗体区域の何れかまた
はその両方に可視信号が獲得される。結合されない余分
の配合体（試薬３、試薬４の）は２つの抗体区域を自由
に通過することができ、試薬片の末端部に洗い出され
る。
【００４８】両第２抗体区域に発現した数量化可能な色
彩を適当な形式の測定器具を用いて評価して、両部位間
の色彩濃度の比を求めることもできる。
【００４９】試料中の２種類以上（すなわち多種類）の
検体の存在を判定することも、臨床学的に非常に有効で
ある。例えば、ある細菌の各種の血清型が存在すること
や、人体の可溶性の血清学的マーカが存在することを検
出できれば非常に有用である。一例として各種血清型Ｓ
treptococcusの存在を検出する多検体試薬について、Ａ
群、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群に関して実施するものとして説明
する。それぞれが各種の病理学的に重要な群の血清型に
対して特異性を有するモノクローン抗体の混合体または
特定のＳtreptococcus群に対して発生させたポリクロー
ン抗血清を多孔質キャリヤ片の上に、試験片の幅方向に
走る線に沿って、長さ約１mmの区域に分与する。すなわ
ち、それぞれが問題の検体と結合できる免疫化学的に活
性の成分を含む空間的に別個の多重線状区域に分与す
る。適当な塗布方法（例えばインク噴射印刷、計量ポン
プとペン、エアブラシ等）を用いて多重区域の塗布を行
なった後、多孔質材料の残りの部分を試薬（例えば牛の
血清アルブミン、ポリビニルアルコール、エタノールア
ミン等）で処理して、残留結合部位を他から遮断しなけ
ればならない。次に、染料ゾル等の標識と各細菌群に対
して特異性の各免疫化学的活性成分との配合体を試料塗
布区域に低い試験片下端部の単一領域または一連の個別
区域に分与する。
【００５０】第３、４、５図は上記のような多孔質試験
片を用いた完成装置を示しており、それぞれ第３図が完
成装置の正面図、第４図が同装置の試薬片内部の詳細を
示す一部切除図、第５図が装置の底面を示す図である。
【００５１】第３図を参照して分かるように、装置は平
坦な直方体本体30から成り、その正面31に円形孔または
窓32を開口されて本体内部の多孔質試験片10が見えるよ
うになっている。窓32を通して見える試験片10の領域が
幅の細い水平区域14を含んでいる。
【００５２】第４図を参照して分かるように、装置は多
孔質材料から形成された矩形の乾燥試験片10を含んでお
り、この試験片10は本体30の正面31と背面34の間の本体
内部に本体30の下端部33から延設されている。試験片10
の下端部11の近傍に検体に対する標識付き特異結合試薬
を保持する水平区域12が設けられており、結合試薬は湿
潤状態で試験片内を移動することができる。試験片のさ
らに上方に窓32を通して見える幅の狭い水平区域14が存
在する。試験片10の上部にあるのが多孔質「シンク」18
であり、試験片を通って上へ浸透して来た液状試料を吸
収する働きをする。
【００５３】次に第５図を参照すると、本体30の底面35
が横開口部を備えており、この中に試験片の下端部11が
入る。
【００５４】動作時、本体30の下端部33を液状試料（尿
等）の中に浸漬して、液状試料を試験片10の下端部11で
吸収させ、毛細管現象により試験片上部17まで上昇させ
てシンク18に吸収させる。その間に液状試料は区域12を
経由して区域14へと進んで行く。上述のような特異結合
反応が生じて、使用者は窓32を通して試験結果を観察す
ることができる。
【００５５】実施例２ 第６図と第７図は本発明による別の試験装置を示す。第
６図が完成装置の正面図であり、第７図は同装置の本体
内部に内蔵されている多孔質試験片の詳細を示す一部切
除図である。
【００５６】第６図を参照すると、装置は細長い本体 2
00を含んで成り、その下端部 201に尿等の液状試料を所
定量保持し得る小型の一体容器 202を備える。本体 200
の正面 203が２つの正方形状の小開口部または窓 204，
205を上下に備えている。
【００５７】第７図を参照して分かるように、本体 200
の伸長部分は中空であり、ほぼ本体の全長に亘って延び
る試験片 206を内蔵している。この試薬片は実施例１で
説明したものと同様の構成であり、その下端部 207の近
傍に、湿潤状態において試験片を自由に移動できる標識
付き特異結合試薬を保持する水平区域 208を備える。窓
204， 205に隣接して２つの円形区域 209， 210が存在
し、それぞれの窓を通して見えるようになっている。試
験片の上端部 211に多孔質シンク 212を備える。装置の
下端部 201において容器 202が横開口部 213を介して中
空本体と連通している。
【００５８】動作時、液状試料を装置下端部に付与し、
所定量の試料で容器 202を充満する。毛細管現象により
液状試料が容器 202から試験片 206を通って上昇する
が、この時標識付試薬を区域 208から２つの円形区域 2
09， 210まで搬送して行く。実施例１に関連して説明し
たような一連の特異結合反応が生じる。この実施態様で
は、第２円形区域 210が対照として作用し（例えば試料
が検体を含有するかどうかとは無関係に着色信号を生じ
る）検体の測定は第１円形区域 209で行なわれる。使用
者は２つの区域に生じる信号を比較することによって、
試料中の被分析物の有無を判定することができる。
【００５９】例えば、妊娠判定試験において尿の中の h
ＣＧの有無の判定にこの試験装置を使用する場合、円形
対照区域 210に固定化したＨＣＧを含ませれば良い。 h
ＣＧは液状試料の移動によって区域 208から上へ運ばれ
て来る標識付き抗体と結合する。同じ標識付き抗体が試
料中の hＣＧと共に「サンドイッチ」反応に参加して第
１円形区域 209でその中に固定化されている別の特異性
抗 hＣＧ抗体と結合することができる。別の方法とし
て、必要であれば装置の動作を完了したことを使用者に
知らせる信号のみを生じるように「対照」区域を設計す
ることもできる。例えば、区域 208からの標識付き抗体
と結合する抗体、例えば標識付き抗体がネズミのハイブ
リドーマを用いて誘導した抗体の場合は「抗−ネズミ」
抗体を第２円形区域に含浸させて、試料が試験片に浸透
し終えたことを確認することができる。
【００６０】実施例３ 添付図面の第８図は、本発明による検定装置を示す等角
投影図であり、第９図は第８図の装置の側断面図であ
る。
【００６１】第８図を参照すると、装置は細長い直方体
のハウジングまたはケーシング 500を含んで成り、その
一端部 501に断面積を縮小した部分 502を有する。キャ
ップを部分 502に嵌合して、ハウジングの端部 501に設
けたショルダ 504と当接することができる。図ではキャ
ップ 503をハウジング 500から分離して示している。断
面積縮小部分 502の端部 505から突出して多孔質部材 5
06が延設されている。キャップ 503をハウジングの部分
502に嵌合すると、多孔質部材 506もキャップによって
被覆される。ハウジング 500の上面 507に２つの開口部
508， 509を備える。
【００６２】次に第９図を参照して分かるように、ハウ
ジング 500は中空構造である。多孔質部材 506がハウジ
ング 500の中に延び、多孔質キャリヤ材料片 510と接触
している。多孔質部材 506とキャリヤ材料片 510とを重
なり合わせることによって、これら２つの材料が確実に
接触し、部材 506に付与された液状試料が部材 506に浸
透してキャリヤ片 510の中に入るようにしている。キャ
リヤ片 510は更にハウジング 500の中に延びている。キ
ャリヤ片 510は透明不透湿性プラスチック材料から成る
支持片 511によって「裏打ち」されている。キャリヤ片
510は開口部 508， 509を超えて延びている。試験片 5
10を定位置に確実に保持する手段としてウェブ 512， 5
13がハウジング 500の内部に設けられている。試験片が
ハウジング内部の定位置に確実に保持され、多孔質部材
506がハウジングに確実に保持されて部材 506と試験片
510の間に流体浸透性接触が維持されている限りにおい
て、ハウジング内部の詳細な構造は本発明の重要な要素
ではない。透明裏打ち支持片 511が試験片 510と開口部
508， 509の間に位置して、ハウジング 500の外部から
開口部を通して侵入する湿気に対するシールとして作用
する。必要に応じてハウジング内部の残りの空間 514に
シリカゲルのような吸湿材料を充填して、保管中の試験
片 510を乾燥状態に維持するようにしても良い。第８図
には試験片 510の試薬含有区域を図示していないが、試
験片が湿潤された時に可動となる標識付き試薬を含む第
１区域は多孔質部材 506と開口部 508との間に位置する
ことになる。また、固定化された無標識試薬を含む第２
区域については、装置を検定に使用した際に開口部 508
を通して検定結果を観察できるように、開口部 508を通
して露出された領域に位置することになる。開口部 509
は試料を試験片に確実に浸透できるようにする別の試薬
を含む対照区域を観察するための手段となる。
【００６３】動作時、保護キャップ 503をホルダから外
して、部材 506を例えば妊娠判定試験の場合には尿の流
れの中に置くなどの方法で液状試料に晒す。部材 506に
試料を含浸できるだけの時間部材 506を液状試料に晒し
た後、再びキャップ 503をかぶせて、装置を適当な時間
（２，３分間）放置しておくと、その間に試料が試験片
510に浸透して分析結果が出る。適当な時間放置した
後、使用者が開口部 508， 509を通して試験片を観察す
ると、開口部 509を通して対照区域を観察することによ
って検定が完了したかどうかを確認することができ、開
口部 508を通して第２区域を観察することによって検定
結果を確認することができる。
【００６４】装置を製造する場合、例えばハウジング 5
00をプラスチック材料で２つの部分（例えば上半分 515
と下半分 516）に成形し、多孔質部材と試験片を一方の
部分に入れた後２つの部分の間に挿んで固着する（例え
ば超音波溶接によって）ことによって容易に組立てるこ
とが可能である。サンドイッチ構造に形成することによ
って多孔質部材と試験片を「締付固定」して、それらを
確実に接触させることも可能になる。キャップ 503は別
個の完全品として成形することができる。必要に応じて
開口部 508， 509に透明インサートを設け、ハウジング
外部からの湿気の侵入に対する防湿性を保証するように
しても良い。ハウジング 500の端部 505と突出多孔質部
材 506とを締り嵌めすることにより、突出部材に試料を
付与しても試料が直接装置内に入らなくなり、部材 506
を通るようになる。従って部材 506は試料がハウジング
内部で試験片に向かう唯一の経路となり、試料を試験片
まで制御しながら送ることができる。そのため装置は全
体として試料採取機能と分析機能を併合して備えるもの
であると言える。
【００６５】次に説明するような試験片材料と試薬を使
用することによって、第８図および第９図の装置は家庭
用または診療所用の妊娠判定試験キットまたは受胎期判
定試験キットとして非常に有効なものとして製造するこ
とができる。使用者は露出されている多孔質部材に試料
としての尿を付与するだけで、（選択的にキャップを嵌
め直した後に）数分間で開口部 508を通して試験結果を
観察することができる。
【００６６】上では特に妊娠判定試験と受胎期判定試験
を例にとって説明したが、適当な試薬を試験片に含ませ
れば上記のような装置を広範囲の被分析物（検体）の存
在の判定に使用できることが理解されよう。また、開口
部 509は試験片に対照手段を含まない場合は省略できる
ことも理解されよう。さらにハウジングおよびキャップ
の全体的形状も、長さ、断面、その他の物理的特徴にお
いて、本発明の精神から逸脱することなく幾多の変更を
加えることができるものである。
【００６７】さらに別の選択例として、標識付き試薬を
試験片から省略して、試料を試験片に付与する前にこの
試薬を試料の中に添加するようにすることもできる。別
の方法として、標識付き試薬を突出多孔質部材 506に含
ませても良い。
【００６８】添付図面の第10図は第８図および第９図に
示した装置の多孔質受容部材と試験片の拡大図である。
【００６９】多孔質受容部材 506は、透明プラスチック
シート 511で裏打ちされた多孔質試験片 510に結合され
ており、試料が多孔質受容部材 506を矢印の方向に流れ
て試験片に入るように構成されている。試験区域 517が
固定化された特異結合試薬を含み、対照区域 518は試料
が試験片に沿って十分な距離浸透したことを示す試薬を
含む。裏打ち片 511と反対側の試験片表面の、多孔質受
容部材 506と隣接する部分に艶出し剤 519が積層されて
おり、その上に標識付き特異結合試薬の層 520が堆積さ
れている。第10図では説明の都合上これら２つの層の厚
さを誇張して示しているが、実際には艶出し剤は本当の
表面層を形成しなくても良く、試験片の中にある程度浸
透しても良い。次に塗布する標識付き試薬も同様に試験
片に浸透しても良い。これらが浸透しても、標識付き試
薬と試験片を形成するキャリヤ材料との間の相互作用を
小さくするという本質的な目的は達成される。受容部材
506に堆積された水性試料がそこから試験片 510の長手
方向に沿って流れて行き、そうする間に艶出し剤 519を
溶解し、標識付き試薬を可動化した後、標識付き試薬を
試験片に沿って、区域 517を通って搬送して行く。
【００７０】実施例４ 第11図と第12図は、本発明の別の実施態様を示してお
り、第11図は平面図、第12図は第11図のＡ−Ａ線に沿っ
て取った断面図である。
【００７１】第11図を参照して分かるように、試験装置
は平坦な直方体ケーシング 600を含んで成り、ケーシン
グ 600はその左側の端部 602に隣接した中央に矩形開口
部 601を備えると共に、装置の中ほどにもさらに２つの
開口部 603， 604を備えている。これらの開口部 601，
603， 604はＡ−Ａ線に対応する装置の縦中心軸上に配
設される。図では３つの開口部全部を矩形として示して
いるが、その形状は実際には余り重要ではない。
【００７２】第12図の断面図を参照すると、装置は中空
であり、その内部に、ケーシング 600の端部 602に隣接
しかつ開口部 601の直下に多孔質試料受容部材を備え
る。実施例１に関連して説明したのと同様の構成の試験
片は透明プラスチックシート 607で裏打ちされた多孔質
材料片 606から成り、やはりケーシング 600に内蔵され
ており、多孔質キャリヤと流体浸透性接触して多孔質試
料受容部材からケーシングの末端部まで延びている。透
明裏打ちシート 607がケーシング 600上部の内面608と
密着しており、開口部 603， 604を封止して湿気や試料
のケーシング内部への侵入を防止している。図では示し
ていないが、多孔質試験片 606は標識付き特異結合試薬
を含み、試験区域と対照区域が実施例３で説明したのと
同様に開口部 603， 604に関して適宜に配設される。
【００７３】動作時、例えば注射器等を用いて水性試料
を開口部 601から注入し、多孔質受容部材 605に含浸さ
せることができる。その後水性試料は試験片を透過し
て、適当な時間経過後に開口部 603， 604を通して試験
結果が観察できるようになる。
【００７４】実施例５ 第13図と第14図は本発明のさらに別の実施態様を示して
いる。第13図の示す装置は、その上面 701に矩形開口部
702を備える直方体ケーシング 700を含んで成る。装置
一端部の壁面 703に開口部 704を備え、この開口部を通
して多孔質試験要素が装置外部と連通する。開口部 704
を備える端部 703から比較的遠い表面 701上の地点に開
口部 702が存在する。
【００７５】第14図は第13図の装置の一部切除図であ
る。中空装置がその内部に、開口部 704からケーシング
700のほぼ全長に亘って延びる多孔質試験片 705を内蔵
している。試験片 705は標識付き特異結合試薬を含む第
１区域 706と固定化された特異結合試薬を含む別の区域
707とを備え、区域 707は開口部 704から遠い所に位置
する。区域 706は開口部 702の直下に位置するため、ケ
ーシング外部から観察可能である。試験片 705の下、区
域 707に隣接して圧潰可能な要素 708を備える。要素 7
08は１種類またはそれ以上の基質または試薬を含んでお
り、装置使用時に区域 706からの標識付き試薬が区域 7
07に結合された場合、区域 707に基質または試薬が放出
されて検出可能な信号を生成することができる。部材 7
08から試薬を放出させるには、ケーシングの外から該部
材のある個所に圧力を加えて部材を圧潰し、試薬を押出
すと良い。
【００７６】動作時、例えばケーシング 700の端部 703
を試料を入れた容器に浸漬することによって、第１試験
要素を水性試料に晒すことができる。液状試料が試験片
705の長手方向に浸透して行って、区域 706から標識付
き試薬を伴って区域 707を通過する時、例えば試料中の
検体も含む「サンドイッチ」反応等によって標識付き試
薬が結合される。試料が試験片に浸透し終わった時点で
圧潰部材 708から試薬を放出すると、開口部 702を通し
て試験結果を観察することができる。
【００７７】次に、試験片および試薬の好適例とその製
造方法について説明するが、これは例示的な意味でのみ
行なうものである。
【００７８】１．液体導通材料の選択 液体導通材料の代表的な例として、紙、ニトロセルロー
ス、ナイロン膜を挙げることができる。この材料に不可
欠の特徴は蛋白質結合能力、液体導通速度の他、必要に
応じて予備処理した後に標識付き抗体を試験片に沿って
通す能力である。これが直接標識であれば、数ミクロン
（通常は0.5 μm 以下）までの大きさの粒子を流すこと
のできる材料とするのが望ましい。各種の材料を用いて
獲得される流速を次に例示する。
【００７９】
【表１】 45mm流れるのに 気孔径 要する時間（分） Schleicher＆Schuell ニトロセルロース ３μ 3.40 （裏張りなし） ５μ 3.30 ８μ 3.00 12μ 2.20 ポリエステル裏張り付き ８μ 3.40 （呼称） Whatman ニトロセルロース ５ 19.20 Pall「イムノダイン」（ナイロン） ３ 4.00 ５ 3.20 試験手続きの速度は使用する材料のもつ流速によって決
定されることになる。上記材料を任意に使用することが
できるが、他より速く試験を行なえるものもある。
【００８０】ニトロセルロースは活性化を要しないとい
う利点があり、吸収によって蛋白質を強力に固定化す
る。「イムノダイン」は予め活性化されており、化学処
理を必要としない。Whatman ３MMのような紙はカルボニ
ルジイミダゾール等で化学的に活性化して、抗体を十分
に固定化できるようにする必要がある。
【００８１】２．標識 標識の製法 使用できる標識の選択方法について次に説明するが、こ
こに挙げたものが全てではない。
【００８２】Ａ）金ゾルの製法 免疫学的検定に用いる金ゾルは市販のコロイド状の金
と、ヒト絨毛アルファゴナドトロピン抗体のような抗体
製剤から製造することができる。金属ゾル標識について
は、欧州特許第ＥＰ7654号明細書等に記載されている。
【００８３】例えばコロイド金Ｇ20（粒径20nm、Jansse
n Life Sciensces Products から供給される）を0.22μ
m のフィルタを通した 0.1ＭのＫ2 ＣＯ3 で pH ７に調
整し、20mlを清潔なガラスビーカに入れる。２ mＭの硼
砂緩衝剤pH９において１mg／mlの割合で調製して0.22μ
m のフィルタに通した抗−α hＣＧ抗体 200μｌを金ゾ
ルに添加し、その混合物を２分間連続的に攪拌する。
0.1ＭのＫ2 ＣＯ3 を用いて抗体と金ゾルの混合物のpH
を９に調整し、２mlの10％（w/v)ＢＳＡを添加する。
【００８４】抗体−金配合体を４℃で30分間、12000gの
遠心分離に３回かけて精製する。この時ペレットの遊離
部分のみを再懸濁してさらに使用し、最終的に獲得され
たペレットを20 mＭトリスと150mＭのＮａＣｌ、pH8.2
に入れた１％（w/v)ＢＳＡ溶液に再懸濁する。
【００８５】Ｂ）染料ゾルの製法 染料ゾル（例えば欧州特許ＥＰ 32270明細書参照）はFo
ron Blue SRP（Sandoz）やResolin Blue BBLS （Bayer
）のような市販の疎水性染料から製造することができ
る。例えば50グラムの染料を１ｌの蒸留水に加え、磁気
攪拌器で２〜３分間混合することによって分散させる。
この染料分散液を室温で10分間1500ｇの初期遠心分離に
かけて大型のゾル粒子を固体ペレットとして除去するこ
とによって、分留が達成される。この時上澄懸濁液をさ
らに遠心分離にかけるために置いておく。
【００８６】懸濁液を室温で10分間、3000ｇにおいて遠
心分離にかけ、上澄を捨てた後、ペレットを 500mlの蒸
留水に再懸濁させる。この工程をさらに３回繰返し、最
終的に獲得されたペレットを 100mlの蒸留水に再懸濁す
る。
【００８７】上記の方法で調製した染料ゾルのスペクト
ルを測定すると、Foron Blueについてはλ最大値が約 6
57nm、Resolin Blueについては690nm となる。経路長１
cmの場合のλ最大値での吸収率を染料ゾル濃度の任意の
測定値として使用する。
【００８８】Ｃ）着色粒子 免疫学的検定に使用するラテックス（重合体）粒子は市
販されており、ポリスチレン、ポリビニルトルエン、ポ
リスチレン−アクリル酸、ポリアクロレイン等の合成重
合体を基材としたものを使用できる。使用する単量体は
水に不溶性とするのが普通であり、水性界面活性剤に乳
化して、単量体マイセルを形成し、開始剤を乳濁液に添
加することによって重合を誘導化する。実質的に球形の
重合体粒子が製造される。
【００８９】着色ラテックス粒子の製造を行うには、重
合前の乳濁液にアントラキノンのような適当な染料を配
合しても良いし、あるいは予備成形した粒子に着色して
も良い。後者の場合、染料を水と不混和性の溶剤、例え
ばクロロホルム等に溶解した後に、ラテックス粒子の懸
濁水に添加する必要がある。粒子が非水性の溶剤と染料
を吸収するので、これを乾燥すれば良い。
【００９０】このようなラテックス粒子の最大寸法は約
0.5 ミクロン未満とするのが好適である。
【００９１】着色ラテックス粒子を蛋白質、特に抗体で
増感して、免疫学的検定に使用する試薬とすることがで
きる。例えば直径約 0.3ミクロンのポリスチレンビーズ
（Polymer Laboratories供給）を次の方法で抗−α hＣ
Ｇ抗体を用いて増感することができる。
【００９２】0.5ml の懸濁液（固形分12.5mg）をエッペ
ンドルフ（Eppendorf ）バイアルの中で１mlの 0.1Ｍ硼
酸塩緩衝液pH8.5 で希釈する。粒子を硼酸塩緩衝液で４
回洗浄する。各洗浄工程において、ＭＳＥマイクロ遠心
分離機を用いて室温で13000rpm の速度で３分間遠心分
離を行なう。最終的に獲得されたペレットを再び１mlの
硼酸塩緩衝液に懸濁して 300μg の抗−α hＣＧ抗体と
混合し、懸濁液を室温で16〜20時間上下逆さにしながら
回転させる。抗体とラテックスの懸濁液を13000 rpm で
５分間遠心分離にかけ、上澄液を捨てた後、0.5 mgの牛
の血清アルブミンを含む硼酸塩緩衝液 1.5mlの中にペレ
ットを再び懸濁する。懸濁液を室温で30分間、上下逆さ
にしながら回転した後、燐酸塩緩衝食塩水pH7.2 にＢＳ
Ａを５mg／mlの割合で含む液に懸濁液を入れて、13000r
pmで５分間遠心分離する方法で３回洗浄を行なう。燐酸
塩緩衝食塩水pH7.2 に５mg／mlのＢＳＡと５％（w/v)の
グリセロールを含む液の中にペレットを再懸濁して、使
用時まで４℃で保管する。
【００９３】（Ａ）抗− hＣＧ−染料ゾルの製法 蛋白質と染料ゾルの結合は受動吸着を伴う工程で行うこ
とができる。蛋白質として例えば燐酸塩緩衝食塩水pH7.
4 に２mg／mlの割合で調製した抗−αヒト絨毛ゴナドト
ロフィン（抗−α hＣＧ）のような抗体製剤を用いる。
100μｌの抗体溶液と、２mlの染料ゾルと、２mlの0.1
Ｍ燐酸塩緩衝液pH5.8 と、15.9mlの蒸留水とを含む反応
混合液を作成する。この混合液をゆっくりと混合した
後、配合物を室温で15分間放置する。牛の血清アルブミ
ン等を添加して、余分の結合部位を遮断しても良い。５
mM ＮａＣｌ pH7.4の中に 150mg／mlのＢＳＡを入れた
液４mlを反応混合液に加え、室温で15分間放置した後、
溶液を3000ｇで10分間遠心分離する。ペレットを0.04Ｍ
燐酸塩緩衝液に0.25％（w/v)のデキストランと 0.5％
（w/v)の乳糖を混合した液10mlの中に再懸濁する。この
抗体と染料ゾルの配合体は、凍結乾燥状態で保存するの
が最も良い。
【００９４】（Ｂ）ＬＨ−染料ゾルの製法 hＣＧとＬＨのα亜単位が構造的に同じであることか
ら、交叉反応式免疫学的検定法においてα hＣＧ抗体を
用いてＬＨを検出することができる。従ってＬＨの検定
に使用する標識付き抗体も、抗−α hＣＧ抗体を用いて
実施例１で説明したのと同じ方法で製造することができ
る。
【００９５】３．試薬含有片の製造方法 液体導通性材料の区域内に含浸させる方法 蛋白質、特に抗体を固定化した制限区域を有する液体導
通性材料は、例えば次の方法で製造することができる。
【００９６】Schleicher and Schuell製の厚さ８μm の
裏打ちニトロセルロースシートの長さ25cm、幅20cmの矩
形シートを用意し、その長さ方向に５cm間隔でその幅20
cmに亘って延びる幅１mmの線を描くように材料を塗布す
ることにより、反応区域を設けることができる。この場
合の塗布材料として例えば適当に選択した抗体製剤を用
いることができる。例えば燐酸塩緩衝食塩水pH 7.4にお
いて２mg／mlの割合で調製した親和力Ｋa 109 の抗−β
（ hＣＧ）抗体は、サンドイッチ形態で第２の（標識付
き）抗− hＣＧ抗体を用いるヒト絨毛ゴナドトロフィン
の免疫学的検定に使用するのに適する抗体である。好適
には直径２mmのノズルから正確な量の試薬を射出するこ
とのできるマイクロプロセッサ制御式超小形注射器を用
いて、この溶液を堆積する。塗布した材料を室温で１時
間乾燥させた後、ポリビニルアルコール（20 mＭトリス
pH7.4 に１％ w/v混合したもの）等の不活性化合物を用
いてニトロセルロースの余分の結合部位を室温で30分間
遮断する。シートを蒸留水で十分すすいだ後、30℃で30
分間乾燥する。
【００９７】一実施態様では、その後液体導通性材料を
長さ５cm、幅１cmの複数片に切り分け、各材料片がその
長さ方向の途中（例えば半ば）に免疫吸収剤として機能
する固定化された抗体から成る制限区域を備えるように
することができる。この例の試験片は、試料と混合する
液状標識と共に使用する。使用時にこの制限区域が免疫
学的反応の生じる試験反応区域となる。
【００９８】別の実施態様では、液体導通性材料を切り
分ける前に標識を制限区域の中または上に分与または堆
積する。この試薬として、上記染料ゾルの製法の項で説
明したように調製した染料ゾルまたは染料重合体を配合
した抗− hＣＧ抗体を例にとると、前記試薬は材料が乾
燥状態にある時は制限区域内に保持されるが、検体を含
有する液状試料を塗布するなどして、材料が湿潤される
とキャリヤ材料を通って自由に移動できるようになる。
この可動試薬区域は例えば次の方法で設けることができ
る。
【００９９】Schleicher and Schuell製厚さ８μm の裏
打ちニトロセルロースシートの長さ25cm、幅20cmの矩形
シートを用意し、その長さ方向に５cm間隔で固定化抗体
区域を先に説明した方法で設ける。染料標識付きの抗体
を堆積する前に、例えば60％w/v の蔗糖を蒸留水に溶か
した溶液等をマイクロプロセッサ制御システムに設けた
エアブラシによりシートの長さ方向に６cm間隔で塗布し
て下塗り層を形成する。次に１％メタセルＫＡＭ（Dow
Chemical Companyから供給されるメチルセルロースの商
品名）と 0.6％(w/v) ポリビニルアルコールにおいて調
製した染料標識付き抗体をエアブラシまたは超小形注射
器によって下塗り層の上に直接塗布する。次にシートを
乾燥させて、完成装置において使用する長さ５cm、幅１
cmの試験片に切り分ける。
【０１００】金ゾルまたは着色ポリスチレン粒子も同様
の方法で堆積することができる。
【０１０１】試験区域の他に、いろいろな対照区域を任
意に作用させることもできる。例えば試験区域の堆積後
に抗−ＩｇＧ種抗体の区域を堆積することができる。
【０１０２】４．ストリップフォーマットを使用しての
サンドイッチ検定法 サンドイッチ形式の反応によって、液状試料中のヒトの
絨毛ゴナドトロピン（hＣＧ）の検出を行うことができ
る。使用する標識は裸眼でも容易に見える直接標識とす
るのが望ましい。上述のように抗− hＣＧ抗体に対して
染料ゾル、金ゾルまたは着色ラテックス粒子を結合する
ことができる。
【０１０３】直接標識を用いた場合、新鮮な尿試料を尿
の流れから直接試験装置の吸収芯にかけるか、あるいは
容器から適当な量（例えば 100μｌ）をピペットを用い
て射出して付与することにより、検定を行うことができ
る。試料を装置内で５分間浸透させ、活性区域内に発生
する色を目測または光反射率計を用いて読取る。
【０１０４】アルカリ性ホスファターゼ等の酵素のよう
な間接標識を用いても良いが、最終的に着色物を生成す
る基質を添加する必要がある。
【０１０５】酵素検定法は、従来技術を用いてアルカリ
性ホスファターゼに抗− hＣＧ抗体を結合し、ポリエチ
レングリコール6000を３％と、牛の血清アルブミン１％
(w/v) と、Triton×305 （Rohm and Haas 社商標）0.02
％とを含有する0.01Ｍの燐酸塩緩衝食塩水pH７を用いて
100分の１に希釈した後、シートに塗布する。次に尿の
流れから直接かけるか、または容器から適当量（例えば
100μｌ）をピペットで射出することにより、新鮮な尿
試料を試験装置の吸収芯に付与する。試料を５分間浸透
させた後、ＢＣＩＰ基質（１Ｍのトリス／ＨＣｌ pH 9.
8 に１mg／mlの割合）において軟浸させた液体膨潤性材
料から成るパッドを固定抗体区域と接触して配置する。
さらに５分経過後、パッドを除去し、発生した色を目測
するか、あるいは光反射率計を用いて読み取る。
【０１０６】hＣＧの代わりに黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）を用いても同様の装置を製造することができる。
【０１０７】５．競合式検定法 競合式の検定法は例えばエストロンの尿代謝物質である
エストロン−３−グルクロニドを用いて実施することが
できる。エストロン−３−グルクロニドと牛の血清アル
ブミンの配合体を下記の方法で作成する。
【０１０８】ＢＳＡ−エストロン−３−グルクロニド配
合体の製法 Ｅ−３−ＧとＢＳＡの配合は混合無水物を使用して行う
ことができる。活性種の製造に使用するガラス器、溶
剤、試薬は全て、オーブン、除湿器、分子篩等を用いて
少なくとも24時間かけて完全に乾燥しておかねばならな
い。
【０１０９】Ｅ−３−Ｇ（２ nＭ）の乾燥ジメチルフォ
ルムアミド（ＤＭＦ）溶液とトリ−ｎ−ブチルアミン
（ＴｎＢ）（10 nＭ）の乾燥ＤＭＦ溶液を４℃で別々に
平衡させた。予め冷却したガラス器を用いてＥ−３−Ｇ
のＤＭＦ溶液（1.25ml）とＴｎＢのＤＭＦ溶液（0.25m
l）を磁気攪拌器内蔵の５mlのバイアル（Reactivial）
を予め冷却したものに入れた。クロロホルム酸イソブチ
ルの乾燥ＤＭＦ（10 nＭ）溶液を作成し、アリコート
（0.25ml）を４℃に冷却してバイアル（Reactivial）に
入れた。バイアルの内容物を４℃で20分間攪拌し、ＢＳ
Ａ（１mg／ml）を重炭酸塩緩衝液（0.5 ％）に溶解した
溶液を製造した。混合無水物の培養完了後、バイアルの
内容物をＢＳＡ溶液(2.5ml) に添加して、磁気攪拌器に
より４℃で４時間攪拌した。この配合体をトリス緩衝液
で平衡したPharmacia PD−10 SephadexG−25カラムに通
して精製し、琥珀ガラス保存びんに移して４℃で保存し
た。
【０１１０】ＢＳＡ−Ｅ−３−Ｇ染料ゾルの製法 蒸留水に染料（５％w/v)を分散した液を十分に混合して
作成し、アリコートをベンチトップ遠心分離機において
3850rpm（1500g ）で10分間遠心分離した。ペレットを
捨て、上澄み液を残してアリコートとして、ベンチトッ
プ遠心分離機において 4850rpm（3000ｇ）で10分間遠心
分離した。上澄みを捨て、ペレットを半量ずつ蒸留水に
懸濁した。この段階を４回反復してペレットを洗浄し
た。最終的に獲得されたペレットを蒸留水に再懸濁しλ
最大値での吸収率を測定した。
【０１１１】染料ゾルの蒸留水溶液とＥ−３−Ｇ／ＢＳ
Ａ配合体を燐酸塩緩衝液で希釈したものを混合して配合
体の最終濃度（ＢＳＡ含有量に対する）が10μg ／ml、
最大吸光度における染料ゾルの推定光学密度が20になる
ようにした。反応混合物を室温で15分間放置し、ＢＳＡ
のＮａＣｌ溶液（５ mＭ，pH7.4 ）で15分間ブロックし
て最終的なＢＳＡ濃度を25mg／mlにする。ベンチトップ
遠心分離機を用いて反応混合物を4850rpm （3000ｇ）で
10分間遠心分離した後、上澄み液を捨ててペレットを半
量ずつデキストラン（0.25％ w/v）／乳糖（0.5 ％ w/
v）の燐酸塩（0.04Ｍ，pH5.8 ）緩衝液に再懸濁した。
【０１１２】Ｅ−３−Ｇ試験片の製法 Ｅ−３−Ｇに対する抗体を実施例３に記載の方法で堆積
した。ＢＳＡ−Ｅ−３−Ｇ染料ゾルを実施例３に記載の
方法で材料片上に堆積した。
【０１１３】Ｅ−３−Ｇの測定 上述の試薬を用いて、既知濃度のＥ−３−Ｇを含む試料
で試験片の実験を行なって標準曲線を作成することがで
きる。固定区域の色の読取りは、例えばミノルタ製比色
計を用いて行なうことができる。また、Ｅ−３−Ｇの濃
度は反射率の値から推定して算出できる。
【０１１４】当業者には自明のように、以上に記載した
発明は幾多の変更、改変の対象となり得るものであり、
添付図面に図示し、明細書に記載した特徴のあらゆる組
合せが本発明の範囲の中に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の多孔質試験片の概略図である。
【図２】本発明の多孔質試験片の概略図である。
【図３】本発明の多孔質試験片を含む試験装置の正面図
である。
【図４】本発明の多孔質試験片を含む試験装置の一部切
除図である。
【図５】本発明の多孔質試験片を含む試験装置の底面を
示す図である。
【図６】本発明の別の試験装置の正面図である。
【図７】本発明の別の試験装置の一部切除図である。
【図８】本発明の検定装置の投影図である。
【図９】本発明の検定装置の側断面図である。
【図１０】図８および図９の装置の多孔質受容部材と試
験片の拡大図である。
【図１１】本発明の別の試験装置の概略図である。
【図１２】図１１の装置のＡ−Ａ線に沿った断面図であ
る。
【図１３】本発明の別の装置の概略図である。
【図１４】図１３の装置の一部切除図である。
【符号の説明】
５００，６００ ケーシング ５１０，６０６ 試験片 ５１７ 検出区域 ５０６，６０５ 試料受容部材
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イアン・リチヤーズ イギリス国、ベドフオード・エム・ケ ー・40・３・エイ・デイー、キンボルト ン・アベニユー・14、ストーンリー・コ ート (56)参考文献 特開 昭53−47894（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−114859（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−142463（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−145459（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−133368（ＪＰ，Ａ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 乾燥多孔質免疫クロマトグラフィーキャ
    リヤ材料からなるストリップもしくはシートを中空ケー
    シング中に収容しており、前記ストリップもしくはシー
    トは適用後ストリップもしくはシートを浸透した試料の
    試験結果を見るための検出区域を有し、前記ケーシング
    は検出区域を観察するための開口部を有する液体試料中
    の検体を検出するための分析試験装置であって、前記ス
    トリップもしくはシートは透明プラスチック材料シート
    で裏打ちされているか、少なくとも一方が透明である２
    枚のプラスチック材料製支持シートの間にしっかり挟持
    されており、透明プラスチック材料シートは湿気または
    試料液体が開口部を介してケーシングに進入するのを防
    止するために開口部に隣接して配設されていること、お
    よび試験結果を粒状の直接標識を付けた特異結合試薬を
    用いて顕現させることを特徴とする前記分析試験装置。
  2. 【請求項２】 キャリヤがニトロセルロースからなるこ
    とを特徴とする請求項１に記載の装置。
  3. 【請求項３】 液体試料が尿であり、液体試料を装置に
    適用するためにケーシングを直接尿の流れの中に保持す
    ることを特徴とする請求項１または２に記載の装置。
  4. 【請求項４】 粒状の直接標識が染料ゾルまたは金属ゾ
    ルであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記
    載の装置。
  5. 【請求項５】 粒状の直接標識が最大直径が約０．５μ
    ｍ以下の着色ラテックス粒子であることを特徴とする請
    求項１〜３のいずれかに記載の装置。
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