KR102055341B1 - 생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102055341B1
KR102055341B1 KR1020180158405A KR20180158405A KR102055341B1 KR 102055341 B1 KR102055341 B1 KR 102055341B1 KR 1020180158405 A KR1020180158405 A KR 1020180158405A KR 20180158405 A KR20180158405 A KR 20180158405A KR 102055341 B1 KR102055341 B1 KR 102055341B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
immobilized
dye
reactive polymer
silica nanoparticles
reactive
Prior art date
Application number
KR1020180158405A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190070289A (ko
Inventor
이진우
전선아
박찬영
김은주
Original Assignee
주식회사 딕스젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 딕스젠 filed Critical 주식회사 딕스젠
Priority to PCT/KR2018/015676 priority Critical patent/WO2019117586A1/ko
Priority to EP18889014.9A priority patent/EP3726215A4/en
Priority to US16/764,973 priority patent/US20200400663A1/en
Publication of KR20190070289A publication Critical patent/KR20190070289A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102055341B1 publication Critical patent/KR102055341B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/583—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with non-fluorescent dye label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/76—Assays involving albumins other than in routine use for blocking surfaces or for anchoring haptens during immunisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/76—Assays involving albumins other than in routine use for blocking surfaces or for anchoring haptens during immunisation
    • G01N2333/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Abstract

본 발명은 생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 당뇨병 진단표지물질로 사용되는 당화혈색소, 당화알부민 등의 당화단백질을 측정할 수 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자는 실리카 나노입자 내부에 염료를 공유결합으로 고정화함으로써, 열, pH 등의 외부환경으로 부터 염료가 영향을 받지 않고, 장기가 보관 시에도 안정성이 높아진다는 장점이 있으며, 여러 개의 염료 분자를 하나의 실리카 나노입자 안에 고정화시킴으로써, 입자 하나가 가지는 빛의 흡수량이 염료분자 1개의 흡수량보다 증폭되어 낮은 검출한계를 갖는 당화단백질의 양을 정확하게 측정할 수 있다. 또한 내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자의 표면에 분산안정성 증가를 위한 비반응성 고분자와 탐침자를 결합시킨 반응성 고분자가 고정화되어 있어, 시료에 포함되어있는 각종 단백질 및 염들에 의한 영향을 최소화시켜, 실제 생체 시료를 이용한 현장 현시 검사(Point-of-Care testing) 시스템에 적용해 검출을 목표로 하는 생체지표를 안정한 방법으로 신속하고 정확하게 측정하는데 활용 할 수 있다.

Description

생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법{Silica Nanoparticles for Diagnosing the Biomakers and Preparing Method Thereof}
본 발명은 생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 당뇨병 진단표지물질로 사용되는 당화혈색소, 당화알부민 등의 당화단백질을 측정할 수 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
당뇨병은 혈당을 조절하는 인슐린 분비의 이상으로 인해 발생하는 대사질환으로, 인슐린을 생성하는 세포가 면역시스템의 이상으로 파괴되어 인슐린 결핍으로 발생되는 1형 당뇨와 인슐린의 분비량이 부족하거나 효과적으로 사용되지 못함에 따라 발생되는 2형 당뇨 등 발병 원인에 따라 분류된다.
당뇨병은 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 혈당조절을 실패할 경우 당뇨망막증, 신장질환, 족부병변 등의 합병증이 유발될 수 있기 때문에 당뇨병 환자들의 혈당 관리 중요성이 증가되고 있다.
최근에는 포도당보다 정확하고, 안정적인 혈당 측정용 바이오 마커로써 당화혈색소(glycated hemoglobin, HbA1c)나 당화알부민(glycated albumin, GA)을 이용하고 있다. 당화혈색소는 그 수명이 안정하여 2~3개월의 평균혈당치를 나타내는 지표로 사용될 수 있으며, 실제 당뇨병의 진단 및 치료 경과 추이를 조사하는데 활용된다. 하지만 당화혈색소 측정법은 말기 만성신부전 등과 같이 혈당이 꾸준히 유지되지 못하는 일부의 환자나 적혈구에 이상이 있는 환자에게는 적합하지 않다.
알부민은 혈액뿐 만 아니라 주요 장기와 체액에 존재하는 단백질로, 혈중 포도당 농도에 따라 이와 결합한 당화알부민이 된다. 알부민은 혈색소에 비해 약 10배 높은 포도당 결합률을 가지고 있으며, 이 때문에 당화알부민은 당화혈색소보다 혈당 변화에 더욱 민감하게 반응할 수 있다. 또한 적혈구 수명이 90일 정도인 것에 비하여, 15~20일 정도의 수명을 갖는 알부민은 최근 2주 동안 혈중 포도당 수준의 평균치를 모니터링 할 수 있다. 따라서 당화알부민은 혈당이 꾸준히 유지되지 않는 말기 만성신부전 환자, 철 결핍성 빈혈 환자, 변종 헤모글로빈을 가진 당뇨환자에서 중요한 혈당 측정인자로 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 당뇨병 진단기준에 있어 이들 당화혈색소와 당화알부민과 같은 당화단백질은 서로 상호보완적으로 진단의 신뢰성 및 환자의 건강관리에 대한 지표가 될 수 있다.
전체 혈색소 및 알부민의 양은 성별, 나이, 혈액 관련 질환 등 개인차가 있기 때문에 당뇨병 진단은 특정 당화단백질의 절댓값이 아닌 당화된 것과 당화되지 않은 특정단백질의 총량에 대한 당화된 특정단백질의 비율로 판단을 해야 한다. 따라서 이들 당화단백질을 당뇨병 진단 지표로 사용하기 위해서는 전체 혈색소 및 전체 알부민의 양과 당화혈색소 및 당화알부민의 양을 각각 구분할 수 있는 기술이 필요하다.
당화혈색소 측정의 경우, 전체 혈색소의 양은 혈색소가 가지는 고유의 자체 흡수파장을 이용하고, 당화된 혈색소의 양은 당화된 부분과 선택적으로 결합 가능한 보론산을 흡광이나 형광특성을 갖는 물질에 처리한 뒤 당화혈색소 및 전체혈색소가 들어있는 시료와 반응시킨 후, 이 물질의 광학적 특성을 분석하여 측정한다. 혈색소는 중심에 철 이온이 배위되어있는 헴(heme)과 글로빈(globin) 단백질로 구성되어 있으나, 혈색소의 산소와의 결합 여부 및 산화 정도 등의 화학적 변형에 따라 각각의 혈색소는 고유의 파장을 가지게 되며, 대부분 400~600 nm대의 흡수 파장을 나타낸다. 이 가운데 430 nm의 흡수 파장은 당화혈색소와 일반 혈색소를 포함하는 공통적 특성이기 때문에 전체혈색소의 양을 대표할 수 있다. 당화된 부분의 표지는 당화혈색소의 포도당 부위의 시스-다이올(cis-diol)을 인지하는 보론산에 발색 염료 또는 형광체를 결합시켜 표지체로 사용하는 보론산 친화법이 널리 사용되고 있으며, 이는 효소를 이용한 반응이나 항원-항체 반응과 같이 민감도 및 안정성이 우수한 장점이 있다.
미국등록특허 제5631364호, 미국등록특허 제7374943호 및 국제특허 제2014-033258호는 염료가 결합된 보론산 유도체를 혈액의 당화혈색소와 반응시키고, 다공성 여과지로 구성된 카트리지에 로딩 및 세척시킨 후, 전체 혈색소와 염료 결합 당화혈색소의 반사도(% Reflectance)를 측정하여 두 물질의 비율을 결정하는 방법을 개시하였다.
유럽공개특허 제2444803호 및 한국등록특허 제1128037호는 비드(bead)에 보론산 유도체를 결합시키는 방법 및 반응된 시료를 다공성 여과지로 구성된 카트리지에서 직접 당화혈색소를 측정하는 방법을 개시하였다. 비드와 보론산 유도체의 합성은 비교적 간단하나, 정확도를 위해서는 혈색소와 당화혈색소를 측정하는 여러 단계에서 세심한 주의가 요구된다. 이는 430 nm대에서 먼저 전체 혈색소를 측정하고, 세척으로 정상 혈색소를 제거한 후 비드-보론산 유도체와 반응하고 남아있는 당화혈색소를 동일 파장을 통해 측정하기 때문이다.
당화알부민의 종래 측정기술로는 효소법이 있다. 미국등록특허 제7871789호, 미국등록특허 제6008006호, 미국등록특허 제8507223호, 중국공개특허 제104673878호 및 중국공개특허 제104614459호는 종래의 당화알부민을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 단백질분해효소를 이용하여 시료에 존재하는 당화단백질을 당화 아미노산 또는 당화 펩타이드로 분해한 후 이와 특이적으로 반응하는 당화 아미노산 산화 효소(EC 1.5.3) 계열의 효소 반응으로 생성된 과산화수소(H2O2)를 다시 페록시다아제(peroxidase) 효소를 이용하여 측정하는 당화알부민 효소법을 개시하였다.
당화알부민 효소법은 알부민에 대한 높은 선택성 및 정확성뿐만 아니라, 면역법 보다 빠른 10~30분내에 검사가 가능하다. 하지만 효소라는 단백질 특성상 외부 환경이나 반응 조건에 따라 활성도 차이가 있고, 그 활성이 당화알부민 분석법 효율에 큰 영향을 미치기 때문에, 효소의 활성 유지 및 보관에 엄격한 주의가 요구된다.
당화알부민 효소법은 시료 내에 이미 존재하는 당화 아미노산과 당화 펩타이드를 제거하기 위한 단계가 선행되어야 한다. 당화 아미노산 산화효소(EC 1.5.3)는 온전한 당화단백질을 기질로 사용할 수 없기 때문에, 반드시 단백질 분해효소를 사용하여 당화단백질을 당화 아미노산 또는 펩타이드로 분해하는 단계가 선행되어야 하는 등 다단계로 구성된 복잡한 측정법이다. 따라서 이보다 간단하며 신속하게 당화알부민을 측정할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
미국등록특허 제5223392호, 미국등록특허 제5908925호, 유럽공개특허 제0657470호, 유럽등록특허 제0257421호 및 중국공개특허 제103554256호는 당화알부민을 검출하기 위하여 알부민 항체 및 페록시다아제 효소가 고정화된 당화알부민 항체를 이용한 효소 면역측정법(ELISA)을 개시하였고, Ikeda 등은 알부민 항체 및 페록시다아제 효소가 고정화된 보론산을 이용한 효소-보론산 면역측정법(ELIBA)을 개시하였다(Ikeda et al, Clin Chem. 44(2):256-263, 1998). 이들 방법은 높은 선택성 및 정확성을 갖지만, 항체 및 효소의 보관 및 유지가 필요하고, 검사하는데 많은 시간(30~90분)이 소요되어 현장진단 및 고속검출 키트로의 개발에는 제한이 있다.
현장진단이나 고속검출키트로써 미국등록특허 제9128085호, 미국공개특허 제2006-0270060호, 미국공개특허 제2008-0227210호, 미국공개특허 제2010-0167306호, 미국등록특허 제5470759호 및 미국등록특허 제7659107호는 혈액, 침 등의 시료에서 알부민 및 당화알부민 측정을 위해 항체 기반의 측면유동면역발색법(lateral flow immunochromatography)을 이용한 일회용 스트립 및 카세트를 개시하였고, 미국공개특허 제2014-0170766호는 항체와 유사한 작용을 하는 핵산 유래의 알부민 앱타머와 당화알부민 앱타머를 이용한 측면유동면역발색법(lateral flow immunochromatography)을 적용시킨 래피드 키트의 제조방법을 개시하였으며, 미국공개특허 제2014-0335630호는 당화알부민 앱타머와 SPR (surface plasmon resonance)을 이용한 측정법을 개시하였다. 그러나 핵산으로 구성된 앱타머 역시 항체와 같이 유지 및 보관에 주의가 필요하다. 따라서, 보다 안정적이고 신속하게 당화알부민을 측정할 수 있는 진단 시약 및 측정 방법의 개발이 필요하다.
보론산 친화법을 적용시킨 당화혈색소용 신속 진단용 키트에 대한 연구는 보고되었으나, 보론산 친화법을 적용시킨 당화알부민 신속 진단용 키트는 아직까지 보고되지 않았다. 이는 보론산 친화법을 당화알부민 측정에 적용하는데 있어 제약사항이 있기 때문이다. 즉, 당화혈색소 측정에 주로 사용되는 "염료-보론산 유도체"인 자일렌사이아놀-다폴-보론산(Xylene Cyanol-DAPOL-CPBA)는 알부민 측정에 사용하는 브로모 크레졸 그린이나 브로모 크레졸 퍼플과 동일한 620 nm 대 흡수파장을 가지고 있어서, 당화알부민 측정에 적합하지 않다. 따라서 당화알부민 측정을 위해 브로모 크레졸 그린 또는 퍼플과 구별되는 염료와 결합한 보론산 유도체의 개발이 필요하다.
당화 혈색소나 당화 알부민과 같은 생체지표 측정용 현장진단 기술을 구현하기 위해서는 실제 환자의 생체시료를 상기에 언급한 염료와 결합한 보론산 유도체등과 반응 시켜야 한다. 그러나 유기물 기반의 염료가 고정화된 보론산 유도체의 경우 해당 물질이 외부환경에 그대로 노출되기 때문에 빛과 열에 취약하고, 그 합성과정이 복잡한 문제점이 있다. 또한 반응계의 pH, 극성도, 다른 불순물 등의 주변 환경에 따라 발색량 및 발색파장이 변화되거나 때때로 빛이 소멸되는 문제점을 최소화하기 위한 방법이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 기존 검출기법의 문제점 및 검출기술에 대한 수요를 해결하기 위해 노력한 결과, 단순히 염료를 그대로 사용하는 것보다 내부에 염료를 공유결합으로 고정화시킨 나노입자를 사용할 경우 염료의 안정성 및 발색도를 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
하지만, 이는 전 처리되지 않은 생체시료와 반응시 안정성이 감소되는 문제점이 있었다. 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 더욱 노력한 결과, 내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자에 분산안정성 향상을 위한 비반응성 고분자와 탐침을 결합시킨 반응성 고분자를 처리할 경우 완충용액 및 실제 시료 내에서의 실리카 나노입자의 안정성이 크게 향상되고, 실제 시료와의 반응에서도 실리카 나노입자와 표적물질과의 반응이 잘 이루어진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 당뇨와 같이 주기적으로 진단이 필요한 질병을 현장 현시 검사(Point-of-Care testing)로 신속하고 정확하게 측정하기 위한 플랫폼 기술로써, 각 해당 표적물질의 특성에 따라 실리카 나노입자 내부의 염료를 선택적으로 고정화한 표지물질의 합성과 생체시료 특성상 시료 내부에 포함되어있는 각종 단백질이나 염들이 있는 환경에서도 분산안정성을 증대시키기 위한 비 반응성 고분자 및 표적물질을 선택적으로 인지할 수 있는 물질과 결합된 반응성 고분자를 처리한 표지물질을 제조하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 발명한 물질과 반응 버퍼용액을 혼합함으로써, 당뇨병 진단용 생체지표인 당화혈색소 및 당화알부민을 신속하고 정확하게 측정할 수 있는 진단방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 염료와 실리카 전구체를 반응시키는 단계; (b) 염료와 실리카 전구체의 반응물 및 실리케이트를 계면활성제와 유기용매 혼합액에 첨가하고 교반시킨 후, 염기성 촉매제를 첨가하여 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"를 제조하는 단계; (c) "반응성 고분자" 및 "비반응성 고분자"를 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"와 교반시켜, "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"의 표면에 "반응성 고분자"와 "비반응성 고분자"를 고정화시키는 단계; 및 (d) "반응성 고분자"에 원하는 탐침자를 결합시키는 단계를 포함하는 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 전체 알부민 또는 전체 혈색소를 측정할 수 있는 파장 및 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"과 결합된 당화알부민 또는 당화혈색소를 측정할 수 있는 파장을 동시에 광원으로 조사하여 광학 반사도를 측정한 다음, 당화알부민 또는 당화혈색소의 비율에 따라 당뇨병을 진단하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 진단방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 생체시료와 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"을 반응시키고 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 측정한 다음, 당화알부민 또는 당화혈색소의 비율에 따라 당뇨병을 진단하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 진단방법을 제공한다.
본 발명에 따른 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자는 실리카 나노입자 내부에 염료를 공유결합으로 고정화함으로써, 열, pH 등의 외부환경으로 부터 염료가 영향을 받지 않고, 장기가 보관 시에도 안정성이 높아진다는 장점이 있으며, 여러 개의 염료 분자를 하나의 실리카 나노입자 안에 고정화시킴으로써, 입자 하나가 가지는 빛의 흡수량이 염료분자 1개의 흡수량보다 증폭되어 낮은 검출한계를 갖는 당화단백질의 양을 정확하게 측정할 수 있다. 또한 내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자의 표면에 분산안정성 증가를 위한 비반응성 고분자와 탐침자를 결합시킨 반응성 고분자가 고정화되어 있어, 시료에 포함되어있는 각종 단백질 및 염들에 의한 영향을 최소화시켜, 실제 생체 시료를 이용한 현장 현시 검사(Point-of-Care testing) 시스템에 적용해 검출을 목표로 하는 생체지표를 안정한 방법으로 신속하고 정확하게 측정하는데 활용할 수 있다.
도 1은 염료와 실리카 전구체(Pre_Si)의 공유결합 형성 반응기작의 설명도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"의 제조방법을 나타낸 설명도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자" 표면에 반응성 고분자 및 비반응성 고분자를 고정화시켜 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"를 합성하는 방법을 나타낸 설명도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 3-아미노페닐보론산(APBA)이 결합된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"의 제조방법을 나타낸 설명도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 4-카르복실릭페닐보론산(CBPA)이 결합된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"의 제조방법을 나타낸 설명도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"과 당화혈색소의 시스-다이올 결합을 나타낸 설명도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP-APBA)"의 흡광도를 측정한 그래프이다(A: 염료만을 캡슐화 시킨 나노입자(DYE SNP)와의 흡광도 스펙트럼 비교, B: 합성에 사용한 Dye-Pre_Si 농도에 따른 pDSNP-APBA의 흡광도 증가).
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자(DSNP)", "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화된 내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자(pDSNP)", "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화된 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산(pDSNP-APBA)"의 FT-IR 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"과 비교예로 염료를 캡슐화한 실리카 나노입자의 형상 및 크기에 대한 분포를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"의 가혹조건 처리 후 흡광도 그래프이다(A: 반복 세척, B: 100℃에서 15분 가열, C: 상온에서 30일간 보관).
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"에 고정화된 고분자의 양이 증가하는 조건에서 염(salt) 농도에 따른 분산 안정성에 대해 평가한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"의 반응성 고분자와 비반응성 고분자 비율에 따른 장기간 분산안정성을 평가한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 다양한 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"의 염 농도에 따른 응집완화 현상을 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"와 당화알부민의 농도에 따른 결합능을 평가한 그래프이다.
본 발명에서는 다양한 흡수파장을 갖는 염료가 내부에 고정화되고, 입자의 분산안정성 향상을 위한 비반응성 고분자와, 생체지표와 특이 결합하는 탐침자가 결합된 반응성 고분자가 표면에 고정화된 생체지표 진단용 실리카 나노입자를 이용할 경우, 검출을 목표로 하는 생체지표를 안정한 방법으로 신속하고 정확하게 측정할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 상호 공유결합이 가능한 작용기를 갖는 염료와 실리카 전구체를 반응시킨 후, 용매에서 실리카와 반응시켜 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"를 제조한 다음, 입자의 생체시료 내 분산 안정성 증가를 위한 비반응성 고분자와 표지하고자 하는 생체지표와 결합가능한 작용기가 있는 반응성 고분자를 표면에 고정화시켜, "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"를 제조하였다.
제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"는 상온에서 30일 보관하거나, 100℃에서 15분간 노출시키거나, 반복 세척시키더라도 염료 고유 파장을 그대로 보유하고 있고, HEPES 등의 버퍼용액에서 뿐 만 아니라 실제 생체 시료 내에서도 분산 안정성이 우수하다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자" 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"의 제조방법은 (a) 염료와 실리카 전구체를 반응시키는 단계; (b) 염료와 실리카 전구체의 반응물 및 실리케이트를 계면활성제와 유기용매 혼합액에 첨가하고 교반시킨 후, 염기성 촉매제를 첨가하여 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"를 제조하는 단계; (c) "반응성 고분자" 및 "비반응성 고분자"를 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"와 교반시켜, "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"의 표면에 "반응성 고분자"와 "비반응성 고분자"를 고정화시키는 단계; 및 (d) "반응성 고분자"에 원하는 탐침자를 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 생체지표는 당화 혈색소 또는 당화 알부민을 포함한 혈액 내에 있는 단백질을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 염료는 생체지표를 측정하기 위한 것으로서, 다양한 스펙트럼을 갖는 유기염료 또는 형광염료를 사용할 수 있으나, 실리카 나노입자와 공유결합을 형성할 수 있도록 하이드록실(-OH), 카르복실(-COOH) 및 아민(-NH 또는 -NH2), 아이소싸이오싸이아네이트(-NCO), 썰포네이트(-SO3) 등의 작용기를 포함하는 염료인 것이 바람직하다.
상기 하이드록실 작용기를 포함하는 염료는 FD&C Green 3, 칼세인 블루(Calcein blue), 칼세인 블루 AM(Calcein blue AM), 카민(Carmine), 실렌테라진(Coelenterazine), 실렌테라진 cp (Coelenterazine cp), 실렌테라진 f (Coelenterazine f), 실렌테라진 h (Coelenterazine h), 실렌테라진 hcp (Coelenterazine hcp), 실렌테라진 n (Coelenterazine n), 코로나 그린(corona green), 헤마톡실린 (hematoxylin), 호크스트 33258 (Hoechst 33258), 뉴포트 그린 PDX (Newport green pdx), 오일 레드 O (Oil red O), 오렌지 II (Orange II), 오르세인(Orcein), 옥소놀 V (Oxonol V), 옥소놀 VI (Oxonol VI), 폰소우 SX (Ponceau SX), 수단 III (Sudan III), 수단 IV (Sudan IV), 선셋 옐로우 FCF (Sunset Yellow FCF) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 카르복실 작용기를 포함하는 염료는 타르트라진 (Tartrazine), 베타닌(Betanin), 빅신(Bixin), 카미닉산(Carminic acid), 갈리오신(Galiosin), 슈도푸르푸린(Pseudo-purpurin), 뱁타(BAPTA), BTC (Benzene-1,3,5-tricarboxylic acid), 칼세인(Calcein), 칼슘 그린 1(Calcium green 1), 칼슘 그린 2(Calcium green 2), 칼슘 그린 5N (Calcium green 5N), 에오신 B (Eosin B), 에오신 Y (Eosin Y), 에리트로신 (Erythrosin), 플루오 3(Fluo 3), 플루오 4(Fluo 4), 플루오진 2(Fluozin 2), 플루오진 3(Fluozin 3), 푸라 2(Fura 2), 푸라 2FF (Fura 2FF), 인도 1(Indo 1), PBFI (Potassium-binding benzofuran isophthalate), 로드진 3(Rhodzin 3), SBFI (Sodium benzofuran isophthalate), 진퀴인(Zinquin) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 1차 아민 작용기를 포함하는 염료는 ACMA (9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine), 메틸렌 블루(Methylene blue), 나일 블루 (Nile blue), 톨루이딘 블루 O (Toluidine blue O), 애저 A (Azure A), 애저 B (Azure B), 염기성 푹신(Basic fuchsin), 비스마크 브라운 Y (Bismark brown Y), 브릴리언트 크레실 블루(brilliant cresyl blue), 크레실 바이올렛 아세테이트(Cresyl violet acetate), DAF-FM (Diaminofluorescein-FM), 댄실 카다버린(Dansyl cardeverine), DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), 다이하이드로에티듐(Dihydroethidium), 다이하이드로로다민 123(Dihydrorhodamine 123), 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide), 에티듐 호모다이머-1(ethidium homodimer-1), 에티듐 호모다이머-2(ethidium homodimer-2), 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide), 헥시듐 아이오다이드(Hexidium iodide), 루시퍼 옐로우 CH (Lucifer Yellow CH), 루시퍼 옐로우 VS (Lucifer yellow VS), 뉴트럴 레드 (Neutral red), 뉴클리어 옐로우(Neclear yellow), 파라로자닐린 하이드로클로라이드(pararosaniline hydrochloride), 프로피듐 아이오다이드(Propidium iodide), 로다민 123(Rhodamine 123), 사프라닌 O (Safranin O), 싸이오닌(Thionin) 등을 예시할 수 있고, 상기 2차 아민 작용기를 포함하는 염료는 아우라민 O (Auramine O)을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 아이소싸이오싸이아네이트 작용기를 포함하는 염료는 플루오레세인 아이소싸이오싸이아네이트(Fluorescein isothiocyanate), 말라카이트 그린 아이소싸이오싸이아네이트(Malachite green isothiocyanate), 로다민 B 아이소싸이오싸이아네이트(Rhodamine B isothiocyanate), 술폰산 스틸벤 아이소싸이오싸이아네이트 (Stilbene isothiocyanate sulfonic acid) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 썰포네이트 작용기를 포함하는 염료는 자일렌 사이아놀 FF(Xylene cyanol FF), 아리자린 레드 S (Alizarin Red S), 알루라 레드 (Allura Red), 아마란스 (Amaranth), 아닐린 블루(Aniline blue), 브릴리언트 블루 FCF (Brillinat blue FCF), 콩고 레드(Congo red), 인디고 카민(Indigo carmine), 라이트 그린 SF 옐로위시(Light green SF yellowish), 메틸 오렌지 (Methyl orange), 오렌지 G (Orange G), SPQ (6-Methoxy-N-(3-Sulfopropyl)Quinolinium), XTT (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 염료와 실리카 전구체(Pre_Si)의 공유결합 형성 반응기작의 설명도이다. "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"를 제조하기 위해서는 먼저 염료와 실리카 전구체를 교반 반응시킨다. 이때 실리카 전구체는 염료와 공유결합 할 수 있는 하이드록실, 카르복실 및 아민 작용기와 같은 작용기를 포함하는 3-아미노프로필트라이에톡시실레인(3-aminopropyltriethoxysilane), 3-아미노프로필트라이메톡시실레인(3-aminopropyltrimethoxysilane), 3-글라시독시프로필트라이메톡시실레인(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane), 아이소싸이아네이트프로필트라이에톡시실레인(Isocyanate propyl triethoxysilane)를 사용하는 것이 바람직하다.
더욱 상세하게는 실리카 전구체(Pre_Si)가 3-아미노프로필트라이에톡시실레인(3-aminopropyltriethoxysilane), 3-아미노프로필트라이메톡시실레인(3-aminopropyltrimethoxysilane)인 경우 카르복실, 아이소싸이오싸이아네이트, 또는 썰포네이트 작용기를 포함하는 염료를 사용하고, 3-글라시독시프로필트라이메톡시실레인(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane) 및 아이소싸이아네이트프로필트라이에톡시실레인(Isocyanate propyl triethoxysilane)의 경우 하이드록실 혹은 아민 작용기를 포함하는 염료를 사용할 수 있다.
이때, 카르복실 작용기를 포함하는 염료를 사용하는 경우, 아마이드 결합을 유도할 수 있는 교차결합제들 중 대표적인 1-에틸-3[3-디메틸 아미노프로필]카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 이용하여 카르보디이미드 가교결합 방법으로 3-아미노프로필트라이에톡시실레인(3-aminopropyltriethoxysilane), 3-아미노프로필트라이메톡시실레인(3-aminopropyltrimethoxysilane)과 같은 실리카 전구체(Pre_Si)에 고정시킬 수 있으나, 가교결합제의 종류는 이에 제한되지는 않는다. 썰포네이트 작용기를 포함하는 염료의 경우 POCl3 등의 물질을 사용하여 썰포닐클로라이드기(-SO2Cl)로 치환시킨 뒤 3-아미노프로필트라이에톡시실레인(3-aminopropyltriethoxysilane), 3-아미노프로필트라이메톡시실레인(3-aminopropyltrimethoxysilane)과 같은 실리카 전구체(Pre_Si)에 고정시키는 것이 바람직하며, 염료와 실리카 전구체의 교반 반응물이 생성되면 도 2와 같이, 역상 마이크로 에멀젼 방법을 이용하여 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"를 제조할 수 있다.
즉, 염료와 실리카 전구체의 결합 반응물 및 실리케이트를 계면활성제와 유기용매 혼합액에 첨가하고 교반시킨 후, 염기성 촉매제를 첨가하여 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"를 제조할 수 있다.
상기 계면활성제는 특별한 제한은 없으나, 본 발명에서는 트리톤 X-100, n-헥산 등을 사용할 수 있으며, 상기 실리케이트는 테트라에틸오르소실리케이트(tetraethyl orthosilicate), 테트라메틸오르소실리케이트(tetramethyl orthosilicate) 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 염기성 촉매제는 실리카 나노입자의 내부에 염료를 고정화시키는 것을 촉진하기 위한 것으로서, 물로 인한 실리케이트의 가수분해를 촉진시킬 수 있다. 이렇게 생성된 이온화 상태의 실리케이트는 서로 반응하여 물 또는 알코올(ROH)을 배출하며 서로 연결되어 실리카 네트워크를 이루면서 성장하게 된다.
상기 염기성 촉매제는 암모늄 하이드록사이드(Ammonium hydroxide), 테트라프로필암모늄 클로라이드(Tetrapropylammonium chloride), 테트라프로필암모늄 하이드록사이드(Tetrapropylammonium hydroxide), 테트라부틸암모늄 브로마이드(Tetrabutylammonium bromide), 테트라부틸암모늄 클로라이드(Tetrabutylammonium chloride), 테트라부틸암모늄 하이드록사이드(Tetrabutylammonium hydroxide) 등을 예시할 수 있다.
"내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"는 염료가 외부로 누출되지 않기 때문에, 안정성 및 민감도를 증대시킬 수 있으며, 생체독성이 적고 손쉽게 표면의 작용기를 바꿀 수 있다.
상기 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"의 직경은 10~500 nm일 수 있는데, 염료 고유의 특성이 유지되는 30~100 nm인 것이 바람직하다. 만일 10 nm 미만인 경우에는 조작이 어렵고, 500 nm를 초과할 경우에는 두께가 두꺼워져 염료의 광학적 특성이 약해질 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자" 표면에 반응성 고분자 및 비반응성 고분자를 고정화시켜 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"를 합성하는 방법을 나타낸 설명도이다.
상기 비반응성 고분자는 세파로즈(sepharose), 라텍스(latex), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리에틸렌글리콜 실레인(poly(ethyleneglycol) silane), 폴리에틸렌옥시 폴리에틸렌글리콜실레인(polyethyleneoxy poly(ethyleneglycol)silane), 폴리에틸렌글리콜 메톡시실레인(poly(ethyleneglycol) methoxylsilane; 다른 명명으로 메톡시폴리에틸렌글리콜 실레인 (Methoxy-PEG-Silane)), 폴리에틸렌옥시 프로필트리에톡시사일레인(poly(ethyleneoxy) propyltriethoxysilane), 2-메톡시폴리에틸렌옥시6-9프로필트리메톡시사일레인(2-[methoxy(polyethyleneoxyl)6-9propyl]trimethoxylsilane), 폴리에틸렌글리콜 다이카복실릭액시드(poly(ethyleneglycol) dicarboxylic acid), 하이드록시 폴리에틸렌글리콜 카복실릭액시드 세파로즈(hydroxy poly(ethyleneglycol) carboxylic acid sepharose), 폴리비닐 알코올(poly(vinyl alcohol)), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리비닐 에테르(poly(vinyl ether)), 폴리올레핀(polyolefin), 폴리에스테르(polyester), 에틸렌비닐 아세테이트(ethylenevinyl acetate), 폴리아미드(polyamide), 폴리히드록시에틸 메타아크릴레이트(poly(hydroxyethyl methacrylate)), 폴리메틸메타아크릴레이트(poly(methylmethacrylate)), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 반응성 고분자는 상기 비반응성 고분자에 하이드록실기, 아민기, 카르복실기, 아이소싸이아네이트, 아이소싸이오싸이아네이트, 이민기 등의 작용기가 결합된 것과, 그 외에 폴리아이소싸이아뉴레이트(polyisocyanurate), 폴리카바메이트(polycarbamate) 등을 예시할 수 있다.
상기 생체지표 진단용 실리카 나노입자의 표면에 고정화되는 반응성 고분자 및 비반응성 고분자의 비율은 1:1,000~1:10,000인 것이 바람직하다. 상기 생체지표 진단용 실리카 나노입자의 표면에 고정화되는 반응성 고분자 및 비반응성 고분자의 비율이 1:1,000 미만인 경우에는 생체지표 진단용 실리카 나노입자의 분산안정성이 낮아질 우려가 있고, 1:10,000을 초과할 경우에는 경제적으로 바람직하지 않다.
혈액과 같은 생체시료의 경우 염이나 단백질 등의 물질은 나노입자와 당화단백질간의 반응을 방해할 뿐만 아니라, 나노입자의 응집현상을 유발하여 정확한 측정에 방해를 준다. 따라서 나노입자를 보호할 수 있는 반응성 고분자 및 비반응성 고분자를 실리카 나노입자 표면에 처리함으로써, 이들로 인한 영향을 최소화할 수 있다.
도 4와 5는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 3-아미노페닐보론산(APBA) 또는 4-카르복실페닐보론산(CPBA)가 결합된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화된 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"의 제조방법을 나타낸 설명도이다.
본 발명에 있어서, 상기 탐침자(페닐 보론산)는 3-아미노페닐 보론산(3-aminophenylboronic acid, APBA), 4-카르복실페닐 보론산(4-carboxylphenyl boronic acid, CPBA) 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
3-아미노페닐 보론산(3-aminophenylboronic acid, APBA)을 사용하는 경우에는 하이드록실 잔기가 도출되어 있는 반응성 고분자의 하이드록실 잔기와 3-아미노페닐 보론산(3-aminophenylboronic acid, APBA)의 아민 잔기를 결합시켜줄 수 있는 가교제인 다이석시니미딜카보네이트(Disuccinimidyl Carbonate)를 이용하여 가교결합을 형성함으로써 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"의 표면에 3-아미노페닐 보론산(3-aminophenylboronic acid, APBA)을 고정화시킬 수 있고, 4-카르복실페닐 보론산(4-carboxyphenyl boronic acid, CPBA)를 사용하는 경우에는 하이드록실 잔기가 도출되어 있는 반응성 고분자와 4-카르복실페닐 보론산(4-carboxyphenyl boronic acid, CPBA)과의 에스테르화 반응 (Esterification)을 통해 결합을 형성시켜 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"의 표면에 4-카르복실페닐 보론산(4-carboxyphenyl boronic acid, CPBA)를 고정화시킬 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"과 당화혈색소의 시스-다이올 결합을 나타낸 설명도이다.
도 6에 도시된 바와 같이, "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"은 당화단백질의 시스-다이올과 반응할 수 있으며, 여러 개의 염료분자가 실리카 나노입자내에 캡슐화되어 있어, 1개의 염료분자보다 빛의 흡수량이 높으므로, 당화혈색소의 검출 민감도를 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"과 시스-다이올 결합된 당화단백질 및 전체 단백질은 UV/Vis 등의 광학기기나 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 전체 알부민 또는 전체 혈색소를 측정할 수 있는 파장 및 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"과 결합된 당화알부민 또는 당화혈색소를 측정할 수 있는 파장을 동시에 광원으로 조사하여 광학 반사도를 측정한 다음, 당화알부민 또는 당화혈색소의 비율에 따라 당뇨병을 진단하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 진단방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, 생체시료와 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"을 반응시키고 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 측정한 다음, 당화알부민 또는 당화혈색소의 비율에 따라 당뇨병을 진단하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 진단방법에 관한 것이다.
당화단백질의 비율은 총 마커 단백질 양에 대한 당화단백질의 상대적인 양으로써 다음 식으로 계산할 수 있다.
당화단백질 비율(%)=[당화단백질]/[전체 마커 단백질]
일반적으로 상기 당화혈색소의 비율이 6.5% 이상인 경우, 당화알부민은 20% 이상인 경우(효소법 기준) 당뇨병으로 진단할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화된 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"(pDSNP-PBA) 제조
1-1: 염료와 실리카 전구체의 교반 반응물 제조
1-1-1: 하이드록실 작용기를 갖는 염료와 실리카 전구체의 교반 반응물(Dye-Pre_Si 1)
FD&C Green 3, 35 mM을 초순수 용액 50 ml에 용해시킨 뒤, 3-글라이시독시프로필트라이메톡시실레인(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane) 용액 40 ml을 넣고, 교반하여 12시간동안 90℃로 반응을 진행하였다.
1-1-2: 아민 작용기를 갖는 염료와 실리카 전구체의 교반 반응물(Dye-Pre_Si 2)
메틸렌블루(Methylene blue) 5 mM을 초순수 용액 50 ml에 용해시킨 뒤, 아이소싸이아네이트프로필트라이에톡시실레인(isocyanatepropyltriethocysilane) 용액 50 ml을 넣고, 교반하여 12시간동안 90℃로 반응을 진행하였다.
1-1-3: 카르복실 작용기를 갖는 염료와 실리카 전구체의 교반 반응물(Dye-Pre_Si 3)
타르트라진 5 mM을 0.1 M의 MES(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) 완충용액(pH 6.0) 50 ml에 용해시킨 다음, 최종농도 10 mM의 EDC를 넣고 60분 교반하며 반응시킨 후, 3-아미노프로필트라이에톡시실레인(3-aminopropyltriethoxylsilane) 45 ml를 첨가한 후 12시간 동안 교반기에서 상온 반응시켰다.
1-2: 내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자(DSNP) 합성
사이클로헥세인(cyclohexane) 150.0 ml, 트리톤 X-100 33.5 ml 및 n-헥산올 (n-hexanol) 35.3 ml을 포함하는 1 L 둥근 바닥 플라스크에 염료와 실리카 전구체의 교반 반응물(Dye-Pre_Si) 용액(1-1-1) 9.25 ml 및 TEOS(tetraethyl orthosilicate) 2.7 ml을 넣고 교반기를 이용하여 1시간 동안 균일하게 혼합시켰다. 이후 15~30% 암모니아수(NH4OH) 1.5 ml를 넣고, 상온에서 20~30시간 동안 반응시킨 후 에탄올 300 ml을 첨가하여 반응을 종결하고, 원심분리기를 이용하여 3900 rpm, 15분의 조건으로 4회 에탄올 세척과 3회 DI 세척한 후 60℃ 오븐에 넣고 건조시켜 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"를 제조하였다.
1-3: 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP) 제조
1-3-1: 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 1:1,000으로 고정화된 pDSNP
하이드록실폴리에틸렌옥시프로필트리에톡시사일레인(Hydroxyl(polyethyleneoxy)propyl)triethoxylsilane)과 2-메톡시폴리에틸렌옥시6-9프로필트리메톡시사일레인(2-(methoxy)polyethyleneoxyl)6-9propyl)trimethoxylsilane)을 1:1,000 비율로 혼합한 용액 100 μL을 99.9% 에탄올에 분산되어 있는 실시예 1-2에서 제조된 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자" 5 mL과 혼합 한 후 , 17시간동안 교반하여 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"(pDSNP)를 제조하였다.
1-3-2~1-3-5: 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 1:100으로 고정화된 pDSNP
하기 표 1에 기재된 바와 같이, 각각의 반응성 고분자 및 비반응성 고분자를 1:100 비율로 혼합한 용액 100 uL를 에탄올에 분산되어 있는 실시예 1-2에서 제조된 "내부에 염료가 고정화 된 실리카 나노입자" 5 mL과 혼합한 후, 17시간 동안 교반하여 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"를 제조하였다.
반응성 고분자 비반응성 고분자
pDSNP_1 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol)
pDSNP_2 폴리아이소사이아뉴레이트
(polyisocyanurate)		 폴리올레핀(polyolefin)
pDSNP_3 폴리에틸렌글리콜실레인카르복실엑시드((PEG-Silane-COOH; Silane-PEG-COOH) 폴리아미드(polyamide)
pDSNP_4 하이드록실폴리에틸렌옥시프로필트리에톡시실레인 (Hydroxyl(polyethyleneoxy)propyl)triethoxysilane) 2-메톡시폴리에틸렌옥시6-9프로필트리메톡시사일레인(2-[methoxy(polyethyleneoxyl)6-9propyl]trimethoxylsilane)
1-4: 나노입자 표면에 고정화 된 반응성 고분자에 PBA 컨쥬게이션을 통한 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-PBA(pDSNP-PBA) 제조
1-4-1: 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA) 제조
1-3-1에서 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"를 지지체로 하여 고정화된 고분자중 반응성 작용기를 가진 고분자에 페닐보론산(PBA)를 컨쥬게이션 시켰다.
첫 번째로, 하이드록실폴리에틸렌옥시프로필트리에톡시사일레인(Hydroxyl(polyethyleneoxy)propyl)triethoxylsilane)이 가진 하이드록실 작용기와 3-아미노페닐보론산(APBA)이 가진 아민작용기를 다이썩시니미딜 카보네이트(disuccinimidyl carbonate)를 이용하여 가교결합을 형성하여 "3-아미노페닐보론산(APBA)이 결합된 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"를 제조하였다.
먼저, 다이메틸설폭사이드(DMSO)에 분산된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자" 5 mL와 다이메틸설폭사이드(DMSO)에 용해된 100 nM의 다이썩시니미딜카보네이트(disuccinimidyl carbonate)를 혼합하고, 2시간동안 반응시켰다. 반응이 종결 된 후, 11,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 반응용매와 "썩시니미딜카보네이트(succinimidyl carbonate)-반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"를 분리하였다.
다음으로 3-아미노페닐보론산(APBA)이 "썩시니미딜카보네이트(succinimidyl carbonate)-반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"와 결합될 수 있도록 24시간동안 반응시켰다(도 4 참조).
1-4-2: 보론산이 결합된 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-4-카르복실페닐 보론산(pDSNP-CPBA) 제조
pH 2.00 조건과 85˚C 조건에서 300 rpm으로 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자" 5 mL과 다이메틸설폭사이드(DMSO)에 용해된 4-카르복실페닐 보론산(CPBA) 1mg/mL 100 μL을 24시간동안 교반하였다. 즉, 하이드록실폴리에틸렌옥시프로필트리에톡시사일레인(Hydroxyl(polyethyleneoxy)propyl)triethoxylsilane)이 가진 하이드록실 작용기가 4-카르복실페닐보론산(CPBA)가 가진 카르복실 작용기와 서로 에스테르화 결합을 이룰 수 있도록 하였다. 상기 반응을 통하여 "4-카르복실페닐보론산이 결합된 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP-CPBA)"를 제조하였다 (도 5 참조).
비교예 1: 염료만을 캡슐화시킨 나노입자(DYE SNP) 제조
사이클로헥세인(cyclohexane) 150.0 ml, 트리톤 X-100 33.5 ml, n-헥산올 (n-hexanol) 35.3 ml, 0.035 M FD&C Green 3 9.25 ml, TEOS (tetraethyl orthosilicate) 2.7 ml을 1 L 둥근 바닥 플라스크에 넣고 교반기를 이용하여 1시간 동안 균일하게 혼합시켰다. 다음으로 25~30% 암모니아수(NH4OH) 1.5 ml를 넣고 상온에서 24시간 동안 반응시킨 후 에탄올 300㎖을 첨가하여 반응을 종결하고, 원심분리기를 이용하여 3900 rpm, 15분의 조건으로 4회 에탄올 세척과 3회 DI 세척한 후 60℃ 오븐에 넣고 건조시켜 염료만을 캡슐화시킨 나노입자(DYE SNP)를 제조하였다.
실험예 1: "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화된 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"과 염료만을 캡슐화시킨 나노입자의 흡광도 차이 평가
실시예 1-4에서 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"과 비교예 1에서 제조된 염료만을 캡슐화시킨 나노입자(DYE SNP)의 유효성을 평가하기 위하여 이들의 흡수파장을 UV/Vis로 측정하고, 도 7에 나타내었다.
도 7A에 도시된 바와 같이, 비교예 1에서 제조된 염료를 캡슐화시킨 나노입자(DYE SNP)는 FD&C Green 3의 고유 흡수파장을 나타내지 않는 반면, "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"는 염료의 고유 흡수파장(630 nm)에 가까운 UV/Vis 스펙트럼을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
또한, Dye-Pre_Si를 25%, 50%, 100% 농도로 하여 각각 합성한 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"의 흡광도를 측정하고, 도 7B에 나타내었다.
도 7B에 도시된 바와 같이, Dye-Pre_Si 농도가 증가함에 따라, 630 nm에서의 흡광도가 증가된다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)" 표면의 보론산 결합능 평가
"반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)" 표면에 보론산이 결합되었는지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 1-2에서 제조된 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자(DSNP)", 실시예 1-3-1에서 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP)", 실시예 1-4에서 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"의 표면 잔기 변화를 FT-IR로 측정하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 1093 ㎝-1과 795 ㎝-1의 실리카 관련 밴드는 내부에 염료가 고정화된 모든 실리카 나노입자에서 확인할 수 있었고, "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP)"에서는 3000 ㎝-1대의 고분자 관련 피크가 나타났으며, "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"에서는 추가로 1338 ㎝-1의 보론산 관련 밴드를 관찰할 수 있었다. 따라서 일련의 합성과정을 마친 나노입자의 표면에는 반응성 고분자와 비반응성 고분자에 보론산이 공유결합으로 고정화되어 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 3: "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)" 및 "염료만을 캡슐화한 나노입자"의 형상 및 크기에 대한 분포 평가
비교예 1에서 제조된 염료를 캡슐화시킨 나노입자(DYE SNP) 및 실시예 1-4에서 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"을 주사전자현미경(Scanning Electro Microscope)과 동적광산란(Dynamic Light Scattering)법으로 나노입자 크기 및 분포를 평가한 다음, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 동일한 합성조건 하에 염료만을 캡슐화시킨 나노입자(DYE SNP)의 경우보다 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"의 입자 크기가 증가되었음을 알 수 있었다.
실험예 4: 합성 후 보관시간 및 가혹조건에서 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"의 발색 안정도 평가
비교예 1에서 제조된 염료를 캡슐화시킨 나노입자(DYE SNP) 및 실시예 1-4에서 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"의 안정성을 평가하기 위하여, (A) 에탄올로 1~4회 세척, (B) 100℃에서 15분 가열, (C) 상온에서 30일간 보관시킨 후, 염료 고유의 흡수파장을 UV/Vis로 측정하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"은 염료만을 캡슐화시킨 나노입자(DYE SNP) 보다 염료 고유 흡수파장에 가까운 UV/Vis 스펙트럼을 나타냈으며, 반복 세척하거나, 100℃에서 15분동안 가열시키거나, 상온에서 30일간 보관하더라도 나노입자 내의 염료 고유의 파장을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5: "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP)"의 분산 안정성 평가
"반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP)"의 분산 안정성을 평가하기 위하여, 염(salt)인 염화아연(Zinc chloride)이 포함된 용액을 농도별로 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP)" 용액과 반응시켰다. 이때, 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자는 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자(DSNP)"에 반응성 고분자와 비반응성 고분자의 비율이 1:10, 1:100, 1:500, 1:1,000 및 1:10,000 비율로 고정된 것을 이용하였다.
염화아연(Zinc chloride)의 농도는 0 mM, 3 mM, 6 mM, 9m M ,12 mM 로 설정하였으며 이때 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP) 1 mL과 염화아연(Zinc chloride) 용액 100 μL을 반응시켰다.
도 11에 나타난 바와 같이 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP)에서 반응성 고분자에 대해 비반응성 고분자의 양이 증가할수록 염에 대한 분산안정성이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 반대로 반응성 고분자에 대해 비반응성 고분자의 양이 감소할수록(1:10) 염농도의 증가에 따라 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자의 분산안정성이 차이가 크게 감소하는 것을 염농도 증가에 따른 입자 크기의 변화를 통해 확인할 수 있었다. 또한 반응성 고분자와 비반응성 고분자의 양이 1:1,000, 1:10,000 인 지점에서는 염농도에 따른 입자크기의 변화가 눈에 띄게 작아지지 않음을 보았을 때, 충분한 입자의 분산안정성이 확인됨을 알 수 있었다.
한편, "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"의 반응성 고분자와 비반응성 고분자 비율에 따른 장기간 분산안정성을 확인하기 위하여, 내부에 염료가 고정화 되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자 (pDSNP)에서 반응성 분자만 고정화 되어있는 내부에 염료가 고정화 되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP(1:0)), 반응성 고분자와 비반응성 고분자 비율이 각각 1:500 및 1:1000인 pDSNP(1:500)과 pDSNP(1:1000)을 대상으로 4개월간 분산안정성을 평가하고 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화 되어있고, 내부에 염료가 고정화 되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자 (pDSNP)에서 반응성 분자만 고정화 되어있는 내부에 염료가 고정화 되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP(1:0))보다, 반응성 고분자와 비반응성 고분자의 양의 비율이 1:500과 1:1000로 고정화된 입자가 시간이 지날수록 응집되는 영향이 적은 것을 확인할 수 있었다. 이는 단일 고분자만 사용하는 것 보다 혼합된 반응성 및 비반응성 고분자를 고정화한 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP (1:500, 1:1000))의 분산안정성이 더욱 우수하며, 1:500 보다 1:1000으로 반응성 고분자와 비반응성 고분자가 고정화된 것이 시간에 대한 입자의 분산안정성이 더 우수하다는 결과를 나타낸다.
또한, 실시예 1-3-2 내지 1-3-5에서 제조된 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자"(pDSNP_1, pDSNP_2, pDSNP_3 및 pDSNP_4)의 염 농도에 따른 응집완화 현상을 동일한 방법으로 평가하고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자(DSNP)는 염농도의 증가에 따라 분산안전성이 떨어져 입자의 크기가 커지는 반면, 표면에 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 1:100 비율로 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자(pDSNP_1, pDSNP_2, pDSNP_3 및 pDSNP_4)는 염농도에 따른 입자크기의 변화가 눈에 띄게 작아지지 않음을 보았을 때, 충분한 입자의 분산안정성이 확인됨을 알 수 있었다.
실험예 6: "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"의 검출 유효성 평가
"반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"의 유효성을 평가하기 위해 정제된 당화알부민 표준 시료(Sigma)를 농도별로 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"과 반응시킨 후, 나노입자에 결합한 당화알부민의 농도를 측정하였다. 5 μl의 각 농도별 당화알부민(0, 10, 30, 40 mg/ml)과 0.2 ml "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"(50 mM HEPES, 8.1)를 상온에서 1시간 동안 교반 반응시킨 다음, 원심분리와 50 mM HEPES 버퍼로 세척을 통해 결합하지 않은 당화알부민을 제거하였다.
"반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)"와 결합된 당화알부민은 회수하여 염료의 고유파장 (630 nm)과 단백질 정량 측정파장 (540 nm)에서 광학분광기를 통하여 측정하고 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이 일정한 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-3-아미노페닐보론산 (pDSNP-APBA)" 농도에 비례하여 결합된 당화알부민(GA)의 양이 증가하는 양상을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

  1. 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자에 있어서,
    상기 반응성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아이소사이아뉴레이트(polyisocyanurate), 폴리에틸렌글리콜실레인카르복실엑시드((PEG-Silane-COOH; Silane-PEG-COOH) 및 하이드록실폴리에틸렌옥시프로필트리에톡시실레인 (Hydroxyl(polyethyleneoxy)propyl)triethoxysilane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이고, 상기 비반응성 고분자는 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol), 폴리올레핀(polyolefin), 폴리아미드(polyamide) 및 2-메톡시폴리에틸렌옥시6-9프로필트리메톡시사일레인(2-[methoxy(polyethyleneoxyl)6-9propyl]trimethoxylsilane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이며, 상기 반응성 고분자와 비반응성 고분자의 비율은 1:1,000 ~ 1:10,000이고, 상기 반응성 고분자에는 3-아미노페닐 보론산(3-aminophenylboronic acid, APBA) 또는 4-카르복실릭페닐 보론산(4-carboxylphenylboronic acid, CPBA)이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생체지표는 당화 혈색소 또는 당화 알부민을 포함한 혈액 내에 있는 단백질인 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 염료는 하이드록실, 카르복실, 아민, 아이소싸이오싸이아네이트, 썰포네이트 작용기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함하는 염료인 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 하이드록실 작용기를 포함하는 염료는 FD&C Green 3, 칼세인 블루(Calcein blue), 칼세인 블루 AM(Calcein blue AM), 카민(Carmine), 실렌테라진(Coelenterazine), 실렌테라진 cp (Coelenterazine cp), 실렌테라진 f (Coelenterazine f), 실렌테라진 h (Coelenterazine h), 실렌테라진 hcp (Coelenterazine hcp), 실렌테라진 n (Coelenterazine n), 코로나 그린(corona green), 헤마톡실린 (hematoxylin), 호크스트 33258 (Hoechst 33258), 뉴포트 그린 PDX (Newport green pdx), 오일 레드 O (Oil red O), 오렌지 II (Orange II), 오르세인(Orcein), 옥소놀 V (Oxonol V), 옥소놀 VI (Oxonol VI), 폰소우 SX (Ponceau SX), 수단 III (Sudan III), 수단 IV (Sudan IV) 및 선셋 옐로우 FCF (Sunset Yellow FCF)로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자.
  5. 제3항에 있어서, 상기 카르복실 작용기를 포함하는 염료는 타르트라진 (Tartrazine), 베타닌(Betanin), 빅신(Bixin), 카미닉산(Carminic acid), 갈리오신(Galiosin), 슈도푸르푸린(Pseudo-purpurin), 뱁타(BAPTA), BTC (Benzene-1,3,5-tricarboxylic acid), 칼세인(Calcein), 칼슘 그린 1(Calcium green 1), 칼슘 그린 2(Calcium green 2), 칼슘 그린 5N (Calcium green 5N), 에오신 B (Eosin B), 에오신 Y (Eosin Y), 에리트로신 (Erythrosin), 플루오 3(Fluo 3), 플루오 4(Fluo 4), 플루오진 2(Fluozin 2), 플루오진 3(Fluozin 3), 푸라 2(Fura 2), 푸라 2FF (Fura 2FF), 인도 1(Indo 1), PBFI (Potassium-binding benzofuran isophthalate), 로드진 3(Rhodzin 3), SBFI (Sodium benzofuran isophthalate), 및 진퀴인(Zinquin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자.
  6. 제3항에 있어서, 상기 1차 아민 작용기를 포함하는 염료는 ACMA (9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine), 메틸렌 블루(Methylene blue), 나일 블루 (Nile blue), 톨루이딘 블루 O (Toluidine blue O), 애저 A (Azure A), 애저 B (Azure B), 염기성 푹신(Basic fuchsin), 비스마크 브라운 Y (Bismark brown Y), 브릴리언트 크레실 블루(brilliant cresyl blue), 크레실 바이올렛 아세테이트(Cresyl violet acetate), DAF-FM (Diaminofluorescein-FM), 댄실 카다버린(Dansyl cardeverine), DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), 다이하이드로에티듐(Dihydroethidium), 다이하이드로로다민 123(Dihydrorhodamine 123), 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide), 에티듐 호모다이머-1(ethidium homodimer-1), 에티듐 호모다이머-2(ethidium homodimer-2), 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide), 헥시듐 아이오다이드(Hexidium iodide), 루시퍼 옐로우 CH (Lucifer Yellow CH), 루시퍼 옐로우 VS (Lucifer yellow VS), 뉴트럴 레드 (Neutral red), 뉴클리어 옐로우(Neclear yellow), 파라로자닐린 하이드로클로라이드(pararosaniline hydrochloride), 프로피듐 아이오다이드(Propidium iodide), 로다민 123(Rhodamine 123), 사프라닌 O (Safranin O) 및 싸이오닌(Thionin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이고, 상기 2차 아민 작용기를 포함하는 염료는 아우라민 O (Auramine O)인 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자.
  7. 제3항에 있어서, 상기 아이소싸이오싸이아네이트 작용기를 포함하는 염료는 플루오레세인 아이소싸이오싸이아네이트(Fluorescein isothiocyanate), 말라카이트 그린 아이소싸이오싸이아네이트(Malachite green isothiocyanate), 로다민 B 아이소싸이오싸이아네이트(Rhodamine B isothiocyanate) 및 술폰산 스틸벤 아이소싸이오싸이아네이트 (Stilbene isothiocyanate sulfonic acid)로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자.
  8. 제3항에 있어서, 상기 썰포네이트 작용기를 포함하는 염료는 자일렌 사이아놀 FF(Xylene cyanol FF), 아리자린 레드 S (Alizarin Red S), 알루라 레드 (Allura Red), 아마란스 (Amaranth), 아닐린 블루(Aniline blue), 브릴리언트 블루 FCF (Brillinat blue FCF), 콩고 레드(Congo red), 인디고 카민(Indigo carmine), 라이트 그린 SF 옐로위시(Light green SF yellowish), 메틸 오렌지 (Methyl orange), 오렌지 G (Orange G), SPQ (6-Methoxy-N-(3-Sulfopropyl)Quinolinium) 및 XTT (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide)로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"는 염료와 실리카 전구체의 교반 반응물을 실리케이트와 함께 계면활성제와 유기용매 혼합액 에 첨가하고 교반시킨 후, 염기성 촉매제를 첨가하여 제조시킨 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 상기 생체지표 진단용 실리카 나노입자의 직경은 10~500 nm인 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자.
  14. (a) 염료와 실리카 전구체를 반응시키는 단계;
    (b) 염료와 실리카 전구체의 반응물 및 실리케이트를 계면활성제와 유기용매 혼합액에 첨가하고 교반시킨 후, 염기성 촉매제를 첨가하여 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"를 제조하는 단계;
    (c) "반응성 고분자" 및 "비반응성 고분자"를 "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"와 교반시켜, "내부에 염료가 고정화된 실리카 나노입자"의 표면에 "반응성 고분자"와 "비반응성 고분자"를 고정화시키는 단계; 및
    (d) "반응성 고분자"에 3-아미노페닐 보론산(3-aminophenylboronic acid, APBA) 또는 4-카르복실릭페닐 보론산(4-carboxylphenylboronic acid, CPBA)를 결합시키는 단계를 포함하는 반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자의 제조방법에 있어서,
    상기 반응성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아이소사이아뉴레이트(polyisocyanurate), 폴리에틸렌글리콜실레인카르복실엑시드((PEG-Silane-COOH; Silane-PEG-COOH) 및 하이드록실폴리에틸렌옥시프로필트리에톡시실레인 (Hydroxyl(polyethyleneoxy)propyl)triethoxysilane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이고, 상기 비반응성 고분자는 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol), 폴리올레핀(polyolefin), 폴리아미드(polyamide) 및 2-메톡시폴리에틸렌옥시6-9프로필트리메톡시사일레인(2-[methoxy(polyethyleneoxyl)6-9propyl]trimethoxylsilane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이며, 상기 반응성 고분자와 비반응성 고분자의 비율은 1:1,000 ~ 1:10,000인 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 실리카 전구체는 3-아미노프로필트라이에톡시실레인(3-aminopropyltriethoxysilane), 3-아미노프로필트라이메톡시실레인(3-aminopropyltrimethoxysilane), 3-글라시독시프로필트라이메톡시실레인(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane) 및 아이소싸이아네이트프로필트라이에톡시실레인(Isocyanatepropyltriethoxysilane)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체지표 진단용 실리카 나노입자의 제조방법.
  16. 삭제
  17. 전체 알부민 또는 전체 혈색소를 측정할 수 있는 파장 및 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"과 결합된 당화알부민 또는 당화혈색소를 측정할 수 있는 파장을 동시에 광원으로 조사하여 광학 반사도를 측정한 다음, 당화알부민 또는 당화혈색소의 비율에 따라 당뇨병을 측정하는 당뇨병 측정방법에 있어서,
    상기 반응성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아이소사이아뉴레이트(polyisocyanurate), 폴리에틸렌글리콜실레인카르복실엑시드((PEG-Silane-COOH; Silane-PEG-COOH) 및 하이드록실폴리에틸렌옥시프로필트리에톡시실레인 (Hydroxyl(polyethyleneoxy)propyl)triethoxysilane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이고, 상기 비반응성 고분자는 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol), 폴리올레핀(polyolefin), 폴리아미드(polyamide) 및 2-메톡시폴리에틸렌옥시6-9프로필트리메톡시사일레인(2-[methoxy(polyethyleneoxyl)6-9propyl]trimethoxylsilane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이며, 상기 반응성 고분자와 비반응성 고분자의 비율은 1:1,000 ~ 1:10,000인 것을 특징으로 하는 당뇨병 측정방법.
  18. 생체시료와 "반응성 고분자 및 비반응성 고분자가 표면에 고정화되어 있고, 내부에 염료가 고정화되어 있는 생체지표 진단용 실리카 나노입자-보론산"을 반응시키고 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 측정한 다음, 당화알부민 또는 당화혈색소의 비율에 따라 당뇨병을 측정하는 당뇨병 측정방법에 있어서,
    상기 반응성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리아이소사이아뉴레이트(polyisocyanurate), 폴리에틸렌글리콜실레인카르복실엑시드((PEG-Silane-COOH; Silane-PEG-COOH) 및 하이드록실폴리에틸렌옥시프로필트리에톡시실레인 (Hydroxyl(polyethyleneoxy)propyl)triethoxysilane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이고, 상기 비반응성 고분자는 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol), 폴리올레핀(polyolefin), 폴리아미드(polyamide) 및 2-메톡시폴리에틸렌옥시6-9프로필트리메톡시사일레인(2-[methoxy(polyethyleneoxyl)6-9propyl]trimethoxylsilane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이며, 상기 반응성 고분자와 비반응성 고분자의 비율은 1:1,000 ~ 1:10,000인 것을 특징으로 하는 당뇨병 측정방법.
KR1020180158405A 2017-12-12 2018-12-10 생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법 KR102055341B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2018/015676 WO2019117586A1 (ko) 2017-12-12 2018-12-11 생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법
EP18889014.9A EP3726215A4 (en) 2017-12-12 2018-12-11 SILICA NANOPARTICLES FOR DIAGNOSIS BY BIOMARKERS AND PROCESS FOR THEIR PRODUCTION
US16/764,973 US20200400663A1 (en) 2017-12-12 2018-12-11 Silica nanoparticles for biomarker diagnosis and method for producing same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170170243 2017-12-12
KR20170170243 2017-12-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190070289A KR20190070289A (ko) 2019-06-20
KR102055341B1 true KR102055341B1 (ko) 2019-12-13

Family

ID=67103508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180158405A KR102055341B1 (ko) 2017-12-12 2018-12-10 생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20200400663A1 (ko)
KR (1) KR102055341B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101368076B1 (ko) 2013-02-26 2014-02-27 강원대학교산학협력단 수용액에서 우수한 분산성을 가지는 표면 개질된 형광 실리카 나노입자 및 그 제조방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1248112A3 (en) * 1987-04-27 2004-08-25 Inverness Medical Switzerland GmbH Immunochromatographic specific binding assay device
KR100818462B1 (ko) * 2006-09-09 2008-04-01 재단법인서울대학교산학협력재단 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 기능성 실리카 나노파티클 및그 제조방법
KR101077966B1 (ko) * 2007-11-30 2011-10-31 고려대학교 산학협력단 펩티드 분리용 나노입자, 그 제조방법 및 이를 이용한 펩티드 분리방법
KR101135054B1 (ko) * 2008-12-17 2012-04-13 고려대학교 산학협력단 단백질 분리용 나노입자, 그 제조 방법 및 이를 이용한 단백질 분리 정제 방법
KR20160092406A (ko) * 2015-01-27 2016-08-04 강원대학교산학협력단 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101368076B1 (ko) 2013-02-26 2014-02-27 강원대학교산학협력단 수용액에서 우수한 분산성을 가지는 표면 개질된 형광 실리카 나노입자 및 그 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
International Journal of Nanomedicine 2017:12 (WIBE Thematic Series) pp. 87-110. (2016.12.20. 온라인 공개) 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190070289A (ko) 2019-06-20
US20200400663A1 (en) 2020-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Arabi et al. Label-free SERS detection of Raman-Inactive protein biomarkers by Raman reporter indicator: Toward ultrasensitivity and universality
Bigdeli et al. Ratiometric fluorescent nanoprobes for visual detection: Design principles and recent advances-A review
Chapman et al. Multivalent nanoparticle networks enable point-of-care detection of human phospholipase-A2 in serum
Xu et al. Detection methods and research progress of human serum albumin
US10036750B2 (en) Immunochromatography, and detection device and reagent for the same
Liu et al. Ratiometric fluorescent sensor for visual determination of copper ions and alkaline phosphatase based on carbon quantum dots and gold nanoclusters
US20020146754A1 (en) Immunochromato device and method for measuring samples using the same
KR102029797B1 (ko) 당화혈색소 측정용 시약 조성물 및 이를 이용한 당화혈색소의 측정방법
Duong et al. Development of novel optical pH sensors based on coumarin 6 and nile blue A encapsulated in resin particles and specific support materials
US20160139137A1 (en) Ratiometric assay for hydrolytic enzyme quantification
Mukundan et al. Optimizing a waveguide-based sandwich immunoassay for tumor biomarkers: evaluating fluorescent labels and functional surfaces
Feng et al. A novel strategy for multiplexed immunoassay of tumor markers based on electrochemiluminescence coupled with cyclic voltammetry using graphene-polymer nanotags
Hamd-Ghadareh et al. Development of three-dimensional semi-solid hydrogel matrices for ratiometric fluorescence sensing of Amyloid β peptide and imaging in SH-SY5 cells: Improvement of point of care diagnosis of Alzheimer's disease biomarker
Moulahoum et al. based lateral flow assay using rhodamine B–loaded polymersomes for the colorimetric determination of synthetic cannabinoids in saliva
KR101670032B1 (ko) 광학 바이오센서
KR102055341B1 (ko) 생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법
Xiao et al. Fluorescent sensing of free bilirubin at nanomolar level using a Langmuir–Blodgett film of glucuronic acid–functionalized gold nanoclusters
KR102029798B1 (ko) 당화 알부민 측정용 시약 조성물 및 이를 이용한 당화 알부민의 측정방법
EP3726215A1 (en) Silica nanoparticles for biomarker diagnosis and method for producing same
KR102312321B1 (ko) 당화 알부민 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율 측정법
KR101042043B1 (ko) 아조 보론산 염료를 이용한 당화단백질의 광학적 측정방법
WO2018056762A1 (ko) 당화 알부민 측정용 시약 조성물 및 이를 이용한 당화 알부민의 측정방법
Li et al. On-chip determination of glycated hemoglobin with a novel boronic acid copolymer
US20220403442A1 (en) Compositions and methods for detection of oxidizable analytes
Unal et al. Novel fluorescence assay using µ-wells coated by BODIPY dye as an enzymatic sensing platform

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right